Summary
Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.
Abstract
İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) bugüne kadar, şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların yönetimi için pluripotent hücrelerin umut verici bir kaynak olarak kabul edilebilir, yaralı dokuların reconstitution ve rejenerasyon ve yeni ilaçların geliştirilmesi için. Düşük ret riski, azalan etik sorunlar ve yeniden programlama potansiyellerinde herhangi bir fark olmaksızın hem genç hem de yaşlı hastalardan bunları elde etme imkanı gibi iPSC'lerin kullanımına ilişkin tüm avantajlara rağmen, üstesinden gelinmesi gereken sorunlar hala çoktur. Aslında, viral ve entegre virüsler ile yapılan hücre yeniden programlama enfeksiyonlara neden olabilir ve gerekli genlerin giriş alıcı hücrenin bir genomik istikrarsızlık neden olabilir, klinikte kullanımını bozan. Özellikle, c-Myc geninin kullanımı hakkında birçok endişe vardır, mutasyona neden olan aktivitesi için çeşitli çalışmalardan iyi bilinmektedir. Fibroblastlar izole etmek ve kültür kolay ve minimal invaziv deri yumruk biyopsisi ile hasat olarak hücresel yeniden programlama için uygun hücre popülasyonu olarak ortaya çıkmıştır. Burada açıklanan protokol, numune işlemeden hücre kültürleri elde etmeye, reaktif ve malzeme seçimine, temizlik ve hazırlamaya, ticari bir yöntemle hücre yeniden programlamasına kadar tüm prosedürün ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sağlar. değiştirilmemiş RNA'lar (NM-RNA)tabanlı yeniden programlama kiti. Seçilen yeniden programlama kiti, insan dermal fibroblastının iPSC'lere etkin bir şekilde yeniden programlanmasına olanak sağlar ve küçük koloniler, standart veri sayfasına ilişkin değişikliklerle bile ilk transfeksiyondan sonra 24 saat kadar erken görülebilir. Bu protokolde kullanılan yeniden programlama prosedürü, viral vektör tabanlı yöntemlerin neden olduğu enfeksiyon riski olmadan güvenli bir yeniden programlama avantajı sunar, hücresel savunma mekanizmalarını azaltır ve xeno-free iPSCs üretimine izin verir, tüm daha fazla klinik uygulamalar için zorunlu olan kritik özellikler.
Introduction
Hücre yeniden programlama iPSC1olarak bilinen bir pluripotent kök hücre, vücudun her somatik hücre dönüştürmek için yeni bir teknoloji temsil eder. Bir pluripotent ve farklılaşmamış devlet geri yetişkin bir somatik hücre yeniden programlama imkanı pluripotent hücrelerin kullanımı ile ilgili kötü durumu ve etik sorunlar tarafından dayatılan sınırları aşmak, daha önce sadece insan embriyolarından elde edilebilir (embriyonik kök hücreler veya ESC)2,3,4. 2006 yılında, Kazutoshi Takahashi ve Shinya Yamanaka yapay dört özel genler (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5ekleyerek pluripotent hücrelere deriden yetişkin somatik hücrelerin ilk dönüşüm elde öncü bir çalışma yürüttü . Bir yıl sonra, Thomson laboratuvarında yapılan çalışmalar dört gen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6farklı bir kombinasyonu transdüksiyon tarafından iPSCs içine somatik hücrelerin başarılı yeniden programlama yol açtı .
iPSC'ler, elde ettikleri hastanın özelliklerinin genotyolojik bir yansıması ile birlikte farklı hastalıkları incelemek ve tedavi etmek için mükemmel bir platform olan, rejeneratif tıp ve farmakoloji gibi farklı alanlardaki bilim adamları ve araştırmacılariçin bir dizi fırsat sunar. iPSCs kullanımı dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar: hücrelerin tamamen otolog kökenli nedeniyle bağışıklık yanıtı için azaltılmış risk; sürekli olarak kendini yenileyebildikleri ve farklı hücre tipleri üretebildikleri için, yeni ilaçlara ve yan etkilerine tepkiyi tahmin etmek için önemli bir araç olan hücre kitaplığı oluşturma olasılığı; ve ilaç yönetimi için özelleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmek için şans7,8,9.
Çeşitli teknikler şu anda, yeniden programlama faktörlerinin ifade ikna etmek için bilinen ve iki ana kategoride yer almaktadır: olmayan viral ve viral vektör tabanlı yöntemler10,11,12,13. Viral olmayan yöntemler mRNA transfeksiyon, miRNA enfeksiyon / transfeksiyon, PiggyBac, minicircle vektörler ve epizomal plazmidler ve ekzozomlar10,11,12,13içerir. Viral tabanlı yöntemler, Adenovirüs, Sendai virüs ve proteinler gibi entegre olmayan virüsler ve Retrovirus ve Lentivirus10,11,12,13gibi entegre virüsler içerir.
Çeşitli çalışmalara göre, hücre yeniden programlama etkinliği açısından bu yöntemler arasında önemli bir fark fark edilmiştir, dolayısıyla, uygun yöntemseçimi kesinlikle kullanılan hücre tipine bağlıdır ve alınan iPSCs sonraki uygulamalara bağlıdır14,15. Söz konusu tüm yöntemler dezavantajları göstermek, örneğin, Sendai virüs tüm hücre türleri üzerinde etkilidir, ancak iPSCs elde etmek için pasajlar bir sürü gerektirir; epizomlar tarafından yeniden programlama kan hücreleri için mükemmel ama fibroblastlar için standart kültür koşullarının değiştirilmesi gerekiyor; PiggyBac yöntemi çekici bir alternatif temsil edebilir ama insan hücrelerinde çalışmalar hala sınırlı ve zayıf10,11,12,13. Ekzozomlar fizyolojik olarak tüm vücut sıvılarına hücreler tarafından salgılanan nano-veziküllerdir. Son çalışmalara göre, hücreler arası iletişimden sorumludurlar ve hücre çoğalması, göç ve farklılaşma gibi önemli biyolojik süreçlerde rol oynarlar. Ekzozomlar, hücre zarının aynı bileşimini paylaştıkları için mRNA ve miRNA'yı tamamen doğal bir mekanizmaya sahip alıcı hücrelere taşıyabilir ve aktarabilirler16. Bu nedenle, ekzozomlar yeniden programlama için umut verici bir yeni nesil tekniktir, ancak somatik hücreleri içeriklerine göre yeniden programlama potansiyelleri hala araştırılmaktadır. Viral vektörtabanlı yöntemler, yeniden programlama genlerini alıcı hücrelere iletmek için değiştirilmiş virüsleri kullanır. Bu teknik, yeniden programlama yüksek verimliliğe rağmen, güvenli olarak kabul edilmez, hücre içinde virüsün entegrasyonu enfeksiyon sorumlu olabilir gibi, teratomlar ve genomik instabilite17.
IPSC kolonileri oluşturmak için aşağıdaki protokol Yamanaka ve Thompson'S yeniden programlama kokteyl birleştirir ve xeno-free koşullarda gerçekleştirmek için imkanı ile NM-RNA ve bağışıklık kaçırma faktörleri gerektiren bir yöntemin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntemin kullanımıarkasındaki mantığı yaymak için, bilimsel topluluk içinde, bir protokol iPSCs içine karın deriden yetişkin insan fibroblastlar hızlı, basit ve son derece etkili bir yeniden programlama sağlayan18.
Önerilen yöntemin güçlü yönleri, aslında, performans kolaylığı ve iPSCs elde etmek için gerekli kısa süre vardır. Ayrıca, yöntem hücresel savunma mekanizmaları ve viral vektörlerin kullanımını önler, ilgili konulardan sorumlu.
Standart protokole göre aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: (1) Konfluent fibroblastlar 48 saat boyunca %0.1 serum yerleştirilerek 4 8 no'lu paragrafta senkronize edilmiştir; (2) Kültür için hücresel yoğunluk ve reaktiflerin hacmi 6 kuyulu plaka yerine 24 kuyulu çok kuyulu bir plaka üzerinde kullanılmak üzere ayarlandı; (3) Yeniden programlama deneyi atmosferik (%21 O 2 ) veya hipoksik (%5 O2)koşullarına sahip birkuvöz yerine %5 CO2 kuluçka makinesi kullanılarak gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan dokusundan alınan örnekler Helsinki Bildirgesi'ne göre üniversite hastanesi Federico II yönergelerine uyulurken toplanmıştır. Bu çalışmaya katılan tüm hastalara yazılı izin verildi.
1. Malzeme ve Kültür Medyasının Hazırlanması
- Temiz ve otoklav cerrahi makas büyük bir çift, ince forceps iki set, mikrodissecting makas iki çift, 1 L steril şişe, 500 mL steril şişe, ve 250 mL steril şişe.
- 100 mm plaka, 60 mm plaka, 35 mm plaka, tek kullanımlık neşterler, 50 mL steril tüpler, 15 mL steril tüpler ve 100 mm cam plaka hazırlayın. Aletleri kullanıma hazır olana kadar steril koşullarda saklayın.
- Kullanmadan önce 22 mm x 22 mm kapak camlarını temizleyin ve sterilize edin. Bunun için, bir cam plaka kapak bardak yerleştirin,% 70 etanol ile kaplayın ve etanol aspirating önce birkaç saniye bekleyin. 37 °C'de bir fırında bardakları kurutun ve sonra otoklavlayın.
- Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 1 L'ini pH 7.4'te, ticari olarak mevcut toz tuzları çift distile steril suda eriterek ve 0,35 g sodyum bikarbonat ekleyerek hazırlayın. Steril bir başlık altında filtrasyon ile sterilize ve kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.
- Steril 1x fosfat-tamponlu-salin (PBS) 500 mL'lik potasyum fosfat monobasic 0,1 g, 0,1 g potasyum klorür, 4,0 g sodyum klorür ve 0,575 g sodyum fosfat dibasic'i steril çift distile suda eriterek hazırlayın. pH değerini (7.4) kontrol edin ve filtrasyon ile steril bir başlık altında sterilize. Kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.
- Steril kaputun altında 45 mL HBSS'ye %10 fetal büyükbaş serumun (FBS) 5 mL'si ekleyerek 50 mL tripsin stop çözeltisi (TSS) hazırlayın. Kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.
- Dulbecco'nun modifiye kartal izolasyonu için modifiye Kartal ortamını (I-DMEM) 250 mL'lik Dulbecco modifiye Kartal ortamını (DMEM) steril bir başlık altında %10 FBS ve %0,5 penisilin ve streptomisin (kalem/strep) ile tamamlayın. Kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.
- DMEM'i steril kaputun altında %0,1 FBS ve %0,5 kalem/strep ile desteklenen 250 mL DMEM kullanarak fibroblast senkronizasyonu (S-DMEM) için hazırlayın. Kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.
2. İnsan Dermal Fibroblastların İzolasyon
NOT: Aşağıda bildirilen 2.1-2.3 adımları steril bir başlık altında yapılmalıdır. Çapı yaklaşık 0,8 cm olan silindirik bir örnek, 1.
- Karından elde edilen taze insan derisi örneğini HBSS solüsyonu ile 100 mm'lik bir kapta yıkayın. Yavaşça kan ve diğer biyolojik sıvıları kaldırmak için sallayın. Her yıkamada HBSS çözeltisini ve plakayı değiştirerek adımı üç kez tekrarlayın.
- Numuneyi 100 mm'lik bir tabağa yerleştirin, ince forseps ve makas kullanarak saç ve yağı çıkarın ve neşterle incelterek ince parçalar halinde inceleyin ve neşterle inceleyerek incelterek ince lterek 2 mm x 1 mm'lik parçalar (toplam 16 parça için) yara, kirli (örneğin, dermografik kalemli çizimlerden kaynaklanan) veya yanmış alanlardan kaçınmak için parçalara ayırın doku.
- Her 35 mm çanak 4 küçük parçalar yerleştirin, steril 22 mm x 22 mm kapak cam ile kapak. İnce forceps ile ayarlayın. 1,5 mL I-DMEM ekleyin.
- Plakaları %5 CO2'de %5'te yaklaşık 15 gün veya hücreler %85 birleştiği zamana kadar kuluçkaya yatırın. Her 3 günde bir kültür ortamını değiştirin ve her gün ters faz kontrastlı mikroskop kullanarak hücrelerin büyümesini kontrol edin.
3. İnsan Cilt Fibroblastları Genişleme
NOT: Aşağıda bildirilen adımlar, kuluçka makinesinde yapılan adımlar dışında steril bir başlık altında yapılmalıdır.
- Kapak bardaklarını ince forsepslerle kaldırın, 100 mm'lik bir tabağa ters yerleştirin ve 1x steril PBS ile yıkayın.
- Örneklerin parçalarını çıkarın ve onları atın, 1x steril PBS ile plakaları yıkayın.
- 1x PBS'yi çıkarın ve sırasıyla 100 mm çanak ve 35 mm tabaklara yerleştirilen bardakları kapsayacak şekilde 3 mL ve 1 mL tripsin-EDTA (Ethylenediaminetetraastic asit) ekleyin. 37 °C'de %5 CO2ile 5 dk kuluçka .
- 100 mm'lik tabağa 5 mL TSS ve her 35 mm'lik tabağa 2 mL TSS ekleyerek tripsinizasyonu engelleyin. Süspansiyonu 15 mL steril tüpler halinde toplayın, 400 x g'da 4 °C'de 5 dk santrifüj.
- Supernatant aspire ve I-DMEM 12 mL pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna her 60 mm plaka için 3 mL aliquots bölün.
- %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Orta yı günlük olarak değiştirin. Hücreleri %75'lik bir kesişme olana kadar kültürde tutun.
- Tabaklardan orta aspirasyon ve hızlı bir şekilde 1x PBS yıkayın.
- 4. geçitte hücre elde etmek için tripsinizasyonu (3.3 ve 3.4 adımları) üç kez tekrarlayın. Her 60 mm çanakta 1,5 mL tripsin-EDTA ve 3 mL TSS kullanın. Hücreleri 1:3'e böl.
- I-DMEM'i S-DMEM ile değiştirerek hücreleri senkronize edin ve 37 °C'de 48 saat boyunca %5 CO2ile kuluçkaya yatırın.
- Aşağıdakileri hazırlayın (hücre senkronizasyonu sırasında).
- +4 °C'de 44,5 mL gelişmiş DMEM 'e (A-DMEM) 5,0 mL FBS ve 0,5 mL L-glutamin ekleyerek fibroblast genleşme ortamı hazırlayın.
- 9 steril RNase içermeyen tüpün her birinde aşağıdakileri birleştirerek fibroblast yeniden programlama için toplam NM-RNA yeniden programlama kokteylini hazırlayın: 32 μL OSKMNL NM-RNA, 24 μL EKB NM-RNA, 5,6 μL NM-microRNA (9 aliquots için 61,6 μL son hacim).
- Fibroblast yeniden programlama için toplam NM-RNA yeniden programlama kokteylinin 61,6 μL'lik her tüpünü steril, RNase içermeyen tüplerde 15,4 μL tek kullanımlık aliquot'a bölün ve -80 °C'de (36 aliquot için 15,4 μL son hacim) depolayın.
4. Dermal Fibroblastların iPSC'lere Yeniden Programlanması
- 0. Gün: Hücre tohumlama
NOT: 4.1.1- 4.1.3 ve 4.1.8 ila 4.1.9 adımları steril başlık altında yapılmalıdır. Bodrum membran matrisi (BMM) oda sıcaklığında hızla jeller. Bu nedenle, bmm bir buzdolabında buz üzerinde bir gecede çözülmek için tavsiye edilir, buz gibi serum içermeyen orta ile seyreltmek ve önceden soğutulmuş pipetler kullanmak, ipuçları, ve tüpler.- Her kuyuyu 100 μL BMM ile kaplayarak 24 kuyulu bir tabak hazırlayın ve hücreleri tohumlamadan önce 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Kültür hücreleri ile plakalardan orta aspire ve hızlı bir şekilde 1x PBS yıkayın.
- Paragraf 5'te hücreleri elde etmek için tripsinizasyonu (adım 3.3 ve 3.4) tekrarlayın. Supernatant aspire ve fibroblastlar genişleme orta uygun bir hacimde pelet resuspend (adım 3.10 bakınız).
- Hemositometreyi %70 alkolle hazırlayın ve temizleyin.
- 10 μl trypan mavisi ve 10 μL hücre süspansiyonu 1,5 mL tüpte hafifçe karıştırarak ve oda sıcaklığında 1-2 dakika kuluçkaya yatırarak bir çözüm hazırlayın. 5 dakikadan daha uzun kuluçkaya yatmayın dikkatli olun.
- Çözeltinin 10 μL'lik hemositometreye yerleştirilecek pipet, ters faz kontrast mikroskobu nun aşamasına yerlebir. Canlı olmayan hücreler mavi olurken, canlı hücreler lekesiz olacaktır.
- Hücreleri hemositometre odasının en az 2 karesinde sayın. Toplam hücre sayısını elde etmek için aşağıdaki hesaplamayı uygulayın:
toplam hücre sayısı = (sayılan hücre sayısı/kare sayısı) x 2 x 10 x hücre süspansiyonunun toplam hacmi - Toplam sayılan hücre sayısına bağlı olarak 500 μL fibroblast genişleme ortamı başına 2,5 x 104 hücre yoğunluğu elde etmek için seyreltme gerçekleştirin. Fibroblastlar genişleme ortamıuygun bir hacimde pelet resuspend.
- Pipet, 24 kuyulu plakanın her bir kuyunun içine hücre süspansiyonunun 500°L.'si. 37 °C ve %5 CO2'debir gecede inkübhücreler .
- 1. Gün: Transfection
NOT: Tüm çalışma yüzeyleri ve malzemeleri (örneğin, eldivenler, şişeler, steril başlık yüzeyleri, pipetler) prosedüre başlamadan önce RNase'nin çıkarılması için temizlik reaktifi ile temizlenmelidir. 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 adımlarını steril bir başlık altında gerçekleştirin.- 37 °C'lik bir su banyosunda xeno içermeyen, serumsuz, düşük büyüme faktörü insan ESC/iPSC kültür ortamını (XF/FF kültür ortamı) ısıtın.
- Eski ortamı her kuyudan çıkarın ve önceden ısıtılmış 500 μL XF/FF kültür ortamı ile değiştirin.
- En az 6 saat boyunca %5 CO2'nin altında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında toplam NM-RNA yeniden programlama kokteyl beş 15.4 μL aliquots çözülme ve buz üzerine yerleştirin.
- Her aliquot'a 234,6 μL azaltılmış serum ortası ekleyin, 3-5 kez hafifçe pipet alın ve her birini TÜP A (RNA + azaltılmış serum ortası) olarak etiketlayın.
- Etiket 5 steril, RNase içermeyen 0.5 mL tüpleri TUBE B olarak ve 244 μL azaltılmış serum orta (RNA-transfeksiyon reaktifi + azaltılmış serum orta) ile sentetik siRNA transfeksiyon reaktifi 6 μL karıştırın.
- Her BIR TÜP B'nin içeriğini bir TÜP A damlasına ekleyin (NM-RNA transfeksiyon kompleksinin 500°L son hacmini elde etmek için). Tüpün dibine dokunarak karıştırın. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- 500 μL'den 4 kuyuya kadar olan beş kuyunun her birinden 125 μL NM-RNA transfeksiyon kompleksi çözeltisi ekleyin (toplam 20 kuyuya ulaşmak için), plakayı yatırın ve ortama damlacık borulama. Hafifçe sallayarak karıştırın. Referans olarak kalan 4 kuyuyu kullanın.
- 37 °C'de 15 saat kuluçka, %5 CO2.
- Gün 2-4: Transfection tamamlayın
- Orta aspiratör. Transfeksiyon işlemini steril kaputun altındaki 1.
- Gün 5-10: Medya değişiklikleri
- Orta aspire ve steril bir başlık altında taze, önceden ısıtılmış XF / FF kültür ortamı ile değişimi.
- Bir gecede 37 °C,% 5 CO2kuluçka .
- Faz-kontrast mikroskobu ile her gün izlenen iPSC kolonilerinin oluşumunu gözlemleyene kadar kültürde kalın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün amacı, abdominal deriden izole edilen dermal fibroblastların nm-rna'lara dayalı entegre olmayan yeniden programlama yöntemi ile belirli faktörlerin ekspresyonunu tetiklemek tir. Bu amaca ulaşmak için, insan dermal fibroblastlar mide tuck cerrahisi geçiren hastaların deri örneklerinden izole edildi ve iPSCs Oct4 tanıtArak oluşturuldu, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 yeniden programlama faktörleri ve E3, K3, B18 bağışıklık kaçırma faktörleri ticari kullanıma hazır yeniden programlama kiti ile NM-RNA ve microR teknolojisini birleştiren. Protokolün zaman çizelgesi Şekil 1'deözetlenmiştir.
İnsan fibroblastları bir hafta içinde karın derisi örneklerinden(Şekil 2A)büyümüş ve iki hafta içinde %85 birleştiğizamana ulaşmıştır(Şekil 2B). Hücreler plastik kültür yemeklerinde yapışkan büyüme ile karakterize edildi ve morfolojileri uzamış ve iğ şeklinden(Şekil 2C)düzleştirilmiş ve yıldız şeklinde(Şekil 2D)kadar değişmektedir. Kültürde fibroblast morfolojisi ve düzenlemesi, BMM'de tohumlamadan sonra, uzatılmış bir morfoloji edinip ince dallı yapılar oluşturacak şekilde düzenlenmiş olarak önemli ölçüde değişmiştir(Şekil 3A). Küçük koloniler ilk transfeksiyondanitibaren1.
Yeniden programlama işlemi antibiyotiksiz ortam kullanılarak yapıldığından, mikrobiyal kontaminasyon önemli bir konudur ve steril koşullar garanti edilmezse(Şekil 4)kontaminasyonu önlemek için standart prosedürleri benimseyin (örneğin eldiven giymek, tüm yüzeylerden toz ları temizlemek, tüm yüzeyleri ve ekipmanları %70 etanol ile temizlemek, açığa çıkarılan hücre kültürü plakaları ile adımlar sırasında konuşmaktan kaçının) oluşabilir.
Şekil 1: Protokol zaman çizelgesi. İnsan fibroblastlarının karın derisinden izolasyon ve yeniden programlanması zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürü. Deri parçalarından fibroblastların dışa doğru görüntülerini(A). Fibroblastlar yaklaşık 14 gün içinde biraraya geldi(B) ve iğ şeklinde gösterdi (C) ve yıldız şeklinde (D) fenotip. Deri parçaları beyaz bir yıldız la gösterilir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deri fibroblastı progresyonu. BMM'de tohumlanan hücreler, düzenleme ve morfolojide belirgin bir değişiklik gösterdi (A). İlk transfeksiyondan sonra 24 saat gibi erken bir zamanda oluşan iPSC'lerin küçük kolonileri(B) ve boyutları 7 (C) ve 14(D)günlerinde kademeli olarak artarken, sayıları 1 gün ile 7 gün arasında artmış, ancak ilk transfeksiyondan itibaren 7 ile 14 gün arasında sabit kalmıştır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yeniden programlama işlemi sırasında mikrobiyal kontaminasyon. Yeniden programlama işlemi sırasında fibroblast kültürünün mikrobiyal kontaminasyonunu gösteren faz-kontrast mikroskobu kullanılarak temsili görüntü. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs hızla rejeneratif tıp uygulamaları için en umut verici hücre adayı olarak ortaya çıkmaktadır ve hastalık modelleme ve ilaç testi için son derece yararlı bir araç olarak3,8. Burada sunulan protokol, herhangi bir özel ekipman veya yeniden programlama teknolojisi ile önceki deneyim gerektirmeyen basit ve verimli bir prosedür ile bir deri yumruk biyopsisi boyutuna sahip bir örnek insan iPSCs nesil açıklar.
Kaplama yoğunluğu ve çoğalma oranı yeniden programlama verimliliğini etkilediğinden, başarı şansını artırmak için fibroblast izolasyonu ve kültürünü optimize etmek birincil öneme sahiptir. Ayrıca, son zamanlarda dermal fibroblastlar yeniden programlama teknolojisine farklı yanıt ve bildirilmiştir, özellikle, karın bölgesinin derisinden izole fibroblastlar daha kolay ve kolayca diğer vücut bölgelerinden izole dermal fibroblastlar daha yeniden programlanmış18. Bu nedenle, doğru yeniden programlamak ve hücre çoğalma oranı temelinde kaplama yoğunluğunu tanımlamak için somatik hücreleri seçmek önemlidir. Bu amaçla, mevcut protokol aynı zamanda karın derisinden dermal fibroblastların nasıl izole edilebildiğini ve prosedürü kolaylaştırmak ve hızlandırmak için in vitro olarak nasıl yayılanıncaya da talimat verir.
Yeniden programlama dan önce, fibroblastlar hücre belleği18 silmek ve passaging pluripotent durum19indüksiyon hızlandırabilir bildirilen kanıtlara uygun geçit 5 ulaşmak için yayılır edildi. Ayrıca, deneyimlerimize göre, kültürdeki fibroblastlar değişken proliferatif özellikler sergilerler, böylece fibroblastları senkronize etmek ve hücre popülasyonundaki değişkenliği azaltmak için ek bir adım atarak protokolü değiştirdik.
Yamanaka ve Thomson yaklaşımı5,6kaynaklanan yeniden programlama faktörlerinin bir arada tanıttı ticari bir NM-RNA tabanlı kiti kullanarak,mRNA tabanlı yeniden programlama geliştirmek için kanıtlanmış miRNA ile birlikte20, insan dermal fibroblastlar başarıyla iPSC ve küçük koloniler için yeniden programlanmış olabilir 24 saat ilk transfection sonra belirgin hale gelir. mRNA tabanlı yeniden programlamanın başlıca avantajları, gerçekten de, kolonilerin erken ortaya çıkması, çok düşük aneuploid oranı ile birlikte20 hücre yeniden programlandığında ve bu yöntemle üretilen iPSC'lerin rejeneratif tıpta kullanımı için güvenli hale getiren entegrasyon yokluğudur. Ayrıca, bu protokol için kullanılan ticari kit, sitotoksik ve immünojenik NM-RNA'ların neden olduğu hücre ölümünü önleyerek yeniden programlamanın verimliliğini artırdığı bilinen immünmodülatör faktörleri birlikte sunar21,22.
Yeniden programlama için kullanılan kit 6-iyi çok kuyulu plaka için tasarlanmış olmasına rağmen, hücresel yoğunluğu optimize ve bir cilt yumruk biyopsi insan iPSCs üretimi için etkili protokol yapmak için 24 iyi çok kuyulu plaka üzerinde kullanımı için reaktifhacmi ni ayarladı. Ayrıca, O2 kontrolü ile bir doku kültürü kuluçka ihtiyacı birkaç yazar tarafından rapor olsa da20,23 ve kit üreticisi tarafından tavsiye, burada açıklanan protokolü izleyerek biz standart bir% 5 CO2 inkübatör karın derisinden insan dermal fibroblastlar yeniden programlanmış. Bu nedenle, prosedür atmosferik gerek kalmadan herhangi bir hücre kültürü laboratuvarında yapılabilir (21% O2) veya hipoksik (5% O2) kültür koşulları, Bu daha fazla yeniden programlama verimliliğini artırabilir rağmen24,25.
Yine de, araştırma amacıyla kullanılabilecek küçük deri örnekleri iPSC'lerden elde etmek için insan dışı hayvan kaynaklı reaktifler kullandık. En cazip uygulama doku ve organların yenilenmesi için olmasına rağmen, iPSCs farklı hastalıkların modelleme için kullanılan ve daha sonra hem altta yatan moleküler mekanizmalar üzerinde araştırmak ve özel ilaçlar ve tedaviler geliştirmek3,26.
Dikkat çekici bir şekilde, uygun ksenno-free reaktifler için hayvan kaynaklı reaktiflerin yerine, aynı protokol yetişkin insan fibroblastlarının klinik kullanımlarını garanti eden tam bir xeno-free kültür ortamında iPSC'lere yeniden programlanmasına olanak tanır.
Ancak, ağır iş yükü dikkate alınmalıdır. Bize göre, denemeyi hafta sonları yapılması gereken adımlar da dahil olmak üzere önceden dikkatlice planlamak ve senkronizasyon adımı sırasında tüm transfeksiyon reaktiflerini hazırlamak çok önemlidir. Gerçekten de transfeksiyon dört gün boyunca her gün yapılmalı dır ve daha sonra hücreler her gün izlenmeli ve ortam günlük olarak değiştirilmelidir.
Ayrıca, iPSC kolonilerinin doğru tanımlanması sadece morfolojik kriterlere dayanamaz. Bu nedenle, yeni türetilen iPSC'ler hücresel ve moleküler analizler yoluyla birden fazla pluripotent belirteçlerin ekspresyonu için arama karakterize edilmesi gerekir. Yaygın olarak kabul gören belirteçler nanog, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 ve SSEA4'ü içerir, bunlar immünositokimyasal analiz ve yarı-kantitatif RT-PCR kullanılarak gen ekspresyonu analizi ile tanımlanabilir. Alkali fosfataz aktivitesi pluripotent kök hücrelerde upregulated olduğu gösterilmiştir bu yana, bu tür enzimatik aktivite tespiti kolayca iPSCs tanımlamak ve yeniden programlama oluşumunu doğrulamak için yapılabilir27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarların hiçbir takdiri yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
- Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
- Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
- Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
- Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
- Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
- Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
- Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
- Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
- Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
- Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
- Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
- Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).
