Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA’lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.
İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) bugüne kadar, şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların yönetimi için pluripotent hücrelerin umut verici bir kaynak olarak kabul edilebilir, yaralı dokuların reconstitution ve rejenerasyon ve yeni ilaçların geliştirilmesi için. Düşük ret riski, azalan etik sorunlar ve yeniden programlama potansiyellerinde herhangi bir fark olmaksızın hem genç hem de yaşlı hastalardan bunları elde etme imkanı gibi iPSC’lerin kullanımına ilişkin tüm avantajlara rağmen, üstesinden gelinmesi gereken sorunlar hala çoktur. Aslında, viral ve entegre virüsler ile yapılan hücre yeniden programlama enfeksiyonlara neden olabilir ve gerekli genlerin giriş alıcı hücrenin bir genomik istikrarsızlık neden olabilir, klinikte kullanımını bozan. Özellikle, c-Myc geninin kullanımı hakkında birçok endişe vardır, mutasyona neden olan aktivitesi için çeşitli çalışmalardan iyi bilinmektedir. Fibroblastlar izole etmek ve kültür kolay ve minimal invaziv deri yumruk biyopsisi ile hasat olarak hücresel yeniden programlama için uygun hücre popülasyonu olarak ortaya çıkmıştır. Burada açıklanan protokol, numune işlemeden hücre kültürleri elde etmeye, reaktif ve malzeme seçimine, temizlik ve hazırlamaya, ticari bir yöntemle hücre yeniden programlamasına kadar tüm prosedürün ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sağlar. değiştirilmemiş RNA’lar (NM-RNA)tabanlı yeniden programlama kiti. Seçilen yeniden programlama kiti, insan dermal fibroblastının iPSC’lere etkin bir şekilde yeniden programlanmasına olanak sağlar ve küçük koloniler, standart veri sayfasına ilişkin değişikliklerle bile ilk transfeksiyondan sonra 24 saat kadar erken görülebilir. Bu protokolde kullanılan yeniden programlama prosedürü, viral vektör tabanlı yöntemlerin neden olduğu enfeksiyon riski olmadan güvenli bir yeniden programlama avantajı sunar, hücresel savunma mekanizmalarını azaltır ve xeno-free iPSCs üretimine izin verir, tüm daha fazla klinik uygulamalar için zorunlu olan kritik özellikler.
Hücre yeniden programlama iPSC1olarak bilinen bir pluripotent kök hücre, vücudun her somatik hücre dönüştürmek için yeni bir teknoloji temsil eder. Bir pluripotent ve farklılaşmamış devlet geri yetişkin bir somatik hücre yeniden programlama imkanı pluripotent hücrelerin kullanımı ile ilgili kötü durumu ve etik sorunlar tarafından dayatılan sınırları aşmak, daha önce sadece insan embriyolarından elde edilebilir (embriyonik kök hücreler veya ESC)2,3,4. 2006 yılında, Kazutoshi Takahashi ve Shinya Yamanaka yapay dört özel genler (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5ekleyerek pluripotent hücrelere deriden yetişkin somatik hücrelerin ilk dönüşüm elde öncü bir çalışma yürüttü . Bir yıl sonra, Thomson laboratuvarında yapılan çalışmalar dört gen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6farklı bir kombinasyonu transdüksiyon tarafından iPSCs içine somatik hücrelerin başarılı yeniden programlama yol açtı .
iPSC’ler, elde ettikleri hastanın özelliklerinin genotyolojik bir yansıması ile birlikte farklı hastalıkları incelemek ve tedavi etmek için mükemmel bir platform olan, rejeneratif tıp ve farmakoloji gibi farklı alanlardaki bilim adamları ve araştırmacılariçin bir dizi fırsat sunar. iPSCs kullanımı dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar: hücrelerin tamamen otolog kökenli nedeniyle bağışıklık yanıtı için azaltılmış risk; sürekli olarak kendini yenileyebildikleri ve farklı hücre tipleri üretebildikleri için, yeni ilaçlara ve yan etkilerine tepkiyi tahmin etmek için önemli bir araç olan hücre kitaplığı oluşturma olasılığı; ve ilaç yönetimi için özelleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmek için şans7,8,9.
Çeşitli teknikler şu anda, yeniden programlama faktörlerinin ifade ikna etmek için bilinen ve iki ana kategoride yer almaktadır: olmayan viral ve viral vektör tabanlı yöntemler10,11,12,13. Viral olmayan yöntemler mRNA transfeksiyon, miRNA enfeksiyon / transfeksiyon, PiggyBac, minicircle vektörler ve epizomal plazmidler ve ekzozomlar10,11,12,13içerir. Viral tabanlı yöntemler, Adenovirüs, Sendai virüs ve proteinler gibi entegre olmayan virüsler ve Retrovirus ve Lentivirus10,11,12,13gibi entegre virüsler içerir.
Çeşitli çalışmalara göre, hücre yeniden programlama etkinliği açısından bu yöntemler arasında önemli bir fark fark edilmiştir, dolayısıyla, uygun yöntemseçimi kesinlikle kullanılan hücre tipine bağlıdır ve alınan iPSCs sonraki uygulamalara bağlıdır14,15. Söz konusu tüm yöntemler dezavantajları göstermek, örneğin, Sendai virüs tüm hücre türleri üzerinde etkilidir, ancak iPSCs elde etmek için pasajlar bir sürü gerektirir; epizomlar tarafından yeniden programlama kan hücreleri için mükemmel ama fibroblastlar için standart kültür koşullarının değiştirilmesi gerekiyor; PiggyBac yöntemi çekici bir alternatif temsil edebilir ama insan hücrelerinde çalışmalar hala sınırlı ve zayıf10,11,12,13. Ekzozomlar fizyolojik olarak tüm vücut sıvılarına hücreler tarafından salgılanan nano-veziküllerdir. Son çalışmalara göre, hücreler arası iletişimden sorumludurlar ve hücre çoğalması, göç ve farklılaşma gibi önemli biyolojik süreçlerde rol oynarlar. Ekzozomlar, hücre zarının aynı bileşimini paylaştıkları için mRNA ve miRNA’yı tamamen doğal bir mekanizmaya sahip alıcı hücrelere taşıyabilir ve aktarabilirler16. Bu nedenle, ekzozomlar yeniden programlama için umut verici bir yeni nesil tekniktir, ancak somatik hücreleri içeriklerine göre yeniden programlama potansiyelleri hala araştırılmaktadır. Viral vektörtabanlı yöntemler, yeniden programlama genlerini alıcı hücrelere iletmek için değiştirilmiş virüsleri kullanır. Bu teknik, yeniden programlama yüksek verimliliğe rağmen, güvenli olarak kabul edilmez, hücre içinde virüsün entegrasyonu enfeksiyon sorumlu olabilir gibi, teratomlar ve genomik instabilite17.
IPSC kolonileri oluşturmak için aşağıdaki protokol Yamanaka ve Thompson’S yeniden programlama kokteyl birleştirir ve xeno-free koşullarda gerçekleştirmek için imkanı ile NM-RNA ve bağışıklık kaçırma faktörleri gerektiren bir yöntemin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntemin kullanımıarkasındaki mantığı yaymak için, bilimsel topluluk içinde, bir protokol iPSCs içine karın deriden yetişkin insan fibroblastlar hızlı, basit ve son derece etkili bir yeniden programlama sağlayan18.
Önerilen yöntemin güçlü yönleri, aslında, performans kolaylığı ve iPSCs elde etmek için gerekli kısa süre vardır. Ayrıca, yöntem hücresel savunma mekanizmaları ve viral vektörlerin kullanımını önler, ilgili konulardan sorumlu.
Standart protokole göre aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: (1) Konfluent fibroblastlar 48 saat boyunca %0.1 serum yerleştirilerek 4 8 no’lu paragrafta senkronize edilmiştir; (2) Kültür için hücresel yoğunluk ve reaktiflerin hacmi 6 kuyulu plaka yerine 24 kuyulu çok kuyulu bir plaka üzerinde kullanılmak üzere ayarlandı; (3) Yeniden programlama deneyi atmosferik (%21 O 2 ) veya hipoksik (%5 O2)koşullarına sahip birkuvöz yerine %5 CO2 kuluçka makinesi kullanılarak gerçekleştirildi.
iPSCs hızla rejeneratif tıp uygulamaları için en umut verici hücre adayı olarak ortaya çıkmaktadır ve hastalık modelleme ve ilaç testi için son derece yararlı bir araç olarak3,8. Burada sunulan protokol, herhangi bir özel ekipman veya yeniden programlama teknolojisi ile önceki deneyim gerektirmeyen basit ve verimli bir prosedür ile bir deri yumruk biyopsisi boyutuna sahip bir örnek insan iPSCs nesil açıklar.
Kaplama…
The authors have nothing to disclose.
Yazarların hiçbir takdiri yok.
10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |