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Cancer Research

मॉडल फेफड़ों स्क्वैमस कार्सिनोमा प्रगति के लिए बहुआयामी सहसंस्कृति प्रणाली

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60644
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

Summary

कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) के साथ 3-आयामी (3डी) सह-संस्कृति में फेफड़ों के स्क्वैमस कार्सिनोमा (एलएलएससी) प्रगति के दौरान ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों को पकड़ने के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली विकसित की गई थी। यह ऑर्गेनॉइड सिस्टम ट्यूमर फेनोटाइप को मिलाने वाले विविध ट्यूमर सेल-आंतरिक और बाह्य परिवर्तनों की भूमिकाओं की जांच करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है।

Abstract

ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन फेफड़ों के स्क्वैमस कार्सिनोमा (एलएएससी) के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, यह समझना कि ट्यूमरके दौरान देखे गए ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों में ये गतिशील बातचीत कैसे योगदान देती है, उपयुक्त मॉडलों की कमी के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक 3 डी सहसंस्कृति मॉडल की पीढ़ी का वर्णन करते हुए एक LUSC प्राथमिक सेल संस्कृति का उपयोग करके जिसे TUM622 के नाम से जाना जाता है। TUM622 कोशिकाओं को एलयूएससी रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) से स्थापित किया गया था और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त होने पर एसीनार जैसी संरचनाओं को बनाने के लिए अद्वितीय संपत्ति है। हम प्रदर्शित करते हैं कि 3 डी कोकल्चर में TUM622 acini LUSC प्रगति के दौरान ऊतक वास्तुकला की प्रमुख विशेषताओं के साथ-साथ ल्यूएससी कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) के घटकों के बीच गतिशील बातचीत को संक्षिप्त करता है, जिसमें एक्स्सेल्युलर भी शामिल है मैट्रिक्स (ईसीएम) और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) । हम अपने प्रमुख 3डी क्यूल्चरिंग प्रोटोकॉल को और अनुकूलित करते हैं ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए इस प्रणाली का उपयोग कैसे किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह ऑर्गेनॉइड मॉडल एक जैविक रूप से समृद्ध और अनुकूलनीय मंच बनाता है जो कोशिका-आंतरिक और बाह्य तंत्रों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सक्षम बनाता है जो कैंसर विज्ञान प्रगति के दौरान एपिथेलियल आर्किटेक्चर के व्यवधान को बढ़ावा देता है और सहायता करेगा नए चिकित्सीय लक्ष्यों और नैदानिक मार्कर के लिए खोज।

Introduction

फेफड़ों का कैंसर दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मृत्यु का प्रमुख कारण है । फेफड़ों स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (LUSC), जो गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) का दूसरा सबसे आम प्रकार है और सभी फेफड़ों के कैंसर के लगभग 30% के लिए खातों, अक्सर उंनत चरणों में निदान किया जाता है और एक गरीब पूर्वानुमान1है । LUSC रोगियों के लिए उपचार के विकल्प एक प्रमुख अपूरित जरूरत है कि अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र है कि LUSC ट्यूमर रोगन ड्राइव की एक बेहतर समझ से सुधार किया जा सकता है ।

अधिकांश मानव कैंसर के साथ, एलओएससी के रोगजनन को बरकरार, अच्छी तरह से आदेश ित एपिथेलियल ऊतक वास्तुकला2के व्यवधान की विशेषता है। इस प्रक्रिया के दौरान, उचित एपिकल-बेसल सेल ध्रुवता, सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स संपर्क खो जाते हैं, जिससे ट्यूमर कोशिकाओं के अनियंत्रित विकास और आक्रामक व्यवहार की अनुमति मिलती है। अब यह व्यापक रूप से सराहना की है कि कैंसर की कोशिकाओं की घातक सुविधाओं कैंसर की कोशिकाओं और उनके स्थानीय ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME)3के बीच एक महत्वपूर्ण परस्पर क्रिया के बिना प्रकट नहीं किया जा सकता है । एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम), कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) के साथ-साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं और घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित TME में प्रमुख घटक सक्रिय रूप से TME को आकार देते हैं और ट्यूमरजेनेसिस4चलाते हैं। फिर भी, कैसे ट्यूमर कोशिकाओं और TME में इन प्रमुख घटकों के बारे में हमारी वर्तमान समझ LUSC प्रगति के दौरान ऊतक वास्तु परिवर्तन ड्राइव करने के लिए बातचीत बहुत सीमित है ।

त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों में ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों को विनियमित करने में कोशिका-आंतरिक और बाह्य परिवर्तनों की जैविक गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरणहै। 3डी संस्कृतियां उपयुक्त संरचनात्मक और कार्यात्मक संदर्भ प्रदान करती हैं जो आमतौर पर पारंपरिक दो-आयामी (2डी) संस्कृतियों में कमी होती है। इस तरह के सिस्टम के अतिरिक्त आयाम अधिक बारीकी से सेल फिजियोलॉजी और सेलुलर व्यवहार के कई पहलुओं में वीवो में ऊतक की नकल, प्रसार, भेदभाव, प्रवास, प्रोटीन अभिव्यक्ति और दवा उपचार के लिए प्रतिक्रिया सहित । हाल के वर्षों में, विभिन्न प्रयोगशालाओं के प्रयासों से सामान्य फेफड़ों के साथ-साथ एनएससीएलसी6,7,8दोनों के लिए इन विट्रो 3डी मॉडल का विकास हुआ है । हालांकि, फेफड़ों के स्क्वैमस कार्सिनोमा के लिए एक मॉडल जो ट्यूमरके जेनेसिस के दौरान गतिशील ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तन ों दोनों को फिर से तैयार कर सकता है और साथ ही प्रमुख स्ट्रोमल घटकों को शामिल कर सकता है, अनुपलब्ध था।

यहां, हम प्राथमिक पीडीएक्स-व्युत्पन्न एलएएससी कोशिकाओं (TUM622 कहा जाता है) और CAFs9,,10का उपयोग करके एक उपन्यास 3-आयामी (3 डी) सहसंस्कृति प्रणाली स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। TUM622 और CAFs दोनों एनएससीएलसी रोगी से प्राप्त होते हैं, जिनमें खराब विभेदित ट्यूमर10होते हैं । जब ईसीएम में एकल कोशिकाओं के रूप में एम्बेडेड होता है, तो TUM622 कोशिकाओं की एक दुर्लभ उप-जनसंख्या में एसिनार जैसी संरचनाओं के साथ ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता होती है जो उचित एपिकल-बेसल सेल ध्रुवता प्रदर्शित करते हैं। ये एसीनार जैसी संरचनाएं हाइपरप्लास्टिक हैं, जो गैर-आक्रामक रहते हुए मूल ट्यूमर के समान स्टेम-जैसे और विभेदन मार्कर की विषम अभिव्यक्ति प्रदर्शित करती हैं, और इस प्रकार एलयूएससी विकास के शुरुआती चरण की नकल करती हैं। महत्वपूर्ण बात, हमने दिखाया कि एसीनार जैसी संरचनाओं के ऊतक वास्तुकला को छोटे अणु अवरोधकों या ईसीएम जैसे सीएएफ में प्रमुख घटकों के अलावा सेल-आंतरिक सिग्नलिंग रास्तों के अवरोध से बदला जा सकता है, जिनमें से उत्तरार्द्ध एसीनी गठन को बढ़ाता है और निकटता में होने पर एसिनी को आक्रामक बनने के लिए उकसाता है। एक साथ, इन आंकड़ों से पता चलता है कि LUSC ऑर्गेनॉइड की यह 3डी सह-संस्कृति प्रणाली LUSC कोशिकाओं और TME के बीच गतिशील पारस्परिकता की जांच के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करती है और11दवा उपचार के लिए LUSC कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. 2डी संस्कृतियों में TUM622 कोशिकाओं और CAFs Passaging और Culturing

  1. TUM622 कोशिकाओं को पासिंग और संजोना
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर TUM622 कोशिकाओं के लिए गर्म 3 डी संस्कृति माध्यम और सेल विसोशन अभिकर्ता (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. 2डी फ्लैक्स में 80% कन्फ्ल्युचर पर मार्ग TUM622 कोशिकाएं। आमतौर पर, यह पासिंग के 1 सप्ताह बाद होता है।
    3. एक T75 फ्लास्क से पुराने माध्यम को त्यागें और HEPES बफर के 6 mL के साथ एक बार धोलें। कोशिकाओं पर सीधे पाइपिंग से बचें।
    4. हेप्स बफर को एस्पिरेट करते हैं। ट्राइप्सिन/EDTA (०.२५ मिलीग्राम/mL, सामग्री की तालिकादेखें) के 4 mL जोड़ें एक त्वरित कुल्ला और ट्राइप्सिन/EDTA त्यागने के लिए ।
    5. 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइप्सिन/ईटीए और इनक्यूबेट के 2 मिलीएल जोड़ें। इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और हवा के बुलबुले बनाने के बिना कोशिकाओं को ढीला करने के लिए फ्लास्क को टैप करें और अतिरिक्त 5 मिन के लिए इनक्यूबेटर में फ्लास्क वापस करें।
      नोट: ट्राइप्सिन के लिए लंबे समय तक जोखिम अपरिवर्तनीय रूप से कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाएगा और उनके फेनोटाइप को बदल देगा, इस प्रकार समय कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के संपर्क में रखने की सिफारिश की जाती है।
    6. पुष्टि कोशिकाओं को अलग और एक हल्के माइक्रोस्कोप (4x या 10x) के तहत अलग है । बेअसर बफर (टीएनएस बफर) (सामग्री की तालिकामें उपसंस्कृति अभिकर्मक जानकारी देखें) के 4 मिलील जोड़ें( 3 डी संस्कृति माध्यम के 10 मिलील (सामग्री की तालिकादेखें) के बाद।
    7. पिपेट अप-एंड-डाउन धीरे-धीरे 10 मीटर पाइपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को और अलग करने के लिए। एक 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से निलंबन को 50 मीटर शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल नंबरों की गणना करें।
    9. बीज ०.८ x १०६ कोशिकाओं/T75 फ्लास्क 3 डी संस्कृति माध्यम के 20 मिलील में (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    10. खर्च किए गए माध्यम के आधे को ताजा माध्यम से बदलकर हर दूसरे दिन कोशिकाओं को खिलाएं।
  2. पासिंग और कैटलिंग सीएएफ
    1. जब कोशिकाएं प्रवाह तक पहुंचती हैं तो मार्ग सीएएफ। आमतौर पर, यह 1:2 विभाजन से सत्तकार के 5 दिनों के बाद होता है।
    2. 20% हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% एल-ग्लूटामाइन और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ आरपीएमआई बेसल मीडियम का उपयोग करके सीएएफ माध्यम तैयार करें। मीडियम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    3. एक T75 फ्लास्क में, फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) के साथ सीएएफ को कुल्ला एक बार फिर 5 न्यूनतम के लिए ट्राइप्सिन/ईडीटीए और इनक्यूबेट के 2 मिलील को 37 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें कि कोशिकाओं ने फ्लास्क (4x या 10x) में विसोसिएट किया है। यदि नहीं, तो एक और 2-3 मिन के लिए ऊष्मायन का विस्तार करें।
    5. एक बार कोशिकाओं को अलग और अलग कर दिया है, 3 डी संस्कृति माध्यम के 10 mL जोड़ने के लिए ट्राइप्सिन बेअसर/
    6. सेल निलंबन को 50 मीटर शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें।
    7. सुपरनेट को त्यागें और पैलेट को 3 डी संस्कृति माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) की उचित मात्रा में फिर से निलंबित करें और दो नए T75 फ्लैक्स में पारित करें।

2. 3 डी क्यूल्चरिंग के लिए एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स में प्लेटिंग TUM622 कोशिकाएं

  1. प्रयोग से एक दिन पहले, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की शीशियों गल । कूलडाउन प्लास्टिक पिपेट (2 mL) और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर सुझाव।
    नोट: सभी बहुत सारे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में TUM622 कोशिकाओं के 3डी विकास का समर्थन करने की समान क्षमता नहीं है। इसलिए, मजबूत एसीनी गठन का समर्थन करने वालों की पहचान करने के लिए कई बहुत सारे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का अधिग्रहण और परीक्षण करना आवश्यक है। आमतौर पर मैट्रिक्स में इसके लिए प्रोटीन एकाग्रता (16-18 मिलीग्राम/एमएल) की जरूरत होती है।
  2. प्रयोग के दिन 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गर्म 3डी कल्चर मीडियम, हेप्स बफर, ट्राइप्सिन/ईटीए और ट्राइप्सिन बेअसराइजेशन बफर (टीएनएस) । संस्कृति स्थापित करने से तुरंत पहले, गल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स फ्रिज से बाहर ले और बर्फ पर शीशी डाल दिया ।
  3. बर्फ पर रखे धातु के मंच कूलर पर ऊतक संस्कृति प्लेटों को ठंडा करें। बर्फ पर मेटल कूलिंग रैक पर सेंट्रलाइज ट्यूब रखें।
  4. चरण 1.1.7 से प्राप्त TUM622 कोशिकाओं का उपयोग करना, चढ़ाना के लिए आवश्यक कोशिकाओं की वांछित संख्या की गणना करें। आमतौर पर, 15,000-30,0000 कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह से प्लेट की प्रति अच्छी तरह से आवश्यक हैं। कम घनत्व इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए अधिक अनुकूल है, जबकि आरएनए निष्कर्षण या पश्चिमी दाग के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करते समय उच्च घनत्व पसंद किया जाता है।
  5. एक ठंडा अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन (ट्रिपलकेट चढ़ाना के लिए कोशिकाओं युक्त प्रत्येक ट्यूब) में स्थानांतरण सेल निलंबन और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फांसी बाल्टी अपकेंद्रित्र में 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन।
  6. एक अनफ़िल्टर्ड टिप (20 μL) से जुड़े एक aspirating पिपेट के साथ ध्यान से अधिद्य, ट्यूब में माध्यम के लगभग 100 μL छोड़ (एक गाइड के रूप में ट्यूब पर निशान का उपयोग करें) ।
  7. धीरे ट्यूब के किनारे पर नल को उखाड़ फेंकना और यह ठंडा रैक को लौटने से पहले गोली अलग ।
  8. 2 mL पूर्व ठंडा pipettes का उपयोग करना, धीरे से ऊपर और नीचे कई बार पाइपिंग द्वारा मैट्रिक्स मिश्रण करते हुए बर्फ के साथ संपर्क में शीशी रखते हुए । एक सम और मध्यम गति से पिपेट इतना है कि इस प्रक्रिया के दौरान मैट्रिक्स में कोई बुलबुले पेश कर रहे हैं।
  9. मैट्रिक्स की उचित मात्रा को प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। 24-अच्छी प्लेट में ट्रिपलिकेट्स चढ़ाना के लिए, प्रत्येक ट्यूब में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का 1.1 एमएल जोड़ें।
  10. प्री-कूल्ड युक्तियों का उपयोग करके, एक समान सेल निलंबन बनाने के लिए प्रत्येक ट्यूब में मैट्रिक्स को लगभग 10 बार पिपेट करें।
  11. सेल/मैट्रिक्स निलंबन के ३१० μL एक पूर्व ठंडा 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरण । पिपेट को प्लेट की सतह पर 90 डिग्री कोण पर रखा जाता है और निलंबन को कुएं के केंद्र में जोड़ा जाता है। निलंबन फैल जाना चाहिए और थाली झुकाव की जरूरत के बिना पूरी अच्छी तरह से कवर ।
  12. डाउनस्ट्रीम इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण की सुविधा के लिए, 2-वेल चैंबर स्लाइड में समानांतर में सेल/मैट्रिक्स निलंबन को प्लेट करें । सेल/मैट्रिक्स निलंबन के 100 μL 2-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के केंद्र में स्थानांतरण (सामग्री की तालिकादेखें) । यह मैट्रिक्स को बहुत छोटी मात्रा के साथ गुंबद जैसी संरचना बनाने की अनुमति देता है।
  13. थाली वापस और कक्ष एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में वापस स्लाइड और 30 मेंस के लिए इनक्यूबेट मैट्रिक्स जमना करने के लिए अनुमति देते हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि एकल कोशिकाओं को मैट्रिक्स (4x या 10x) के भीतर समान रूप से वितरित किया जाता है, एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट/स्लाइड की जांच करें।
  14. पूर्व गर्म 3 डी संस्कृति के 1 mL जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से और चैंबर स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से 3 डी संस्कृति माध्यम के १.५ mL में पूरा करें तो उन्हें इनक्यूबेटर को वापस ।

3. एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स में TUM622 कोशिकाओं और CAFs के 3 डी कोकुल्चरिंग

  1. धारा 2 के अनुसार TUM622 और CAFs के सेल निलंबन तैयार करें।
  2. सेल निलंबन के 10 μL लेने और यह trypan नीले रंग के 10 μL के साथ मिश्रण द्वारा सीएएफ सेल घनत्व गिनती ।
  3. सेल घनत्व की गणना और गणना करने के लिए एक हेमैमेटोमीटर पर दो कक्षों में से प्रत्येक में मिश्रण के 10 μL जोड़ें।
    नोट: सीएएफ में अनियमित आकार होते हैं और स्वचालित सेल काउंटर पर सटीक रूप से नहीं गिना जा सकता है।
  4. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में TUM622 कोशिकाओं और CAFs सह एम्बेडिंग
    1. सेल घनत्व जानकारी के आधार पर, चढ़ाना के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की वांछित संख्या की गणना करें। सीएएफ TUM622 कोशिकाओं के 2:1 अनुपात में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, 30,000 TUM622 कोशिकाओं के लिए वरीयता प्राप्त, 60,000 सीएएफ सह-एम्बेडेड हैं।
    2. TUM622 की उचित मात्रा के साथ-साथ सीएएफ सेल निलंबन को एक ही अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 24-अच्छी प्लेटों में चढ़ाना के लिए चरण 2.5-2.11 का पालन करें। प्रतिरक्षण के लिए, TUM622/CAFs मिश्रण के ६० μL चैंबर स्लाइड के लिए हस्तांतरण के रूप में कदम २.१२ में वर्णित है) ।
  5. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में मढ़ा CAFs के साथ TUM622 Coculturing (सामग्री की तालिकादेखें)
    1. चरण 2.5-2.13 के अनुसार TUM622 मोनो-कल्चर स्थापित करें।
    2. दो बार CAFs निलंबन की संख्या (TUM622 कोशिकाओं वरीयता प्राप्त की संख्या की तुलना में) एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
    3. 3 डी संस्कृति माध्यम के 1 मिलील में सीएएफ को फिर से निलंबित करें।
    4. सीएफ निलंबन के 1 मिलील को एम्बेडेड TUM622 कोशिकाओं वाले कुएं में स्थानांतरित करें।

4. आरएनए/प्रोटीन निष्कर्षण और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए TUM622 Acini की कटाई

  1. पिछले दिन 3डी सेल हार्वेस्टिंग किट प्रोटोकॉल के अनुसार वॉश बफर और सेल हार्वेस्टिंग बफर तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठंडा करें।
  2. निष्कर्षण प्रक्रिया शुरू करने से पहले बर्फ पर प्लेट कूलर और अन्य अभिकर्मकों पर प्लेटें रखें।
  3. मैट्रिक्स को छूने के बिना 3 डी संस्कृति कुओं से एस्पिरेट मीडिया और धीरे से धोने बफर के 1 mL के साथ अच्छी तरह से 3 बार धोने ।
  4. अंतिम धोने को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से सेल हार्वेस्टिंग बफर का 1 एल जोड़ें।
  5. प्रत्येक कुएं के मैट्रिक्स को कुरेदने के लिए एक p1000 पिपेट टिप का उपयोग करें।
  6. मैट्रिक्स को और अलग करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  7. मिश्रण का 1 मिलीएल पूर्व-ठंडा 15 मिलील शंकुई ट्यूब पर स्थानांतरित करें। एक ही कुएं में हार्वेस्टिंग बफर का एक और 1 mL जोड़ें।
  8. चरण 4.5-4.7 दोहराएं, और एक ही अच्छी तरह से एक 15 mL शंकुट्यूब में सभी मिश्रण स्थानांतरित करें।
  9. ट्यूब ों और रॉक को 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कैप करें।
  10. प्रत्येक ट्यूब को 10 मिलीग्राम तक बर्फ-ठंडा पीबीएस से भरें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  11. गोली को छुए बिना अधिनायक को एस्पिरेट करें। अधिव्रत में मैट्रिक्स के टुकड़े होने चाहिए, लेकिन स्फेरॉइड सभी को ट्यूब के नीचे एकत्र किया जाना चाहिए।
  12. एक दूसरे धोने के लिए बर्फ ठंड पीबीएस जोड़ें । गोली को अलग करने के लिए कई बार ट्यूब को उलटना। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन।
  13. कताई करते समय प्रोटीन और आरएनए कलेक्शन के लिए लाइसिस बफर तैयार करें।
  14. ध्यान से अधिनेता को एस्पिरेट करें और प्रोटीन या आरएनए इकट्ठा करने के लिए डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग के लिए लाइसिस बफर जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को प्रवाह विश्लेषण/FACS छंटाई या धारावाहिक passaging के लिए फिर से निलंबित किया जा सकता है ।

5. TUM622 Acini की प्रतिरक्षण

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर तैयार करें (यदि बफर: 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 0.2% ट्राइटन एक्स-100 और 0.05% ट्वीन-20 के साथ पीबीएस), प्राथमिक अवरुद्ध बफर (10% बकरी सीरम के साथ यदि बफर), माध्यमिक अवरुद्ध बफर (प्राथमिक अवरुद्ध बफर 20 μg/mL बकरी विरोधी माउस एफ एबी(2)
  2. 2-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड से एस्पिरेट माध्यम, पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला और बर्फ पर धातु प्लेट कूलर पर स्लाइड सेट करें। चैंबर स्लाइड प्रोटोकॉल के शेष के लिए धातु प्लेट कूलर पर रहना चाहिए।
  3. 20 मिन के लिए बर्फ पर एसीनी और इनक्यूबेट को ठीक करने के लिए प्री-चिल्ड 4% पीएफए जोड़ें।
  4. 4% पीएफए निकालें और एक झूली कुरसी पर कोमल कमाल के साथ 5 मिन के लिए पूर्व ठंडा PBS प्रत्येक के 2 mL के साथ तीन बार धोने ।
  5. एस्पिरेट पीबीएस और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के 1.5 मिलील के साथ पीबीएस (प्री-चिल्ड) में 20 मिन के लिए परमीट्रिज करें। इस प्रक्रिया के अंत तक, गुंबद जैसी संरचना ढीली हो जाएगी।
  6. नमूना हानि से बचने के लिए कक्ष स्लाइड से परमीबिलाइजेशन बफर को धीरे-धीरे एस्पिरेट करें। यह एस्पिरेटिंग पिपेट में एक ठीक टिप (20 माइक्रोन) जोड़कर और टिप को कक्ष के कोने की ओर दबाकर हासिल किया जाता है।
  7. एक झूली कुरसी पर कोमल कमाल के साथ 5 मिन के लिए पूर्व ठंडा PBS प्रत्येक के 2 mL के साथ तीन बार धोएं ।
  8. 1 घंटे के लिए बर्फ पर प्राथमिक अवरुद्ध बफर के साथ नमूना ब्लॉक ।
  9. प्राथमिक अवरुद्ध बफर निकालें और 30 सीन के लिए माध्यमिक अवरुद्ध बफर और ब्लॉक जोड़ें।
  10. प्राथमिक अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    नोट: यहां इस्तेमाल एंटीबॉडी की एकाग्रता सामान्य रूप से 2 डी संस्कृति में धुंधला कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल की तुलना में अधिक होना चाहिए । इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश प्राथमिक एंटीबॉडी 1:100 कमजोर पड़ने पर पतला होते हैं (सामग्री की तालिकादेखें)।
  11. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और यदि बफर के 2 मिलील के साथ नमूना 3 बार धोएं।
    नोट: नमूने ढीले हो सकते हैं, जब aspirating अतिरिक्त सावधानी बरतें।
  12. माध्यमिक एंटीबॉडी में नमूनों को आरटी में 1 घंटे के लिए प्राथमिक अवरुद्ध बफर में पतला इनक्यूबेट। पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए पसंदीदा माध्यमिक एंटीबॉडी को अत्यधिक क्रॉस-एडोरबेड किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश माध्यमिक एंटीबॉडी 1:200 कमजोर पड़ने पर पतला होते हैं।
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और यदि बफर के 2 मिलील के साथ नमूना 3 बार धोएं।
    नोट: नमूने ढीले हो सकते हैं, जब aspirating अतिरिक्त सावधानी बरतें।
  14. नाभिक को दाग देने के लिए अंतिम धोने के दौरान डीएपीआई (1:1,000 कमजोर पड़ने) के साथ पीबीएस जोड़ें। पीबीएस में एक और 2 वॉश प्रदर्शन करते हैं ।
  15. 3 दिनों के भीतर एक confocal माइक्रोस्कोप पर नमूनों की छवि।
    नोट: ऑब्जेक्टिव की वर्किंग डिस्टेंस में ऑर्गेनॉइड के आकार और सीमाओं के कारण, नमूनों को आमतौर पर 10x या 20x आवर्धन पर चित्रित किया जाता है।

6. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए 3डी कल्चर सैंपल तैयार करना

  1. 2-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड से एस्पिरेट माध्यम और पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला।
  2. 3डी संस्कृतियों को 4% पीएफए में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठीक करें।
  3. 4% पीएफए निकालें, हिस्टोलॉजी नमूना जेल के 2.5 मिलील के साथ संस्कृतियों को घेरें (सामग्री की तालिकादेखें) और स्लाइड को कम से कम 1 घंटे के लिए जमना करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. ऊतक कैसेट के लिए हिस्टोलॉजिकल नमूना जेल के साथ घिरे नमूनों को स्थानांतरित करें और रातोंरात एक स्वचालित ऊतक नमूना प्रोसेसर में संसाधित करें।
  5. पैराफिन मोम में नमूने एम्बेड करें औरधारा 12के लिए तैयार करें ।

7. यौगिक स्क्रीनिंग के लिए 3 डी साइटोटॉक्सिकिटी परख (एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए उदाहरण)

  1. एक प्लेट कूलर पर एक ९६-अच्छी तरह से थाली सेट, एक जलाशय कूलर पर एक 25 mL जलाशय और प्रयोग शुरू करने से पहले बर्फ पर एक 15 mL शंकुट्यूब ।
  2. कोशिकाओं में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उचित मात्रा जोड़कर एक पूर्व ठंडा 15 मीटर पॉलीप्रोपाइलीन शंकुट्यूब में TUM622 कोशिकाओं के सेल मैट्रिक्स निलंबन तैयार करें। TUM622 कोशिकाओं के लिए वांछित घनत्व तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 70-75 μL प्रति 10,000 कोशिकाओं है। मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं के मिश्रण की अनुमति देने के लिए कुछ समय ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  3. स्थानांतरण के दौरान बर्फ के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के संपर्क से बचने के लिए बर्फ से दूर एक जलाशय कूलर के साथ प्लेट कूलर और जलाशय के साथ थाली ले जाएँ।
  4. बुलबुले बनाने के बिना मैट्रिक्स सेल मिश्रण को ठंडा जलाशय में स्थानांतरित करें।
  5. एक यांत्रिक मल्टीचैनल पिपेट (10-300 माइक्रोन) का उपयोग करके, मिश्रण कोशिकाओं के 70-75 माइक्रोन को 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक उपयुक्त कुएं में स्थानांतरित करें।
  6. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जमना करने के लिए 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट प्लेट।
  7. सभी पंक्तियों में मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें और इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस।
  8. प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर अगले दिन या बाद में यौगिक खुराक शुरू करें।
  9. स्फेरॉइड को 8-या 12-वेल वैक्यूम कई गुना खर्च किए गए मीडिया को हटाकर और वांछित यौगिकों के बिना ताजा मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करके 10 दिनों तक हर 2-3 दिनों में फिर से खिलाया और फिर से खुराक किया जा सकता है।
  10. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 3डी इमेजर का उपयोग करके TUM622 स्फेरॉइड की संख्या की मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

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Representative Results

2डी संस्कृति में TUM622 और CAFs
चित्रा 1 2डी संस्कृति में TUM622 कोशिकाओं और CAFs की विशिष्ट आकृति विज्ञान प्रस्तुत करता है। TUM622 कोशिकाओं को बड़े नाभिक के साथ गोल किया जाता है जबकि सीएएफ सपाट और लम्बी होती हैं। TUM622 कोशिकाओं संस्कृति में 80%-90% प्रवाह तक पहुंच सकते हैं। आगे प्रसार अधिक होता है, लेकिन छोटी कोशिकाओं को सीधे संपर्क में नहीं आने वाली कॉलोनियों में एकत्रित किया जाता है। इसके विपरीत, सीएएफ उच्च कोशिका घनत्व पर बढ़ना पसंद करते हैं और यदि पर्याप्त पोषक तत्व प्रदान किए जाते हैं तो पूर्ण प्रवाह पर प्रसार करते रहेंगे।

3डी ईसी एम में TUM622 acini के विकास और आकृति विज्ञानM
चित्रा 2 3 डी संस्कृति में वरीयता प्राप्त TUM622 कोशिकाओं का एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग प्रस्तुत करता है। आंकड़ों से पता चलता है कि एकल TUM622 कोशिकाएं एम्बेडेड होने पर एसिनार जैसी मॉर्फोलोजी के साथ ऑर्गनॉइड बनाने में सक्षम हैं। 5 और 7 दिनों के बीच, एक लुमेन एसीनार जैसी संरचनाओं में स्पष्ट हो जाता है और उसके बाद खोखला रहता है(चित्रा 2ए)। प्रत्येक एसीइनस, खोखले लुमेन के आसपास की कोशिकाओं के मोनोलेयर से बना है, विवो में फेफड़ों के एपिथेलियम(चित्रा 2बी)के समान उचित एपिकल-बेसल ध्रुवता प्रदर्शित करता है। ये एसीनार जैसी संरचनाएं हाइपरप्लास्टिक हैं और जब तक पर्याप्त पोषक तत्व प्रदान किए जाते हैं तब तक बढ़ता रहता है। ईसीएम पूरी तरह से विखंडित होने से पहले संस्कृति को 24 दिनों तक बनाए रखा जा सकता है(चित्रा 2सी)। कमजोर पड़ने परख (एलडीए) (एलडीए) (नहीं दिखाए गए डेटा) को सीमित करने के माध्यम से, यह अनुमान लगाया गया है कि TUM622 कोशिकाओं (<0.02%) की केवल एक दुर्लभ उपआबादी एसिनर जैसी संरचनाओं9बनाने की क्षमता है .

TUM622-CAFs सहसंस्कृति के विकास और आकृति विज्ञान
चित्रा 3 TUM622-CAF सहसंस्कृतियों के सेटअप और प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाया गया है। सीएएफ को या तो मैट्रिक्स के शीर्ष पर ओवरलेज करके या TUM622 कोशिकाओं के साथ सह-एम्बेडेड द्वारा सह-संस्कृति में एकीकृत किया जा सकता है। सेटअप की परवाह किए बिना, सीएएफ की उपस्थिति ने गठित स्फेरॉइड(चित्रा 3बी)की संख्या और आकार को बहुत बढ़ाया। दिलचस्प बात यह है कि जब TUM622 acini CAFs के साथ निकटता में आते हैं, वे acini को आक्रामक बनने के लिए प्रेरित करते हैं और सीएएफ की ओर माइग्रेट करते हैं, संरचनाओं की तरह "आंसू-ड्रॉप" बनाते हैं(चित्रा 3सी)। ध्यान दें कि मोनोकल्चर में TUM622 acini आक्रामक व्यवहार प्रदर्शित नहीं करता है और केवल सीएएफ के करीब होने पर संरचनाओं की तरह "आंसू-ड्रॉप" बनाते हैं।

प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला परिणाम
चित्रा 4 10 दिनों की रचनात्मकता के बाद TUM622 acini के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला प्रतिरक्षण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है । कॉन्फोकल छवियों को इम्यूनोफ्लोरेसेंटी दाग TUM622 acini(चित्र 4ए)के भूमध्य रेखीय विमान में लिया गया था । इसके विपरीत, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सैंपल से प्रत्येक खंड विभिन्न विमानों(चित्र4बी)पर एसीनी पर कब्जा कर सकता है। दोनों परिणामों में प्रत्येक एसीइनस के भीतर स्टेम जैसी और विभेदित कोशिकाओं की विषम अभिव्यक्ति दिखाई दी ।

TUM622 3D साइटोटॉक्सिकिटी परख एक Wnt मार्ग अवरोधक का उपयोग कर
चित्रा 5 XAV939, एक tankyrase अवरोधक(चित्रा 5ए, बी)के साथ इलाज TUM622 acini की खुराक प्रतिक्रिया से पता चलता है । XAV939 संस्कृति में जोड़ा गया था 1 दिन चढ़ाना के बाद और कुल 10 दिनों के लिए हर 2 दिन ताजा । प्रयोग के अंत में, एसीनी की संख्या को एक इमेजर द्वारा निर्धारित किया गया था। उच्च आवर्धन पर ब्राइटफील्ड छवियों को भी नियंत्रण बनाम XAV939-इलाज कुओं(चित्र 5सी)में स्फेरॉइड की आकृति विज्ञान पर कब्जा करने के लिए अधिग्रहीत किया गया । कुल मिलाकर, XAV939 acini गठन पर खुराक पर निर्भर अवरोध प्रदर्शित करता है और गोलाकार के ऊतक वास्तुकला को बदल देता है। इन परिणामों से पता चलता है कि TUM622 acinar मॉर्फोजेनेसिस के दौरान विहित Wnt मार्ग की सक्रियता की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्रा 1: 2डी संस्कृति में TUM622 और CAFs। 2डी में सुसंस्कृत TUM622 कोशिकाओं और CAFs के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े को चेन एट अल9 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 3डी ईसीएम में TUM622 acini की वृद्धि और आकृति विज्ञान। (A)10 दिन की अवधि में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सुसंस्कृत TUM622 कोशिकाओं के टाइम कोर्स छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन।(बी)TUM622 acini के इम्यूनोफ्लोरेसेंस एपिकल-बेसल सेल पोलारिटी मार्कर, गोलगी-एंजाइम (जीएम-130, ग्रीन, एपिकल) और इंटेग्रिन अल्फा 6 (सीडी49एफ, बेसल, रेड) के साथ दागदिया। (ग)एसिनी नंबर (दाएं वाई-एक्सिस, रेड) और संस्कृति में 24 दिनों में 24 दिनों में 24-अच्छी प्लेट में त्रिपाल में चढ़ाया गया एसीनी (बाएं वाई-एक्सिस, ब्लू) का औसत आकार । त्रुटि बार एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को चेन एट अल9 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: TUM622-CAFs सहसंस्कृति के विकास और आकृति विज्ञान। (A)TUM622-CAFs सहसंस्कृति के सेटअप की योजनाबद्ध ड्राइंग। सीएएफ ईसीएम में TUM62 कोशिकाओं के साथ मढ़ा या सह-एंबेडेड है। सहसंस्कृति में 6-12 दिनों के बाद, TUM622 कोशिकाएं मोनो-कल्चर की तुलना में अधिक से अधिक बड़ी एसीनी बनाने में सक्षम हैं और सीएएफ के साथ निकटता और सीधे संपर्क में ईसीएम पर आक्रमण करते हैं। ध्यान दें कि आक्रामक फेनोटाइप केवल सह-संस्कृति में देखा जा सकता है। (ख)8 दिनों के बाद मढ़ा सीएएफ की उपस्थिति या अनुपस्थिति में TUM622 3D संस्कृतियों की ब्राइटफील्ड छवि। स्केल बार = 200 माइक्रोन(सी)ब्राइटफील्ड छवियां जो सीएएफ की परवाह किए बिना सहसंस्कृतियों में बनने वाली आंसू-बूंद के आकार की एसीनी दिखाती हैं, ईसीएम में मढ़ा या सह-एंबेडेड हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े को चेन एट अल9 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला परिणाम। (A)स्टेम/प्रोजेनिटर सेल (सीएक्ससीआर4 और SOX2), मेसेनचिम (विमेंटिन), एपिथेलियल विभेदन (इनवोलुक्राइन), एपोप्टोसिस (क्लीव्ड-कैस्पास-3) और प्रसार (कि67) के मार्कर के साथ एसीनी का एंटीबॉडी धुंधला, हरे रंग में डीपीआई, ई-कैशेरिन और फालिनॉयरेड में लाल रंग में लाल रंग में । स्केल बार = 50 माइक्रोन.(B)TUM622 acini के FFPE वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। स्केल बार = 100 माइक्रोन (ऊपर) और 50 माइक्रोन (नीचे)। इस आंकड़े को चेन एट अल9 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: TUM622 3D साइटोटॉक्सिकिटी परख एक Wnt मार्ग अवरोधक का उपयोग कर । (क)96-अच्छी प्लेट में स्फेरॉइड संख्याओं का परिमाणीकरण जहां TUM622 कोशिकाओं का इलाज डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (नियंत्रण) या XAV939 के साथ किया गया था। प्रत्येक स्थिति ट्रिपलिकेट्स में परखे है। त्रुटि सलाखों के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं(बी)एक 24 अच्छी तरह से एक इमेजर के साथ लिया प्लेट से पूरी अच्छी तरह से छवियों acini गठन पर XAV939 के निरोधात्मक प्रभाव दिखा । (ग)नियंत्रण बनाम इलाज कुओं से प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां XAV939 उपचार के कारण रूपात्मक परिवर्तनों का प्रदर्शन । स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े को चेन एट अल9 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ट्यूमर कैंसर कोशिकाओं से बने विषम ऊतक हैं जो कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं और ईसीएम के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ-साथ मौजूद होते हैं। साथ में, ये विविध घटक ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को पार करते हैं और प्रभावित करते हैं, ट्यूमर को चलाने में सक्रिय भूमिका निभाते हैं, एक प्रक्रिया जिसमें ट्यूमर वास्तुकला में प्रगतिशील परिवर्तन शामिल हैं। आदर्श रूप से, ट्यूमर विकास का एक इन विट्रो मॉडल वीवो में मानव ट्यूमर में देखे गए गतिशील ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों को पकड़ने में सक्षम होना चाहिए, ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर विविध कोशिका प्रकारों का जटिल परस्पर क्रिया और एक ही समय में परमिट TME में ट्यूमर कोशिकाओं और घटकों दोनों पर प्रयोगात्मक हेरफेर। हालांकि हाल के वर्षों में 3डी कैंसर मॉडलों में बहुत प्रगति हुई है, लेकिन ऐसे मॉडल LUSC के लिए आसानी से नहीं आ रहे हैं । अधिकांश मॉडलों को तारीख को रिपोर्ट केवल इन महत्वपूर्ण सुविधाओं के कुछ पहलुओं को शामिल । यहां हम LUSC की 3डी सहसंस्कृति प्रणाली के तरीकों की रिपोर्ट करते हैं जो साथ ही एलयूएससी विकास के दौरान देखे गए प्रमुख ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों के साथ-साथ ट्यूमर कोशिकाओं और ईसीएम सहित टीएमई के प्रमुख घटकों के बीच गतिशील बातचीत को कैप्चर करते हैं और सीएएफ।

ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों को अधिक सटीक रूप से मॉडल करने के लिए इस प्रणाली की क्षमता 3 डी ईसी में एम्बेडेड होने पर एसिनर जैसी मॉर्फोलोजी के साथ ऑर्गनॉइड बनाने में TUM622 कोशिकाओं की अनूठी संपत्ति पर आधारित है। एक आत्म नवीनीकरण एकल कोशिका से बना, प्रत्येक acinus एक खोखले lumen आसपास की कोशिकाओं के एक मोनोलेयर से बना है । कोशिकाओं का यह मोनोलेयर एपिकल-बेसल सेल ध्रुवता को प्रदर्शित करता है और फेफड़ों के एपिथेलियम के ऊतक वास्तुकला जैसा दिखता है, गैर-आक्रामक रहता है। जबकि 3 डी मोनो-कल्चर डिस्प्ले हाइपरप्लास्टिक ग्रोथ के रूप में TUM622, सीएएफ के अलावा एसीनार मॉर्फोजेनेसिस को और बढ़ाता है और अधिक से अधिक बड़ी एसीनी को बनाने के लिए प्रेरित करता है। महत्वपूर्ण बात, सीएएफ TUM622 कोशिकाओं में गतिशील ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों का आह्वान करते हैं जब दो सेल प्रकार निकट निकटता में आते हैं, जिससे TUM622 कोशिकाओं को अपने एपिकल-बेसल ध्रुवता को खोने और सीएएफ की ओर मैट्रिक्स पर आक्रमण करने की अनुमति मिलती है। ये फेनोटाइपिक परिवर्तन शुरुआती हाइपरप्लासिया के साथ-साथ एलएएससी के देर से आक्रामक चरणों दोनों को फिर से दोहराते हैं।

कई ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल के विपरीत जहां प्रत्येक स्फेरॉइड कई कोशिकाओं के एकत्रीकरण से बनता है, प्रत्येक TUM622 acinus एक ही कोशिका9से प्राप्त होता है। इन विट्रो एलडीए द्वारा, यह अनुमान लगाया गया है कि केवल एक छोटी-मोटी उपजनसंख्या (0.02%) TUM622 कोशिकाओं की ऐसी क्षमता9है . हालांकि दुर्लभ, इन कोशिकाओं को स्वयं को नवीनीकृत कर सकता है के रूप में अपनी क्षमता का सबूत 3 डी में धारावाहिक passaging से गुजरना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मूल ट्यूमर के समान कोशिकाओं की एक विषम आबादी में अंतर । TUM622 कोशिकाओं की इस अनूठी विशेषता के कारण, सफल पुलिया और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए चढ़ाना के समय ईसीएम के भीतर एकल TUM622 कोशिकाओं का वितरण भी सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल में कई प्रमुख बिंदुओं का सावधानीपूर्वक पालन करने की आवश्यकता है, जिसमें उचित सीडिंग घनत्व का निर्धारण, समय से पहले जमना को रोकने के लिए कोशिकाओं और मैट्रिक्स के मिश्रण के दौरान सभी उपकरणों और अभिकर्मकों को ठंडा रखना, मिश्रण प्रक्रिया के दौरान बुलबुले की शुरूआत से बचना और संस्कृति माध्यम जोड़ने से पहले मैट्रिक्स को पूरी तरह से जमना करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देना शामिल है। एक साथ, इन सावधानियों सभी एम्बेडेड कोशिकाओं के लिए एक और अधिक समान मैट्रिक्स सब्सट्रेट और संस्कृति की स्थिति को प्राप्त करने में मदद मिलेगी ।

एक बार सफलतापूर्वक स्थापित होने के बाद, इस संस्कृति का उपयोग ट्यूमरजेनेसिस को विनियमित करने वाली कोशिका और जैव रासायनिक प्रक्रिया को विच्छेदन करने के लिए विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है। प्रत्येक कुएं में गठित एसीनी की संख्या और आकार उज्ज्वल क्षेत्र इमेजर्स के साथ समय के साथ निगरानी की जा सकती है और इसे TUM622 कोशिकाओं की प्रसारात्मक और आत्म-नवीकरण क्षमता के लिए एक readout के रूप में उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक एसीइनस के मॉर्फोजेनेसिस में अधिक विस्तृत गतिशीलता को विभिन्न लेबलिंग रंगों के साथ या बिना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लाइव-इमेजिंग के साथ देखा जा सकता है। वातानुकूलित माध्यम घुलनशील कारकों का विश्लेषण करने के लिए संस्कृति अवधि के दौरान कई समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है जो सेल-सेल या सेल-मैट्रिक्स क्रॉस-टॉक में मध्यस्थता कर सकते हैं। प्रोटोकॉल 4 का उपयोग करईसीएम से सीधे निकाली गई TUM622 कोशिकाएं कोशिका सतह मार्कर के आधार पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री क्वांटिफिकेशन या एफएसीएस छंटाई के लिए आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपयुक्त हैं। वैकल्पिक रूप से, संस्कृतियों को विभिन्न मार्कर के स्थानिक-लौकिक वितरण को समझने के लिए सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन में तय किया जा सकता है। हालांकि इसी तरह, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधियों का पूरक है जिसमें यह संपूर्ण एसीनी के नमूने की अनुमति देता है जो कॉन्फोकल उद्देश्यों की सीमित इमेजिंग-गहराई के कारण संभव नहीं हो सकता है। इन दोनों तरीकों के लिए, जिस समय और तापमान पर निर्धारण और परमीबिलाइजेशन किया जाता है, वह महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से यह देखते हुए कि TUM622 कोशिकाओं को कई अन्य 3 डी संस्कृतियों के विपरीत घने मैट्रिक्स (>90% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) में एम्बेडेड किया जाता है जहां मैट्रिक्स घनत्व बहुत कम है। इसलिए, दोहराव परिणाम प्राप्त करने के लिए मानकीकृत और लगातार निर्धारण और प्रसंस्करण पर ध्यान देना आवश्यक है।

एक मंच के रूप में इस प्रणाली का उपयोग करना, एक तो जांच कर सकते है कैसे ट्यूमर कोशिकाओं में सेल आंतरिक परिवर्तन, साथ ही ट्यूमर माइक्रोवातावरण में सेल बाह्य परिवर्तन, प्रभाव एपिथेलियल वास्तुकला और मॉडल प्रारंभिक कैंसर कारक गठन में शामिल घटनाओं । उदाहरण के लिए, ट्यूमर ऊतक वास्तुकला को विनियमित करने में ऑनकोजीन या ट्यूमर दमन जीन की भूमिकाओं का अध्ययन ट्यूमर कोशिकाओं में रुचि के जीन को लक्षित करने वाले लाभ या हानि-समारोह प्रयोग द्वारा किया जा सकता है। दरअसल, हमने दिखा दिया कि SOX2 की अधिक अभिव्यक्ति, जो आमतौर पर LUSC में मनाई जाती है, TUM622 कोशिकाओं के फेनोटाइप को बदल देता है जैसा कि 3 डी में हाइपरप्लासिया के नुकसान और डिस्प्लास्टिक विकास9की दिशा में प्रगति का सबूत है। दूसरी ओर, कोई भी सामान्य बनाम कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की तुलना कोकल्चर सेटिंग्स में कर सकता है, यह निर्धारित करता है कि मैट्रिक्स घटक या इसकी कठोरता प्रभाव acini विकास/आकृति विज्ञान/आक्रमण कैसे होता है, और यदि कुछ साइटोकिन्स को अवरुद्ध करने से सेल-सेल संचार में हस्तक्षेप हो सकता है और बदले में ऊतक वास्तुकला और ट्यूमर प्रगति को प्रभावित कर सकता है । महत्वपूर्ण बात, इन सभी परखों को कुछ चिकित्सीय एजेंटों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया जा सकता है और एक बहुआयामी readout11के साथ LUSC कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रणाली में सीमित है रास्तों यह पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के संबंध में, के रूप में केवल कुछ लेकिन नहीं सभी प्रमुख संकेत रास्ते विकास और संस्कृति में TUM622 ऑर्गेनोइड के आकृति विज्ञान को विनियमित (यानी, Wnt के निषेध लेकिन नहीं पायदान संकेत TUM622 कोशिकाओं के acinar mophogenesis को प्रभावित करता है)9।

संक्षेप में, हम प्रदर्शित करते हैं कि यह ऑर्गेनॉइड सिस्टम ट्यूमर प्रगति के दौरान LUSC कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के बीच गतिशील परस्पर क्रिया में नई अंतर्दृष्टि पैदा करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है। हमें आशा है कि हमारी मॉडल प्रणाली दवा खोज और विकास के लिए एक मूल्यवान मंच होगा । इस संबंध में, एक देशी ट्यूमर ऊतक संदर्भ में उपन्यास विरोधी कैंसर चिकित्सा स्क्रीनिंग LUSC लक्ष्यीकरण अधिक प्रभावी चिकित्सा विज्ञान के चयन और विकास में सहायता करनी चाहिए ।

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Disclosures

लेखक कर्मचारी और फाइजर इंक के शेयरधारक हैं ।

Acknowledgments

हम मैगली गफरॉय, जॉन क्रेगर और फाइजर-ऑन्कोलॉजी हिस्टोपैथोलॉजी और बायोमार्कर समूह के स्टेफनी बिसुल्को को पैथोलॉजी/हिस्टोलॉजी सपोर्ट के लिए और माइकल एरेन्समैन को पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धन्यवाद देते हैं । हम इस कार्यक्रम के समर्थन के लिए फाइजर पोस्टडॉक्टोरल प्रोग्राम और ऑन्कोलॉजी आर एंड डी समूह, विशेष रूप से रॉबर्ट अब्राहम, पूजा सपरा, करेन विडबिन और जेनिफर तेजादा को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

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References

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कैंसर रिसर्च इश्यू 157 3डी कोकल्चर फेफड़ों का कैंसर कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट एसीनार मॉर्फोजेनेसिस ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स
मॉडल फेफड़ों स्क्वैमस कार्सिनोमा प्रगति के लिए बहुआयामी सहसंस्कृति प्रणाली
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Chen, S., Giannakou, A., Golas, J.,… More

Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

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