Flerdimensionale Coculture System til Model Lung Planocellualt Karcinom Progression

Summary

En in vitro model system blev udviklet til at fange væv arkitektoniske ændringer under lunge planocelluøs karcinom (LUSC) progression i en 3-dimensionel (3D) co-kultur med kræft-associerede fibroblaster (CAFs). Dette organoid system giver en unik platform til at undersøge rollerne af forskellige tumor celle-iboende og ydre ændringer, der modulerer tumor fænotype.

Abstract

Tumor-stroma interaktioner spiller en afgørende rolle i udviklingen af lunge planocelluøs karcinom (LUSC). Men, forstå, hvordan disse dynamiske interaktioner bidrage til væv arkitektoniske ændringer observeret under tumorigenesis fortsat udfordrende på grund af manglen på passende modeller. I denne protokol beskriver vi genereringen af en 3D-coculture-model ved hjælp af en LUSC primærcellekultur kendt som TUM622. TUM622 celler blev etableret fra en LUSC patient-afledt xenograft (PDX) og har den unikke egenskab til at danne acinar-lignende strukturer, når seedet i en kælder membran matrix. Vi viser, at TUM622 acini i 3D-kokultur opsummerer de vigtigste elementer i vævsarkitekturunder LUSC-progression samt de dynamiske interaktioner mellem LUSC-celler og komponenter i tumormikromiljøet (TME), herunder det ekstracellulære (ECM) og kræftrelaterede fibroblaster (CAF'er). Vi yderligere tilpasse vores vigtigste 3D dyrkning protokol for at vise, hvordan dette system kan udnyttes til forskellige downstream analyser. Samlet set skaber denne organoidmodel en biologisk rig og fleksibel platform, der gør det muligt for en at få indsigt i de celleiboende og ydre mekanismer, der fremmer afbrydelsen af epitelarkitekturer under karcinomprogression og vil hjælpe søgen efter nye terapeutiske mål og diagnostiske markører.

Introduction

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed på verdensplan. Lunge pladecellekarcinom (LUSC), som er den næsthyppigste form for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og tegner sig for ca 30% af alle lungekræft, er ofte diagnosticeret på fremskredne stadier og har en dårlig prognose¹. Behandlingsmuligheder for LUSC patienter er et stort udækket behov, der kan forbedres ved en bedre forståelse af de underliggende cellulære og molekylære mekanismer, der driver LUSC tumorigenesis.

Som med de fleste menneskelige kræftformer, patogenesen af LUSC er kendetegnet ved afbrydelse af den intakte, velordnet epitelvæv arkitektur². Under denne proces, korrekt apilogisk-basal celle polaritet, celle-celle og celle-matrix kontakter er tabt, tillader ukontrolleret vækst og invasiv adfærd tumorceller. Det er nu almindeligt værdsat, at de ondartede træk ved kræftceller ikke kan manifesteresig uden et vigtigt samspil mellem kræftceller og deres lokale tumor mikromiljø (TME)³. Nøglekomponenter i TME herunder ekstracellulær matrix (ECM), kræft-associerede fibroblaster (CAFs) samt endotelceller og infiltrerende immunceller aktivt forme TME og drev tumorigenesis⁴. Ikke desto mindre, vores nuværende forståelse af, hvordan tumorceller og disse centrale komponenter i TME interagere for at drive væv arkitektoniske ændringer under LUSC progression er meget begrænset.

Tredimensionel (3D) kultur er et vigtigt redskab til at studere de biologiske aktiviteter af celle-iboende og ydre ændringer i reguleringen af væv arkitektoniske ændringer i både normale og syge væv⁵. 3D-kulturer giver den passende strukturelle og funktionelle kontekst, der normalt mangler i traditionelle todimensionale (2D) kulturer. De ekstra dimensioner af sådanne systemer mere nøje efterligne væv in vivo i mange aspekter af celle fysiologi og cellulære adfærd, herunder spredning, differentiering, migration, protein udtryk og reaktion på narkotikabehandling. I de seneste år har indsatsen fra forskellige laboratorier ført til udvikling af in vitro 3D-modeller for både den normale lunge samt NSCLC^6,7,8. Men en model for lunge planocelluøs karcinom, der kan opsummere både den dynamiske væv arkitektoniske ændringer under tumorigenesis samt indarbejde centrale stromale komponenter var ikke tilgængelig.

Her beskriver vi metoderne til etablering af en ny 3-dimensionel (3D) coculture system ved hjælp af primære PDX-afledte LUSC celler (benævnt TUM622) og CAFs^9,10. Både TUM622 og CAFs er afledt af NSCLC patient med dårligt differentierede tumorer¹⁰. Når indlejret som enkelte celler i ECM, en sjælden delpopulation af TUM622 celler har kapacitet til at danne organoider med acinar-lignende strukturer, der viser korrekt apilogisk-basal celle polaritet. Disse acinar-lignende strukturer er hyperplastiske, vise heterogene udtryk for stilk-lignende og differentiering markører ligner den oprindelige tumor, mens de resterende ikke-invasive, og dermed efterligne den tidligste fase af LUSC udvikling. Vigtigt, vi viste, at væv arkitektur acinar-lignende strukturer kunne ændres ved hæmning af celle-iboende signalering veje med små molekyle hæmmere eller tilsætning af centrale komponenter i ECM såsom CAFs, hvoraf sidstnævnte øger acini dannelse og yderligere provokerer acini at blive invasive, når i umiddelbar nærhed. Tilsammen tyder disse data på, at dette 3D-co-kultursystem af LUSC-organoider udgør en værdifuld platform for undersøgelse af den dynamiske gensidighed mellem LUSC-celler og TME og kan tilpasses til overvågning af LUSC-cellers reaktion på narkotikabehandling^11.

Protocol

1. Passaging og culturing TUM622 Celler og CAFs i 2D-kulturer

1. Passaging og dyrkning AF TUM622-celler
   1. Varm 3D-dyrkningsmedium og celledissociationsreagenser (se Materialetabel)til TUM622-celler ved 37 °C.
   2. Passage TUM622 celler ved 80% sammenløb i 2D kolber. Normalt sker dette 1 uge efter passaging.
   3. Gammelt medium kasseres fra en T75-kolbe, og vaskes én gang med 6 ml HEPES-buffer. Undgå at pipettere direkte på cellerne.
   4. Aspirere HEPES-bufferen. Der tilsættes 4 ml trypsin/EDTA (0,25 mg/ml, se Materialetabel)for en hurtig skylning og kassér trypsin/EDTA.
   5. Der tilsættes 2 ml trypsin/EDTA og inkuberes ved 37 °C i 5 min. Fjern kolber fra rugemaskinen, og kolberne tilføres kolberne for at løsne cellerne uden at danne luftbobler og vend ind til rugemaskinen i yderligere 5 minutter.
      BEMÆRK: Langvarig udsættelse for trypsin vil uopretteligt skade cellerne og ændre deres fænotype, og det anbefales derfor at begrænse den tid, cellerne udsættes for trypsin.
   6. Bekræft celler har løsrevet og dissocieret under et lys mikroskop (4x eller 10x). Der tilsættes 4 ml neutraliseringsbuffer(TNS-buffer) (se oplysninger om subkulturreagens i materialetabellen ) efterfulgt af 10 ml 3D-kulturmedium (se Materialetabel).
   7. Pipette op og ned forsigtigt for yderligere at adskille cellerne ved hjælp af en 10 ml pipette. Suspensionen overføres gennem en 40 μm cellesi til et konisk 50 ml rør.
   8. Tæl celletal ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
   9. Frø 0,8 x 10⁶ celler/T75 kolbe i 20 ml 3D-dyrkningsmedium (se Materialetabel).
   10. Giv cellerne mad hver anden dag ved at erstatte halvdelen af det brugte medium med frisk medium.
2. Passaging og dyrkning CAFs
   1. Passage CAF'er, når cellerne når sammenløbet. Normalt sker dette efter 5 dages dyrkning fra en 1:2 split.
   2. Klargør CAF-mediet med RPMI-basalmedium med 20% varmeinaktiveret fosterserum, 1% L-glutamin og 1% Penicillin/Streptomycin. Varm mediet til 37 °C.
   3. I en T75-kolbe skylles CAF'er med fosfat-bufferet saltvand (PBS) én gang og tilsættes 2 ml trypsin/EDTA og inkuberes ved 37 °C i 5 min.
   4. Overhold under et let mikroskop for at sikre, at cellerne er dissocieret i kolben (4x eller 10x). Hvis ikke, forlænge inkubationen i yderligere 2-3 min.
   5. Når cellerne har løsrevet og dissocieret, tilsættes 10 ml 3D-kulturmedium for at neutralisere trypsin/EDTA og pipette op og ned flere gange for yderligere at adskille CAF'erne.
   6. Cellesuspensionen overføres til et konisk 50 ml rør, og der spins ned ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
   7. Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes igen i et passende volumen af 3D-dyrkningsmedium (se Materialetabel ) og føresi to nye T75-kolber.

2. Plating TUM622 Celler i den ekstracellulære Matrix til 3D Culturing

1. Dagen før forsøget tø hætteglas af kælder membran matrix i en 4 °C køleskab natten over. Cooldown plast pipetter (2 ml) og tips ved -20 °C natten over.
   BEMÆRK: Ikke alle masser af kælder membran matrix har samme kapacitet til at understøtte 3D-vækst af TUM622 celler. Derfor er det nødvendigt at erhverve og teste flere masser af kælder membran matrix til at identificere dem, der understøtter robust acini dannelse. Normalt kræver dette en højere proteinkoncentration (16-18 mg/ml) i matrixen.
2. På dagen for forsøget, varm 3D kultur medium, HEPES buffer, trypsin / EDTA og trypsin neutralisering buffer (TNS) i en 37 °C vandbad. Umiddelbart før opsætning af kulturen, tage optøet kælder membran matrix ud af køleskabet og sætte hætteglasset på is.
3. Nedkøling vævskulturpladerne på en metalplatformskøler placeret på is. Placer centrifugerør på en metalkølestativ på is.
4. Ved hjælp af TUM622-celler fra trin 1.1.7 beregnes det ønskede antal celler, der er nødvendige for plettering. Typisk er der behov for 15.000-30.000 celler pr. brønd af en 24-brøndplade. Lavere tæthed er mere velegnet til billeddannelse og kvantificering, mens højere densitet foretrækkes ved indsamling af celler til RNA-ekstraktion eller vestlig blotting.
5. Cellesuspensionen overføres til et afkølet centrifugerør (hvert rør, der indeholder celler til treeksemplarsplettering), og der spindes ned ved 300 x g i en hængende spandcentrifuge ved 4 °C i 5 min.
6. Aspirer er omhyggeligt overspiratret med en aspirerende pipette fastgjort til en ufiltreret spids (20 μL), så der efterlades ca. 100 μL af mediet i røret (brug markeringer på røret som vejledning).
7. Bank forsigtigt på siden af røret for at løsne og fjerne pellet, før du returnerer den til kølestativet.
8. Brug de 2 ml forkølede pipetter til forsigtigt at blande matrixen ved at pipettere op og ned et par gange, mens hætteglasset er i kontakt med isen. Pipette ved en jævn og moderat hastighed, så der ikke indføres bobler i matrixen under denne procedure.
9. Matrixens passende volumen overføres til hvert centrifugerør. Til plating treeksemplarer i en 24-brønd plade, tilsættes 1,1 ml kælder membran matrix til hvert rør.
10. Ved hjælp af forkølede spidser pipette matrixen i hvert rør op og ned omkring 10 gange for at lave en ensartet cellesuspension.
11. 310 μL celle-/matrixsuspension overføres til hver brønd af en forkølet 24-brøndplade. Pipetten er placeret i en 90° vinkel til pladens overflade og suspensionen tilføjet til midten af brønden. Suspensionen skal sprede og dække hele brønden uden at skulle vippe pladen.
12. For at lette downstream immunfluorescensanalyse, plade celle / matrix suspension parallelt i 2-brønd kammer dias. Overfør 100 μL celle/matrix suspension til midten af en brønd af 2-brønd kammer dias (se Tabel af materialer). Dette gør det muligt for matrix til at danne en kuppel-lignende struktur med meget mindre volumen.
13. Returner pladen og kammeret glide tilbage i en vævkultur inkubator og inkubere i 30 min at tillade matrix at størkne. Pladen/diaset undersøges under et let mikroskop for at sikre, at enkelte celler fordeles jævnt i matrixen (4x eller 10x).
14. Tilføj 1 ml forvarmet 3D-kultur komplet medium i hver brønd og 1,5 ml 3D-kulturmedium til hver brønd af kammerdiaset og vend dem derefter tilbage til kuvøsen.

3. 3D-kokulering af TUM622-celler og CAF'er i den ekstracellulære matrix

1. Klargør cellesuspensioner af TUM622 og CAF'er i henhold til afsnit 2.
2. Tæl CAF-celletætheden ved at tage 10 μL cellesuspension og blande den med 10 μL trypanblå.
3. Der tilsættes 10 μL af blandingen til hvert af de to kamre på et hemacytometer for at tælle og beregne celletætheden.
   BEMÆRK: CAF'er har uregelmæssige former og tælles muligvis ikke nøjagtigt med på en automatisk celletæller.
4. Co-indlejring AF TUM622 celler og CAF'er i kældermembranmatrix
   1. Ud fra oplysningerne om celletætheden beregnes det ønskede antal celler, der bruges til plettering. CAF'er er seedet ved et 2:1-forhold mellem TUM622-celler. For 30.000 SEEDEDE TUM622-celler er 60.000 CAF'er f.eks.
   2. Det relevante volumen af TUM622 samt CAF'ercellesuspensionen overføres til samme centrifugerør, og trin 2.5-2.11 til plettering føres ind i 24-brøndplader. For immunfluorescens overføres 60 μL TUM622/CAFs til kammerdias som beskrevet i trin 2.12).
5. Coculturing TUM622 med overlejrede CAF'er i kældermembranmatrix (se Materialetabel)
   1. Indstil TUM622 monokultur i henhold til trin 2.5-2.13.
   2. Dobbelt så mange CAF'er sophæng (sammenlignet med antallet af seedede TUM622-celler) overføres til et centrifugerør og spinned ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
   3. Aspirere supernatanten og resuspender CAF'erne i 1 ml 3D-kulturmedium.
   4. 1 ml CAF'ers suspension overføres til brønden, der indeholder de indlejrede TUM622-celler.

4. Høst AF TUM622 Acini til RNA/Protein Extraction og Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)

1. Forbered vaskebuffer og cellehøstbuffer i henhold til 3D-cellehøstsættets protokol den foregående dag og afkøles natten over ved 4 °C.
2. Opbevar pladerne på en pladekøler og andre reagenser på is, før ekstraktionsprocessen påbegyndes.
3. Aspirate medier fra 3D kultur brønde uden at røre matrix og forsigtigt vaske godt 3 gange med 1 ml vaske buffer.
4. Aspirate den endelige vask og tilsæt 1 ml cellehøstbuffer til hver brønd.
5. Brug en p1000 pipette spids til at skrabe matrix ud af hver brønd.
6. Pipette op og ned for yderligere at adskille matrix.
7. 1 ml af blandingen overføres til et forkølet konisk rør på 15 ml. Tilføj yderligere 1 ml høstbuffer til samme brønd.
8. Gentag trin 4.5-4.7, og overfør al blanding af samme brønd til et konisk 15 ml rør.
9. Rørene og stenen kl.
10. Hvert rør fyldes med iskold PBS op til 10 ml, og centrifugeres derefter ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
11. Aspirer supernatanten uden at røre ved pelleten. Supernatanten skal indeholde matrixfragmenter, men sfænoiderne skal alle indsamles i bunden af røret.
12. Tilsæt iskold PBS for en anden vask. Inverter røret et par gange for at adskille pellet. Spin ned ved 300 x g i 5 min.
13. Mens du drejer, forberede lysis buffer til protein og RNA indsamling.
14. Omhyggeligt aspirere supernatanten og tilføje lysis buffer til downstream behandling for at indsamle protein eller RNA. Alternativt kan celler opslæmmes igen til flowanalyse/FACS-sortering eller seriel passaging.

5. Immunfluorescens af TUM622 Acini

1. Forbered immunfluorescensbuffer (IF-buffer: PBS med 0,1% bovinalbumin (BSA), 0,2% Triton X-100 og 0,05% Tween-20), primær blokeringsbuffer (IF-buffer med 10% gedeserum), sekundær blokeringsbuffer (primær blokeringsbuffer med 20 μg/mL gede antimuse F(ab')₂)
2. Aspirate medium fra 2-brønd kammer dias, skyl en gang med PBS og sæt dias på metalplade køler på is. Kammerslidslen skal forblive på metalpladekøleren i resten af protokollen.
3. Tilsæt forkølet 4% PFA for at fastgøre acini og inkubere på is i 20 min.
4. Fjern 4% PFA og vask tre gange med 2 ml forkølet PBS hver i 5 min med blid rokkende på en rocker.
5. Aspirate PBS og permeabilisere med 1,5 ml 0,5% Triton X-100 i PBS (forkølet) i 20 min. Ved afslutningen af denne procedure, vil kuppel-lignende struktur bliver løs.
6. Vis forsigtigt permeabiliseringsbufferen fra kammerslidsen for at undgå prøvetab. Dette opnås ved at tilføje en fin spids (20 μL) til den aspirerende pipette og trykke spidsen mod hjørnet af kammeret.
7. Vask tre gange med 2 ml forkølet PBS hver i 5 min med blid rokkende på en rocker.
8. Prøven klodser med den primære blokeringsbuffer på is i 1 time.
9. Fjern den primære blokeringsbuffer, og tilføj sekundær blokeringsbuffer og -blok i 30 min.
10. Der tilsættes primære antistoffer i den primære blokeringsbuffer, og der inkuberes natten over ved 4 °C.
    BEMÆRK: Koncentrationen af de antistoffer, der anvendes her, bør være højere end normalt anvendt til farvning af celler i 2D-dyrkning. De fleste af de primære antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse, fortyndes ved 1:100 fortynding (se Materialetabel).
11. De primære antistoffer fjernes, og prøven vaskes 3 gange med 2 ml kold IF-buffer.
    BEMÆRK: Prøverne kan være løse, tage ekstra forsigtighed, når indsugning.
12. Prøverne inkuberes i sekundære antistoffer fortyndet i primær blokeringsbuffer i 1 time ved RT. De foretrukne sekundære antistoffer bør være stærkt cross-adsorberet for at reducere baggrundsfarvning. De fleste sekundære antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse, fortyndes ved 1:200 fortynding.
13. Der fjernes sekundære antistoffer, og prøven vaskes 3 gange med 2 ml kold IF-buffer.
    BEMÆRK: Prøverne kan være løse, tage ekstra forsigtighed, når indsugning.
14. Tilsæt PBS med DAPI (1:1.000 fortynding) under den sidste vask for at plette kernen. Udfør yderligere 2 vasker i PBS.
15. Billede prøverne på et konfokalmikroskop inden for 3 dage.
    BEMÆRK: På grund af størrelsen af organoider og grænser i målets arbejdsafstand, er prøverne normalt afbildet ved 10x eller 20x forstørrelse.

6. Forberedelse af 3D-kulturprøver til immunhistokemi

1. Aspirate medium fra 2-brønd kammer dias og skyl en gang med PBS.
2. Fastgør 3D-kulturer i 4% PFA ved 37 °C natten over.
3. 4% PFA, omgive kulturer med 2,5 ml histologiprøvegel (se Materialetabel)fjernes, og slæden anbringes ved 4 °C for at størkne i mindst 1 time.
4. Prøver omgivet med histologisk prøvegel overføres til tissuekassetter og behandles i en automatiseret vævsprøveprocessor natten over.
5. Integrer prøver i paraffin og forbered sektion¹².

7. 3D cytotoksicitet assay for sammensatte screening (eksempel for en 96-godt Plade)

1. Sæt en 96-brøndsplade på en pladekøler, et 25 ml reservoir på en reservoirkøler og en 15 ml koniske rør på is, før forsøget påbegyndes.
2. Der fremstilles cellematrixsuspensioner af TUM622-celler i et forkølet 15 ml polypropylenkonisk rør ved at tilføje den passende mængde kældermembranmatrix til cellerne. Den ønskede tæthed for TUM622 celler er 10.000 celler pr. 70-75 μL kældermembranmatrix. Pipette op og ned et par gange for at tillade en jævn blanding af celler i matrixen.
3. Flyt pladen med pladekøler og reservoir med en reservoirkøler væk fra isen til en tør overflade for at undgå kontakt af kældermembranmatrix med is under overførslen.
4. Matrixcelleblandingen overføres til kølereservoiret uden at skabe bobler.
5. Ved hjælp af en mekanisk multikanalpipette (10-300 μL) overføres 70-75 μL af blandingscellerne til hver passende brønd af en 96-brøndsplade.
6. Inkuberplade ved 37 °C og 5% CO₂ i 30 min for kælderen membran matrix til at størkne.
7. Der tilsættes 100 μL medier i alle rækker, og pladen returneres til kuvøsen.
8. Start sammensat dosering den næste dag eller senere afhængigt af målet med eksperimentet.
9. Sfæroider kan re-fodres og re-dosed hver 2-3 dage i op til 10 dage, ved at fjerne brugte medier med en 8- eller 12-godt vakuum manifold og erstatte med friske medier med eller uden ønskede forbindelser.
10. Antallet af TUM622 sfæroider kan kvantificeres ved hjælp af 3D-billedmaskine i henhold til producentens protokol.

Representative Results

TUM622 og CAF'er i 2D-kultur
Figur 1 præsenterer den typiske morfologi af TUM622 celler og CAF'er i 2D-kultur. TUM622 celler afrundes med store kerner, mens CAF'er er flade og aflange. TUM622 celler kan nå 80%-90% sammenløb i kulturen. Yderligere spredning fører til flere, men mindre celler samlet i kolonier, der ikke kommer i direkte kontakt. I modsætning hertil foretrækker CAF'er at vokse ved højere celletæthed og vil holde prolifererende ved fuld sammenføring, hvis der er tilstrækkelige næringsstoffer.

Vækst og morfologi af TUM622 acini i 3D ECM
Figur 2 præsenterer et tidsforløbseksperiment af TUM622 celler, der er seedet i 3D-kultur. Data viser, at enkelte TUM622 celler er i stand til at danne organoider med acinar-lignende morfologier, når indlejret. Mellem dag 5 og 7, en lumen bliver synlige i acinar-lignende strukturer og forbliver hule derefter (Figur 2A). Hver acinus, der består af et monolag af celler omkring den hule lumen, viser korrekt apilogisk-basal polaritet svarende til lungeepitel in vivo (Figur 2B). Disse acinar-lignende strukturer er hyperplastiske og fortsætte med at vokse, så længe tilstrækkelige næringsstoffer er fastsat. Kulturen kan opretholdes i op til 24 dage, før ECM'en helt går i opløsning (figur 2C). Gennem begrænsende fortyndingsanalyse (LDA) (data, der ikke er vist), anslås det, at kun en sjælden delpopulation af TUM622-celler (<0,02%) har kapacitet til at danne acinar-lignende strukturer⁹.

Vækst og morfologi af TUM622-CAFs samkultur
Figur 3 viser opsætningen og repræsentative resultater af TUM622-CAF cocultures. CAF'er kunne integreres i samkulturen ved enten at overlejre toppen af matrixen eller co-embedded med TUM622-cellerne. Uanset opsætningen, tilstedeværelsen af CAFs stærkt forbedret antallet og størrelsen af sfænoider dannet (Figur 3B). Interessant, når TUM622 acini kommer i umiddelbar nærhed med CAFs, de inducerer acini at blive invasive og migrere mod CAFs, danner "tear-drop" lignende strukturer (Figur 3C). Bemærk, at TUM622 acini i monokultur ikke viser invasiv adfærd og kun form "tear-drop" som strukturer, når tæt på CAFs.

Repræsentative immunofluorescerende og immunohistokemi farvningresultater
Figur 4 viser repræsentative resultater fra immunfluorescens og immunhistokemifarvning af TUM622 acini efter 10 dages dyrkning. Konfokale billeder blev taget på ækvatoriale plan af immunofluorescerende farvede TUM622 acini (Figur 4A). I modsætning hertil kan hver sektion fra immunhistokemiprøven optage acini i forskellige planer (figur 4B). Begge resultater viste heterogene udtryk for stilk-lignende og differentierede celler inden for hver acinus.

TUM622 3D cytotoksicitetsanalyse ved hjælp af en Wnt pathway-hæmmer
Figur 5 viser dosis-respons af TUM622 acini behandlet med XAV939, en tankyrasehæmmer (Figur 5A,B). XAV939 blev tilføjet til kulturen 1 dag efter plating og opdateret hver 2 dage i alt 10 dage. I slutningen af eksperimentet blev antallet af acini kvantificeret af en imager. Brightfield billeder ved højere forstørrelse blev også erhvervet for at fange morfologi af sfæroider i kontrol versus XAV939-behandlede brønde (Figur 5C). Samlet set xAV939 viser dosis-afhængig hæmning på acini dannelse og ændrer væv arkitektur af sfæroider dannet. Disse resultater tyder på, at aktivering af den kanoniske Wnt vej er påkrævet under TUM622 acinar morfogenese.

Figur 1: TUM622 og CAF'er i 2D-kultur. Repræsentative lyse-felt billeder af TUM622 celler og CAFs dyrket i 2D. Skalabar = 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.⁹ og brugt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Vækst og morfologi af TUM622 acini i 3D ECM. (A) Time kursus billeder af TUM622 celler dyrket i kælderen membran matrix over en 10-dages periode. Skalabar = 100 μm. (B) Immunofluorescens af TUM622 acini plettet med apikale-basalcellepolaritetsmarkører, Golgi-enzym (GM-130, grøn, apitisk) og integrinsk alfa 6 (CD49f, basal, red). (C) Kvantificering af acini-nummer (højre y-akse, rød) og den gennemsnitlige størrelse af acini (venstre y-akse, blå) belagt i tre eksemplarer i en 24-brønd plade over 24 dage i kultur. Fejllinjer repræsenterer SD. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.⁹ og brugt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Vækst og morfologi af CO622-CAFs samkultur. (A) Skematisk tegning af opsætningen af TUM622-CAFs samkultur. CAF'er er overlejret eller co-indlejret med TUM62 celler i ECM. Efter 6-12 dage i coculture, TUM622 celler er i stand til at danne mere og større acini sammenlignet med mono-kultur og invadere ECM når i umiddelbar nærhed og direkte kontakt med CAFs. Bemærk, at den invasive fænotype kun kunne observeres i samkulturen. (B) Brightfield billede af TUM622 3D kulturer i nærvær eller fravær af overlejret CAFs efter 8 dage. Skalastænger = 200 μm. (C) Brightfield-billeder, der viser dråbeformede acini-formede acini-formeringer i cokulturer, uanset CAF'er, er overlejret eller integreret i ECM'en. Skalastænger = 200 μm. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.⁹ og brugt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentative immunofluorescerende og immunohistokemi farvningresultater. (A) Antistoffarvning af acini med markører for stængel-/progenitorceller (CXCR4 og SOX2), mesenkym (Vimentin), epiteldifferentiering (Involucrin), apoptose (Cleaved-Caspase-3) og spredning (Ki67) i grøn, DAPI i blåt, E-cadherin og Phalloidin i rødt. Skalabar = 50 μm. (B) Immunhistokemi på FFPE dele af TUM622 acini. Skalabjælke = 100 μm (øverst) og 50 μm (bund). Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.⁹ og brugt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: TUM622 3D cytotoksicitetsanalyse ved hjælp af en Wnt pathway-hæmmer. (A) Kvantificering af sfællenumre i en 96-brøndsplade, hvor TUM622-celler blev behandlet med dimethylsulfoxid (Kontrol) eller XAV939. Hver betingelse er assayed i treeksemplarer. Fejlstænger repræsenterer SD. (B) Hele godt billeder fra en 24-brøndsplade taget med en imager, der viser xav939's hæmmende virkninger på aciniformation. (C)Repræsentative brightfield billeder fra kontrol vs behandlede brønde viser morfologiske ændringer forårsaget af XAV939 behandling. Skalastænger = 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.⁹ og brugt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Tumorer er heterogene væv, der består af kræftceller side om side med stromale celler såsom kræft-associerede fibroblaster, endotelceller og immunceller inden for ECM. Sammen, disse forskellige komponenter cross-talk og påvirke tumor mikromiljø, spiller en aktiv rolle i kørsel tumorigenesis, en proces, der indebærer progressive ændringer i tumor arkitektur. Ideelt set bør en in vitro model af tumor udvikling være i stand til at fange de dynamiske væv arkitektoniske ændringer observeret i menneskelige tumorer in vivo, det komplekse samspil mellem forskellige celletyper inden for tumor mikromiljø og samtidig tillade eksperimentel manipulation på både tumorceller og komponenter i TME. Selv om der er gjort store fremskridt i 3D-kræftmodeller i de seneste år, har sådanne modeller ikke været let kommende for LUSC. De fleste modeller rapporteret til dato kun indarbejde et par aspekter af disse vigtige funktioner. Her rapporterer vi metoderne til et 3D-cokultursystem af LUSC, der samtidig indfanger vigtige vævsarkitektoniske ændringer observeret under LUSC-udvikling samt dynamiske interaktioner mellem tumorceller og vigtige komponenter i TME, herunder ECM og CAF'er.

Systemets evne til mere præcist at modellere arkitektoniske ændringer i væv er baseret på TUM622-cellernes unikke egenskab ved at danne organoider med acinar-lignende morfologier, når de er indlejret i 3D EF. Dannet af en selvfornyen enkelt celle, hver acinus er sammensat af et monolag af celler omkring en hul lumen. Denne monolayer af celler udviser apilogisk-basal celle polaritet og forbliver ikke-invasiv, der ligner væv arkitektur lunge epitel. Mens TUM622 som en 3D mono-kultur viser hyperplastisk vækst, tilsætning af CAFs yderligere øger acinar morfogenese og inducerer mere og større acini at danne. Vigtigere er det, CAFs påberåbe dynamiske væv arkitektoniske ændringer i TUM622 celler, når de to celletyper kommer i umiddelbar nærhed, så TUM622 celler til at miste deres apikale-basal polaritet og invadere matrix mod CAFs. Disse fænotypiske ændringer opsummerer både tidlig hyperplasi samt sene invasive stadier af LUSC.

I modsætning til mange tumor sfæroide modeller, hvor hver sfæroide dannes ved sammenlægning af mange celler, hver TUM622 acinus er afledt af en enkelt celle⁹. Ved in vitro LDA anslås det, at kun en mindre delpopulation (≤0,02 %) af TUM622 celler har en sådan kapacitet⁹. Selvom sjældne, disse celler kunne selvforny som det fremgår af deres evne til at gennemgå seriel passaging i 3D samt differentiere i en heterogen population af celler svarende til den oprindelige tumor. På grund af dette unikke træk ved TUM622 celler er det afgørende at sikre en jævn fordeling af enkelte TUM622-celler i ECM på tidspunktet for plating for vellykket dyrkning og downstream-analyse. For at nå dette mål skal flere nøglepunkter følges nøje i protokollen, herunder bestemmelse af passende såningstæthed, holde alle værktøjer og reagenser kølige under blanding af celler og matrix for at forhindre for tidlig størkning, undgå at indføre bobler under blandingsprocessen og give tilstrækkelig tid til, at matrixen kan størkne fuldt ud, før der tilføjes dyrkningsmedium. Sammen vil disse forholdsregler bidrage til at opnå en mere ensartet matrix substrat og kultur tilstand for alle indlejrede celler.

Når det er lykkedes etableret, denne kultur kan bruges til en række downstream analyser til at dissekere cellen og biokemiske proces, der regulerer tumorigenesis. Antallet og størrelsen af acini dannet i hver brønd kan overvåges over tid med lyse felt imagers og bruges som en udlæsning for spredning og selvfornyelse kapacitet TUM622 celler. Mere detaljeret dynamik i morfogenese af hver acinus kunne observeres med levende-imaging på et konfokal mikroskop, med eller uden forskellige mærkning farvestoffer. Det konditionerede medium kan indsamles på flere tidspunkter i kulturperioden til analyse af opløselige faktorer, der kan mægle celle-celle eller celle-matrix krydssamtaler. TUM622 celler, der er udvundet direkte fra ECM ved hjælp af protokol 4, er egnede til RNA- og proteinekstraktion til analyse af genekspression, flowcytometrikvantificering eller FACS-sortering baseret på celleoverflademarkører. Alternativt kan kulturerne fastsættes for in situ immunfluorescens eller immunhistokemi undersøgelser for at forstå de rumlige-tidsmæssige fordelinger af forskellige markører. Selv om immunhistokemi ens, supplerer immunfluorescensmetoderne, idet det giver mulighed for prøveudtagning af hele acini, som måske ikke er mulig på grund af den begrænsende billeddannelsesdybde af de konfokale mål. For begge disse metoder er den tid og temperatur, hvor fiksering og permeabilisering udføres, kritisk, især i betragtning af, at TUM622-celler er indlejret i en tæt matrix (>90% kældermembranmatrix) i modsætning til mange andre 3D-kulturer, hvor matrixtætheden er meget lavere. Derfor er det nødvendigt at være opmærksom på standardiseret og konsekvent fiksering og behandling for at opnå replikative resultater.

Ved hjælp af dette system som en platform, kan man derefter undersøge, hvordan celle-iboende ændringer i tumorceller, samt celle-ydre ændringer i tumor mikromiljø, indflydelse epitelarkitektur og model tidlige begivenheder involveret i karcinom dannelse. For eksempel, rollerne af onkogener eller tumor suppressor gener i reguleringen af tumorvæv arkitektur kunne undersøges ved gevinst- eller tab-of-funktion eksperiment rettet mod genet af interesse i tumorceller. Faktisk viste vi, at over-udtryk for SOX2, som er almindeligt observeret i LUSC, ændrer fænotype af TUM622 celler som det fremgår af et tab af hyperplasi i 3D og progression mod dysplastisk vækst⁹. På den anden side, man kunne sammenligne normale versus kræft-associerede fibroblaster i coculture indstillinger, bestemme, hvordan matrix komponenter eller dens stivhed indvirkning acini vækst / morfologi / invasion, og hvis blokering visse cytokiner kunne forstyrre celle-celle kommunikation og til gengæld påvirke væv arkitektur og tumor progression. Det er vigtigt, at alle disse analyser kan udføres i nærvær eller fravær af visse terapeutiske midler og anvendes som et redskab til at bestemme lægemidlet svar på LUSC celler med en flerdimensional udlæsning¹¹. Det er også vigtigt at bemærke, at dette system er begrænset med hensyn til de veje, det kunne bruges til at afhøre, da kun nogle, men ikke alle større signalveje regulerer væksten og morfologien af TUM622 organoider i kulturen (dvs. hæmning af Wnt, men ikke Notch signalering påvirker acinar mophogenesis af TUM622 celler)⁹.

Sammenfattende viser vi, at dette organoid system giver en unik platform for at generere ny indsigt i det dynamiske samspil mellem LUSC celler og tumor mikromiljø under tumor progression. Vi forventer, at vores modelsystem vil være en værdifuld platform for opdagelse og udvikling af lægemidler. I denne henseende bør screening nye anti-cancer terapeutiske i en indfødt tumorvæv sammenhæng støtte i udvælgelsen og udviklingen af mere effektive terapeutiske rettet mod LUSC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	For 3D culture
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	For 3D culture
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Rabbit
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		For Acini counts and measurements
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Mouse
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	For CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Rat
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Mouse
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	For 3D culture
L-Glutamine	Gibco	25030-081	For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	For 3D culture
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	For TUM622 cell dissociation
RPMI	ThermoFisher	11875-093	For CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	For CAF dissociation
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatic cell counter
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Rabbit
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Mouse