Summary
Ein In-vitro-Modellsystem wurde entwickelt, um architektonische Veränderungen des Gewebes während des Fortschreitens des Plattenepithelkarzinoms (LUSC) in einer dreidimensionalen (3D) Kokultur mit krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) zu erfassen. Dieses Organoidsystem bietet eine einzigartige Plattform, um die Rollen verschiedener Tumorzell-intrinsinininsische und extrinsische Veränderungen zu untersuchen, die den Tumorphänotyp modulieren.
Abstract
Tumor-Stroma-Wechselwirkungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Plattenepithelkarzinoms (LUSC). Das Verständnis, wie diese dynamischen Wechselwirkungen zu architektonischen Veränderungen des Gewebes beitragen, die während der Tumorigenese beobachtet werden, bleibt jedoch aufgrund des Fehlens geeigneter Modelle eine Herausforderung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Generierung eines 3D-Kokulturmodells unter Verwendung einer LUSC-Primärzellkultur, die als TUM622 bekannt ist. TUM622-Zellen wurden aus einem LUSC-Patienten-abgeleiteten Xenograft (PDX) hergestellt und haben die einzigartige Eigenschaft, acinarartige Strukturen zu bilden, wenn sie in einer Kellermembranmatrix gesät werden. Wir zeigen, dass TUM622 acini in 3D-Cokultur wichtige Merkmale der Gewebearchitektur während der LUSC-Progression sowie die dynamischen Wechselwirkungen zwischen LUSC-Zellen und Komponenten der Tumormikroumgebung (TME), einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs). Wir passen unser Hauptprotokoll zur 3D-Kultivierung weiter an, um zu zeigen, wie dieses System für verschiedene nachgelagerte Analysen genutzt werden könnte. Insgesamt schafft dieses Organoidmodell eine biologisch reiche und anpassungsfähige Plattform, die es einem ermöglicht, Einblicke in die zellintrinsischen und extrinsischen Mechanismen zu gewinnen, die die Störung epitheliale Architekturen während der Karzinomprogression fördern und helfen, die Suche nach neuen therapeutischen Zielen und diagnostischen Markern.
Introduction
Lungenkrebs ist weltweit die hauptursache für die krebsbedingte Sterblichkeit. Lungenplattenzellkarzinom (LUSC), die zweithäufigste Art von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und etwa 30% aller Lungenkrebserkrankungen ausmacht, wird oft im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und hat eine schlechte Prognose1. Behandlungsmöglichkeiten für LUSC-Patienten sind ein großer unerfüllter Bedarf, der durch ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen verbessert werden kann, die die LUSC-Tumorgenese antreiben.
Wie bei den meisten menschlichen Krebsarten ist die Pathogenese von LUSC durch die Störung der intakten, gut geordneten Epithelgewebearchitektur2gekennzeichnet. Dabei gehen die richtige apikal-basale Zellpolarität, Zellzell- und Zellmatrixkontakte verloren, was ein unkontrolliertes Wachstum und invasives Verhalten der Tumorzellen ermöglicht. Es wird heute allgemein geschätzt, dass die bösartigen Merkmale von Krebszellen nicht ohne ein wichtiges Zusammenspiel zwischen Krebszellen und ihrer lokalen Tumormikroumgebung (TME)3manifestiert werden können. Schlüsselkomponenten in der TME, einschließlich extrazellulärer Matrix (ECM), krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sowie endotheliale Zellen und infiltrierende Immunzellen prägen aktiv die TME und treiben die Tumorigenese4an. Dennoch ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Tumorzellen und diese Schlüsselkomponenten in der TME interagieren, um architektonische Veränderungen im Gewebe während der LUSC-Progression voranzutreiben, sehr begrenzt.
Dreidimensionale (3D) Kultur ist ein wichtiges Werkzeug, um die biologischen Aktivitäten der zellintrininellen und extrinsischen Veränderungen bei der Regulierung von Gewebearchitektonischen Veränderungen in normalen und kranken Geweben zu studieren5. 3D-Kulturen bieten den geeigneten strukturellen und funktionalen Kontext, der in traditionellen zweidimensionalen (2D) Kulturen normalerweise fehlt. Die zusätzlichen Dimensionen solcher Systeme imitieren Gewebe in vivo in vielen Aspekten der Zellphysiologie und des zellulären Verhaltens, einschließlich Proliferation, Differenzierung, Migration, Proteinexpression und Reaktion auf die medikamentöse Behandlung. In den letzten Jahren haben Bemühungen verschiedener Labore zur Entwicklung von In-vitro-3D-Modellen sowohl für die normale Lunge als auch für NSCLC6,7,8geführt. Ein Modell für Lungenplattenkrebs, das sowohl die dynamischen Gewebe-Architekturänderungen während der Tumorigenese als auch wichtige stromale Komponenten rekapitulieren kann, war jedoch nicht verfügbar.
Hier beschreiben wir die Methoden zur Einrichtung eines neuartigen dreidimensionalen (3D) Cokultursystems mit primären PDX-abgeleiteten LUSC-Zellen (tUM622) und CAFs9,10. Sowohl TUM622 als auch CAFs stammen von NSCLC-Patienten mit schlecht differenzierten Tumoren10. Wenn sie als Einzelzellen in ECM eingebettet wird, hat eine seltene Subpopulation von TUM622-Zellen die Fähigkeit, Organoide mit acinarähnlichen Strukturen zu bilden, die die richtige apikal-basale Zellpolarität aufweisen. Diese acinarartigen Strukturen sind hyperplastisch, zeigen heterogene Expression von Stamm- und Differenzierungsmarkern, die dem ursprünglichen Tumor ähneln, während sie nicht-invasiv bleiben, und imitieren somit das früheste Stadium der LUSC-Entwicklung. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass die Gewebearchitektur der acinarartigen Strukturen durch Hemmung zellintrininintrinischer Signalwege mit kleinen Molekülinhibitoren oder die Zugabe von Schlüsselkomponenten im ECM wie CAFs verändert werden kann, von denen letztere die Acini-Bildung verbessert und die Acini in unmittelbarer Nähe weiter invasiv wird. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass dieses 3D-Kokultursystem von LUSC-Organoiden eine wertvolle Plattform für die Untersuchung der dynamischen Rezipatonität zwischen LUSC-Zellen und tME bietet und für die Überwachung der Reaktion von LUSC-Zellen auf die medikamentöse Behandlung angepasst werden könnte11.
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Protocol
1. Passieren und Culieren von TUM622-Zellen und CAFs in 2D-Kulturen
- Passieren und Kultivieren von TUM622-Zellen
- Warmes 3D-Kulturmedium und Zelldissoziationsreagenzien (siehe Materialtabelle) für TUM622-Zellen bei 37 °C.
- Durchgang TUM622-Zellen bei 80% Konfluenz in 2D-Flaschen. In der Regel tritt dies 1 Woche nach der Passage auf.
- Altes Medium aus einem T75-Kolben entsorgen und einmal mit 6 ml HEPES-Puffer waschen. Vermeiden Sie das Pipetieren direkt auf die Zellen.
- Aspirieren Sie den HEPES-Puffer. Fügen Sie 4 ml Trypsin/EDTA (0,25 mg/ml, siehe Materialtabelle) für eine schnelle Spülung hinzu und entsorgen Sie trypsin/EDTA.
- Fügen Sie 2 ml Trypsin/EDTA hinzu und brüten Sie bei 37 °C für 5 min. Entfernen Sie Die Kolben aus dem Inkubator und tippen Sie auf die Kolben, um die Zellen zu lösen, ohne Luftblasen zu erzeugen und DieKolben für weitere 5 min in den Inkubator zurückbringen.
HINWEIS: Eine längere Exposition gegenüber Trypsin wird die Zellen irreversibel schädigen und ihren Phänotyp verändern, daher wird empfohlen, die Zeit zu begrenzen, in der Zellen Trypsin ausgesetzt sind. - Bestätigen Sie, dass sich die Zellen unter einem Lichtmikroskop (4x oder 10x) gelöst und dissoziiert haben. Fügen Sie 4 ml Neutralisationspuffer (TNS-Puffer) hinzu (siehe Subkultur-Reagenzieninformationen in der Tabelle der Materialien), gefolgt von 10 ml 3D-Kulturmedium (siehe Materialtabelle).
- Pipette nach oben und unten sanft, um die Zellen mit einer 10 ml Pipette weiter zu dissoziieren. Übertragen Sie die Suspension durch ein 40-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr.
- Zählen Sie Die Zellennummern mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
- Samen 0,8 x 106 Zellen/T75 Kolben in 20 ml 3D-Kulturmedium (siehe Materialtabelle).
- Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums durch frisches Medium ersetzen.
- Passierung und Kultivierung von CAFs
- Passage CAFs, wenn Zellen die Konfluenz erreichen. In der Regel geschieht dies nach 5 Tagen kultivieren von einem 1:2 Split.
- Bereiten Sie CAF Medium mit RPMI Basalmedium mit 20% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin vor. Das Medium auf 37 °C erwärmen.
- In einem T75-Kolben caFs mit phosphatgepufferter Saline (PBS) einmal abspülen und dann 2 ml Trypsin/EDTA hinzufügen und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
- Beobachten Sie unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen im Kolben (4x oder 10x) aufgelöst haben. Wenn nicht, verlängern Sie die Inkubation um weitere 2-3 min.
- Sobald sich zellengelöst und getrennt haben, fügen Sie 10 ml 3D-Kulturmedium hinzu, um Trypsin/EDTA und Pipetten mehrmals nach oben und unten zu neutralisieren, um die CAFs weiter zu dissoziieren.
- Die Zellsuspension in ein 50 ml konisches Rohr geben und bei 300 x g bei Raumtemperatur 5 min nach unten drehen.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von 3D-Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) und Durchgang in zwei neue T75-Flaschen.
2. Beschichtung von TUM622-Zellen in der extrazellulären Matrix für 3D-Culturing
- Am Tag vor dem Experiment, Tauen Fläschchen der Kellermembran Matrix in einem 4 °C Kühlschrank über Nacht. Abklingluft-Kunststoffpipetten (2 ml) und Spitzen bei -20 °C über Nacht.
HINWEIS: Nicht alle Lose der Kellermembranmatrix haben die gleiche Kapazität, um das 3D-Wachstum von TUM622-Zellen zu unterstützen. Daher ist es notwendig, mehrere Lose von Kellermembranmatrix zu erwerben und zu testen, um diejenigen zu identifizieren, die eine robuste Acini-Bildung unterstützen. In der Regel erfordert dies eine höhere Proteinkonzentration (16-18 mg/ml) in der Matrix. - Am Tag des Experiments, warmes 3D-Kulturmedium, HEPES-Puffer, Trypsin/EDTA und Trypsin-Neutralisationspuffer (TNS) in einem 37 °C-Wasserbad. Unmittelbar vor dem Aufbau der Kultur die aufgetaute Kellermembranmatrix aus dem Kühlschrank nehmen und die Durchstechflasche auf Eis legen.
- Abklingzeit der Gewebekulturplatten auf einem Metallplattformkühler, der auf Eis platziert ist. Zentrifugenrohre auf ein Metallkühlregal auf Eis legen.
- Berechnen Sie mithilfe von TUM622-Zellen aus Schritt 1.1.7 die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung benötigt werden. In der Regel werden 15.000-30.0000 Zellen pro Brunnen einer 24-Well-Platte benötigt. Eine niedrigere Dichte eignet sich besser für die Bildgebung und Quantifizierung, während eine höhere Dichte bevorzugt wird, wenn Zellen für die RNA-Extraktion oder das westliche Blotting gesammelt werden.
- Zellsuspension in ein gekühltes Zentrifugenrohr (jedes Rohr mit Zellen für die dreifache Beschichtung) übertragen und bei 300 x g in einer hängenden Eimerzentrifuge bei 4 °C für 5 min nach unten drehen.
- Den Überstand vorsichtig mit einer an einer ungefilterten Spitze befestigten Saugpipette (20 l) ansaugen und ca. 100 l des Mediums im Rohr zurücklassen (Markierungen auf dem Rohr als Führung verwenden).
- Tippen Sie vorsichtig auf die Seite des Rohres, um das Pellet zu lösen und zu lösen, bevor Sie es in das Kühlregal zurückgeben.
- Mit den 2 ml vorgekühlten Pipetten mischen Sie die Matrix vorsichtig, indem Sie einige Male nach oben und unten pfeifen und gleichzeitig die Durchstechflasche mit dem Eis in Kontakt halten. Pipette mit einer gleichmäßigen und moderaten Geschwindigkeit, so dass während dieses Verfahrens keine Blasen in die Matrix eingeführt werden.
- Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Matrix in jedes Zentrifugenrohr. Zum Plattieren von Triplicaten in einer 24-Well-Platte 1,1 ml Kellermembranmatrix zu jedem Rohr hinzufügen.
- Mit vorgekühlten Spitzen, Pipette die Matrix in jedem Rohr nach oben und unten etwa 10 Mal, um eine einheitliche Zellsuspension zu machen.
- Übertragen Sie 310 l Zell-Matrix-Suspension in jeden Brunnen einer vorgekühlten 24-Well-Platte. Die Pipette wird in einem 90°-Winkel zur Plattenoberfläche platziert und die Aufhängung in der Mitte des Brunnens hinzugefügt. Die Aufhängung sollte sich ausbreiten und den gesamten Brunnen abdecken, ohne die Platte kippen zu müssen.
- Um die nachgeschaltete Immunfluoreszenzanalyse zu erleichtern, wird die Zell-Matrix-Suspension parallel in 2-Well-Kammergweise plattiert. Übertragen Sie 100 l Zell-Matrix-Suspension in die Mitte eines Brunnens mit 2-Well-Kammerschlitten (siehe Materialtabelle). Dadurch kann die Matrix eine kuppelartige Struktur mit viel kleinerem Volumen bilden.
- Die Platte und die Kammer gleiten zurück in einen Gewebekultur-Inkubator und inkubieren 30 min, damit sich die Matrix verfestigen kann. Untersuchen Sie die Platte/den Schlitten unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass einzelne Zellen innerhalb der Matrix gleichmäßig verteilt sind (4x oder 10x).
- Fügen Sie 1 ml vorgewärmte 3D-Kultur komplettes Medium in jeden Brunnen und 1,5 ml 3D-Kulturmedium zu jedem Brunnen der Kammerrutsche hinzu und geben Sie sie dann an den Inkubator zurück.
3. 3D-Kokultivierung von TUM622-Zellen und CAFs in der extrazellulären Matrix
- Bereiten Sie Zellsuspensionen von TUM622 und CAFs gemäß Abschnitt 2 vor.
- Zählen Sie die CAF-Zelldichte, indem Sie 10 l Zellsuspension einnehmen und mit 10 l Trypanblau mischen.
- Fügen Sie jeder der beiden Kammern auf einem Hemacytometer 10 L des Gemischs hinzu, um die Zelldichte zu zählen und zu berechnen.
HINWEIS: CAFs haben unregelmäßige Formen und werden möglicherweise nicht genau auf einem automatischen Zellenzähler gezählt. - Ko-Einbettung von TUM622-Zellen und CAFs in die Kellermembranmatrix
- Berechnen Sie anhand der Zelldichteinformationen die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung verwendet werden. CAFs werden mit einem Verhältnis von 2:1 von TUM622-Zellen gesät. Für 30.000 TUM622-Zellen, die gesät wurden, sind beispielsweise 60.000 CAFs mit eingebettet.
- Übertragen Sie das entsprechende Volumen von TUM622 sowie CAFs Zellsuspension in das gleiche Zentrifugenrohr und folgen Sie den Schritten 2.5-2.11 für die Beschichtung in 24-Well-Platten. Übertragen Sie bei der Immunfluoreszenz 60 l TUM622/CAFs auf Kammerschlitten, wie in Schritt 2.12 beschrieben).
- Kokultierung von TUM622 mit überlagerten CAFs in der Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)
- Richten Sie TUM622 Monokultur gemäß den Schritten 2.5-2.13 ein.
- Übertragen Sie die doppelte Anzahl der CAF-Suspension (im Vergleich zur Anzahl der ausgesäten TUM622-Zellen) in ein Zentrifugenrohr und drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur nach unten.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die CAFs in 1 ml 3D-Kulturmedium aus.
- Übertragen Sie die 1 ml CAFs Suspension in den Brunnen, der die eingebetteten TUM622-Zellen enthält.
4. Ernte TUM622 Acini für RNA/Protein-Extraktion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
- Bereiten Sie Waschpuffer und Zellerntepuffer gemäß dem 3D-Zellernte-Kit-Protokoll vom Vortag vor und kühlen Sie über Nacht bei 4 °C.
- Bewahren Sie Platten auf einem Plattenkühler und andere Reagenzien auf Eis auf, bevor Sie mit dem Extraktionsprozess beginnen.
- Saugen Sie Medien aus 3D-Kulturbrunnen, ohne die Matrix zu berühren und waschen Sie den Brunnen 3 Mal mit 1 ml Waschpuffer.
- Die Endwäsche ansaugen und 1 ml Zellerntepuffer zu jedem Brunnen hinzufügen.
- Verwenden Sie eine p1000 Pipettenspitze, um die Matrix von jedem Brunnen abzukratzen.
- Pipette nach oben und unten, um die Matrix weiter zu dissoziieren.
- 1 ml der Mischung in ein vorgekühltes 15 ml konisches Rohr geben. Fügen Sie dem Brunnen weitere 1 ml Erntepuffer hinzu.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.7, und übertragen Sie alle Mischungen des gleichen Brunnens in ein 15 ml konisches Rohr.
- Die Rohre und das Gestein 30 min bei 4 °C verkapseln.
- Füllen Sie jedes Rohr mit eiskaltem PBS bis zu 10 ml und zentrieren Sie dann bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu berühren. Der Überstand sollte Matrixfragmente enthalten, aber die Sphäroide sollten alle am unteren Rand des Rohres gesammelt werden.
- Eiskalte SPBS für eine zweite Wäsche hinzufügen. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um das Pellet zu dissoziieren. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min.
- Während des Spinnens, bereiten Lysepuffer für Protein- und RNA-Sammlung.
- Sorgsam den Überstand ansaugen und Einen Lysepuffer für die nachgeschaltete Verarbeitung hinzufügen, um Protein oder RNA zu sammeln. Alternativ können Zellen für die Flussanalyse/FACS-Sortierung oder serielle Passierung resuspendiert werden.
5. Immunfluoreszenz von TUM622 Acini
- Vorbereiten des Immunfluoreszenzpuffers (IF-Puffer: PBS mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% Triton X-100 und 0,05% Tween-20), primärer Sperrpuffer (IF-Puffer mit 10% Ziegenserum), sekundärer Blockierpuffer (primärer Blockierpuffer mit 20 g/ml Ziege-Anti-Maus F(ab')2)
- Aspirieren Sie das Medium aus 2-Well-Kammerrutschen, spülen Sie einmal mit PBS und stellen Sie die Rutsche auf Metallplattenkühler auf Eis. Der Kammerschlitten sollte für den Rest des Protokolls auf dem Metallplattenkühler verbleiben.
- Fügen Sie vorgekühlte 4% PFA, um die Acini zu fixieren und brüten auf Eis für 20 min.
- Entfernen Sie 4% PFA und waschen Sie dreimal mit 2 ml vorgekühlten PBS jeweils für 5 min mit sanftem Schaukeln auf einer Wippe.
- ASpirieren PBS und permeabilisieren mit 1,5 ml von 0,5% Triton X-100 in PBS (vorgekühlt) für 20 min. Am Ende dieses Verfahrens wird sich die kuppelartige Struktur lösen.
- Saugen Sie vorsichtig den Permeabilisierungspuffer aus der Kammerrutsche, um Probenverluste zu vermeiden. Dies wird erreicht, indem der Ansaugpipetette eine feine Spitze (20 l) hinzugefügt und die Spitze in Richtung der Ecke der Kammer gedrückt wird.
- Waschen Sie dreimal mit 2 ml vorgekühlten PBS für jeweils 5 min mit sanftem Schaukeln auf einer Wippe.
- Blockieren Sie die Probe mit dem primären Sperrpuffer auf Eis für 1 h.
- Entfernen Sie den primären Blockierpuffer, und fügen Sie einen sekundären Blockierpuffer und Block für 30 min hinzu.
- Primäre Antikörper in primären Sperrpuffer hinzufügen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Konzentration der hier verwendeten Antikörper sollte höher sein als normalerweise für die Färbung von Zellen in der 2D-Kultur verwendet. Die meisten der in dieser Studie verwendeten primären Antikörper werden bei 1:100 Verdünnung verdünnt (siehe Materialtabelle). - Primäre Antikörper entfernen und die Probe 3 Mal mit 2 ml kaltem IF-Puffer waschen.
HINWEIS: Die Proben könnten lose sein, nehmen Sie zusätzliche Vorsicht beim Ansapirieren. - Inkubieren Sie die Proben in sekundären Antikörpern, die im primären Sperrpuffer für 1 h bei RT verdünnt werden. Die bevorzugten sekundären Antikörper sollten stark kreuzadsorbiert sein, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Die meisten sekundären Antikörper, die in dieser Studie verwendet werden, werden bei 1:200 Verdünnung verdünnt.
- Sekundäre Antikörper entfernen und die Probe 3 Mal mit 2 ml kaltem IF-Puffer waschen.
HINWEIS: Die Proben könnten lose sein, nehmen Sie zusätzliche Vorsicht beim Ansapirieren. - Fügen Sie PBS mit DAPI (1:1.000 Verdünnung) während der letzten Wäsche hinzu, um den Kern zu färben. Die führen Sie weitere 2 Wärvorgänge in PBS.
- Stellen Sie die Proben innerhalb von 3 Tagen auf einem konfokalen Mikroskop ab.
HINWEIS: Aufgrund der Größe der Organoide und der Grenzen im Arbeitsabstand des Objektivs werden Proben in der Regel mit einer 10-fachen oder 20-fachen Vergrößerung dargestellt.
6. Vorbereitung von 3D-Kulturproben für die Immunhistochemie
- Aspirieren Sie Dasmedium aus 2-Well-Kammerrutschen und spülen Sie einmal mit PBS.
- Fix 3D-Kulturen in 4% PFA bei 37 °C über Nacht.
- Entfernen Sie 4% PFA, umgeben Kulturen mit 2,5 ml Histologie-Probengel (siehe Materialtabelle) und legen Sie das Dia auf 4 °C, um sich für mindestens 1 h zu erstarren.
- Übertragen Sie Proben, die mit histologischem Probengel umgeben sind, auf Gewebekassetten und werden Sie über Nacht in einem automatisierten Gewebeprobenprozessor verarbeitet.
- Proben in Paraffinwachs einbetten und für die Schnittung12vorbereiten.
7. 3D Cytotoxizität Assay für Compound Screening (Beispiel für eine 96-Well-Platte)
- Stellen Sie eine 96-Well-Platte auf einen Plattenkühler, ein 25 ml-Reservoir auf einen Reservoirkühler und eine 15 ml konische Röhren auf Eis, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
- Bereiten Sie Zellmatrixsuspensionen von TUM622-Zellen in einem vorgekühlten 15 ml Polypropylen-Konusrohr vor, indem Sie den Zellen das entsprechende Volumen der Kellermembranmatrix hinzufügen. Die gewünschte Dichte für TUM622-Zellen beträgt 10.000 Zellen pro 70-75 L Kellermembranmatrix. Pipetten ein paar Mal nach oben und unten, um eine gleichmäßige Vermischung von Zellen innerhalb der Matrix zu ermöglichen.
- Bewegen Sie die Platte mit Plattenkühler und Reservoir mit einem Reservoirkühler weg vom Eis auf eine trockene Oberfläche, um den Kontakt der Kellermembranmatrix mit Eis während der Übertragung zu vermeiden.
- Übertragen Sie die Matrixzellmischung in das Kühlreservoir, ohne Blasen zu erzeugen.
- Übertragen Sie mit einer mechanischen Mehrkanalpipette (10-300 l) 70-75 l der Mischzellen in jeden geeigneten Brunnen einer 96-Well-Platte.
- Inkubationsplatte bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min für die Verfestigung der Kellermembranmatrix.
- Fügen Sie in allen Zeilen 100 L Medien hinzu und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.
- Beginnen Sie die zusammengesetzte Dosing am nächsten Tag oder später, abhängig vom Ziel des Experiments.
- Sphäroide können alle 2-3 Tage für bis zu 10 Tage erneut gefüttert und erneut dosiert werden, indem verbrauchte Medien mit einem 8- oder 12-Well-Vakuumkrümmer entfernt und durch frische Medien mit oder ohne gewünschte Verbindungen ersetzt werden.
- Die Anzahl der TUM622 Sphäroide konnte mit 3D-Imager nach dem Herstellerprotokoll quantifiziert werden.
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Representative Results
TUM622 und CAFs in 2D-Kultur
Abbildung 1 zeigt die typische Morphologie von TUM622-Zellen und CAFs in der 2D-Kultur. TUM622-Zellen werden mit großen Kernen gerundet, während CAFs flach und länsam sind. TUM622-Zellen können 80%-90% Konfluenz in der Kultur erreichen. Eine weitere Proliferation führt zu mehr, aber kleineren Zellen, die in Kolonien aggregiert werden, die nicht direkt in Kontakt kommen. Im Gegensatz dazu ziehen es CAFs vor, bei höherer Zelldichte zu wachsen und sich bei voller Konfluenz weiter auszuwachsen, wenn genügend Nährstoffe zur Verfügung gestellt werden.
Wachstum und Morphologie von TUM622 acini in 3D ECM
Abbildung 2 zeigt ein Zeitverlaufsexperiment von TUM622-Zellen, die in der 3D-Kultur gesät sind. Die Daten zeigen, dass einzelne TUM622-Zellen in der Lage sind, Organoide mit acinarähnlichen Morphologien zu bilden, wenn sie eingebettet werden. Zwischen den Tagen 5 und 7 wird ein Lumen in den acinarartigen Strukturen sichtbar und bleibt danach hohl (Abbildung 2A). Jeder Acinus, bestehend aus einer Monoschicht von Zellen, die das hohle Lumen umgeben, weist eine korrekte apikal-basale Polarität auf, ähnlich der des Lungenepithels in vivo (Abbildung 2B). Diese acinarartigen Strukturen sind hyperplastisch und wachsen weiter, solange genügend Nährstoffe zur Verfügung gestellt werden. Die Kultur kann bis zu 24 Tage aufrechterhalten werden, bevor das ECM vollständig aufgelöst wird (Abbildung 2C). Durch die Begrenzung des Verdünnungstestes (LDA) (Daten nicht dargestellt) wird geschätzt, dass nur eine seltene Subpopulation von TUM622-Zellen (<0,02%) haben die Fähigkeit, acinarartige Strukturen zu bilden9.
Wachstum und Morphologie der TUM622-CAFs Cokultur
Abbildung 3 zeigt die Einrichtung und repräsentative Ergebnisse der TUM622-CAF-Kokulturen. CAFs könnten in die Kokultur integriert werden, indem entweder die Matrix überlagert oder gemeinsam mit den TUM622-Zellen eingebettet werden. Unabhängig von der Einrichtung hat das Vorhandensein von CAFs die Anzahl und Größe der gebildeten Sphäroide erheblich verbessert (Abbildung 3B). Interessanterweise, wenn TUM622 acini in die Nähe von CAFs kommen, induzieren sie die Acini, invasiv zu werden und in Richtung der CAFs zu wandern, die "Tränentropfen" wie Strukturen bilden (Abbildung 3C). Beachten Sie, dass TUM622 acini in der Monokultur kein invasives Verhalten anzeigt und nur in der Nähe von CAFs "Tear-Drop" wie Strukturen bildet.
Repräsentative immunfluoreszierende und immunhistochemische Färbungsergebnisse
Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse der Immunfluoreszenz und immunhistochemischen Färbung von TUM622 acini nach 10 Tagen Kultivierung. Konfokale Bilder wurden auf der äquatorialen Ebene des immunfluoreszierend gefärbten TUM622 acini aufgenommen (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu kann jeder Abschnitt aus der Immunhistochemieprobe Acini auf verschiedenen Ebenen erfassen (Abbildung 4B). Beide Ergebnisse zeigten eine heterogene Expression von stammartigen und differenzierten Zellen in jedem Acinus.
TUM622 3D-Zytotoxizitätstest mit einem Wnt-Signalweg-Inhibitor
Abbildung 5 zeigt die Dosis-Wirkung von TUM622-Acini, die mit XAV939, einem Tankyrase-Hemmer, behandelt wurden (Abbildung 5A,B). XAV939 wurde der Kultur 1 Tag nach der Beschichtung hinzugefügt und alle 2 Tage für insgesamt 10 Tage aktualisiert. Am Ende des Experiments wurde die Anzahl der Acini durch einen Imager quantifiziert. Helle Feldbilder mit höherer Vergrößerung wurden ebenfalls aufgenommen, um die Morphologie von Sphäroiden in der Kontrolle im Vergleich zu XAV939-behandelten Brunnen zu erfassen (Abbildung 5C). Insgesamt zeigt XAV939 eine dosisabhängige Hemmung der Acini-Bildung und verändert die Gewebearchitektur der gebildeten Sphäroide. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs während der TUM622-Acinarmorphogenese erforderlich ist.
Abbildung 1: TUM622 und CAFs in 2D-Kultur. Repräsentative Hellfeldbilder von TUM622-Zellen und CAFs, die in 2D kultiviert sind. Skalenbalken = 100 m. Diese Zahl wurde von Chen et al.9 geändert und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wachstum und Morphologie von TUM622 acini in 3D ECM. (A) Zeitverlaufsbilder von TUM622-Zellen, die über einen Zeitraum von 10 Tagen in der Kellermembranmatrix kultiviert wurden. Scale bar = 100 m . (B) Immunfluoreszenz von TUM622 acini gefärbt mit apikal-basalen Zellpolaritätsmarkern, Golgi-Enzym (GM-130, grün, apikal) und Integrin alpha 6 (CD49f, basal, rot). (C) Quantifizierung der Acini-Zahl (rechte y-Achse, rot) und die durchschnittliche Größe der acini (linke y-Achse, blau) in Dreifache in einer 24-Well-Platte über 24 Tage in kultur plattiert. Fehlerbalken stellen SD dar. Diese Zahl wurde von Chen et al.9 geändert und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wachstum und Morphologie der TUM622-CAFs-Kokultur. (A) Schematische Zeichnung der Einrichtung der TUM622-CAFs-Kokultur. CAFs werden mit TUM62-Zellen in ECM überlagert oder mit eingebettet. Nach 6-12 Tagen in der Kokultur sind TUM622-Zellen in der Lage, mehr und größere Acini im Vergleich zur Monokultur zu bilden und in das ECM einzudringen, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe und in direktem Kontakt mit CAFs befinden. Beachten Sie, dass der invasive Phänotyp nur in der Kokultur beobachtet werden konnte. (B) Hellfeldbild von TUM622 3D-Kulturen in Gegenwart oder Abwesenheit von überlagerten CAFs nach 8 Tagen. Skalenbalken = 200 m . (C) Hellfeldbilder, die tränentropfenförmige Acini-Bildung in Kokulturen unabhängig von CAFs zeigen, werden überlagert oder in das ECM eingelassen. Skalenbalken = 200 m. Diese Zahl wurde von Chen et al.9 geändert und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Immunfluoreszenz- und Immunhistochemie-Färbungsergebnisse. (A) Antikörperfärbung von Acini mit Markern von Stamm-/Vorläuferzellen (CXCR4 und SOX2), Mesenchym (Vimentin), epithelialer Differenzierung (Involucrin), Apoptose (Cleaved-Caspase-3) und Proliferation (Ki67) in Grün, DAPI in blau, E-Cadherin und Phalloidin in Rot. Skala bar = 50 m . (B) Immunohistochemie auf FFPE-Abschnitten von TUM622 acini. Skala bar = 100 m (oben) und 50 m (unten). Diese Zahl wurde von Chen et al.9 geändert und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: TUM622 3D-Zytotoxizitätstest mit einem Wnt-Signalweg-Inhibitor. (A) Quantifizierung von Sphäroidnummern in einer 96-Well-Platte, bei der TUM622-Zellen mit Dimethylsulfoxid (Kontrolle) oder XAV939 behandelt wurden. Jede Bedingung wird in Triplicaten geprüft. Fehlerbalken stellen SD. (B) Ganze Gutbilder von einer 24-Well-Platte dar, die mit einem Imager aufgenommen wurde, der die hemmende Wirkung von XAV939 auf die Acini-Bildung zeigt. (C) Repräsentative Hellfeldbilder aus den Kontroll- und behandelten Brunnen, die die morphologischen Veränderungen zeigen, die durch die Behandlung von XAV939 verursacht werden. Skalenbalken = 100 m. Diese Zahl wurde von Chen et al.9 geändert und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Tumoren sind heterogene Gewebe, die aus Krebszellen bestehen, die nebeneinander mit stromalen Zellen wie krebsassoziierten Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen innerhalb des ECM koexistieren. Zusammen gehen diese unterschiedlichen Komponenten ins Gespräch und beeinflussen die Tumormikroumgebung und spielen eine aktive Rolle bei der Förderung der Tumorgenese, einem Prozess, der progressive Veränderungen in der Tumorarchitektur mit sich bringt. Idealerweise sollte ein In-vitro-Modell der Tumorentwicklung in der Lage sein, die dynamischen architektonischen Veränderungen des Gewebes, die in menschlichen Tumoren beobachtet werden, in vivo zu erfassen, das komplexe Zusammenspiel verschiedener Zelltypen innerhalb der Tumormikroumgebung zu erfassen und gleichzeitig experimentelle Manipulation sowohl an den Tumorzellen als auch an den Komponenten im TME. Obwohl in den letzten Jahren bei 3D-Krebsmodellen große Fortschritte erzielt wurden, waren solche Modelle für LUSC nicht ohne weiteres verfügbar. Die meisten Modelle, die bisher berichtet wurden, enthalten nur einige Aspekte dieser wichtigen Merkmale. Hier berichten wir über die Methoden für ein 3D-Kokultursystem von LUSC, das gleichzeitig wichtige architektonische Veränderungen des Gewebes erfasst, die während der LUSC-Entwicklung beobachtet wurden, sowie dynamische Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und hauptteilen Teilen der TME, einschließlich des ECM und CAFs.
Die Fähigkeit dieses Systems, architektonische Veränderungen des Gewebes genauer zu modellieren, basiert auf der einzigartigen Eigenschaft von TUM622-Zellen bei der Bildung von Organoiden mit acinarähnlichen Morphologien, wenn sie in 3D-EC eingebettet sind. Jeder Aus einer sich selbst erneuernden Einzelzelle besteht aus einer Monoschicht von Zellen, die ein hohles Lumen umgeben. Diese Monoschicht von Zellen weist eine apikal-basale Zellpolarität auf und bleibt nicht-invasiv, was der Gewebearchitektur des Lungenepithels ähnelt. Während TUM622 als 3D-Monokultur hyperplastisches Wachstum zeigt, verbessert die Zugabe von CAFs die acinarmorphogenese weiter und induziert mehr und größere Acini zur Bildung. Wichtig ist, dass CAFs dynamische architektonische Gewebeänderungen in TUM622-Zellen aufrufen, wenn die beiden Zelltypen in die Nähe kommen, sodass die TUM622-Zellen ihre apikal-basale Polarität verlieren und in die Matrix in Richtung der CAFs eindringen können. Diese phänotypischen Veränderungen rekapitulieren sowohl die frühe Hyperplasie als auch die späten invasiven Stadien von LUSC.
Im Gegensatz zu vielen Tumorsphäroidmodellen, bei denen jedes Sphäroid durch Aggregation vieler Zellen gebildet wird, wird jeder TUM622 Acinus von einer einzelzelle9abgeleitet. Bei In-vitro-LDA wird geschätzt, dass nur eine geringfügige Subpopulation (0,02 %) tUM622-Zellen haben eine solche Kapazität9. Obwohl selten, könnten sich diese Zellen selbst erneuern, wie ihre Fähigkeit zeigt, sich einer seriellen Passage in 3D zu unterziehen und sich in eine heterogene Population von Zellen zu differenzieren, die der des ursprünglichen Tumors ähnelt. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaft von TUM622-Zellen ist es wichtig, eine gleichmäßige Verteilung einzelner TUM622-Zellen innerhalb des ECM zum Zeitpunkt der Beschichtung für eine erfolgreiche Kultivierung und nachgelagerte Analyse sicherzustellen. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen mehrere Schlüsselpunkte im Protokoll sorgfältig befolgt werden, einschließlich der Bestimmung einer angemessenen Sädichte, der Kühlung aller Werkzeuge und Reagenzien während des Mischens von Zellen und Matrix, um eine vorzeitige Erstarrung zu verhindern, die Vermeidung der Einführung von Blasen während des Mischprozesses und die Möglichkeit, genügend Zeit für die Matrix vollständig zu erstarren, bevor das Kulturmedium hinzugefügt wird. Zusammen werden diese Vorsichtsmaßnahmen dazu beitragen, ein gleichmäßigeres Matrixsubstrat und einen stärkeren Kulturzustand für alle eingebetteten Zellen zu erreichen.
Einmal erfolgreich etabliert, kann diese Kultur für eine Vielzahl von nachgeschalteten Analysen verwendet werden, um die Zelle und den biochemischen Prozess zu sezieren, der die Tumorgenese reguliert. Die Anzahl und Größe der acini in jedem Brunnen gebildet kann im Laufe der Zeit mit hellen Feld-Imagern überwacht werden und als Auslesung für die proliferative und Selbsterneuerung Kapazität der TUM622 Zellen verwendet werden. Eine detailliertere Dynamik in der Morphogenese jedes Acinus konnte mit Live-Imaging auf einem konfokalen Mikroskop beobachtet werden, mit oder ohne verschiedene Etikettierfarbstoffe. Das konditionierte Medium kann während des Kulturzeitraums zu mehreren Zeitpunkten gesammelt werden, um lösliche Faktoren zu analysieren, die Zellzell- oder Zellmatrix-Cross-Talks vermitteln können. TUM622-Zellen, die direkt aus dem ECM mit Protokoll 4 extrahiert werden, eignen sich für die RNA- und Proteinextraktion zur Genexpressionsanalyse, Durchflusszytometrie-Quantifizierung oder FACS-Sortierung auf Basis von Zelloberflächenmarkern. Alternativ könnten die Kulturen für In-situ-Immunfluoreszenz- oder Immunhistochemiestudien fixiert werden, um die räumlich-zeitlichen Verteilungen verschiedener Marker zu verstehen. Obwohl die Immunhistochemie ähnlich ist, ergänzt sie die Immunfluoreszenzmethoden, da sie die Probenahme ganzer Acini ermöglicht, die aufgrund der einschränkenden Bildgebungstiefe der konfokalen Ziele möglicherweise nicht möglich sind. Bei beiden Methoden sind die Zeit und die Temperatur, bei der Fixierung und Permeabilisierung durchgeführt werden, entscheidend, insbesondere da TUM622-Zellen im Gegensatz zu vielen anderen 3D-Kulturen in eine dichte Matrix (>90% Kellermembranmatrix) eingebettet sind, wenn Matrixdichte ist viel geringer. Daher ist die Aufmerksamkeit auf eine standardisierte und konsistente Fixierung und Verarbeitung erforderlich, um replizierende Ergebnisse zu erhalten.
Anhand dieses Systems als Plattform kann man dann untersuchen, wie zellintrininelle Veränderungen in den Tumorzellen sowie zell-extrinsische Veränderungen in der Tumormikroumgebung die Epithelarchitektur beeinflussen und frühe Ereignisse modellieren, die an der Karzinombildung beteiligt sind. Beispielsweise könnten die Rollen von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen bei der Regulierung der Tumorgewebearchitektur durch Gain- oder Verlust-Funktions-Experiment untersucht werden, das auf das Gen abzielt, das für die Tumorzellen von Interesse ist. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass eine Überexpression von SOX2, die häufig in LUSC beobachtet wird, den Phänotyp von TUM622-Zellen verändert, wie ein Verlust der Hyperplasie bei 3D und die Progression in Richtung dysplastischesWachstum9 belegt. Auf der anderen Seite könnte man normale und krebsassoziierte Fibroblasten in Kokulturumgebungen vergleichen, bestimmen, wie Matrixkomponenten oder ihre Steifigkeit das Wachstum/Morphologie/Invasion beeinflussen, und ob die Blockierung bestimmter Zytokine die Zell-Zell-Kommunikation stören und sich wiederum auf die Gewebearchitektur und die Tumorprogression auswirken könnte. Wichtig ist, dass alle diese Assays in Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter therapeutischer Mittel durchgeführt werden und als Werkzeug zur Bestimmung der arzneimittelen Reaktion von LUSC-Zellen mit einer multidimensionalen Auslesung11verwendet werden können. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieses System in Bezug auf die Wege begrenzt ist, die es zur Vernehmung verwenden könnte, da nur einige, aber nicht alle wichtigen Signalwege das Wachstum und die Morphologie von TUM622-Organoiden in der Kultur regulieren (d.h. Hemmung von Wnt, aber nicht Notch-Signalisierung wirkt sich auf die Acinar-Mophogenese von TUM622-Zellen aus)9.
Zusammenfassend zeigen wir, dass dieses Organoidsystem eine einzigartige Plattform bietet, um neue Einblicke in das dynamische Zusammenspiel zwischen LUSC-Zellen und der Tumormikroumgebung während der Tumorprogression zu generieren. Wir gehen davon aus, dass unser Modellsystem eine wertvolle Plattform für die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln sein wird. In dieser Hinsicht sollte das Screening neuartiger Krebstherapeutika in einem nativen Tumorgewebekontext bei der Auswahl und Entwicklung wirksamerer Therapeutika helfen, die auf LUSC abzielen.
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Disclosures
Die Autoren sind Mitarbeiter und Aktionäre von Pfizer Inc.
Acknowledgments
Wir danken Magali Guffroy, John Kreeger und Stephani Bisulco von der Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker Group für Pathologie/Histologie unterstützung und Michael Arensman für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Wir danken auch dem Pfizer Postdoktorandenprogramm und der Oncology R&D-Gruppe, insbesondere Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin und Jennifer Tejeda für die Unterstützung des Programms.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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