Summary

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Published: January 19, 2020
doi:

Summary

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA’lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Abstract

İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) bugüne kadar, şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların yönetimi için pluripotent hücrelerin umut verici bir kaynak olarak kabul edilebilir, yaralı dokuların reconstitution ve rejenerasyon ve yeni ilaçların geliştirilmesi için. Düşük ret riski, azalan etik sorunlar ve yeniden programlama potansiyellerinde herhangi bir fark olmaksızın hem genç hem de yaşlı hastalardan bunları elde etme imkanı gibi iPSC’lerin kullanımına ilişkin tüm avantajlara rağmen, üstesinden gelinmesi gereken sorunlar hala çoktur. Aslında, viral ve entegre virüsler ile yapılan hücre yeniden programlama enfeksiyonlara neden olabilir ve gerekli genlerin giriş alıcı hücrenin bir genomik istikrarsızlık neden olabilir, klinikte kullanımını bozan. Özellikle, c-Myc geninin kullanımı hakkında birçok endişe vardır, mutasyona neden olan aktivitesi için çeşitli çalışmalardan iyi bilinmektedir. Fibroblastlar izole etmek ve kültür kolay ve minimal invaziv deri yumruk biyopsisi ile hasat olarak hücresel yeniden programlama için uygun hücre popülasyonu olarak ortaya çıkmıştır. Burada açıklanan protokol, numune işlemeden hücre kültürleri elde etmeye, reaktif ve malzeme seçimine, temizlik ve hazırlamaya, ticari bir yöntemle hücre yeniden programlamasına kadar tüm prosedürün ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sağlar. değiştirilmemiş RNA’lar (NM-RNA)tabanlı yeniden programlama kiti. Seçilen yeniden programlama kiti, insan dermal fibroblastının iPSC’lere etkin bir şekilde yeniden programlanmasına olanak sağlar ve küçük koloniler, standart veri sayfasına ilişkin değişikliklerle bile ilk transfeksiyondan sonra 24 saat kadar erken görülebilir. Bu protokolde kullanılan yeniden programlama prosedürü, viral vektör tabanlı yöntemlerin neden olduğu enfeksiyon riski olmadan güvenli bir yeniden programlama avantajı sunar, hücresel savunma mekanizmalarını azaltır ve xeno-free iPSCs üretimine izin verir, tüm daha fazla klinik uygulamalar için zorunlu olan kritik özellikler.

Introduction

Hücre yeniden programlama iPSC1olarak bilinen bir pluripotent kök hücre, vücudun her somatik hücre dönüştürmek için yeni bir teknoloji temsil eder. Bir pluripotent ve farklılaşmamış devlet geri yetişkin bir somatik hücre yeniden programlama imkanı pluripotent hücrelerin kullanımı ile ilgili kötü durumu ve etik sorunlar tarafından dayatılan sınırları aşmak, daha önce sadece insan embriyolarından elde edilebilir (embriyonik kök hücreler veya ESC)2,3,4. 2006 yılında, Kazutoshi Takahashi ve Shinya Yamanaka yapay dört özel genler (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5ekleyerek pluripotent hücrelere deriden yetişkin somatik hücrelerin ilk dönüşüm elde öncü bir çalışma yürüttü . Bir yıl sonra, Thomson laboratuvarında yapılan çalışmalar dört gen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6farklı bir kombinasyonu transdüksiyon tarafından iPSCs içine somatik hücrelerin başarılı yeniden programlama yol açtı .

iPSC’ler, elde ettikleri hastanın özelliklerinin genotyolojik bir yansıması ile birlikte farklı hastalıkları incelemek ve tedavi etmek için mükemmel bir platform olan, rejeneratif tıp ve farmakoloji gibi farklı alanlardaki bilim adamları ve araştırmacılariçin bir dizi fırsat sunar. iPSCs kullanımı dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar: hücrelerin tamamen otolog kökenli nedeniyle bağışıklık yanıtı için azaltılmış risk; sürekli olarak kendini yenileyebildikleri ve farklı hücre tipleri üretebildikleri için, yeni ilaçlara ve yan etkilerine tepkiyi tahmin etmek için önemli bir araç olan hücre kitaplığı oluşturma olasılığı; ve ilaç yönetimi için özelleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmek için şans7,8,9.

Çeşitli teknikler şu anda, yeniden programlama faktörlerinin ifade ikna etmek için bilinen ve iki ana kategoride yer almaktadır: olmayan viral ve viral vektör tabanlı yöntemler10,11,12,13. Viral olmayan yöntemler mRNA transfeksiyon, miRNA enfeksiyon / transfeksiyon, PiggyBac, minicircle vektörler ve epizomal plazmidler ve ekzozomlar10,11,12,13içerir. Viral tabanlı yöntemler, Adenovirüs, Sendai virüs ve proteinler gibi entegre olmayan virüsler ve Retrovirus ve Lentivirus10,11,12,13gibi entegre virüsler içerir.

Çeşitli çalışmalara göre, hücre yeniden programlama etkinliği açısından bu yöntemler arasında önemli bir fark fark edilmiştir, dolayısıyla, uygun yöntemseçimi kesinlikle kullanılan hücre tipine bağlıdır ve alınan iPSCs sonraki uygulamalara bağlıdır14,15. Söz konusu tüm yöntemler dezavantajları göstermek, örneğin, Sendai virüs tüm hücre türleri üzerinde etkilidir, ancak iPSCs elde etmek için pasajlar bir sürü gerektirir; epizomlar tarafından yeniden programlama kan hücreleri için mükemmel ama fibroblastlar için standart kültür koşullarının değiştirilmesi gerekiyor; PiggyBac yöntemi çekici bir alternatif temsil edebilir ama insan hücrelerinde çalışmalar hala sınırlı ve zayıf10,11,12,13. Ekzozomlar fizyolojik olarak tüm vücut sıvılarına hücreler tarafından salgılanan nano-veziküllerdir. Son çalışmalara göre, hücreler arası iletişimden sorumludurlar ve hücre çoğalması, göç ve farklılaşma gibi önemli biyolojik süreçlerde rol oynarlar. Ekzozomlar, hücre zarının aynı bileşimini paylaştıkları için mRNA ve miRNA’yı tamamen doğal bir mekanizmaya sahip alıcı hücrelere taşıyabilir ve aktarabilirler16. Bu nedenle, ekzozomlar yeniden programlama için umut verici bir yeni nesil tekniktir, ancak somatik hücreleri içeriklerine göre yeniden programlama potansiyelleri hala araştırılmaktadır. Viral vektörtabanlı yöntemler, yeniden programlama genlerini alıcı hücrelere iletmek için değiştirilmiş virüsleri kullanır. Bu teknik, yeniden programlama yüksek verimliliğe rağmen, güvenli olarak kabul edilmez, hücre içinde virüsün entegrasyonu enfeksiyon sorumlu olabilir gibi, teratomlar ve genomik instabilite17.

IPSC kolonileri oluşturmak için aşağıdaki protokol Yamanaka ve Thompson’S yeniden programlama kokteyl birleştirir ve xeno-free koşullarda gerçekleştirmek için imkanı ile NM-RNA ve bağışıklık kaçırma faktörleri gerektiren bir yöntemin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntemin kullanımıarkasındaki mantığı yaymak için, bilimsel topluluk içinde, bir protokol iPSCs içine karın deriden yetişkin insan fibroblastlar hızlı, basit ve son derece etkili bir yeniden programlama sağlayan18.

Önerilen yöntemin güçlü yönleri, aslında, performans kolaylığı ve iPSCs elde etmek için gerekli kısa süre vardır. Ayrıca, yöntem hücresel savunma mekanizmaları ve viral vektörlerin kullanımını önler, ilgili konulardan sorumlu.

Standart protokole göre aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: (1) Konfluent fibroblastlar 48 saat boyunca %0.1 serum yerleştirilerek 4 8 no’lu paragrafta senkronize edilmiştir; (2) Kültür için hücresel yoğunluk ve reaktiflerin hacmi 6 kuyulu plaka yerine 24 kuyulu çok kuyulu bir plaka üzerinde kullanılmak üzere ayarlandı; (3) Yeniden programlama deneyi atmosferik (%21 O 2 ) veya hipoksik (%5 O2)koşullarına sahip birkuvöz yerine %5 CO2 kuluçka makinesi kullanılarak gerçekleştirildi.

Protocol

İnsan dokusundan alınan örnekler Helsinki Bildirgesi’ne göre üniversite hastanesi Federico II yönergelerine uyulurken toplanmıştır. Bu çalışmaya katılan tüm hastalara yazılı izin verildi. 1. Malzeme ve Kültür Medyasının Hazırlanması Temiz ve otoklav cerrahi makas büyük bir çift, ince forceps iki set, mikrodissecting makas iki çift, 1 L steril şişe, 500 mL steril şişe, ve 250 mL steril şişe. 100 mm plaka, 60 mm plaka, 35 mm plaka, tek kullanı…

Representative Results

Protokolün amacı, abdominal deriden izole edilen dermal fibroblastların nm-rna’lara dayalı entegre olmayan yeniden programlama yöntemi ile belirli faktörlerin ekspresyonunu tetiklemek tir. Bu amaca ulaşmak için, insan dermal fibroblastlar mide tuck cerrahisi geçiren hastaların deri örneklerinden izole edildi ve iPSCs Oct4 tanıtArak oluşturuldu, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 yeniden programlama faktörleri ve E3, K3, B18 bağışıklık kaçırma faktörleri ticari kullanıma hazır yeniden programlama kiti …

Discussion

iPSCs hızla rejeneratif tıp uygulamaları için en umut verici hücre adayı olarak ortaya çıkmaktadır ve hastalık modelleme ve ilaç testi için son derece yararlı bir araç olarak3,8. Burada sunulan protokol, herhangi bir özel ekipman veya yeniden programlama teknolojisi ile önceki deneyim gerektirmeyen basit ve verimli bir prosedür ile bir deri yumruk biyopsisi boyutuna sahip bir örnek insan iPSCs nesil açıklar.

Kaplama…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Materials

10 mL serological pipet Falcon 357551 Sterile, polystyrene
100 mm plates Falcon 351029 Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes Falcon 352097 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates Falcon 353935 Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet Falcon 357525 Sterile, polystyrene
35 mm plates Falcon 353001 Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet Falcon 357543 Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes Falcon 352098 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco 12491-015 Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Sigma- Aldrich D6429-500ml Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum Sigma- Aldrich F9665-500ml Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution Sigma- Aldrich H1387-1L Powder
L-glutamine Lonza BE17-605E Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent INVITROGEN 13778-030 Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel CORNING 354234 Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber VWR 631-1116 Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium Biological Industries 05-100-1A-500ml Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM Gibco 31985-062-100ml Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin Sigma- Aldrich P4333-100ml Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride Sigma- Aldrich P9333 Powder
Potassium Phosphate Monobasic Sigma- Aldrich P5665 Powder
RNase-free 0.5 mL tubes Eppendorf H0030124537 RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes Eppendorf H0030120086 RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP INVITROGEN AM9780 Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate Sigma- Aldrich S5761 Powder
Sodium Chloride Sigma- Aldrich S7653 Powder
Sodium Phosphate Dibasic Sigma- Aldrich 94046 Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit Reprocell 00-0076 Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA Sigma- Aldrich T4049-100ml Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles

References

  1. Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
  2. Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
  3. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  4. Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  7. Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
  10. Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
  11. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  12. Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
  13. Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
  14. Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
  15. Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
  16. Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
  17. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
  18. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  19. Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
  20. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  21. Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
  22. Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
  23. Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
  24. Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
  25. Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
  26. Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
  27. Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
  28. Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).

Play Video

Cite This Article
Belviso, I., Sacco, A. M., Romano, V., Schonauer, F., Nurzynska, D., Montagnani, S., Di Meglio, F., Castaldo, C. Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method. J. Vis. Exp. (155), e60629, doi:10.3791/60629 (2020).

View Video