Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bruk av kapillær elektroforese immunoassay å søke etter potensielle biomarkører av amyotrofisk lateral sklerose i menneskelige blodplater

Published: February 10, 2020 doi: 10.3791/60638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 3, 1
1Department of Basic Sciences, Kansas City University of Medicine and Biosciences, 2Rice University School of Medicine, 3University of Kansas Medical Center

Summary

Blodbaserte biomarkører for nevrodegenerative sykdommer er avgjørende for implementering av store kliniske studier. En pålitelig og validert blodprøve bør kreve et lite prøvevolum samt være en mindre invasiv prøvetakingsmetode, rimelig og reproduserbar. Dette papiret viser at høy gjennomstrømning kapillær elektroforese immunoassay tilfredsstiller kriterier for potensiell biomarkørutvikling.

Abstract

Kapillær elektroforese immunoassay (CEI), også kjent som kapillær vestlig teknologi, blir en metode for å screene sykdomsrelevante proteiner og legemidler i kliniske studier. Reproduserbarhet, følsomhet, lite prøvevolumbehov, multiplekseringsantistoffer for flere proteinmerking i samme prøve, automatisert høy gjennomstrømningsevne til å analysere opptil 24 individuelle prøver, og korttidskrav gjør CEI fordelaktig over den klassiske vestlige blot immunoassay. Det er noen begrensninger av denne metoden, for eksempel manglende evne til å bruke en gradient gel (4% -20%) matrise, høy bakgrunn med uraffinerte biologiske prøver og kommersiell utilgjengelighet av individuelle reagenser. Dette papiret beskriver en effektiv metode for å kjøre CEI i en flere analyseinnstilling, optimalisere proteinkonsentrasjon og primær antistofftitrering i en analyseplate, og gi brukervennlige maler for prøveforberedelse. Også beskrevet er metoder for måling av pan TDP-43 og fosforylert TDP-43 derivat i blodplatelysat cytosol som en del av initiativet i blodbasert biomarkørutvikling for nevrodegenerative sykdommer.

Introduction

Det overordnede målet med CEI som beskrevet her er å gi en oppdatert trinnvis protokoll for å analysere målproteiner i menneskelige blodplater. Tildeling av et blodbasert signaturmolekyl er en av de viktigste oppgavene innen biomarkørutvikling i humane nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD), Parkinsons sykdom (PD), inkluderingskroppsmyositt (IBM) og andre proteinaggregasjonsrelevante patologiske tilstander. Påvisning av små mengder slike signaturproteiner i store mengder blod med mange forstyrrende midler er en utfordring. Derfor er spesifisitet, følsomhet, evne til å håndtere et stort antall prøver, og reproduserbarhet av den valgte metoden avgjørende.

Menneskelige blodplater kan tjene som et miljø for å identifisere og tildele potensielle biomarkørproteiner for nevrodegenerativ sykdom. Blodplater gir mulighet til å tjene som en surrogat primær cellemodell, som gjenspeiler noen funksjoner i nevronale celler1,2,3. Det er visse funksjoner som gjør blodplater til et av de foretrukne måtene å analysere biomarkørkandidatproteiner og deres kjemiske derivater. Først kan blodplater enkelt kjøpes ved hjelp av en mindre invasiv tilnærming ved å samle blod fra donorer (dvs. venipunktur) eller i store volumer fra samfunnets blodbanker. For det andre kan blodplater enkelt isoleres fra hele blodet med minimalt forberedende arbeid i minimalt utstyrte laboratorier4,5. Tredje, blodplater har ikke kjerner; Derfor er de en god modellcelle for å studere endringer i metabolisme uten transkripsjonsregulering. For det fjerde er biomolekylinnholdet i blodplater innkapslet; Derfor beskytter blodplatemikromiljøet innholdet mot serumforstyrrende stoffer (dvs. proteaser). Femte, blodplateberiket plasma kan lagres ved romtemperatur i 7-8 dager uten å miste metabolsk aktivitet. Blodplater gir derfor en arbeidsmodell der eksterne faktorer minimeres og kontrolleres.

Tradisjonelle immunanalyseteknikker som immunblotting (f.eks. vestlig flekking) og enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) er mer utbredt i spesifikk proteinanalyse. Disse to metodene har imidlertid flere ulemper, inkludert flere analysetrinn, krav til farlige kjemikalier og reagenser, stor utvalgsstørrelse, problemer med analysereproduserbarhet og inter-run datavariabilities. Disse førte til utviklingen av en metode som er enklere med færre trinn og oppnåelig i en relativt kort periode. Selv om den klassiske vestlige blot teknikken vil forbli en populær laboratoriemetode, sin multi-trinns prosedyre, forsyninger, giftig avfall (dvs. akrylamid, metanol, etc.) og analysetid blir mindre ønskelig når du utfører høy gjennomstrømming kvantitative proteinanalyse.

En automatisert CEI tilnærming blir gradvis en metode for valg for laboratorier som utfører høy gjennomstrømning protein analyser6. CEI eliminerer behovet for geler, gelelektroforeseapparater, membraner, elektroforese og elektrooverføringsenheter, og mer fysisk håndteringsinvolvering. Hvis det er utformet godt, bør en CEI-analyse fullføres innen ca. 3,5 timer, inkludert kvantitativ dataanalyse, elektropherogrammet av publikasjonskvalitet og grafer med statistisk analyse. En annen overlegenhet av CEI-systemet er kravet om 10x-20x mindre proteinkonsentrasjon, noe som gjør den ideell for bruk i menneskelige prøver som brukes i kliniske studier7,8.

Den mest kritiske delen av CEI optimaliserer analyseforholdene for hvert antistoff kjøpt fra forskjellige leverandører, type antistoff (monoklonal vs. polyklonale), optimale proteinkonsentrasjoner, prøveforberedelse, prøvedenatureringstemperatur og elektroforesespenning påkapillærene. Vi har utviklet en optimaliseringsmetode for enkeltanalyseformat for CEI som bør implementeres før nye analyser, noe som vil spare tid og ressurser. Dette optimaliseringstrinnet etterfølges av en automatisert kvantitativ vurdering av både total og fosforylert derivat av transaktiveringsrespons DNA/RNA bindingsprotein (TARDP). På grunn av størrelsen (43 kDa) vil forkortelsen TDP-43 bli brukt i hele dette papiret. Her vurderes TDP-43-protein i humant blodplatelysat hentet fra ALS-pasienter for å bidra til å utvikle prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) som en potensiell prognostisk biomarkør.

TDP-43 er en ny potensiell sykdom biomarkør kandidat for ALS. TDP-43 er et allestedsnærværende protein i alle kjerneceller; Derfor har funksjonene til TDP-43 under ulike normale cellulære hendelser og nevrodegenerativ sykdom blitt undersøkt9,10,11,12,13,14. Selv om TDP-43 er et kjernefysisk protein15, har det evnen til å shuttle inn og ut mellom kjernen og cytoplasma på grunn av tilstedeværelsen av kjernefysisk lokalisering og kjernefysisk eksport sekvenser16,17,18,19. Cytoplasmatisk TDP-43 er involvert i ulike cellulære hendelser, som mRNA stabilitet og transport, stressrespons, mitokondriefunksjon, autophagosome20. Imidlertid er ikke mye kjent om rollen fosforylerte derivater av TDP-43 annet enn deres engasjement i patogenesen av nevrodegenerativ sykdom21.

Denne protokollen illustrerer hvordan du optimaliserer analyseforholdene for å analysere innholdet i TDP-43 og dets fosforylerte derivat i blodplater ved hjelp av CEI-tilnærmingen. Siden fosforylert TDP-43 ikke er kommersielt tilgjengelig, foreslås det å bruke en prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) for å vurdere TDP-43-profiler hos ALS-pasienter. Dette CEI-systemet benytter et lite volum av prøveblanding (2,5–3,0 μL per kapillær). Totalt analysevolumoppsett er 8,0 μL per kapillær basert på produsentens protokoll; derfor kan forskere bruke en prøveblandingsforberedelse for to separate løp. Produsenten designet analyseprotokollen slik at eventuelle pipetteringsfeil minimeres, om ikke helt eliminert. De 24 individuelle humane blodplatelysatprøveblandingene er delt inn i halvvolumer (dvs. 2,5–3,0 μL per prøve) og analyserte de etter følgende de med to forskjellige antistoffer innen ~7 timer. CEI-systemet som er beskrevet her, gir en ønskelig analysemodalitet med høy gjennomstrømning. Brukere må teste antistoffer fra forskjellige leverandører og prøveforberedelsesmodaliteter for målproteinet før de utfører storskala screening.

Protocol

Alle protokoller om behandling av menneskelige blodplater følger retningslinjene til både University of Kansas Medical Center og Kansas City University of Medicine and Biosciences IRB-komiteer.

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser

MERK: Klargjør alle eksempler i henhold til produsentens retningslinjer. Bruk personlig verneutstyr (laboratoriekåper, hansker og vernebriller) under denne prosedyren.

  1. Klargjør citrate vask buffer ved å kombinere 0,941 g sukrose (11 mM endelig konsentrasjon), 6,4 ml 5 M NaCl (128 mM final), 5,4 ml 0,2 M NaH2PO4 (4,3 m M-finale), 9,4 ml 0,2 M Na2PHO4 (7,5 mM-finale), 0,352 g natriumsitrat (4,8 mM-finale) og 0,115 g sitronsyre (2,4 mM-finale). Juster det totale volumet til 250 ml med ddH2O. Filtrer gjennom en 0,45 μm filterdisk og juster pH til 6,5. Oppbevares opptil 1 år ved 4 °C. Ta med løsningsromtemperaturen (RT) før bruk22.
  2. Forbered bruddbufferen ved å kombinere 250 mM sukrose, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-Cl (pH 7.4) i et 100 ml endelig volum. Oppbevares opptil 1 år ved 4 °C. Tilsett 2 μL fosfatasehemmere cocktail (1:1000 endelig) og 1 μL proteasehemmere cocktail (1:2000 endelig) i 2 ml bruddbuffer. Hold på is til bruk. Kast den ubrukte bruddbufferen.

2. Isolasjon av blodplater

  1. Samle 8-10 ml humant blod i gul-cap blodsamlingrør som inneholder syre-citrat-dextrose (ACD) oppløsning (75 mM trinatriumsitrat, 124 mM dextrose, og 38 mM sitronsyre, pH = 7,4; ACD:blod = 1:9). Bland rørinnholdet forsiktig 5x–6x invertere for hånd.
  2. Sentrifuge rørene på 200 x g i en svingende bøtte rotor for 20 min på RT.
  3. Samle blodplaterikt plasma (PRP) (~3–4 ml) i et 15 ml konisk bunnrør og la ca. 0,5 ml PRP stå fra den buffy-kåringen (uklar fraksjon) for å unngå forurensning. Hvis det oppstår kontaminering av røde blodlegemer, gjentar du dette trinnet.
  4. Sentrifuge PRP-prøvene på 1200 x g i 15 min ved RT.
  5. Vask blodplatepellets (P1) ved skånsom resuspensjon i 1 ml sitratvaskebuffer og pellet ved sentrifugering ved 1200 x g i 15 min ved RT.
  6. Lagre den rene blodplatepelleten. Kast supernatanten.
  7. Resuspender blodplatepellets i 600 μL av bruddbufferen som inneholder inhibitorcocktailer.
  8. Soniker blodplatesuspensjonen ved hjelp av en sonikator. Plasser prøven i en mini isbøtte. Sett sonikatoren ved innstilling 3 for 20 s i kontinuerlig modus.
    MERK: Sørg for å rengjøre sonden med 10% blekemiddel etterfulgt av destillert vann.
  9. Sentrifuge de sonikerte prøvene ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C for å fjerne membranøse fraksjoner. Aliquot supernatants i 60 μL og lagre ved -80 °C. Unngå gjentatte tining/frysesykluser for blodplatecytosolic fraksjoner.

3. Forberedelse til CEI

MERK: 100 μL humant blodplatelysat ble kombinert fra ALS-pasienter (n = 8–10), og friske forsøkspersoner (n = 8–10) ble separat samlet og brukt til analyseoptimalisering.

  1. Fyll ut interne genererte maler for CEI-oppsettet (tabell 1) og prøveforberedelse (tabell 2). Tilberedningstabellen for prøveblanding er dynamisk og beregner automatisk hvor mye volum som må fjernes fra kilden.
    MERK: Når nødvendig kildevolum som er angitt i dynamisk tabell-2, beregnes automatisk 0,1 X eksempelbuffervolum.
  2. Pre-label 25 0,2 ml PCR rør med kapillærer #1-#25 og plassere dem i en PCR rack. Sett på is.
  3. Pre-label 0,6 ml mikrocentrifugerør: en for hvert primære antistoff og fortynning (om nødvendig) som skal brukes, en for 0,1x prøvebufferen, en for luminol-S/peroksid, og en for hver prøve som skal fortynnes (om nødvendig). Plasser dem på is i rørstativet.
  4. Ta ut prøvebufferen, vaskebufferen, én plate og en patron som følger med i CEI-separasjonsmodulen 12–230 kDa master kit.
  5. Fra kjøleskapet på 4 °C tar du ut antistofffortynningsbufferen, primære antistoffer, sekundære antistoffer, luminol, hydrogenperoksid og standardpakning. Plasser alle reagenser på is, unntatt standardpakken, som forblir på RT.
    MERK: Reagensene fra standardpakkene er lyofiliserte og forseglet med et foliedeksel. Disse bør snurres ned kort ved hjelp av en mini sentrifuge før åpning for å redusere produkttap. For å åpne, reagensrørene kan enten bli gjennomboret av en pipettespiss eller trukket tilbake fra hjørnet.
  6. For å forberede 400 mM DTT, tilsett 40 μL avdeionisert vann til det klare røret som inneholder DTT.
  7. For å forberede 40 μL fluorescerende 5x mastermix, tilsett 20 μL av 10x prøvebufferen og 20 μL av den tilberedte 400 mM DTT-oppløsningen til det rosa røret som følger med i settet.
  8. For å forberede den biotinylated stigen, tilsett 16 μL avdeionisert vann, 2 μL 10x prøvebuffer og 2 μL av den tilberedte 400 mM DTT-oppløsningen til det hvite røret som følger med i settet. Bland forsiktig og overfør til et 0,2 ml PCR-rør for denaturering.
  9. Forbered 0,1 x prøvebuffer ved å tilsette 1,5 μL 10x prøvebuffer og 148,5 μL deionisert vann til et 0,6 ml mikrosentrifugerør. Vortex å blande og plassere på is.
  10. Forbered de ønskede antistofffortynningene. Tilsett antistofffortynningsvæske i volumer som er utpekt til hvert forhåndsmerkede mikrosentrifugerør. Hvis volumene er identiske, bruk omvendt pipetteringsteknikk23; Hvis ikke, må pipettspissen før du dispenseres.
    MERK: I denne analysen ble det brukt a-TDP-43 pan antistoff og a-p(S409/410-2) TDP-43 antistoff. Antistoffet mot ERK ble brukt til internkontroll for å sikre at analysekomponenter fungerer.
  11. Utfør reversrørfortynningen for antistofffortynning som beskrevet nedenfor. Du finner også mer informasjon i litteraturen24.
    MERK: Omvendt pipetteringsteknikk foretrekkes ved dispensering av små sekvensielle mengder løsninger23. Denne teknikken gir noen fordeler: (i) gir et nøyaktig volum, (ii) eliminere reagensskummende i spissen åpningen, og (iii) ideell for lite volum (<5 μL) reagenser, viskøse løsninger, overflateaktive løsninger og løsninger med høyt damptrykk.
    1. Sett en riktig spiss i en pipette og trykk stempelet ned til andre stopp (trinn-2). Dypp rørspissen noen få millimeter inn i oppløsningen. Slipp stempelet langsomt for å fylle opp rørspissen med oppløsningen mens spissen fortsatt er nedsenket i oppløsningen. Fjern spissen fra oppløsningen og berør forsiktig mot kanten av reagensbeholderen slik at overflødig væske som er igjen på utsiden av spissen, fjernes.
    2. Før oppløsningen ved å trykke stempelet ned til første stopp (trinn-1). Ikke utfør den gjenværende løsningen i spissen.
    3. Tøm den gjenværende oppløsningen i spissen til reagensreservoaret ved å trykke stempelet til det andre stoppet (trinn-2). Slipp stempelet til klarposisjon for neste pipetteringstrinn.
    4. Tilsett det nødvendige antistoffet i volumer som er angitt i hvert forhåndsmerkede mikrocentrifugerør (tabell 1) Ikke skyll rørspissen før: Tilsett det direkte til fortynningsmiddelet og skyll spissen flere ganger for å fjerne antistoffet. Plasser rørene på is.
  12. For å forberede CEI-eksempelblandingen, utfør trinnene nedenfor for PCR-rør merket cap#2 til cap#25: Dette er i samme rekkefølge som det vises i tabell 1.
    1. Åpne alle rør, tilsett 1,6 μL aliquots av fluorescerende 5x prøvebuffer til hvert rør ved hjelp av en omvendt pipetteringsteknikk, og lukk deretter hvert PCR-rør ved tilsetning av 5x-bufferen for å minimere prøvetap.
    2. Åpne alle rør, legg til 0,1 x prøvebuffer i volumer som er angitt i tabell 2 til hvert rør, og lukk deretter umiddelbart etterpå. Hvis volumene er identiske, bruk en omvendt pipetteringsteknikk. Hvis ikke, forhåndsskyllrørspissen før du dispenserer 0,1x prøvebuffer.
    3. Åpne alle rør, legg til proteinprøve i volumer som er angitt i tabell 2 til hvert rør, og lukk deretter umiddelbart etterpå. Hvis volumene er identiske, bruk omvendt pipetteringsteknikk. Hvis ikke, forhåndsskyllrørspissen før du dispenserer 0,1x prøvebuffer.
    4. Kort sentrifuge alle PCR rør i en benkeplate sentrifuge (13.000 x g for 30 s), flick / vortex PCR rør å blande, deretter gjenta sentrifugering.
    5. Overfør alle PCR-rør til termocycler med oppvarmet lokk. Denature prøver ved definert temperatur og varighet (dvs. 95 °C for 5 min; 70 °C for 10 min).
      MERK: Denatureation temperatur og varighet må optimaliseres for målprotein.
    6. Gjenta trinn 3.12.4.
    7. Returner alle PCR-rør til rørstativet og plasser på is.
    8. Under denaturering trinnet, forberede utviklingsløsningen (1:1 luminol-S:peroxide løsning), deretter legge til 200 μL luminol-S og 200 μL peroksid. Plasser på is.
    9. Hvis du vil laste en CEI ferdigfylt plate med prøven utarbeidet ovenfor, dispenserer du reagenser og prøver i analyseplaten som vises i analyseoppsettet (figur 1). Unngå å introdusere luftbobler.
      MERK: Hvis volumer og oppløsning er identiske, bruk en omvendt pipetteringsteknikk. Hvis ikke, skyll rørspissen før du dispenserer og ikke utfør resten i platebrønnen ved hjelp av det andre tabulatorstoppet på pipetten. En 12–230 kDa-separasjonsmodul kan inneholde en fargekodet plateinnlastingsveiledning. Plasser denne veiledningen under platen mens du legger til reagenser og prøver til brønnen, noe som visuelt hjelper når prøvelasting lastes inn. Plate-lasting guide kan lastes ned fra selskapets hjemmeside, også.
      1. I rad E tilsett 15 μL luminol:peroxide mix til hver brønn.
        MERK: Ideelt sett forberede denne reagensen like før bruk og legg til hver brønn. Hvis dette ikke er praktisk, kan denne blandingen tilberedes ikke mer enn 30 min før platelasting.
      2. I rad D, til godt D1, tilsett 10 μL streptavidin-HRP.
      3. I rad D, til brønner D2–D25, tilsett 10 μL av utpekt sekundærantistoff.
      4. I rad B, til hver brønn, tilsett 10 μL antistofffortynningsvæske.
      5. I rad C, til godt C1, tilsett 10 μL antistofffortynningsvæske.
      6. I rad C, til brønner C2–C25, tilsett 10 μL av utpekt primær antistoff.
      7. I rad A, til godt A1, tilsett 5 μL biotinylated stige fra PCR tube #1.
      8. I rad A, til brønner A2-A25, tilsett 3 μL av prøven, PCR-rør #2-#25 i tilsvarende brønner #2-#25.
      9. Tilsett 500 μL vaskebuffer til hver utpekte vaskebufferbrønn.
      10. Sentrifuge platen i 5 min ved 1000 x g ved RT.

Figure 1
Figur 1: Analyseoppsett. Både primære antistoff og målprotein prøveoptimalisering kan utføres i en analyse. Kapillærer 2–7, 8–13, 14–19 og 20–24 representerer ulike proteinkonsentrasjoner og primære antistoffområde. Kapillær 25 representerer positiv kontroll. Antistoffet antistoffmot ERK ble brukt; Imidlertid kan enhver passende positiv kontroll inkluderes. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

4. Utføre CEI på plate 1

  1. Slå først på CEI -Analyseavisatoren ( Materialtabell),og slå deretter på datamaskinen. Åpne programvaren (Materialtabell)
  2. Koble analysatoren til det elektroniske systemet (Materialtabell). Dette er et nødvendig skritt for å samle inn kjøredata for problemer med å skyte formål og datagjenoppretting.
  3. Klikk på Instrument fra menyen øverst til venstre, og klikk deretter på Koble til. Velg instrumentserienummeret som vises som en lokalmeny. Klikk på Koble til.
  4. Velg kategorien"Analyse"og velg Ny analyse eller velg en lagret mal.
  5. Parametere for inndataanalyse (tabell 1) eller endre mal for øyeblikket. Lagre filnavnet og plasseringen.
  6. Kontroller at den blinkende blå fargeindikatoren i analysatoren forblir heldekkende blå.
  7. Trykk på sølvmetallknappen på toppen av den oransje døren for å åpne.
  8. Fjern kapillærkassetten forsiktig fra emballasjen. Sett inn kapillærkassetten som beskrevet i produsentens protokoll. Hvis det er riktig installert, blir innsiden lyset til "blå".
  9. Fjern beskyttelsesforseglingen fra analyseplaten. Følg de ferdigfylte brønnene visuelt for luftbobler. Hvis observert, pop dem med en liten pipt tips (Langaksel P10 rørspissen fungerer bra).
  10. Legg plateholderen ved å plassere analyseplaten og lukk døren. Klikk på Start-knappen i datamaskinen.
    1. Plasser isbrett som inneholder temperaturfølsomme reagenser og prøver i mørket ved 4 °C til den er klar til å klargjøre andre ferdigfylte plate.
    2. La reagenser/forsyninger stå ute ved romtemperatur for den andre platen.

5. Utføre CEI på plate 2

MERK: Denne platen er satt for å analysere fosforylerte TDP-43 nivåer.

  1. Fjern isbrettet som oppbevares ved 4 °C og legg det på benken, 1 time før estimert fullføringstid for den første platen. Hent en annen plate og patron.
  2. Forbered eventuelle antistofffortynninger som trengs for andre løp og lagre dem på is. Forbered frisk 1:1 luminol-S:peroxide løsning (trinn 3.12.8 ovenfor).
  3. Remiks og re-sentrifuge prøveblandingen og reagensene som trengs for å laste den ferdigfylte platen. Legg den andre platen i henhold til figur 1. Legg a-p(S409-410-2) TDP-43 antistoffoppløsning i rad C brønner.
  4. Når det første løpet er fullført, kast den første platen og sylinderampullen. Ta ut patronen og plasser i en skarp beholder for avhending. Hold klistremerkene fra platen og patronen for referanseformål.
  5. Lukk programvarefilen, og velg den samme malen på nytt. Programvaren vil huske innstillingene fra forrige kjøring. Gjør eventuelle endringer i merknaden etter behov (dvs. endre det primære antistoffet).
  6. Gjenta trinn 4,8–4,10. Sett bort alle 12–230 kDa master kit separasjonsmodul reagenser og forsyninger
  7. Kast til venstre over CEI prøve-mix, antistoff fortynninger, 0,1x prøvebuffer og luminol-S:peroxide blandinger i samsvar med universitetsforskrifter.

6. Dataanalyse

  1. Når kjøringen er fullført, må du kontrollere at følgende kvalitetskontroller utføres.
    1. I programvare velger du kategorien Vis standarder og grafvisning. Korriger feiljusteringene ved å velge Force Standard eller høyreklikke på feil topp og deretter velge Ikke en standard. Utfør denne sjekken for hver nye kapillær.
    2. Klikk på Eksempler og Single View-ikonet. Velg kapillær #1 (biotinylated stige) i eksperimentfanen. Klikk på toppen i Grafvisning og velg Fjern topp, hvis et feil valg av toppen er gjort av programvaren.
      MERK: Som et eksempel vil den 12–230 KDa biotinylated stigen vise størrelsestopper på 12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa og 230 kDa. Størrelsen på prøvetoppene vil være feil hvis dette trinnet ikke utføres og genererer unøyaktige resultater.
    3. Vis elektroforetisk film og legg merke til om noen unormal migrering oppstod under kjøringen.
    4. Utlede data (f.eks. topper tabell, inkludert molekylvekt, toppområde, topphøyde og signal-til-støy [S/N]) etter behov for ytterligere beregninger. Det finnes grafmerknadsverktøy øverst til høyre i Graph-vinduet for å gi mer informasjon om grafen.

Representative Results

Optimalisering av blodplatecytosolic protein konsentrasjon og primære antistoff titrering
Det er viktig å etablere et lineært dynamisk utvalg av blodplatecytosolic proteiner i analysen, siden endringer i signalet er direkte proporsjonal med endringer i protein i blodplatecytosol. Bruk av hele blodplatelysatblandingen i analysen kan redusere signalintensiteten til målproteinene (TDP-43 og P(S409-412) TDP-43) og bidra til et høyt bakgrunnssignal. Derfor, i denne analysen, ble den klare supernatant brukt (cytosolic fraksjon) etter rupturing blodplater (Figur 2).

Figure 2
Figur 2: Signalklarhet avhenger av prøvekvaliteten. (A) Hele blodplatelysat homogenat forstyrrer anti-TDP-43 antistoffbinding; Derfor ble det observert et støyende elektropherogram. (B) Blodplate cytosolic fraksjon ble hentet fra å utsette hele lysattil sentrifugering (16.000 x g i 30 min). De fleste membranøse proteiner ble fjernet; Derfor ble anti-TDP-43 antistoffbinding til TDP-43-protein forbedret (blå linjespor). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Et lineært dynamisk område for blodplatecytosolproteinkonsentrasjon ble etablert ved 0,2–0,8 mg/ml. En analysemal ble vedtatt slik at både proteinkonsentrasjon og primær antistofftitrering kunne utføres i en analyse (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Lineærdynamisk område for blodplatecytosolproteinkonsentrasjon. (A) Både proteinkonsentrasjoner og antistofftitreringer ble optimalisert i en plate i samme løp. (B) Det lineære arbeidsområdet (0,2–0,8 mg/ml) for protein ble etablert. En 0,5 mg/ml proteinbelastning ble merket med a-ERK antistoff som positiv kontroll (kapillær 25). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Det bør bemerkes at glyserolinnhold i prøvepreparatrøret skal være mindre enn 20% (endelig), ellers vil den høye glycerolkonsentrasjonen påvirke den primære antistoffbindingen negativt.

Bestemme optimal eksponeringstid
I den eldre versjonen av programvaren måtte den optimale eksponeringstiden bestemmes ved å plotte toppområdet mot proteinkonsentrasjon (mg/ml). Den nye versjonen gir et nytt verktøy kalt high dynamic range (HDR) deteksjonsprofil(Figur 4). Ved hjelp av bildepanelet gitt muligheten til å vise alle eksponeringstider (dvs. 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) sammen. Dataprogramvare analyserte alle eksponeringstider og identifiserte automatisk den beste eksponeringstiden (HDR). HDR-deteksjonsprofil leverte et betydelig bredere dynamisk område på grunn av den større følsomheten til CEI, noe som betyr bedre deteksjon og kvantitet over et større utvalgskonsentrasjonsområde. Brukere har imidlertid fortsatt muligheten til å velge hvilken som helst eksponeringstid som tilfredsstiller det eksperimentelle målet. Ved hjelp av denne funksjonen ble optimal eksponeringstid funnet for TDP-43-protein. Toppen representerer optimal eksponeringstid (figur 4A). En enkelt eksponeringstid (4 s) ble definert for dette antistoffet etter å ha gjennomgått alle ni eksponeringstider mellom 1–512 s (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: Hdr-gjenkjenningsprofil (High dynamic range) for et målprotein. (A) TDP-43 protein topp representerer optimal eksponeringstid for målet protein. a-TDP-43 Ab titrering var 1:300, og blodplate cytosol proteinkonsentrasjon var 0,5 mg/ml. Den programvaredefinerte blå linjen indikerer optimal eksponeringstid. (B) Dette tallet representerer en brukerdefinert enkelt eksponeringstid (4 s) etter gjennomgang av alle ni eksponeringstider mellom 1-512 s. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

TDP-43 nivåer i humant blodplatecytosol hos ALS-pasienter
En biomarkørutvikling for blodbase ble utført. Ved hjelp av optimaliserte analysetilstander ble blodplatelysatcytosolic fraksjoner hentet fra ALS-pasienter analysert ved hjelp av to sett med antistoffer (dvs. anti-TDP-43 [Pan] antistoff, et antistoff som gjenkjenner fosforerte derivater av TDP-43 protein; her ble a-P [S409/410-2] TDP-43 brukt). I denne demonstrasjonen presenteres sykdomsspesifikke TDP-43 og dets fosforerte derivat (figur 5).

Figure 5
Figur 5: En representasjon av prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) av TDP-43. Absolutt mengde fosforylert TDP-43 og pan TDP-43 alene viste ikke mye forskjell mellom ALS og kontrollgrupper. PPV indikerte imidlertid en liten økning i ALS-kohorten, selv om det ikke var noen statistisk forskjell mellom de to gruppene på grunn av utilstrekkelig antall forsøkspersoner (ALS = 25, kontroll = 27). En lav Cohens d-verdi mellom als og kontrollgruppe viste en lav effektstørrelse mellom de to gruppene på grunn av liten utvalgsstørrelse (kontroll = 25, ALS = 27). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Totalt Ble Kvantifisert ved hjelp av kalibreringskurven (figur 6)

Figure 6
Figur 6: Standard kalibreringskurve. Kommersielt kjøpte rekombinant TDP-43 proteinkonsentrasjoner ble brukt til å konstruere en standard kurve. Hver data representerer gjennomsnittet av triplicates. Proteinbåndintensitetene var konsentrasjonsavhengige (Innfelt). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Kvantifiseringen av fosforylert TDP-43-protein var ikke mulig på grunn av kommersielt utilgjengelighet av dette proteinet. I stedet ble det etablert en spådd fosforyleringsverdi (PPV) som definerer prosentandelen av fosforylerte arter av TDP-43. PPV ble bestemt fra to sekvensielle CEI-analyser for samme prøve ved hjelp av følgende ligning.

Equation 1

Intra- og inter-run analysevariabilitet ble testet i samlede humane ALS blodplate cytosolic fraksjoner (Figur 7)

Figure 7
Figur 7: Analysevariasjoner. (A) To kapillærer lastet med samme prøve ble analysert av CEI, og intra-run analyse variasjon ble beregnet som CV% = 14,9. (B) Den samme prøven ble analysert på tre forskjellige analysedager og i tre forskjellige analysekjøringer. Inter-run analyse variasjon ble beregnet som CV% = 18,7. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Selv om intra-run (kapillær-til-kapillær variasjon) koeffisient variasjon verdier falt i akseptabelt område (CV% = 14,9), inter-run analyseverdien var relativt høy (CV% = 18,7). Det tolkes at denne variasjonen kan skyldes bruk av kapillære patroner og prøveplater fra forskjellige tomter. Det anbefales at reproduserbarhetsstudier bør utføres i CEI-komponenter som har samme partinummer.

Tabell 1: CEI analyseplate innlasting smal. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Interaktiv prøveblandingsforberedelsesmal. Etter å ha kommet inn i lagerproteinkonsentrasjonen fra ukjente prøver, vil interaktive celler automatisk beregne hvor mye volum som må brukes til å forberede prøveblandingen. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Kapillær elektroforetisk-basert immunoassay er nå metoden for valg for høy gjennomstrømning prøveanalyse og narkotika screenings25. Små utvalgsvolumer, godt optimaliserte analysekomponenter, brukervennlig analyseplattform og instrumentering, reagensutgifter og lav CV-prosent er primære fordeler26,27. Selv om det finnes flere metoder for å skille proteiner i forskjellige analysemodaliteter, kan antistoffbaserte CEI beskrevet her tilpasses av små laboratorier som er engasjert i blodbasert biomarkørutvikling. CEI analyseteknologi som brukes her gir pålitelige, reproduserbare og følsomme målinger for TDP-4328 og dets fosforerte derivat5.

CEI-systemet gir også et multipleksingsvalg for å analysere TDP-43 og dets fosforylerte derivater samtidig og gi direkte kvantifisering av målproteinet, hvis renset eller rekombinant målprotein er tilgjengelig. Full lengde rekombinant TDP-43 protein er kommersielt tilgjengelig; Rekombinant fosforylert TDP-43 derivat er imidlertid ikke. Siden fosforylert TDP-43 ikke er kommersielt tilgjengelig, ble en prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) implementert for å vurdere TDP-43-profil hos ALS-pasienter. Pan TDP-43 og fosforerte TDP-43 beløp ble permanent merket med en fluorophore; Derfor forblir TDP-43-profilen den samme med eller uten en kvantitativ enhet (dvs. ng/ml, pg/ml osv.). Selv om det å bestemme den absolutte mengden TDP-43 og dets fosforerte derivater (dvs. P [S409-410-12] TDP-43) gir en mer kvantitativ måling, eliminerer beregning av PPV nødvendigheten av den rekombinante fosforylerte TDP-43 for standardisering, siden det ikke er kommersielt tilgjengelig.

CEI gir flere kontrollpunkter i analyseplattformen for å nøyaktig identifisere problemet i tilfelle en analyse mislykkes. Dette eliminerer hindringer og gir bedre eksperimentell design. Analyseprosedyren er helautomatisk, bortsett fra å fylle prøveplaten. Dette er en betydelig funksjon sammenlignet med standard western blotting analyse. Denne funksjonen gir konsistens fra kjøring til kjøring. Selv om hvert laboratorium har unike standard driftsprosedyrer, er det viktig å følge praksis som minimerer menneskelige feil. For eksempel er det viktig å forberede luminol-S/ peroxide blandingen like før platelasting, siden å legge peroksid i luminol starter enzymatisk reaksjon og forbruker luminol substrat. Lasting av prøver og primære/sekundære antistoffer i platebrønner uten luftbobler er også kritisk viktige skritt.

I tillegg, siden platebrønnene er små i volum og det ikke er plass mellom brønner, bør brukerne være forsiktige mens de pipetterer, noe som er det viktigste trinnet siden alt annet er automatisert. Innlastingsrekkefølgen for prøvene, antistoffene og andre reagenser er viktig for konsistensen av analysen (figur 1). Prosessen med plateforberedelse tar ca 40–45 min. Derfor anbefales det å først laste platen med de nødvendige analysekomponentene og forberede luminol-S/peroxideblandingen like før pipettering. På denne måten er det en konsekvent sekvens av reagens tilsetning, og konsekvent luminescence signalstyrke vil bli oppnådd. Det anbefales ikke å bruke en utløpt luminol-S/peroxide reagens, da det primært påvirker styrken av peroksid. Nylig fremgang i innføringen av split-buffersystemet og inkludert kompatibilitetsområdet for kjemiske og vaskemidler har forbedret analysekvaliteten og produsert mer reproduserbare og forutsigbare resultater. Nå har en ny combo-analysator fra samme produsent en funksjon for å analysere prøvene merket med chemiluminescence og fluorescens konjugerte antistoffer i samme løp. Denne nye funksjonen eliminerer behovet for å kjøre to individuelle plater og eliminerer run-to-run variasjon.

Analyseplatene skal oppbevares i omgivelsestemperatur. Hvis det er valgt å holde analyseplatene i et 4 °C kjøleskap, må platene tas ut natten før analysen og bringes til omgivelsestemperatur. Feil belastede prøvebrønner må vaskes grundig (4–5 ganger) med buffer som følger med i settet før de legger til riktig prøve. Hvert primære antistoff og biologiske prøver er unike; Derfor bør antistoff-/proteinoptimaliseringen utføres før du analyserer prøvene for målproteiner i biologiske væsker.

Her ble den primære antistoffinkubasjonstiden satt til 30 min som standard. Hvis signalet er svakt, bør brukerne vurdere å øke den primære antistoffinkubasjonstiden til de når ønsket signalstyrke uten fluorescenssignalutbrenthet. For humane blodplater ble samlede prøver fra pasienter forberedt og brukt til optimaliseringsanalyse. Utvalget pooling bedre representerer variasjonen blant mål biomolekyler. Det anbefales å bruke klare supernatants i stedet for totalt lysat eller total homogenat for CEI.

Den høye konsentrasjonen av protein i hele blodplatelysatblandingen kan redusere signal-til-støy-forholdet (figur 2). Gjentatte fryse-tine sykluser av prøver bør unngås, da dette påvirker primære antistoffbindingen negativt. Ingrediensene i lysatbufferen er viktige, da noen reagenser ikke er kompatible med CEI29. Det anbefales å krysssjekke listen over kompatible reagenser som tilbys på produsentens hjemmeside før prøveforberedelse. Dette er en begrensning av systemet som ikke tolererer høye stringency forhold for prøveforberedelse. Det anbefales å optimalisere analysen kjøre parametere (dvs. primære antistoff fortynning, proteinkonsentrasjon, primære antistoff inkubasjonstid, etc.) ved hjelp av samlede prøver for senere å analysere de enkelte prøvene.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse unntatt ProteinSimple, Inc. dekket publiseringskostnaden for dette manuskriptet.

Acknowledgments

Denne forskningen ble sponset av et intramural stipend tildelt for A.A. Dette arbeidet ble støttet av et CTSA-stipend fra NCATS tildelt University of Kansas Medical Center for Frontiers: The Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til NIH eller NCATS. Vi er takknemlige for University of Kansas Medical Center ALS klinikk personlig for å få IRB godkjenning for blodprøve samling fra sunn frivillig og ALS pasienter. Forfatterne takker Emre Agbas for korrekturlesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
  2. Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
  3. Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
  4. Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  5. Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease. Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).
  6. Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
  7. Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
  8. Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
  9. Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780 (2012).
  10. Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
  11. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
  12. Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
  13. Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
  14. Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
  15. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  16. Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
  17. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
  18. Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, Pt 22 3778-3785 (2008).
  19. Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
  20. Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
  21. Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
  22. Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).
  23. Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
  24. Pipetting tool box for life sciences. , https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019).
  25. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).
  26. Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
  27. Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
  28. Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
  29. Compatibility, S.W.S.A.B. , https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 156 TDP-43 fosforylert TDP-43 kapillær elektroforese humant blodplate nevrodegenerative sykdommer biomarkør prediktiv fosforyleringsverdi analyseoptimalisering
Bruk av kapillær elektroforese immunoassay å søke etter potensielle biomarkører av amyotrofisk lateral sklerose i menneskelige blodplater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A.,… More

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter