Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نظام ثقافة الرئة المتعددة الأبعاد لنموذج سرطان الرئة الحرشفية

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60644
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

Summary

تم تطوير نظام نموذج في المختبر لالتقاط التغيرات المعمارية الأنسجة أثناء سرطان الرئة الحرشفية (LUSC) التقدم في ثقافة 3-الأبعاد (3D) المشتركة مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). يوفر هذا النظام العضوي منصة فريدة من نوعها للتحقيق في أدوار التغيرات المتنوعة الجوهرية للخلايا السرطانية والخارجية التي تعدل النمط الظاهري للورم.

Abstract

تلعب تفاعلات الورم وستروما دورًا حاسمًا في تطور سرطان الرئة الحرشفي (LUSC). ومع ذلك ، فإن فهم كيفية مساهمة هذه التفاعلات الديناميكية في التغيرات المعمارية للأنسجة التي لوحظت أثناء تكوين الورم لا يزال صعبًا بسبب عدم وجود نماذج مناسبة. في هذا البروتوكول، نصف إنشاء نموذج ثقافة مشاركة ثلاثية الأبعاد باستخدام ثقافة الخلية الأساسية LUSC المعروفة باسم TUM622. تم إنشاء خلايا TUM622 من xenograft المشتقة من المريض LUSC (PDX) ولها خاصية فريدة من نوعها لتشكيل هياكل تشبه acinar عندما بذرت في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. نحن نثبت أن TUM622 acini في الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد لخص السمات الرئيسية لهندسة الأنسجة أثناء تقدم LUSC بالإضافة إلى التفاعلات الديناميكية بين خلايا LUSC ومكونات البيئة الدقيقة للورم (TME) ، بما في ذلك خارج الخلية مصفوفة (ECM) والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). كما نقوم بتكييف بروتوكول نا الرئيسي 3D زراعة بيان كيف يمكن استخدام هذا النظام لمختلف التحليلات المصب. وعموما، يخلق هذا النموذج الأورغياني منصة غنية بيولوجيا وقابلة للتكيف تمكن المرء من الحصول على نظرة ثاقبة في الآليات الجوهرية للخلايا والخارجية التي تعزز تعطيل العمارات الظهارية أثناء تطور السرطان وسيساعد البحث عن أهداف علاجية جديدة وعلامات تشخيصية.

Introduction

سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. سرطان الخلايا الحرشفية الرئة (LUSC) ، وهو ثاني أكثر أنواع سرطان الرئة غير الخلايا الصغيرة (NSCLC) ويمثل حوالي 30٪ من جميع سرطان الرئة ، غالبًا ما يتم تشخيصه في مراحل متقدمة ولديه تشخيص ضعيف1. خيارات العلاج للمرضى LUSC هي حاجة رئيسية غير ملباة التي يمكن تحسينها من خلال فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة التي تدفع LUSC الورم.

كما هو الحال مع معظم أنواع السرطان البشرية ، يتميز الإمراض في LUSC بتعطيل بنية الأنسجة الظهارية السليمة والمنظم بشكل جيد2. خلال هذه العملية ، يتم فقدان قطبية الخلايا القاعدية apical المناسبة ، والخلايا الخلية والاتصالات مصفوفة الخلية ، مما يسمح بالنمو غير المنضبط والسلوك الغازي للخلايا السرطانية. ومن الآن على نطاق واسع أن السمات الخبيثة للخلايا السرطانية لا يمكن أن تتجلى دون تفاعل مهم بين الخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة للورم المحلي (TME)3. المكونات الرئيسية في TME بما في ذلك مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) وكذلك الخلايا الفيوليلية والخلايا المناعية المتسللة تشكل بنشاط TME وتدفع الورم4. ومع ذلك، فهمنا الحالي لكيفية تفاعل الخلايا السرطانية وهذه المكونات الرئيسية في TME لدفع التغييرات المعمارية الأنسجة خلال تقدم LUSC محدودة جدا.

الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) هي أداة هامة لدراسة الأنشطة البيولوجية للتغيرات الجوهرية الخلية والخارجية في تنظيم التغيرات المعمارية الأنسجة في كل من الأنسجة العادية والمريضة5. توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد السياق الهيكلي والوظيفي المناسب الذي عادة ما تفتقر له الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد(2D). الأبعاد المضافة لهذه النظم تحاكي بشكل أوثق الأنسجة في الجسم الحي في العديد من جوانب فسيولوجيا الخلايا والسلوكيات الخلوية ، بما في ذلك الانتشار والتمايز والهجرة والتعبير عن البروتين والاستجابة للعلاج من المخدرات. في السنوات الأخيرة ، أدت الجهود المبذولة من مختبرات مختلفة إلى تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر لكل من الرئة الطبيعية وكذلك NSCLC6،7،8. ومع ذلك ، لم يكن هناك نموذج لسرطان الرئة الحرشفي الذي يمكن تلخيص كل من التغيرات المعمارية الحيوية للأنسجة أثناء تكوين الورم وكذلك دمج المكونات السترومالية الرئيسية.

هنا ، ونحن نصف أساليب لإنشاء رواية 3 الأبعاد (3D) نظام الثقافة المشتركة باستخدام خلايا LUSC الأساسية المشتقة من PDX (يطلق عليها TUM622) وCAFs9،10. يتم اشتقاق كل من TUM622 و CAFs من مريض NSCLC المصاب بأورام متباينة بشكل سيئ10. عندما تكون جزءا لا يتجزأ من الخلايا واحدة في ECM، مجموعة فرعية نادرة من الخلايا TUM622 لديها القدرة على تشكيل organoids مع هياكل تشبه acinar التي تظهر القطبية الخلايا القاعدية apical السليم. هذه الهياكل مثل acinar هي فرط البلاستيك ، وعرض التعبير غير المتجانس من علامات مثل الجذعية والتمايز مماثلة للورم الأصلي في حين تبقى غير الغازية ، وبالتالي تحاكي المرحلة الأولى من التنمية LUSC. الأهم من ذلك، أظهرنا أن بنية الأنسجة من الهياكل مثل acinar يمكن تغييرها عن طريق تثبيط مسارات الإشارات الجوهرية الخلية مع مثبطات جزيء صغير أو إضافة المكونات الرئيسية في ECM مثل CAFs، وهذا الأخير يعزز تشكيل أشيني ويثير كذلك أشيني لتصبح الغازية عندما تكون على مقربة. معا، تشير هذه البيانات إلى أن هذا النظام 3D الثقافة المشتركة من الأعضاء LUSC يوفر منصة قيمة للتحقيق في المعاملة بالمثل الديناميكية بين خلايا LUSC وTME ويمكن تكييفها لرصد استجابة خلايا LUSC للعلاج من المخدرات11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Passaging وزراعة TUM622 الخلايا وCAFs في الثقافات 2D

  1. التصاريح وزراعة الخلايا TUM622
    1. الكواشف الدافئة متوسطة الثقافة والخلايا (انظر جدول المواد)لخلايا TUM622 عند 37 درجة مئوية.
    2. مرور TUM622 الخلايا في 80٪ التقاء في القوارير 2D. عادة، يحدث هذا بعد أسبوع واحد من المرور.
    3. تجاهل المتوسطة القديمة من قارورة T75 وغسل مرة واحدة مع 6 مل من المخزن المؤقت HEPES. تجنب الأنابيب مباشرة على الخلايا.
    4. اسشق المخزن المؤقت HEPES. إضافة 4 مل من التربسين / EDTA (0.25 ملغ / مل ، انظر جدول المواد)لشطف سريع وتجاهل التربسين / EDTA.
    5. إضافة 2 مل من التربسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. إزالة القوارير من الحاضنة والاستفادة من القوارير لتخفيف الخلايا دون خلق فقاعات الهواء والعودة القوارير إلى الحاضنة لمدة 5 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: التعرض لفترات طويلة لالتربسين سوف تلحق ضررا لا رجعة فيه الخلايا وتغيير النمط الظاهري، وبالتالي فمن المستحسن للحد من الخلايا الزمنية التي تتعرض للالتربسين.
    6. تأكيد الخلايا قد انفصلت وانفصلت تحت المجهر الخفيف (4x أو 10x). إضافة 4 مل من المخزن المؤقت التحييد (المخزن المؤقت TNS) (انظر معلومات الكواشف الثقافة الفرعية في جدول المواد)متبوعاً 10 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد (انظر جدول المواد).
    7. ماسيت صعودا وهبوطا بلطف لمزيد من فصل الخلايا باستخدام ماصة 10 مل. نقل التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    8. عد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتو أو عداد الخلية الآلي.
    9. البذور 0.8 × 106 خلايا / T75 قارورة في 20 مل من وسط ثقافة 3D (انظر جدول المواد).
    10. إطعام الخلايا كل يومين عن طريق استبدال نصف المتوسط المستهلك مع المتوسطة الطازجة.
  2. تمرير وزراعة CAFs
    1. مرور CAFs عندما تصل الخلايا إلى التقاء. عادة، يحدث هذا بعد 5 أيام من التّسمع من انقسام 1:2.
    2. إعداد CAF المتوسطة باستخدام متوسط القاعديRPMI مع 20٪ مصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة، 1٪ L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين / ستريبتومسين. دافئة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية.
    3. في قارورة T75، شطف CAFs مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS) مرة واحدة ثم إضافة 2 مل من التربسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
    4. لاحظ تحت المجهر الخفيف لضمان انفصال الخلايا في القارورة (4x أو 10x). إذا لم يكن كذلك، تمديد الحضانة لمدة 2-3 دقيقة أخرى.
    5. مرة واحدة وقد فصل الخلايا وتفككت، إضافة 10 مل من متوسط ثقافة 3D لتحييد التربسين / EDTA وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لمزيد من التفكك CAFs.
    6. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور لأسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في حجم مناسب من وسط الثقافة 3D (انظر جدول المواد)والمرور إلى اثنين من قوارير T75 الجديدة.

2. طلاء TUM622 الخلايا في مصفوفة خارج الخلية ل3D التبول

  1. في اليوم السابق للتجربة، تذوب قوارير مصفوفة غشاء الطابق السفلي في ثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ماسات بلاستيكية التبريد (2 مل) ونصائح في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ليس كل الكثير من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لديها نفس القدرة على دعم النمو 3D من الخلايا TUM622. ولذلك، فمن الضروري الحصول على واختبار الكثير من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتحديد تلك التي تدعم تشكيل اسينى قوية. وعادة ما يتطلب هذا تركيز بروتين أعلى (16-18 ملغم/مل) في المصفوفة.
  2. في يوم التجربة ، متوسطة الثقافة ثلاثية الأبعاد الدافئة ، العازلة HEPES ، التربسين / EDTA والتربسين تحييد العازلة (TNS) في حمام مائي 37 درجة مئوية. مباشرة قبل إعداد الثقافة، واتخاذ مصفوفة غشاء الطابق السفلي مذاب ة من الثلاجة ووضع القارورة على الجليد.
  3. تبريد لوحات زراعة الأنسجة على برودة منصة معدنية وضعت على الجليد. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف تبريد معدني على الجليد.
  4. باستخدام الخلايا TUM622 التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.1.7، حساب العدد المطلوب من الخلايا اللازمة للطلاء. عادة، هناك حاجة إلى 15،000-30،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 24 جيدا. الكثافة المنخفضة هي أكثر ملاءمة للتصوير والقياس الكمي، في حين يفضل الكثافة العالية عند جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي أو النشاف الغربي.
  5. نقل تعليق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مبرد (كل أنبوب يحتوي على خلايا للطلاء ثلاثية) وتدور لأسفل في 300 × ز في جهاز طرد مركزي دلو معلقة عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
  6. استنشق الـ supernatant بعناية مع ماصة متصلة بطرف غير مفلتر (20 ميكرولتر) ، تاركًا حوالي 100 ميكرولتر من الوسط في الأنبوب (استخدم علامات على الأنبوب كدليل).
  7. اضغط بلطف على جانب الأنبوب لطرد وفك البيلية قبل إعادته إلى رف التبريد.
  8. باستخدام 2 مل ماصة قبل تبريدها، مزيج بلطف المصفوفة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات مع الحفاظ على قارورة في اتصال مع الجليد. ماصة في سرعة حتى ومعتدلة بحيث يتم إدخال أي فقاعات في المصفوفة خلال هذا الإجراء.
  9. نقل الحجم المناسب للمصفوفة إلى كل أنبوب طرد مركزي. للطلاء ثلاثية في لوحة 24-well، إضافة 1.1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى كل أنبوب.
  10. باستخدام نصائح ما قبل تبريد، ماصة المصفوفة في كل أنبوب صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات لجعل تعليق الخلية موحدة.
  11. نقل 310 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة في كل بئر من لوحة 24-well المبردة مسبقًا. يتم وضع الماصة بزاوية 90 درجة على سطح اللوحة وإضافة التعليق إلى وسط البئر. يجب أن ينتشر التعليق ويغطي البئر بأكمله دون الحاجة إلى إمالة اللوحة.
  12. لتسهيل تحليل الفلورة المناعية في المراحل النهائية، قم بصفالة تعليق الخلية/المصفوفة بالتوازي مع شرائح الغرفة 2-well. نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة إلى وسط بئر من شريحة غرفة 2-well (انظر جدول المواد). وهذا يسمح للمصفوفة لتشكيل هيكل يشبه القبة مع حجم أصغر بكثير.
  13. عودة لوحة وغرفة الشريحة مرة أخرى إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضان لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة لترسيخ. فحص لوحة / الشريحة تحت المجهر الخفيفة لضمان أن يتم توزيع خلايا واحدة بالتساوي داخل المصفوفة (4x أو 10x).
  14. إضافة 1 مل من الثقافة 3D ما قبل الحارة متوسطة كاملة في كل بئر و 1.5 مل من 3D ثقافة المتوسطة إلى كل بئر من الشريحة الغرفة ثم إعادتها إلى الحاضنة.

3. 3D Coculturing من الخلايا TUM622 وCAFs في مصفوفة خارج الخلية

  1. إعداد تعليق الخلايا من TUM622 وCAFs وفقا للقسم 2.
  2. عد كثافة الخلية CAF عن طريق اتخاذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وخلطها مع 10 ميكرولتر من الأزرق trypan.
  3. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى كل من الغرفتين على مقياس الهيماسي لعد وحساب كثافة الخلية.
    ملاحظة: CAFs لها أشكال غير منتظمة وقد لا يتم حسابها بدقة على عداد خلية تلقائي.
  4. التضمين المشترك لخلايا TUM622 وCAFs في مصفوفة غشاء الطابق السفلي
    1. استناداً إلى معلومات كثافة الخلية، احسب العدد المطلوب من الخلايا المستخدمة في الطلاء. يتم بذر CAFs بنسبة 2:1 من خلايا TUM622. على سبيل المثال، بالنسبة لـ 30,000 خلية TUM622 المصنفة، يتم تضمين 60,000 CAFs.
    2. نقل الحجم المناسب من TUM622 وكذلك CAFs تعليق الخلية في نفس أنبوب الطرد المركزي واتبع الخطوات 2.5-2.11 للطلاء في لوحات 24-well. بالنسبة للفلورية المناعية، قم بنقل 60 ميكرولتر من مزيج TUM622/CAFs إلى شرائح الغرفة كما هو موضح في الخطوة 2.12).
  5. Coculturing TUM622 مع CAFs متراكبة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد)
    1. إعداد TUM622 أحادية الثقافة وفقا للخطوات 2.5-2.13.
    2. نقل ضعف عدد تعليق CAFs (مقارنة بعدد خلايا TUM622 المصنفة) إلى أنبوب طرد مركزي والدوران لأسفل عند 300 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. اسشق supernatant وresuspend CAFs في 1 مل من وسط الثقافة 3D.
    4. نقل 1 مل من CAFs تعليق إلى البئر التي تحتوي على الخلايا TUM622 جزءا لا يتجزأ.

4. حصاد TUM622 Acini لاستخراج الحمض النووي الريبي / البروتين وفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)

  1. إعداد العازلة غسل وخلية الحصاد العازلة وفقا لبروتوكول مجموعة حصاد الخلية 3D في اليوم السابق والبرد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. احتفظ بألواح على مبرد طبق يُبوّت وكواشف أخرى على الثلج قبل البدء في عملية الاستخراج.
  3. استعجل وسائل الإعلام من الآبار الثقافة 3D دون لمس المصفوفة وغسل بلطف البئر 3 مرات مع 1 مل من العازلة غسل.
  4. استشير الغسيل النهائي وإضافة 1 مل من خلية الحصاد العازلة إلى كل بئر.
  5. استخدام p1000 تلميح ماصة لكشط مصفوفة الخروج من كل بئر.
  6. ماسيت صعودا وهبوطا لمزيد من فصل المصفوفة.
  7. نقل 1 مل من هذا المزيج إلى أنبوب مخروطي 15 مل مبردة مسبقا. إضافة آخر 1 مل من الحصاد العازلة إلى نفس البئر.
  8. كرر الخطوات 4.5-4.7، ونقل كل مزيج من نفس جيدا في واحد 15 مل أنبوب مخروطي.
  9. كاب الأنابيب والصخور في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. ملء كل أنبوب مع الجليد الباردة PBS تصل إلى 10 مل ومن ثم الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  11. يستنشق السوبرناستان دون لمس بيليه. يجب أن يحتوي الـ supernatant على أجزاء مصفوفة ، ولكن يجب جمع جميع الأجزاء الكروية في الجزء السفلي من الأنبوب.
  12. أضف PBS البارد ة للثلج للغسيل الثاني. عكس الأنبوب عدة مرات لفصل بيليه. تدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة.
  13. أثناء الغزل، وإعداد العازلة اللايسليس لجمع البروتين والجيش الملكي النيبالي.
  14. يستنشق بعناية supernatant وإضافة العازلة تحليل لمعالجة المصب لجمع البروتين أو الحمض النووي الريبي. وبدلاً من ذلك، يمكن إعادة تعليق الخلايا لتحليل التدفق/فرز القوات المسلحة الكونغولية أو التمرير التسلسلي.

5. الفلور المناعي من TUM622 أشيني

  1. إعداد العازلة المناعية (IF العازلة: PBS مع 0.1٪ بومالفين مصل (BSA)، 0.2٪ تريتون X-100 و 0.05٪ Tween-20)، المخزن المؤقت المنع الأولي (IF المخزن المؤقت مع 10٪ مصل الماعز)، العازلة مانعة الثانوية (المخزن المؤقت المنع الأولي مع 20 ميكروغرام /مل الماعز المضادة للفأرة F (ab')2)
  2. يستنشق المتوسطة من 2-جيدا غرفة الشرائح، شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وتعيين الشريحة على برودة لوحة معدنية على الجليد. يجب أن تبقى شريحة الغرفة على مبرد اللوحة المعدنية لبقية البروتوكول.
  3. إضافة مبردة مسبقا PFA 4٪ لإصلاح acini واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  4. إزالة 4٪ PFA وغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني قبل المبردة لكل 5 دقيقة مع هزاز لطيف على الروك.
  5. اسشق برنامج تلفزيوني وpermeabilize مع 1.5 مل من 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (مبردة مسبقا) لمدة 20 دقيقة. بحلول نهاية هذا الإجراء ، سيصبح الهيكل الشبيهة بالقبة فضفاضًا.
  6. يستنشق المخزن المؤقت permeabilization بلطف من شريحة الغرفة لتجنب فقدان العينة. ويتحقق ذلك عن طريق إضافة طرف رفيع (20 ميكرولتر) إلى ماصة الأنابيب والضغط على الطرف نحو زاوية الغرفة.
  7. غسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني قبل المبردة لكل من5 دقيقة مع هزاز لطيف على الروك.
  8. حظر العينة مع المخزن المؤقت حظر الأساسي على الجليد لمدة 1 ساعة.
  9. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر الأساسي وإضافة مخزن مؤقت ثانوي للحظر وكتلة لمدة 30 دقيقة.
  10. إضافة الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت حظر الأولية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الأجسام المضادة المستخدمة هنا أعلى من المستخدمعادة لتلطيخ الخلايا في الثقافة 2D. يتم تخفيف معظم الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة في 1:100 تخفيف (انظر جدول المواد).
  11. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل العينة 3 مرات مع 2 مل من العازلة IF الباردة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون العينات فضفاضة، واتخاذ الحذر إضافية عند aspirating.
  12. احتضان العينات في الأجسام المضادة الثانوية المخففة في المخزن المؤقت للحظر الأساسي لساعة واحدة في RT. يجب أن تكون الأجسام المضادة الثانوية المفضلة شديدة الامتصاص عبر للحد من تلطيخ الخلفية. يتم تخفيف معظم الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة في تخفيف 1:200.
  13. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل العينة 3 مرات مع 2 مل من العازلة IF الباردة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون العينات فضفاضة، واتخاذ الحذر إضافية عند aspirating.
  14. إضافة برنامج تلفزيوني مع DAPI (1:1,000 تخفيف) خلال غسل الماضي لوصمة عار النواة. أداء آخر 2 يُسَلّف في برنامج تلفزيوني.
  15. صورة العينات على المجهر البؤري في غضون 3 أيام.
    ملاحظة: نظرًا لحجم الأجهزة وحدود مسافة عمل الهدف ، عادة ما يتم صورة العينات بمعدل تكبير 10x أو 20x.

6. إعداد عينات الثقافة ثلاثية الأبعاد للكيمياء المناعية

  1. اسشق المتوسطة من 2-جيدا غرفة الشرائح وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  2. إصلاح الثقافات 3D في 4٪ PFA في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. إزالة 4٪ PFA، والثقافات المحيطة مع 2.5 مل من هلام عينة الأنسجة (انظر جدول المواد)ووضع الشريحة في 4 درجة مئوية لترسيخ لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  4. نقل عينات محاطة هلام عينة الأنسجة إلى أشرطة الأنسجة ومعالجتها في معالج عينة الأنسجة الآلي بين عشية وضحاها.
  5. تضمين العينات في شمع البارافين والاستعداد للقسم12.

7. 3D السمية الخلويه فحص للفحص المركب (مثال للوحة واحدة 96 جيدا)

  1. قم بتعيين لوحة 96 بئرًا على مبرد لوحة، وخزان 25 مل على مبرد خزان وأنابيب مخروطية 15 مل على الجليد قبل بدء التجربة.
  2. إعداد تعليق مصفوفة الخلية من الخلايا TUM622 في أنبوب البولي بروبلين 15 مل المبردة مسبقا مخروطية عن طريق إضافة الحجم المناسب من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الخلايا. الكثافة المطلوبة لخلايا TUM622 هي 10000 خلية لكل 70-75 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. ماسيت صعودا وهبوطا عدة مرات للسماح حتى خلط الخلايا داخل المصفوفة.
  3. نقل لوحة مع برودة لوحة وخزان مع برودة خزان بعيدا عن الجليد إلى سطح جاف لتجنب اتصال مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الجليد أثناء النقل.
  4. نقل خليط خلية المصفوفة إلى خزان التبريد دون خلق فقاعات.
  5. باستخدام ماصة ميكانيكية متعددة القنوات (10-300 ميكرولتر)، نقل 70-75 ميكرولتر من خلايا المزيج إلى كل بئر مناسب من لوحة 96 بئر.
  6. لوحة احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة لمصفوفة غشاء الطابق السفلي لترسيخ.
  7. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط في جميع الصفوف وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
  8. بدء الدوس المركب في اليوم التالي أو في وقت لاحق اعتمادا على الهدف من التجربة.
  9. يمكن إعادة تغذية Spheroids وإعادة مُدوّنها كل 2-3 أيام لمدة تصل إلى 10 أيام ، عن طريق إزالة الوسائط المستهلكة مع مشعب فراغ 8 أو 12 بئرًا واستبداله بوسائط جديدة مع أو بدون المركبات المطلوبة.
  10. يمكن قياس عدد الكرويدات TUM622 باستخدام الصور ثلاثية الأبعاد وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUM622 وCAFs في الثقافة 2D
يعرض الشكل 1 الشكل النموذجي لخلايا TUM622 وCAFs في الثقافة 2D. يتم تقريب خلايا TUM622 مع نواة كبيرة في حين CAFs مسطحة وممدودة. يمكن أن تصل خلايا TUM622 إلى 80٪ -90٪ التقاء في الثقافة. ويؤدي المزيد من الانتشار إلى المزيد من الخلايا الصغيرة المجمعة في مستعمرات لا تلامس هاوية مباشرة. وعلى النقيض من ذلك، تفضل الخلايا المرتفعة الكثافة أن تنمو بكثافة أعلى من الخلايا وستستمر في التكاثر عند التقاء كامل إذا تم توفير ما يكفي من العناصر الغذائية.

نمو ومورفولوجيا TUM622 أسينى في 3D ECM
يقدم الشكل 2 تجربة دورة زمنية لخلايا TUM622 المزروعة في الثقافة ثلاثية الأبعاد. تظهر البيانات أن خلايا TUM622 المفردة قادرة على تشكيل الأرغن مع مورفولوجيا تشبه acinar عندما تكون مضمنة. بين الأيام 5 و 7 ، يصبح التجويف واضحًا في الهياكل الشبيهة بـ acinar ويبقى جوفاء بعد ذلك(الشكل 2A). كل acinus ، تتألف من طبقة أحادية من الخلايا المحيطة تجويف جوفاء ، ويعرض القطبية apical القاعدية المناسبة مماثلة لتلك التي من ظهارة الرئة في الجسم الحي(الشكل 2B). هذه الهياكل مثل acinar هي فرط البلاستيك وتستمر في النمو طالما يتم توفير ما يكفي من المواد الغذائية. يمكن الحفاظ على الثقافة لمدة تصل إلى 24 يوما قبل أن يتفكك ECM تماما(الشكل 2C). من خلال الحد من تخفيف (LDA) (البيانات غير مبينة) ، ويقدر أن السكان الفرعيين نادرة فقط من الخلايا TUM622 (ltlt;0.02 ٪ ) . لديها القدرة على تشكيل هياكل تشبه acinar9.

نمو ومورفولوجيا الثقافة المشتركة TUM622-CAFs
يصور الشكل 3 الإعداد والنتائج التمثيلية للثقافات المشتركة TUM622-CAF. يمكن دمج CAFs في الثقافة المشتركة إما عن طريق تراكب على رأس المصفوفة أو جزءا لا يتجزأ مع الخلايا TUM622. بغض النظر عن الإعداد ، فإن وجود CAFs عزز بشكل كبير عدد وحجم الكرويدات التي تم تشكيلها(الشكل 3B). ومن المثير للاهتمام ، عندما TUM622 acini تأتي على مقربة مع CAFs ، فإنها تحفز acini لتصبح الغازية والهجرة نحو CAFs ، وتشكيل "المسيل للدموع قطرة" مثل الهياكل(الشكل 3C). لاحظ أن TUM622 acini في الزراعة الأحادية لا تعرض السلوك الغازي وتشكل فقط "المسيل للدموع قطرة" مثل الهياكل عندما تكون قريبة من CAFs.

نتائج الفلورسنت المناعية التمثيلية والكيمياء المناعية
ويبين الشكل 4 النتائج التمثيلية من الفلورالمناعي وتلطيخ الكيمياء المناعية لـ TUM622 acini بعد 10 أيام من التعباد. تم التقاط الصور المعتمة في الطائرة الاستوائية من المتألق ينافي المناعة TUM622 acini(الشكل 4A). في المقابل ، قد يلتقط كل قسم من عينة الكيمياء المناعية الأشيني في مستويات مختلفة(الشكل 4B). وأظهرت كلتا النتيجتين تعبيرا غير متجانس عن الخلايا الجذعية الشبيهة والمتمايزة داخل كل من الخلايا الجذعية.

TUM622 3D السمية السيتومية السمية باستخدام مثبط مسار Wnt
ويبين الشكل 5 الجرعة استجابة من TUM622 acini تعامل مع XAV939، مثبط تانكيراس(الشكل 5A, B). تمت إضافة XAV939 إلى الثقافة بعد يوم واحد من الطلاء وتحديثها كل يومين لما مجموعه 10 أيام. في نهاية التجربة، تم تحديد عدد الـ acini حسب التصوير. كما تم الحصول على صور Brightfield في التكبير العالي لالتقاط مورفولوجيا الشرودات في السيطرة مقابل الآبار XAV939 المعالجة(الشكل 5C). عموما، XAV939 يعرض تثبيط تعتمد على الجرعة على تشكيل اسيني ويغير بنية الأنسجة من كرويويدس شكلت. هذه النتائج تشير إلى أن تفعيل مسار Wnt الكنسي مطلوب خلال تكوين MORPHOGenesis TUM622 acinar.

Figure 1
الشكل 1: TUM622 و CAFs في الثقافة 2D. صور تمثيلية مشرقة المجال لخلايا TUM622 وCAFs مثقفة في 2D. مقياس شريط = 100 ميكرون. وقد عُدل هذا الرقم من تشين وآخرون9 واستخدم بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نمو ومورفولوجيا من الـ TUM622 acini في 3D ECM. (أ)صور الدورة الزمنية لخلايا TUM622 المستزرعة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي على مدى فترة 10 أيام. مقياس شريط = 100 ميكرومتر.(B)الفلورية المناعية من TUM622 acini ملطخة علامات قطبية الخلية القاعدية apical، Golgi-enzyme (GM-130، الأخضر، apical) وIntegrin ألفا 6 (CD49f، القاعدية، الحمراء). (C)القياس الكمي لعدد الآسيني (المحور الأيمن، الأحمر) ومتوسط حجم أشيني (يسار المحور ص، الأزرق) مطلي في ثلاثية في لوحة 24-جيدا على مدى 24 يوما في الثقافة. تمثل أشرطة الخطأ SD. وقد عُدل هذا الرقم من تشين وآخرون9 واستخدم بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نمو ومورفولوجيا الثقافة المشتركة TUM622-CAFs. (أ)الرسم التخطيطي لإعداد الثقافة المشتركة TUM622-CAFs. يتم تراكب CAFs أو جزءا لا يتجزأ مع خلايا TUM62 في ECM. بعد 6-12 يوما في الثقافة المشتركة، والخلايا TUM622 قادرة على تشكيل أكثر وأكبر acini مقارنة مع أحادية الثقافة وغزو ECM عندما تكون على مقربة والاتصال المباشر مع CAFs. لاحظ أن النمط الظاهري الغازي لا يمكن ملاحظته إلا في الثقافة المشتركة. (ب)صورة برايتفيلد لثقافات 3D TUM622 في وجود أو عدم وجود CAFs متراكبة بعد 8 أيام. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (C) صور برايتفيلد تظهر شكل أشيني المسيل للدموع قطرة في cocultures بغض النظر عن CAFs هي متراكبة أو جزءا لا يتجزأ في ECM. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. وقد عُدل هذا الرقم من تشين وآخرون9 واستخدم بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتائج تلطيخ المناعة المناعية التمثيلية والكيمياء المناعية. (أ)تلطيخ الأجسام المضادة من أسيني مع علامات من الخلايا الجذعية / السلف (CXCR4 وSOX2) ، mesenchyme (Vimentin) ، التمايز الظهاري (Involucrin) ، الخلايا المبرمجة (CleaveD - Caspase -3) والانتشار (Ki67) باللون الأخضر ، DAPI باللون الأزرق ، E -cadherin وPhalloidin باللون الأحمر. مقياس شريط = 50 ميكرون.(B)الكيمياء المناعية على أقسام FFPE من TUM622 acini. مقياس شريط = 100 ميكرون (أعلى) و 50 ميكرون (أسفل). وقد عُدل هذا الرقم من تشين وآخرون9 واستخدم بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: TUM622 3D مقهسة السمية السيتومية باستخدام مثبط مسار Wnt. (أ)القياس الكمي للأرقام الكروية في لوحة 96-well حيث عولجت خلايا TUM622 بثنائي ميثيل سولفوكسيد (التحكم) أو XAV939. يتم تعيين كل شرط في ثلاثية. أشرطة الخطأ تمثل SD.(B)صور بئر كاملة من لوحة 24-well مأخوذة مع صور تظهر الآثار المثبطة لXAV939 على تشكيل أسيني. (C)صور برايتفيلد التمثيلية من الآبار المُعالجة للتحكم، مما يدل على التغيرات المورفولوجية التي يسببها العلاج XAV939. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. وقد عُدل هذا الرقم من تشين وآخرون9 واستخدم بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأورام هي أنسجة غير متجانسة تتكون من الخلايا السرطانية تتعايش جنبا إلى جنب مع الخلايا المترالية مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والخلايا الفيوذيلية والخلايا المناعية داخل ECM. معا، هذه المكونات المتنوعة عبر الحديث والتأثير على البيئة الدقيقة الورم، ولعب دور نشط في دفع الورم، وهي العملية التي تنطوي على تغييرات تدريجية في الهندسة المعمارية الورم. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون نموذج المختبر لتطوير الورم قادرًا على التقاط التغيرات المعمارية الديناميكية للأنسجة التي لوحظت في الأورام البشرية في الجسم الحي ، والتفاعل المعقد لأنواع الخلايا المتنوعة داخل البيئة الدقيقة للورم وفي الوقت نفسه السماح التلاعب التجريبي على كل من الخلايا السرطانية والمكونات في TME. على الرغم من إحراز تقدم كبير في نماذج السرطان ثلاثية الأبعاد في السنوات الأخيرة، لم تكن هذه النماذج متاحة بسهولة لـ LUSC. معظم النماذج المبلغ عنها حتى الآن تتضمن سوى عدد قليل من جوانب هذه الميزات الهامة. هنا نبلغ عن أساليب نظام الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد لـ LUSC الذي يلتقط في وقت واحد التغيرات المعمارية الرئيسية للأنسجة التي لوحظت أثناء تطوير LUSC بالإضافة إلى التفاعلات الديناميكية بين الخلايا السرطانية والمكونات الرئيسية لـ TME ، بما في ذلك ECM و CAFs.

وتستند قدرة هذا النظام على نموذج التغييرات المعمارية الأنسجة أكثر دقة على خاصية فريدة من خلايا TUM622 في تشكيل organoids مع الأشكال مثل acinar عندما جزءا لا يتجزأ من EC 3D. تتكون كل خلية واحدة مكونة من خلية واحدة تجدد نفسها بنفسها ، وتتكون من طبقة أحادية من الخلايا المحيطة بتجويف أجوف. هذه الطبقة الأحادية من الخلايا يحمل قطبية الخلايا القاعدية وتبقى غير الغازية، تشبه بنية الأنسجة من ظهارة الرئة. في حين TUM622 كعرض ثلاثي الأبعاد أحادي الثقافة نمو فرط البلاستيك ، فإن إضافة CAFs يعزز المزيد من تولد الخلايا العصبية ويحفز على تشكيل المزيد والأكبر. الأهم من ذلك ، CAFs استدعاء التغيرات المعمارية الأنسجة الحيوية في الخلايا TUM622 عندما يأتي نوعان من الخلايا في مكان قريب ، مما يسمح للخلايا TUM622 لتفقد قطبية apical القاعدية وغزو المصفوفة نحو CAFs. هذه التغييرات فينوتيبيك تلخيص كل من تضخم في وقت مبكر وكذلك المراحل الغازية في وقت متأخر من LUSC.

على عكس العديد من نماذج الورم الكروي حيث يتم تشكيل كل كروية عن طريق تجميع العديد من الخلايا ، يتم اشتقاق كل من TUM622 acinus من خلية واحدة9. حسب المختبر LDA، تشير التقديرات إلى أن السكان الفرعيين القاصرين فقط (≤0.02%) من الخلايا TUM622 لديها مثل هذه القدرة9. على الرغم من ندرة، يمكن لهذه الخلايا تجديد الذات كما يتضح من قدرتها على الخضوع لتمرير المسلسل في 3D، فضلا عن التفريق في مجموعة غير متجانسة من الخلايا مماثلة لتلك الموجودة في الورم الأصلي. نظرًا لهذه الميزة الفريدة لخلايا TUM622 ، من الأهمية بمكان ضمان التوزيع حتى لخلايا TUM622 واحدة داخل ECM في وقت الطلاء للزراعة الناجحة وتحليل المصب. لتحقيق هذا الهدف، هناك العديد من النقاط الرئيسية التي يجب اتباعها بعناية في البروتوكول، بما في ذلك تحديد كثافة البذر المناسبة، والحفاظ على برودة جميع الأدوات والكواشف أثناء خلط الخلايا والمصفوفة لمنع التصلب المبكر، وتجنب إدخال الفقاعات أثناء عملية الخلط والسماح بوقت كاف ٍ لترسيخ المصفوفة بشكل كامل قبل إضافة وسيط الثقافة. معا، وهذه الاحتياطات تساعد على تحقيق ركيزة مصفوفة أكثر اتساقا وحالة الثقافة لجميع الخلايا جزءا لا يتجزأ.

وبمجرد تأسيسها بنجاح ، يمكن استخدام هذه الثقافة لمجموعة متنوعة من التحليلات النهائية لتشريح الخلية والعملية الكيميائية الحيوية التي تنظم تكوين الورم. يمكن رصد عدد وحجم الآشيني التي تشكلت في كل بئر مع مرور الوقت مع صور ميدانية ساطعة واستخدامها كقراءة لقدرة التكاثر والتجديد الذاتي لخلايا TUM622. يمكن ملاحظة ديناميكيات أكثر تفصيلاً في تكوين كل من الخلايا الحية مع التصوير الحي على المجهر البؤري، مع أو بدون الأصباغ الموسية المختلفة. يمكن جمع المتوسطة مكيفة في نقاط زمنية متعددة خلال فترة الثقافة لتحليل العوامل القابلة للذوبان التي قد تتوسط خلية الخلية أو الخلية مصفوفة عبر المحادثات. TUM622 الخلايا المستخرجة مباشرة من ECM باستخدام بروتوكول 4 هي مناسبة لالحمض النووي الريبي واستخراج البروتين لتحليل التعبير الجيني، وتدفق القياس الخلوي الكمي أو فرز FACS على أساس علامات سطح الخلية. وبدلاً من ذلك، يمكن تثبيت الثقافات لدراسات الفلور المناعي أو الكيمياء المناعية في الموقع لفهم التوزيعات المكانية الزمانية لمختلف العلامات. على الرغم من تشابه، والكيمياء الهيستوكيميائية المناعية يكمل أساليب الفلور المناعي في أنه يسمح بأخذ عينات من اسينى كامل التي قد لا تكون ممكنة بسبب عمق التصوير الحد من الأهداف المعالبؤرة. بالنسبة لكل من هذه الطرق ، فإن الوقت ودرجة الحرارة التي يتم فيها التثبيت وpermeabilization أمر بالغ الأهمية ، خاصة بالنظر إلى أن خلايا TUM622 مضمنة في مصفوفة كثيفة (> 90 ٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي) على النقيض من العديد من الثقافات ثلاثية الأبعاد الأخرى حيث كثافة المصفوفة أقل بكثير. ولذلك، فإن الاهتمام بالتثبيت والمعالجة الموحدين والمتسقين ضروري للحصول على نتائج تكرارية.

باستخدام هذا النظام كمنصة، يمكن للمرء بعد ذلك التحقيق في كيفية التغيرات الجوهرية للخلايا في الخلايا السرطانية، فضلا عن التغيرات الخارجية الخلية في البيئة الدقيقة للورم، وتأثير العمارة الظهارية ونموذج الأحداث المبكرة المشاركة في تشكيل السرطان. على سبيل المثال ، يمكن دراسة أدوار الجينات الأورام أو الجينات مثبطة الورم في تنظيم بنية أنسجة الورم عن طريق تجربة الكسب أو فقدان الوظيفة التي تستهدف الجين الذي يهم في الخلايا السرطانية. في الواقع ، أظهرنا أن الإفراط في التعبير عن SOX2 ، والذي لوحظ عادة في LUSC ، يغير النمط الظاهري لخلايا TUM622 كما يتضح من فقدان تضخم في 3D والتقدم نحو نمو خلل التنسج9. من ناحية أخرى ، يمكن للمرء أن يقارن الخلايا الليفية العادية مقابل السرطان المرتبطة بها في إعدادات الثقافة المشتركة ، وتحديد كيفية تأثير مكونات المصفوفة أو صلابتها على نمو acini / مورفولوجيا / الغزو ، وإذا كان منع بعض السيتوكينات يمكن أن تتداخل مع الاتصالات بين الخلايا وتؤثر بدورها على هندسة الأنسجة وتطور الورم. الأهم من ذلك ، يمكن إجراء كل هذه المقالات في وجود أو عدم وجود بعض العوامل العلاجية واستخدامها كأداة لتحديد استجابة الدواء لخلايا LUSC مع قراءة متعددة الأبعاد11. من المهم أيضا أن نلاحظ أن هذا النظام محدود فيما يتعلق بالمسارات التي يمكن استخدامها للإستجواب ، حيث أن بعض مسارات الإشارات الرئيسية فقط وليس كلها تنظم نمو ومورفولوجيا ORGANOIDs TUM622 في الثقافة (أي تثبيط Wnt ولكن ليس إشارات Notch تؤثر على acinar mophogenesis من خلايا TUM622)9.

باختصار ، نثبت أن هذا النظام العضوي يوفر منصة فريدة من نوعها لتوليد رؤى جديدة في التفاعل الديناميكي بين خلايا LUSC والبيئة الدقيقة للورم أثناء تطور الورم. ونتوقع أن يكون نظامنا النموذجي منبرا قيما لاكتشاف المخدرات وتطويرها. في هذا الصدد، فحص العلاجات الجديدة المضادة للسرطان في سياق أنسجة الورم الأصلي ينبغي أن تساعد في اختيار وتطوير علاجات أكثر فعالية تستهدف LUSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وصاحبا البلاغ هما موظفون ومساهمون في شركة فايزر

Acknowledgments

نشكر ماغالي غوفروي، وجون كريغر، وستيفاني بيسولكو من مجموعة علم الأمراض الأنسجة في شركة فايزر-الأورام ومجموعة العلامات البيولوجية لدعم علم الأمراض/الأنسجة ومايكل أرينزمان للمراجعة النقدية للمخطوطة. كما نشكر برنامج ما بعد الدكتوراه من Pfizer ومجموعة البحث والتطوير في مجال الأورام، وعلى وجه التحديد روبرت أبراهام، وبوجا سابرا، وكارين ويدبين، وجنيفر تيجيدا على دعمهم للبرنامج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 157، الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد، سرطان الرئة، الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، تولد الأورام، ورم
نظام ثقافة الرئة المتعددة الأبعاد لنموذج سرطان الرئة الحرشفية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Giannakou, A., Golas, J.,… More

Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter