Summary
开发了一个体外模型系统，用于捕捉与癌症相关成纤维细胞 （CAF） 共同培养的三维 （3D） 共同培养中肺鳞状癌 （LUSC） 进展期间的组织结构变化。该器官系统提供了一个独特的平台来研究各种肿瘤细胞内在和外在变化的作用，调节肿瘤表型。
Abstract
肿瘤-斯特罗马相互作用在肺鳞癌（LUSC）的发展中起着关键作用。然而，由于缺乏适当的模型，了解这些动态相互作用如何促进肿瘤发生期间观察到的组织结构变化仍然具有挑战性。在此协议中，我们描述了使用 LUSC 主细胞培养（称为 TUM622）生成 3D 共培养模型。TUM622细胞由LUSC患者衍生的异种移植物（PDX）建立，具有独特的特性，在地下室膜基质中播种时形成类似甲烷的结构。我们演示了在3D共同培养中TUM622 acini在LUSC进展期间重述组织结构的关键特征，以及LUSC细胞与肿瘤微环境（TME）组件之间的动态相互作用，包括细胞外基质 （ECM） 和癌症相关成纤维细胞 （CAFs）。我们进一步调整我们的主要3D培养协议，以演示如何将该系统用于各种下游分析。总体而言，这个器官模型创造了一个生物学丰富和适应性强的平台，使人们能够深入了解细胞内在和外在机制，促进上皮结构在癌变过程中破坏，并将有助于寻找新的治疗靶点和诊断标记。
Introduction
肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因。肺鳞状细胞癌（LUSC），是非小细胞肺癌（NSCLC）的第二常见类型，约占所有肺癌的30%，通常诊断为晚期，预后差1。LUSC 患者的治疗选择是一个主要未满足的需求，可以通过更好地了解推动 LUSC 肿瘤生成的基础细胞和分子机制来改进。
与大多数人类癌症一样，LUSC的发病机制的特点是破坏完整、有序的上皮组织架构2。在这个过程中，适当的肛门-基底细胞极性、细胞细胞和细胞基质接触丢失，从而允许肿瘤细胞不受控制的生长和侵入性行为。现在人们普遍认识到，癌细胞的恶性特征不能表现出，没有癌细胞与局部肿瘤微环境（TME）3之间的重要相互作用。3TME中的关键成分包括细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及内皮细胞和渗透免疫细胞，积极塑造TME并驱动肿瘤发生4。然而，我们目前对TME中肿瘤细胞和这些关键成分在LUSC进展过程中如何相互作用以驱动组织架构变化的理解非常有限。
三维（3D）培养是研究细胞内在和外在调节正常组织和病变组织中组织结构变化的生物活动的重要工具。3D 区域性提供了传统二维 （2D） 区域性中通常缺少的合适结构和功能上下文。这些系统的附加维度更密切地模仿体内组织在细胞生理学和细胞行为的许多方面，包括增殖、分化、迁移、蛋白质表达和对药物治疗的反应。近年来，各实验室的努力已导致正常肺和NSCLC66、7、87,8的体外3D模型的发展。然而，一个肺鳞状癌的模型，可以重述肿瘤发生期间的动态组织结构变化，以及纳入关键的基质成分是不可用的。
在这里，我们描述了使用主要PDX衍生的LUSC细胞（称为TUM622）和CAF9、10,10建立新型三维（3D）共培养系统的方法。TUM622和CAF均来自肿瘤不良的NSCLC患者10。当作为单个细胞嵌入ECM时，TUM622细胞的罕见亚群能够形成具有类似甲形结构的器官，以显示适当的锥形基底细胞极性。这些类似同形的构造是超塑性的，在保持非侵入性的同时，表现出类似茎的异质表达和分化标记物，同时保持非侵入性，从而模仿LUSC发展的最早阶段。重要的是，我们表明，通过抑制带有小分子抑制剂的细胞内通信号通路或加入ECM中的关键组分（如CAF）来改变类似阿基纳尔结构的组织结构，后者可增强阿基尼的形成，并进一步促使阿基尼在近距离侵入。这些数据共同表明，LUSC器官的这种3D共同培养系统为研究LUSC细胞与TME之间的动态互惠提供了一个有价值的平台，并可用于监测LUSC细胞对药物治疗的反应。
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Protocol
1. 在 2D 培养中传递和培养 TUM622 细胞和 CAF
- 传路和培养TUM622细胞
- 37°C的TUM622细胞的加热3D培养基和细胞分离试剂（参见材料表）。
- 在 2D 烧瓶中以 80% 的汇合度通过 TUM622 细胞。通常，这发生在传递后 1 周。
- 从 T75 烧瓶中丢弃旧介质，用 6 mL 的 HEPES 缓冲液洗涤一次。避免移液直接移到细胞上。
- 吸气 HEPES 缓冲器。加入4 mL的胰蛋白酶/EDTA（0.25毫克/mL，见材料表），快速冲洗并丢弃胰蛋白酶/EDTA。
- 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA，在37°C孵育5分钟。从培养箱中取出烧瓶，敲击烧瓶以松开细胞，而不会产生气泡，并将烧瓶送回培养箱5分钟。
注：长时间接触胰蛋白酶将不可逆转地损害细胞并改变其表型，因此建议限制细胞暴露于胰蛋白酶的时间。 - 确认细胞在光学显微镜下分离和分离（4倍或10倍）。添加 4 mL 的中和缓冲液（TNS 缓冲区）（请参阅材料表中的亚培养试剂信息），然后添加 10 mL 的 3D 培养介质（参见材料表）。
- 使用 10 mL 移液器上下轻轻移液器进一步分离细胞。通过 40 μm 细胞滤网将悬架转移到 50 mL 锥形管中。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞数。
- 种子 0.8 x 106细胞/T75 烧瓶在 20 mL 的 3D 培养介质 （参见材料表）.
- 每隔一天用新鲜的介质替换一半的废介质，使细胞喂食。
- 传递和培养 CAF
- 当细胞达到汇合时通过CAF。通常，这发生在从1：2分裂5天的培养后。
- 使用具有20%热灭活胎儿牛血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI基底介质制备CAF介质。将介质加热至 37 °C。
- 在 T75 烧瓶中，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 CAF，然后加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA，并在 37 °C 孵育 5 分钟。
- 在光学显微镜下观察，确保细胞在烧瓶中分离（4倍或10倍）。如果没有，将孵育再延长2-3分钟。
- 细胞分离并分离后，加入10 mL的3D培养基，以中和胰蛋白酶/EDTA和移液器上下几次，以进一步分离CAF。
- 将细胞悬浮液转移到 50 mL 锥形管中，并在室温下以 300 x g旋转 5 分钟。
- 丢弃上清液，在适当体积的3D培养介质中重新悬浮颗粒（参见材料表），并进入两个新的T75瓶。
2. 在细胞外基质中电镀 TUM622 细胞，用于 3D 培养
- 实验前一天，在4°C冰箱中解冻了一小瓶地下室膜基质。在 -20°C 过夜下冷却塑料移液器 （2 mL） 和尖端。
注：并非所有的基底膜基质都具有相同的容量来支持TUM622细胞的3D生长。因此，有必要获取和测试多个批次的基底膜基质，以识别那些支持强健的acini形成。通常，这需要基质中更高的蛋白质浓度（16-18毫克/mL）。 - 在实验当天，在37°C水浴中，加热3D培养介质、HEPES缓冲液、胰蛋白酶/EDTA和胰蛋白中和缓冲液（TNS）。在设置培养剂之前，将解冻的地下室膜基质从冰箱中拿出来，将小瓶放在冰上。
- 冷却放置在冰上的金属平台冷却器上的组织培养板。将离心机管放在冰上金属冷却架上。
- 使用从步骤 1.1.7 获得的 TUM622 细胞，计算电镀所需的所需细胞数。通常，每孔 24 孔板需要 15，000-30，000 个细胞。低密度更适合成像和定量，而在收集细胞提取RNA或西印迹时，更需要高密度。
- 将细胞悬浮液转移到冷却的离心管中（每个管包含用于三联电镀的细胞），并在4°C的悬挂式离心桶离心机中以300 x g的速度旋转5分钟。
- 用附着在未过滤的尖端（20 μL）上的吸气液液器小心吸气，在管中留下大约100 μL的介质（使用管上的标记作为导引）。
- 轻轻敲击管侧，将颗粒脱落并分离，然后再将其返回到冷却架。
- 使用 2 mL 预冷却移液器，通过上下移液几次轻轻混合基体，同时保持小瓶与冰的接触。以均匀和中等速度移液，以便在此过程期间不会引入气泡到矩阵中。
- 将相应体积的基质转移到每个离心管中。对于在 24 孔板中电镀三联，在每个管中加入 1.1 mL 的基底膜基质。
- 使用预冷却的尖端，移液每个管的基质上下约10次，使均匀的细胞悬浮液。
- 将310 μL的细胞/基体悬浮液转移到预冷却的24孔板的每个孔中。移液器以 90° 角放置到板表面，将悬架添加到孔的中心。悬架应展开并覆盖整个孔，而无需倾斜板。
- 为方便下游免疫荧光分析，将细胞/基体悬浮板平行板入2孔腔片。将100 μL的细胞/基体悬浮液转移到2孔腔滑孔的中心（参见材料表）。这允许矩阵形成一个圆顶状结构，体积小得多。
- 返回板和腔室滑入组织培养培养箱，孵育30分钟，使基质凝固。在光学显微镜下检查板/幻灯片，以确保单个细胞均匀分布在基质内（4 倍或 10 倍）。
- 将1 mL预热的3D培养完整介质添加到每个井中，将1.5 mL的3D培养介质添加到腔室幻灯片的每个井中，然后将其返回到培养箱。
3. 细胞外基质中TUM622细胞和CAF的3D培养
- 根据第 2 节准备 TUM622 和 CAF 的细胞悬架。
- 通过服用10 μL的细胞悬浮液并将其与10μL的锥色蓝色混合，计算CAF细胞密度。
- 在血变仪上，将混合物的10 μL添加到每个腔室中，以计数和计算细胞密度。
注： CAF 的形状不规则，可能无法在自动单元格计数器上准确计数。 - 在地下室膜基质中共同嵌入 TUM622 细胞和 CAF
- 根据细胞密度信息，计算用于电镀的所需细胞数。CAF 以 TUM622 细胞的 2：1 比率播种。例如，对于种子的 30，000 个 TUM622 细胞，共嵌入了 60，000 个 CAF。
- 将 TUM622 和 CAF 细胞悬浮液的适当体积转移到同一个离心管中，然后按照步骤 2.5-2.11 进行电镀到 24 孔板中。对于免疫荧光，将 TUM622/CAF 混合的 60 μL 转移到室滑室，如步骤 2.12 所述）。
- 在地下室膜基质中覆盖CAF的培养TUM622（参见材料表）
- 根据步骤 2.5-2.13 设置 TUM622 单区域性。
- 将 CAF 悬架数量的两倍（与播种的 TUM622 细胞数量相比）转移到离心管中，并在室温下以 300 x g旋转 5 分钟。
- 吸气上清剂，并在 1 mL 的 3D 培养介质中重新挂起 CAF。
- 将 1 mL 的 CAF 悬架转移到包含嵌入式 TUM622 细胞的井中。
4. 收获 TUM622 Acini 用于RNA/蛋白质提取和荧光活性细胞分拣 （FACS）
- 根据前一天的3D细胞收获试剂盒协议准备洗涤缓冲液和细胞收获缓冲液，并在4°C下过夜。
- 在开始提取过程之前，将板放在板冷却器和其他试剂上放在冰上。
- 从 3D 培养液中吸气介质，无需接触矩阵，即可用 1 mL 洗涤缓冲液轻轻清洗井 3 次。
- 吸气最终洗涤，并在每口井中加入1 mL的细胞收获缓冲液。
- 使用 p1000 移液器尖端刮出每个油井的基质。
- 上下移液，以进一步分离矩阵。
- 将 1 mL 的混合物转移到预冷却的 15 mL 锥形管中。将另外 1 mL 的收获缓冲液添加到同一井中。
- 重复步骤 4.5-4.7，并将同一井的所有混合转移到一个 15 mL 锥形管中。
- 在4°C下将管子和岩石盖30分钟。
- 在每个管中加入高达 10 mL 的冷 PBS，然后在 300 x g下以离心机在 4 °C 下 5 分钟。
- 在不接触颗粒的情况下吸气上清剂。上清液应包含基质片段，但球体应全部收集在管的底部。
- 添加冰冷PBS进行第二次洗涤。反转管子几次以分离颗粒。在 300 x g下旋 5 分钟。
- 纺纱时，准备乳液缓冲液以收集蛋白质和RNA。
- 小心吸气上清液，加入压网缓冲液进行下游处理，以收集蛋白质或RNA。或者，可以重新挂起单元以进行流分析/FACS 排序或串行传递。
5. TUM622 Acini的免疫荧光
- 制备免疫荧光缓冲液（IF缓冲液：带0.1%牛血清白蛋白（BSA）、0.2%Triton X-100和0.05%Tween-20的PBS，主阻塞缓冲液（含10%山羊血清的IF缓冲液），辅助阻断缓冲液（主阻塞缓冲液，20 μg/mL山羊抗鼠F（ab'2）
- 从 2 孔腔室滑道中吸气介质，使用 PBS 冲洗一次，并将滑块放在冰上金属板冷却器上。在协议的其余部分中，腔室滑块应保留在金属板冷却器上。
- 加入预冷却 4% PFA 来修复阿基尼，并在冰上孵育 20 分钟。
- 去除 4% PFA，用 2 mL 预冷却 PBS 洗涤三次，每个 PBS 5 分钟，在摇臂上轻轻摇动。
- 吸气PBS和渗透与1.5 mL 0.5% Triton X-100 在PBS（预冷却）20分钟。到此过程结束时，圆顶状结构将松动。
- 从腔室滑道中轻轻吸气渗透缓冲液，以避免样品丢失。这是通过在吸吸移液器中添加细尖 （20 μL） 并按向造型室角落实现的。
- 用 2 mL 预冷却 PBS 洗涤三次，每个 PBS 5 分钟，在摇臂上轻轻摇动。
- 将样品与冰上主阻塞缓冲器阻塞 1 小时。
- 删除主阻塞缓冲区并添加辅助阻塞缓冲区和阻塞 30 分钟。
- 在原阻块缓冲液中加入原抗体，并在4°C下孵育过夜。
注：此处使用的抗体浓度应高于 2D 培养物中用于染色细胞的通常浓度。本研究中使用的大多数主要抗体在1：100稀释时稀释（参见材料表）。 - 去除原抗体，用2 mL冷IF缓冲液清洗样品3次。
注：样品可能松动，吸气时要格外小心。 - 在RT时，在原阻块缓冲液中稀释的二次抗体中的样品孵育1小时。首选的二次抗体应高度交叉吸附，以减少背景染色。本研究中使用的大多数二次抗体在1：200稀释时稀释。
- 去除二次抗体，用2 mL冷IF缓冲液清洗样品3次。
注：样品可能松动，吸气时要格外小心。 - 在最后一次洗涤过程中加入带有DAPI（1：1，000稀释）的PBS，以染色核。在 PBS 中执行另外 2 次换个进行。
- 在3天内在共聚焦显微镜上成像样品。
注：由于器官的大小和目标工作距离的限制，样品通常以10倍或20倍的放大倍率进行成像。
6. 准备免疫学化学的3D培养样本
- 从 2 井腔室滑动吸气介质，然后用 PBS 冲洗一次。
- 在 37 °C 下一夜之间将 3D 培养物在 4% PFA 中固定。
- 去除4%的PFA，用2.5 mL的组织样本凝胶环绕培养物（参见材料表），并将幻灯片置于4°C，以凝固至少1小时。
- 将用组织样本凝胶包围的样品转移到组织盒中，并在自动组织样品处理器中进行一夜处理。
- 将样品嵌入石蜡中，并准备分节12。
7. 化合物筛选的3D细胞毒性测定（一个96孔板示例）
- 在开始实验之前，在板式冷却器上设置一个96孔板，在储液罐冷却器上设置一个25mL储液罐，在冰上设置一个15mL锥形管。
- 通过在细胞中加入适当体积的基底膜基质，在预冷却的15 mL聚丙烯锥形管中制备TUM622细胞的细胞基体悬浮液。TUM622细胞所需的密度为每70-75μL的基底膜基质10，000个细胞。上下移液几次，允许均匀地混合基质内的细胞。
- 将带板冷却器的板和储液罐从冰中移至干燥表面，以避免在转移过程中与冰接触基底膜基质。
- 将基体单元混合物转移到冷却储液罐中，而不会产生气泡。
- 使用机械多通道移液器 （10-300 μL），将 70-75 μL 的混合电池转移到 96 孔板的每个适当孔中。
- 在37°C和5%CO2孵育板30分钟，使基底膜基质凝固。
- 在所有行中加入 100 μL 的介质，并将板返回到培养箱。
- 根据实验的目标，在第二天或更晚开始复合化。
- 雪带可以每2-3天重新喂食和重新配，长达10天，通过去除使用8或12口真空歧管的废介质，并用新鲜介质替代或不使用所需化合物。
- 根据制造商的协议，可以使用 3D 成像仪对 TUM622 球形的数量进行量化。
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Representative Results
TUM622 和 2D 区域性中的 CAF
图 1显示了 2D 培养中 TUM622 细胞和 CAF 的典型形态。TUM622细胞用大核四舍五入，而CAF是扁平和细长的。TUM622细胞在培养中可达到80%-90%的汇合度。进一步的增殖导致更多的，但较小的细胞聚合在菌落，不直接接触。相反，CAF更喜欢在更高的细胞密度下生长，如果提供足够的营养，则会保持完全汇合的增殖。
3D EC M 中 TUM622 acini 的生长和形态M
图 2介绍了在 3D 培养中播种的 TUM622 细胞的时间过程实验。数据显示，单个 TUM622 细胞在嵌入时能够形成具有类似甲形形态的器官。在第5天至7天之间，流明在类似表子的结构中变得明显，之后保持空心（图2A）。每个合成物由围绕空心流明的单层细胞组成，显示适当的尖塔基极性，类似于体内肺上皮的极性（图2B）。这些类似丙纳尔的结构是超塑性，只要提供足够的营养，就会继续生长。在 ECM 完全解体之前，该区域性可以维护长达 24 天（图 2C）。通过限制稀释测定（LDA）（未显示的数据），估计只有罕见的TUM622细胞亚群（<0.02%）有能力形成类似甲形的结构9。
TUM622-CAF 共同培养的生长和形态
图 3描述了 TUM622-CAF 共同培养的设置和代表性结果。CAF 可以通过叠加在矩阵顶部或与 TUM622 细胞共同嵌入而集成到共同培养中。无论设置如何，CAF 的存在都极大地增强了形成的球形的数量和大小（图 3B）。有趣的是，当TUM622 acini与CAF接近时，它们诱使阿基尼变得侵入并迁移到CAFs，形成类似结构的"撕裂滴"（图3C）。请注意，单一培养中的 TUM622 acini 不会表现出侵入性行为，仅在接近 CAF 时形成类似结构的"撕裂"。
具有代表性的免疫荧光和免疫作用化学染色结果
图4显示了经过10天的培养后，TUM622 acini免疫荧光和免疫组织化学染色的代表性结果。在免疫荧光染色的TUM622 acini（图4A）赤道平面上拍摄了共聚焦图像。相反，免疫组织化学样本中的每个部分都可能在不同平面上捕获阿基尼（图4B）。两项结果表明，每个细胞内均异质表达干细胞样和分化细胞。
TUM622 3D 细胞毒性测定，使用 Wnt 通路抑制剂
图5显示了用XAV939（一种坦克酶抑制剂）治疗的TUM622阿基尼的剂量反应（图5A，B）。XAV939在电镀后1天被添加到培养中，每2天刷新一次，总共10天。实验结束时，由成像器量化了阿基尼的数量。还获得了更高放大倍率的布莱特菲尔德图像，以捕捉对照中的球体形态与XAV939处理井（图5C）。总体而言，XAV939表现出对阿基尼形成的剂量依赖性抑制，并改变形成的球体组织结构。这些结果表明，在TUM622甲形形态发生期间，需要激活规范的Wnt通路。
图 1：2D 区域性中的 TUM622 和 CAF。以 2D 形式培养的 TUM622 细胞和 CAF 的代表性明亮场图像。刻度柱 = 100 μm。这个数字是从陈等人9号修改的，并经许可使用。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：3D ECM 中 TUM622 acini 的生长和形态。（A） 在10天内在基底膜基质中培养的TUM622细胞的时间过程图像。刻度棒 = 100 μm. （B） TUM622 acini 的免疫荧光，带有角质基细胞极性标记、Golgi 酶（GM-130、绿色、阿皮）和 Integrin α 6（CD49f、基底、红色）。（C） 在培养 24 天内，在 24 孔板中镀有 acini 编号（右 y 轴、红色）和 acini（左 y 轴、蓝色）的平均尺寸的定量。误差条表示 SD。这个数字是从陈等人9号修改的，并经许可使用。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：TUM622-CAF共同培养的生长和形态。（A） TUM622-CAF 共同培养的设置的原理图图。CAF 被覆盖或与 ECM 中的 TUM62 细胞共同嵌入。在联合培养6-12天后，TUM622细胞能够形成越来越大的acini与单一培养相比，并在近距离接触和直接接触CAF时侵入ECM。请注意，侵入性表型只能在共同培养中观察到。（B） 8 天后，在存在或不存在叠加的 CAF 时，TUM622 3D 区域性的明亮场图像。比例尺 = 200 μm. （C） 明亮的场图像，显示泪滴形 acini 形成在共同培养中，而不管 CAF 被覆盖或共同嵌入 ECM 中。刻度柱 = 200 μm。这个数字是从陈等人9号修改的，并经许可使用。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：代表性免疫荧光和免疫作用化学染色结果。（A） 具有茎/祖细胞标记的acini抗体染色（CXCR4和SOX2）、美感（维门廷）、上皮分化（Involucrin）、凋亡（Cleaved-Caspase-3）和在绿色中增殖（Ki67），红色为DAPI，E-Cadherin和Phalloidin。刻度杆 = 50 μm. （B） TUM622 acini FFPE 部分的免疫组织化学。刻度柱 = 100 μm（顶部）和 50 μm（底部）。这个数字是从陈等人9号修改的，并经许可使用。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：使用Wnt通路抑制剂进行TUM622 3D细胞毒性测定。（A） 在 TUM622 细胞用二甲基亚硫酸氧化物（控制）或 XAV939 处理的 96 孔板中，球体编号的定量。每种情况都用三联测定。误差条表示SD. （B） 从24孔板拍摄的全井图像，该图像由成像器显示XAV939对阿基尼形成的抑制作用。（C） 对照井与处理井的代表性明场图像，显示XAV939处理引起的形态变化。刻度柱 = 100 μm。这个数字是从陈等人9号修改的，并经许可使用。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
肿瘤是由癌细胞与巨发细胞并存的异质组织，如癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和ECM内的免疫细胞。这些不同的成分相互交扰并影响肿瘤微环境，在推动肿瘤形成方面起着积极的作用，这个过程涉及肿瘤结构的渐进变化。理想情况下，肿瘤发育的体外模型应该能够捕捉人体肿瘤体内观察到的动态组织结构变化，在肿瘤微环境中各种细胞类型的复杂相互作用，同时允许对TME中的肿瘤细胞和成分进行实验操作。尽管近年来3D癌症模型取得了很大进展，但LUSC的这种模型并不好。迄今为止报告的大多数模型只包含这些重要功能的几个方面。在这里，我们报道了LUSC的3D共同培养系统的方法，该系统同时捕获LUSC开发期间观察到的关键组织架构变化，以及肿瘤细胞与TME主要组成部分之间的动态相互作用，包括ECM和CAFs.
该系统能够更准确地模拟组织架构变化，其依据是TUM622细胞在嵌入3D EC中时形成具有类似甲形形态的器官的独特特性。由自更新的单细胞组成，每个细胞由围绕空心流明的单层细胞组成。这种单层细胞表现出尖基细胞极性，并且仍然是非侵入性的，类似于肺上皮的组织结构。虽然TUM622作为3D单文化显示超塑性增长，但CAF的加入进一步增强了甲二形态的生成，并促使越来越多的阿基尼形成。重要的是，当两种细胞类型接近时，CAFs 会调用 TUM622 细胞的动态组织体系结构变化，从而使 TUM622 细胞失去其极性，并侵入基质向 CAF。这些象形变化概括了LUSC的早期增生和晚期侵入性阶段。
与许多肿瘤球形模型不同，其中每个球体由多个细胞的聚合形成，每个 TUM622 球体派生自单个细胞9。根据体外LDA，估计只有轻微的亚群（±0.02%）TUM622细胞具有这样的容量9。虽然罕见，这些细胞可以自我更新，这证明他们的能力，经历串行传递在3D，以及分化成一个异质的细胞群类似于原始肿瘤。由于 TUM622 细胞的这一独特特性，在电镀时确保 ECM 内单个 TUM622 细胞均匀分布，以便成功培养和下游分析至关重要。为了实现这一目标，协议中需要谨慎遵循几个要点，包括确定适当的播种密度，在细胞和基质混合过程中保持所有工具和试剂的冷却，以防止过早凝固，避免在混合过程中引入气泡，并留出足够的时间在添加培养介质之前使基质完全凝固。总之，这些预防措施将有助于实现更均匀的基质基质和培养条件的所有嵌入式细胞。
一旦成功建立，这种培养可用于各种下游分析，以解剖调节肿瘤成因的细胞和生化过程。每个井中形成的 acini 的数量和大小可以随着时间的推移使用明亮的场成像器进行监控，并用作 TUM622 细胞增殖和自我更新能力的读出。在共聚焦显微镜上，无论是否带有各种标记染料，都可以通过实时成像来观察每个甲锥体形态的更详细动力学。在培养期，可以在多个时间点采集条件介质，以分析可能调节细胞或细胞基质交叉切指的可溶性因子。使用协议4直接从ECM中提取的TUM622细胞适用于RNA和蛋白质提取，用于基因表达分析、流细胞测量定量或基于细胞表面标记的FACS分拣。或者，可以固定培养物进行原位免疫荧光或免疫组化学研究，以了解各种标记的时空分布。虽然类似，免疫作用化学补充免疫荧光方法，因为它允许采样整个阿基尼，由于共聚焦目标有限的成像深度可能是不可能的。对于这两种方法，执行固定和渗透的时间和温度至关重要，特别是考虑到 TUM622 细胞嵌入密集矩阵（>90% 基膜矩阵），这与许多其他 3D 培养物形成鲜明对比，矩阵密度要低得多。因此，要获得复制结果，必须注意标准化和一致的固定和处理。
利用这个系统作为平台，可以研究肿瘤细胞的细胞内在变化，以及肿瘤微环境中的细胞外在变化，如何影响上皮结构，并模拟肿瘤形成的早期事件。例如，肿瘤基因或肿瘤抑制基因在调节肿瘤组织结构中的作用可以通过针对肿瘤细胞中感兴趣的基因的增益或功能丧失实验来研究。事实上，我们证明了SOX2的过度表达（在LUSC中很常见）会改变TUM622细胞的表型，3D中增生丧失和向发育不良生长9的进展就证明了这一点。另一方面，人们可以比较在共同培养环境中的正常成纤维细胞和癌症相关的成纤维细胞，确定基质成分或其刚度如何影响阿基尼生长/形态/入侵，如果阻断某些细胞因子可能会干扰细胞-细胞通信，进而影响组织架构和肿瘤进展。重要的是，所有这些测定都可以在存在或缺乏某些治疗剂的情况下进行，并被用作一种工具，通过多维读出11来确定LUSC细胞的药物反应。还必须注意，这个系统是有限的，它可以用来查询的通路，因为只有一些但不是所有主要的信号通路调节TUM622器官在培养物的生长和形态（即，抑制Wnt，但不是Notch信号影响TUM622细胞的甲酸酶体增生）9。
综上所述，本器官系统为生成对LUSC细胞与肿瘤微环境在肿瘤进展过程中的动态相互作用的新见解提供了一个独特的平台。我们预计我们的模型系统将成为药物发现和开发的宝贵平台。在这方面，筛选在原生肿瘤组织环境中的新型抗癌疗法应有助于选择和开发针对LUSC的更有效的治疗。
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Disclosures
作者是辉瑞公司的雇员和股东。
Acknowledgments
我们感谢马加里·古夫罗伊、约翰·克雷格和辉瑞肿瘤学组织病理学和生物标志物小组为病理学/组织学支持而对手稿进行批判性审查的斯蒂芬尼·比苏尔科。我们还感谢辉瑞博士后计划和肿瘤研发小组，特别是罗伯特·亚伯拉罕、普贾·萨普拉、卡伦·维布丁和詹妮弗·特杰达对该计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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