Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

מערכת מרב התרבות Coculture מודל ריאות קשקש התקדמות קרצינומה

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60644

Summary

מערכת מודל מבחנה פותחה כדי ללכוד שינויים אדריכליים רקמה במהלך קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC) התקדמות ב תלת מימדי (3D) שיתוף התרבות עם סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs). מערכת זו אורגאיד מספק פלטפורמה ייחודית כדי לחקור את התפקידים של שונים תא הגידול הפנימי ושינויים חיצוניים לווסת את פנוטיפים הגידול.

Abstract

גידול-משתית אינטראקציות לשחק תפקיד קריטי בפיתוח של קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC). עם זאת, הבנת האינטראקציות הדינמיות הללו תורמות לשינויים ברקמה האדריכלית שנצפתה במהלך הפעילות המאתגרת עקב חוסר המודלים המתאימים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של מודל coculture 3D באמצעות תרבות התא הראשי LUSC המכונה TUM622. תאים TUM622 הוקמו מטופל lusc נגזר מבע שתל (pdx) ויש להם את המאפיין הייחודי ליצור מבנים כמו שכבתית כאשר נזרע בתוך מטריצה קרום המרתף. אנו להדגים כי TUM622 acini בתלת-ממד coculture תכונות מפתח של האדריכלות רקמה במהלך התקדמות LUSC, כמו גם את האינטראקציות דינמי בין תאים LUSC ורכיבים של מיקרוסביבה הגידול (TME), כולל מסחטות מטריקס (ECM) והתרופות הקשורות לסרטן (CAFs). אנו להתאים את פרוטוקול 3D העיקרי שלנו culturing כדי להדגים כיצד מערכת זו יכולה להיות מנוצל עבור ניתוח שונים במורד הזרם. בסך הכל, מודל זה אורגאיד יוצר פלטפורמה עשירה ביולוגית וישימה המאפשרת לקבל תובנה לתוך תא פנימי מנגנונים חיצוניים המקדמים את השיבוש של ארכיטקטורות אפיתל במהלך התקדמות קרצינומה ויסייע החיפוש אחר מטרות טיפוליות חדשות וסמני אבחון.

Introduction

סרטן ריאות הוא הגורם המוביל לתמותה הקשורות לסרטן ברחבי העולם. קרצינומה של תאי הקשקש (LUSC), שהוא הסוג השני הנפוץ ביותר של סרטן ריאות שאינו קטן תאים (NSCLC) וחשבונות עבור כ 30% של סרטן ריאות כל, מאובחנת לעתים קרובות בשלבים מתקדמים יש פרוגנוזה גרועה1. אפשרויות טיפול עבור חולים lusc הם הצורך העיקרי קליניות שניתן לשפר על ידי הבנה טובה יותר של מנגנונים סלולריים ומולקולריים המשמש כונן lusc tumorigenesis.

כמו ברוב סוגי הסרטן האנושיים, הפתוגנזה של LUSC הוא מאופיין על ידי שיבוש של שלמות, היטב מסודרת רקמת אפיתל הרקמה2. במהלך תהליך זה, הנכון apical-בסיס תא קוטביות, תא תא ואנשי הקשר מטריקס יאבדו, המתיר צמיחה בלתי מבוקרת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים. עכשיו זה מוערך מאוד כי תכונות ממאירות של תאים סרטניים לא יכול להיות ביטוי ללא הקשר החשוב בין תאים סרטניים המקומי שלהם מיקרוסביבה הגידול (TME)3. רכיבי מפתח ב-TME כולל מטריצה החילוץ (ECM), סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs), כמו גם תאים אנדותל וחדירה תאים חיסוניים באופן פעיל הצורה של TME וכוננים tuמוריגנזה4. עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו כיצד תאים סרטניים ורכיבים מרכזיים אלה ב TME אינטראקציה לכונן שינויים אדריכליים במהלך LUSC התקדמות היא מוגבלת מאוד.

תרבות תלת ממדית (3D) היא כלי חשוב כדי ללמוד את הפעילות הביולוגית של שינויים פנימיים בתאים וחיצוניים בוויסות שינויי אדריכלי רקמות ברקמות נורמלי וחולה5. התרבויות תלת-ממדיות מספקות את ההקשר המבני והפונקציונלי המתאים, החסר בדרך כלל בתרבויות דו-ממדיות מסורתיות (2D). הממדים הנוספים של מערכות כאלה לחקות מקרוב יותר רקמות בvivo בהיבטים רבים של פיזיולוגיה התא והתנהגויות סלולר, כולל התפשטות, בידול, הגירה, חלבון ביטוי ותגובה לטיפול בסמים. בשנים האחרונות, המאמצים של מעבדות שונות הובילו לפיתוח של מודלים 3d מחוץ גופית עבור ריאה רגילה כמו גם nsclc6,7,8. עם זאת, מודל של קרצינומה של הריאות הקשקש שיכול ללכוד הן את שינויי הרקמה הדינמית של רקמות במהלך tuמוריגנזה, כמו גם לשלב רכיבי סטרומה מפתח לא היה זמין.

כאן, אנו מתארים את השיטות להקמת רומן תלת מימדי (3d) מערכת coculture באמצעות התאים הראשוניים pdx נגזר (נקרא TUM622) ו-כף s9,10. הן TUM622 ו-CAFs נגזרות החולה NSCLC עם גידולים הבדיל גרוע10. כאשר מוטבעים כתאים בודדים ב-ECM, אוכלוסיית משנה נדירה של תאי TUM622 מעניקה את היכולת ליצור אורגנואידים עם מבנים דמויי-שכבתית המציגים קוטביות מתאימה של תא בסיס-apical. אלה מבנים כמו שכבתית הם hyperplastic, להציג ביטוי הטרוגנית של גזע כמו סמנים בידול דומה לגידול המקורי תוך שנותר לא פולשני, ובכך לחקות את השלב המוקדם ביותר של פיתוח LUSC. חשוב מכך, הראנו כי הארכיטקטורה רקמות של מבנים כמו שכבתית יכול להיות שונה על ידי עיכוב של תא-פנימי איתות מסלולים עם מעכבי מולקולה קטנה או תוספת של רכיבי מפתח ECM כגון CAFs, האחרון אשר מגביר את היווצרות acinar ועוד מעוררת acinar להיות פולשנית כאשר בסמיכות. יחד, נתונים אלה מראים כי מערכת זו שיתוף התרבות התלת-ממד של LUSC אורגנואידים מספק פלטפורמה רבת ערך עבור החקירה של הדדיות דינמי בין תאים LUSC ו TME יכול להיות מותאם עבור ניטור התגובה של תאי LUSC לטיפול בסמים11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפספ ו Culturing TUM622 תאים ו-CAFs בתרבויות דו-ממדיות

  1. הTUM622 תאים מפני הזדקנות וculturing
    1. חם 3D בינוני התרבות ואת הדיסוציאציה של התא ריאגנטים (ראה טבלת חומרים) עבור TUM622 תאים ב 37 ° c.
    2. מעבר TUM622 תאים ב 80% שטף ב 2D מבחנות. בדרך כלל, זה קורה שבוע לאחר הפסנת.
    3. להיפטר המדיום הישן מ T75 תרמוס ולשטוף פעם עם 6 מ ל של מאגר HEPES. הימנע מליטוף ישירות על התאים.
    4. . ומתה את המאגר של הכלב הוסף 4 מ ל טריפסין/EDTA (0.25 mg/mL, ראה טבלה של חומרים) לשטיפה מהירה ולהשליך את טריפסין/edta.
    5. הוסף 2 מ ל טריפסין/EDTA ו-דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות. הסר מבחנות מן החממה ולהקיש על מבחנות כדי לשחרר את התאים מבלי ליצור בועות אוויר ולהחזיר צלוחיות לחממה עבור 5 דקות נוספות.
      הערה: חשיפה ממושכת לטריפסין תגרום לנזק הפיך בתאים ולשינוי פנוטיפ שלהם, ולכן מומלץ להגביל את תאי הזמן החשופים לטריפסין.
    6. אישור תאים התנתק מתחת למיקרוסקופ אור (4x או 10x). הוסף 4 מ ל של ניטרול מאגר (מאגר TNS) (ראה מידע מגיב תת-תרבות בטבלת החומרים) ואחריו 10 מ ל של מדיום תרבות תלת-ממד (ראה טבלת חומרים).
    7. הפיפטה מעלה-ומטה בעדינות כדי להמשיך ולנתק את התאים באמצעות צינורות של 10 מ ל. העבר את ההשעיה באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL.
    8. ספירת מספרי תאים באמצעות מונה הומוציטוטומטר או תא אוטומטי.
    9. זרעי 0.8 x 106 תאים/T75 בקבוקון 20 מ ל של בינונית תרבות תלת-ממדית (ראה טבלת חומרים).
    10. האכילו את התאים בכל יום אחר על-ידי החלפת חצי מהמדיום המושקע במדיום טרי.
  2. הפסנות והזדקנות הקפה
    1. מעבר בקפה כאשר התאים מגיעים לשטף. בדרך כלל, זה מתרחש לאחר 5 ימים של culturing מ 1:2 לפצל.
    2. הכנת בינונית-קפה באמצעות בינוני RPMI הבסיס עם 20% חום מופעל סרום העובר, 1% L-גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. חמם את המדיום עד 37 ° c.
    3. ב T75 בקבוקון, לשטוף את CAFs עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) פעם אחר כך להוסיף 2 מ ל טריפסין/EDTA ו דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות.
    4. להתבונן תחת מיקרוסקופ קל כדי להבטיח תאים הנתק בבקבוקון (4x או 10x). אם לא, להאריך את הדגירה של 2-3 מינימום אחר.
    5. לאחר תאים מנותקים והתנתק, להוסיף 10 מ ל של בינונית התרבות 3D לנטרל את טריפסין/EDTA ו פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להמשיך לנתק את ה-CAFs.
    6. העבר את ההשעיה התא לתוך שפופרת חרוט 50 mL ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח מתאים של בינונית תרבות תלת-ממד (ראה טבלת חומרים) ומעבר לשתי מבחנות חדש T75.

2. ציפוי תאים TUM622 מטריצה מימדית עבור 3D בתפירה

  1. יום לפני הניסוי, להפשיר את הבקבוקונים של מטריצת קרום המרתף במקרר 4 ° c בלילה. הרגעות פיפטות פלסטיק (2 מ ל) וטיפים ב-20 ° c ללילה.
    הערה: לא כל הרבה מטריקס קרום המרתף יש את אותה יכולת לתמוך בצמיחה 3D של תאים TUM622. לכן, יש צורך לרכוש ולבדוק מספר רב של מטריקס קרום המרתף כדי לזהות את אלה התומכים היווצרות acini חסון. בדרך כלל, זה דורש ריכוז חלבון גבוה יותר (16-18 mg/mL) במטריצה.
  2. ביום הניסוי, מדיום התרבות התלת-ממדית החמה, מאגר ה-HEPES, טריפסין/EDTA וטריפסין ניטרול מאגר (TNS) באמבט מים ב37 ° c. מיד לפני הקמת התרבות, לקחת את המטריקס המוסדר ממברנה קרום המרתף מהמקרר ולשים את הבקבוקון על הקרח.
  3. הרגעות את לוחיות התרבות רקמות על קריר פלטפורמת מתכת להציב על הקרח. מניחים צינורות צנטריפוגה על מתלה מתכת קירור על קרח.
  4. שימוש בתאים TUM622 שהתקבלו משלב 1.1.7, לחשב את המספר הרצוי של תאים הדרושים לציפוי. בדרך כלל, 15000-30, בתאי 0000 נחוצים לכל טוב של צלחת 24. צפיפות נמוכה יותר מתאימה יותר עבור הדמיה וכימות, בעוד צפיפות גבוהה עדיפה בעת איסוף תאים עבור הפקת RNA או בלוק המערבי.
  5. העברת תא הבולם לתוך צינור הצנטריפוגה מקורר (כל צינור המכיל תאים עבור ציפוי שלישיה) ו ספין למטה ב 300 x g בצנטריפוגה דלי תלוי ב 4 ° c עבור 5 דקות.
  6. מנושף את הסופרנטנט בזהירות עם פיפטה מריר מוצמד לטיפ לא מסונן (20 μL), ועוזב כ-100 μL של המדיום בצינור (השתמש בסימונים בצינור כמדריך).
  7. הקש בעדינות על הצד של הצינור להוציא והנתק את הגלולה לפני החזרתו למדף הקירור.
  8. באמצעות 2 מ ל הפיפטות מקורר לערבב בעדינות את המטריצה על ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים תוך שמירה על הבקבוקון במגע עם הקרח. פיפטה במהירות מתונה, כך ששום בועות לא הוכנסו לתוך המטריצה במהלך הליך זה.
  9. להעביר את הנפח המתאים של המטריצה לתוך כל צינורית צנטריפוגה. לציפוי מטריליטים בצלחת 24-היטב, הוסיפו 1.1 מ ל של מטריצת קרום המרתף לכל צינור.
  10. באמצעות עצות טרום מקורר, פיפטה את המטריצה בכל צינור למעלה ולמטה כ 10 פעמים כדי לבצע השעיה תא אחיד.
  11. העברת 310 μL של תא/מטריצה השעיית לכל טוב של צלחת מקורר מראש 24-היטב. הפיפטה ממוקם בזווית 90 מעלות למשטח הצלחת וההשעיה התווספה למרכז הבאר. ההשעיה צריכה להתפשט ולכסות את כל הבאר ללא צורך להטות את הצלחת.
  12. כדי להקל על ניתוח הזרם האנטי-מטריצות, צלחת ההשעיה של התא/מטריצה במקביל לתוך 2-היטב שקופיות קאמרית. העבר 100 μL של תא/מטריצה הבולם למרכז של באר של 2-היטב שקופית קאמרית (ראה טבלת חומרים). זה מאפשר למטריצה ליצור מבנה כמו כיפת עם נפח הרבה יותר קטן.
  13. החזר את הצלחת ואת השקופית הקאמרית חזרה לתוך החממה תרבות רקמות ו הדגירה עבור 30 דקות כדי לאפשר את המטריצה כדי לגבש. בדוק את הלוח/השקופית תחת מיקרוסקופ קל כדי לוודא שתאים בודדים מופצים באופן שווה בתוך המטריצה (4x או 10x).
  14. הוסף 1 מ ל של התרבות טרום מחומם 3D השלם בינוני לתוך כל טוב ו 1.5 mL של מדיום התרבות 3D לכל טוב של שקופית קאמרית ואז להחזיר אותם לחממה.

3.3D Coculturing של תאים TUM622 ו-כף s ב מטריקס מסחטות

  1. הכינו את השעיות התאים של TUM622 ו-CAFs לפי סעיף 2.
  2. לספור את צפיפות התא קפה על ידי לקיחת 10 μL של השעיית תא וערבוב זה עם 10 μL של טריפי כחול.
  3. הוסף 10 μL של התערובת לכל אחד משני החדרים על hemacytometer כדי לספור ולחשב צפיפות התא.
    הערה: ל-CAFs יש צורות לא סדירות וייתכן שלא ייספרו במדויק על מונה תאים אוטומטי.
  4. שיתוף TUM622 תאים ו-CAFs בתוך מטריצת קרום המרתף
    1. בהתבסס על מידע צפיפות התא, לחשב את המספר הרצוי של תאים המשמשים לציפוי. CAFs הם שנזרע ביחס 2:1 של תאים TUM622. לדוגמה, עבור 30,000 תאים TUM622 הזרע, 60,000 CAFs הם שיתוף מוטבע.
    2. העבר את הנפח המתאים של TUM622, כמו גם הבולם התא של CAFs לתוך שפופרת הצנטריפוגה אותו ובצע את השלבים 2.5-2.11 לציפוי לתוך לוחות 24-טוב. עבור אימונוoforas, העברת 60 μL של שילוב TUM622/CAFs לשקופיות קאמרית כמתואר בשלב 2.12).
  5. Coculturing TUM622 עם מצופה כף s בתוך מטריצות קרום מרתף (ראה לוח חומרים)
    1. הגדר TUM622 מונו-תרבות בהתאם לשלבים 2.5-2.13.
    2. העבר פעמיים את מספר ההשעיה של CAFs (לעומת מספר התאים TUM622 הזרע) לתוך שפופרת צנטריפוגה ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. ומחדש את הקפה ב 1 מ ל של מדיום תרבות תלת-ממד.
    4. העבר את 1 mL של הבולם של CAFs היטב המכיל את התאים TUM622 מוטבעים.

4. קציר TUM622 Acini עבור RNA/חלבון חילוץ ומיון תאים פלואורסצנטית-פעיל (FACS)

  1. הכנת מאגר לשטוף ומאגר קצירת תאים בהתאם לפרוטוקול ערכת הפיתוח של התא התלת-ממדי ביום הקודם ולצנן את הלילה ב -4 ° c.
  2. לשמור לוחיות על מצנן צלחת וריאגנטים אחרים על הקרח לפני תחילת תהליך החילוץ.
  3. שטפי מדיה מבארות תרבות תלת-ממדית מבלי לגעת במטריצה ולשטוף בעדינות את הבאר 3 פעמים עם 1 mL של מאגר לשטוף.
  4. מטפי את השטיפה הסופית ומוסיפים 1 מ ל של מאגר קצירת תאים לכל באר.
  5. השתמש בטיפ p1000 כדי לגרד את המטריצה מכל באר.
  6. הפיפטה מעלה ומטה. כדי לנתק את המטריצה
  7. העבר 1 mL של התערובת לצינור מקורר מראש של 15 מ"ל. הוסף עוד 1 mL של מאגר קציר לאותו הבאר.
  8. חזור על שלבים 4.5-4.7, והעבר את כל התמהיל של אותו היטב לתוך 1 15 mL חרוט.
  9. מכסה את הצינורות והסלע ב -4 ° c עבור 30 דקות.
  10. ממלאים כל צינור עם הקרח קר PBS עד 10 מ ל ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  11. . מבלי לגעת בגלולה על הסופרנטאנט להכיל חלקי מטריקס, אך יש לאסוף את כל הספרואידים בתחתית הצינורית.
  12. הוסיפו את הערוץ הקרח הקר. לשטיפה נוספת היפוך הצינור כמה פעמים כדי לנתק את הגלולה. ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות.
  13. בזמן ספינינג, להכין מאגר לפירוק לחלבון ו-RNA אוסף.
  14. הוסף בזהירות את supernatant ולהוסיף מאגר הליזה עבור עיבוד במורד הזרם לאסוף חלבון או RNA. לחילופין, ניתן להשעות תאים מחדש עבור ניתוח זרימה/מיון FACS או הפסעות סדרתית.

5. immunofluorescence של TUM622 Acini

  1. הכנת מאגר אימונוללואוורנציה (אם מאגר: PBS עם 0.1% בסרום שור (BSA), 0.2% טריטון X-100 ו 0.05% רצף-20), מאגר חסימת ראשי (אם מאגר עם 10% הסרום עז), מאגר חסימה משני (מאגר חסימת ראשי עם 20 μg/mL2עז נגד העכבר F (ab
  2. שטוף בינוני מ 2-היטב שקופיות קאמרית, לשטוף פעם אחת עם PBS ולהגדיר את השקופית על מצנן לוחית מתכת על קרח. השקופית הקאמרית צריכה להישאר על מצנן המתכת לשארית הפרוטוקול.
  3. הוסף טרום מקורר 4% כלייט כדי לתקן את acini ו דגירה על הקרח 20 דקות.
  4. הסרת 4% בתחתית ולשטוף שלוש פעמים עם 2 מ ל של ה-PBS מקורר כל אחד עבור 5 דקות עם נדנדה עדין על הנדנדה.
  5. מרוב הPBS והחדירות עם 1.5 mL של 0.5% טריטון X-100 ב-PBS (טרום מקורר) עבור 20 דקות. עד סוף הליך זה, מבנה כמו כיפת יהיה רופף.
  6. הפחת בעדינות את מאגר החדירות מהשקופית הקאמרית כדי להימנע מאובדן דגימה. זה מושגת על ידי הוספת טיפ דק (20 μL) לתוך הפיפטה ולחיצה על הקצה לכיוון הפינה של החדר.
  7. לרחוץ שלוש פעמים עם 2 מ ל של הPBS מקורר כל אחד עבור 5 דקות עם נדנדה עדין על הנדנדה.
  8. חסום את המדגם עם מאגר החסימה העיקרי על הקרח עבור 1 h.
  9. הסר מאגר חסימות ראשי והוסף מאגר חסימות משני וחסום עבור 30 דקות.
  10. הוסיפו נוגדנים עיקריים במאגר החסימות הראשי ובמשך הלילה ב-4 ° c.
    הערה: ריכוז הנוגדנים המשמשים כאן צריך להיות גבוה יותר מאשר בדרך כלל בשימוש לצביעת תאים בתרבות דו-ממדית. רוב הנוגדנים העיקריים המשמשים במחקר זה מדולל ב 1:100 דילול (ראה לוח חומרים).
  11. הסר נוגדנים ראשוניים ושטוף את המדגם 3 פעמים עם 2 מ ל של מאגר IF קר.
    הערה: הדגימות יכולות להיות משוחררות, לנקוט זהירות נוספת בעת הפחתת מייפת.
  12. מודלת את הדגימות של נוגדנים משניים מדולל במאגר חסימת ראשי עבור 1 h ב RT. הנוגדנים המשניים המועדפת צריך להיות מאוד צולבות adsorbed כדי להפחית את כתמים ברקע. הנוגדנים המשניים ביותר בשימוש במחקר זה מדולל ב 1:200 דילול.
  13. הסר נוגדנים משניים ושטוף את המדגם 3 פעמים עם 2 מ ל של מאגר IF קר.
    הערה: הדגימות יכולות להיות משוחררות, לנקוט זהירות נוספת בעת הפחתת מייפת.
  14. הוסף את ה-PBS עם DAPI (1:1000 דילול) במהלך השטיפה האחרונה כדי להכתים את הגרעין. לבצע עוד 2 שוטפים ב-PBS.
  15. התמונה הדגימות על מיקרוסקופ הקונמוקד בתוך 3 ימים.
    הערה: בשל גודל האורגנואידים והמגבלות במרחק העבודה של המטרה, הדגימות מוסיביות בדרך כלל בהגדלה של 10x או 20x.

6. הכנת דגימות תרבות תלת-ממדית לאימונוהיסטוכימיה

  1. שטוף בינוני מ 2-היטב שקופיות קאמרית ולשטוף פעם אחת עם PBS.
  2. לתקן את התרביות תלת-ממד ב 4% בכיוון כדור הבמה ב37 ° c.
  3. הסרה של 4% כלפי מע, תרביות סראונד עם 2.5 מ ל של ג'ל לדוגמא היסטולוגיה (ראו טבלת חומרים) ומניחים את השקופית ב -4 ° c כדי לגבש לפחות 1 h.
  4. דגימות העברה מוקפים ג'ל היסטולוגית לדוגמה לקלטות רקמות ומעובד במעבד מדגם ממוחשב לדגימת רקמה בלילה.
  5. להטביע דגימות בשעווה פרפין ולהתכונן לכיוון12.

7. בדיקת הרעלים הציטובית של 3D עבור הקרנה מורכבת (דוגמה עבור 1 96-ובכן צלחת)

  1. הגדר צלחת 96-ובכן על מצנן צלחת, מאגר 25 מ ל על מצנן אגירה ו 15 מ ל שפופרות חרוט על קרח לפני תחילת הניסוי.
  2. הכנת השעיות של מטריצת התאים של תאים TUM622 בשפופרת מלפני מקורר 15 מ"ל פוליפרופילן באמצעות הוספת הנפח המתאים של מטריצת קרום המרתף לתאים. הצפיפות הרצויה עבור TUM622 תאים הוא 10,000 תאים לכל 70-75 μL של מטריצה קרום המרתף. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לאפשר אפילו ערבוב של תאים בתוך המטריצה.
  3. הזז את הצלחת עם צידנית צלחת ומאגר עם קריר מאגר הרחק מהקרח אל משטח יבש כדי להימנע ממגע של מטריקס קרום המרתף עם קרח במהלך ההעברה.
  4. העבר את תערובת התא מטריצה למאגר קירור מבלי ליצור בועות.
  5. באמצעות הצנרת מכני רב-ערוצי (10-300 μL), העברה 70-75 μL של התאים לערבב לתוך כל טוב המתאים של הצלחת 96-באר.
  6. הצלחת דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 30 דקות עבור מטריצת קרום המרתף כדי לגבש.
  7. הוסף 100 μL של מדיה בכל השורות והחזר את הצלחת לחממה.
  8. התחל במינון מורכב ביום הבא או במועד מאוחר יותר, בהתאם למטרת הניסוי.
  9. Spheroids ניתן להאכיל מחדש מחדש כל 2-3 ימים עד 10 ימים, על ידי הסרת מדיה בילו עם 8-או 12-היטב ואקום והחלפה עם מדיה טרייה עם או בלי תרכובות רצויות.
  10. מספר TUM622 spheroids יכול להיות כימות באמצעות 3d צמידה בהתאם לפרוטוקול של היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUM622 ו-CAFs בתרבות הדו
איור 1 מציג את המבנה האופייני של תאים TUM622 ו-cafs בתרבות הדו-ממדית. תאים TUM622 מעוגלים עם גרעינים גדולים בעוד CAFs הם שטוחים מוארך. TUM622 תאים יכולים להגיע ל-80%-90% שליטה בתרבות. התפשטות נוספת מובילה ליותר, אך תאים קטנים הצבורים במושבות שאינן מגיעות למגע ישיר. לעומת זאת, CAFs מעדיף לגדול בצפיפות התא גבוה יותר ולשמור על מתרבים בשטף מלא אם מספיק חומרים מזינים מסופקים.

צמיחה ומורפולוגיה של TUM622 acini ב 3D ECM
איור 2 מציג ניסוי זמן-קורס של תאים TUM622 שנזרע בתרבות 3d. נתונים מראים כי תאים TUM622 בודדים מסוגלים להרכיב אורגנואידים עם מורפולוגיות דמויי-שכבתית כאשר הם מוטבעים. בין הימים 5 ו -7, לומן הופך להיות ברור במבנים כמו שכבתית ונשאר חלול לאחר מכן (איור 2א). כל acinus, מורכב של מונאולייר של תאים המקיפים את לומן חלול, מציג קוטביות apical בסיס הנכון דומה לזה של אפיתל הריאה ב vivo (איור 2ב). אלה מבנים כמו שכבתית הם hyperplastic ולהמשיך לגדול כל עוד מספיק חומרים מזינים מסופקים. את התרבות ניתן לשמור עד 24 ימים לפני ECM לחלוטין מתפורר (איור 2ג). באמצעות הגבלת שיטת דילול (אידה) (נתונים לא מוצגים), מעריכים שרק אוכלוסיית משנה נדירה של TUM622 תאים (< 0.02%) יש את היכולת ליצור מבנים בעלי שכבתית כמו9.

צמיחה ומורפולוגיה של TUM622-כף התרבות הקוכית
איור 3 מתאר את תוצאות ההתקנה והנציגים של TUM622-בקפה. CAFs יכול להיות משולב לתוך התרבות הcoculture על ידי הנחת מעל המטריצה או שיתוף עם התאים TUM622. ללא קשר לכיוונון, נוכחות של CAFs השתפרה מאוד את מספר וגודל הspheroids נוצר (איור 3ב). מעניין, כאשר TUM622 acini לבוא לסמיכות עם CAFs, הם לגרום acini להיות פולשנית ולהגר לעבר הקפה, ויוצרים "דמעה שחרור" כמו מבנים (איור 3ג). שים לב כי TUM622 acini ב-מונוקולטורה לא להציג התנהגות פולשנית ורק טופס "דמעה-שחרור" כמו מבנים כאשר קרוב ל-cafs.

מוחיסולוגיה ואימונוהיסטולוכימיה ומכתיבי כימיה מייצגים
איור 4 מראה את התוצאות של הנציגים מתוך מודלואונציה וכתמים אימונוהיסטוכימיה של TUM622 acini לאחר 10 ימים של culturing. תמונות confocal וקד צולמו במישור המשוונית של מוכתם TUM622 acini מוכתמים (איור 4א). לעומת זאת, כל קטע ממדגם האימונוהיסטוכימיה עשוי ללכוד את האקני במישורים שונים (איור 4ב'). שתי התוצאות הראו ביטוי הטרוגנית של תאים כמו גזע והבדיל בתוך כל acinus.

TUM622 הרעלת ציטוד תלת-ממדי באמצעות מעכב מסלול Wnt
איור 5 מראה את המינון-תגובה של TUM622 acini מטופלים עם XAV939, מעכב Tankyrase (איור 5a, B). XAV939 התווסף לתרבות 1 יום לאחר ציפוי ורענון כל יומיים במשך 10 ימים בסך הכל. בסוף הניסוי, מספר האקני. הושפע על ידי האימנגר ברייטפילד תמונות בהגדלה גבוהה נרכשו גם כדי ללכוד את המבנה של הספרואידים בשליטה לעומת XAV939 בארות מטופלים (איור 5ג). בסך הכל, XAV939 מציג עיכוב תלוי מינון על היווצרות acini ומשנה את ארכיטקטורת הרקמה של spheroids נוצר. תוצאות אלה מצביעים על כך הפעלה של המסלול הקאנוני Wnt נדרש במהלך TUM622 acinar מורקוגנזה.

Figure 1
איור 1: TUM622 ו-cafs בתרבות הדו-ממדית. הנציג של השדה הבהיר תמונות של תאים TUM622 ו-CAFs תרבותי ב-2D. סרגל קנה מידה = 100 μm. דמות זו השתנתה מ-חן ואח '9 ומשמשת באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צמיחה ומורפולוגיה של TUM622 acini ב-ECM 3D. (A) קורס הזמן תמונות של תאים TUM622 המתורבת בתוך מטריקס קרום המרתף על פני 10 ימים. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ב) immunofluorescence המוכתמת של TUM622 acini עם apical-בסיס תאים קוטביות סמנים, golgi-אנזים (GM-130, ירוק, apical) ו אינטגרציה אלפא 6 (CD49f, בסיס, אדום). (ג) כימות של מספר acini (y-ציר ימני, אדום) ואת הגודל הממוצע של acini (שמאל ציר y, כחול) מצופה טריליטה בצלחת 24-היטב על 24 ימים בתרבות. קווי שגיאה מייצגים את SD. דמות זו השתנתה מ-חן ואח '9 ומשמשת באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צמיחה ומורפולוגיה של TUM622-CAFs התרבות. (א) רישום סכמטי של הכיוונון של TUM622-cafs. ה-CAFs מצופים או מוטבעים עם תאי TUM62 ב-ECM. לאחר 6-12 ימים בתרבית, תאים TUM622 מסוגלים טופס acini גדול יותר לעומת מונו-תרבות לפלוש ECM כאשר בסמיכות ומגע ישיר עם CAFs. שימו לב כי הפנוטיפים הפולשניים ניתן לצפות רק בתרבות המשותף. (ב) ברייטפילד תמונה של TUM622 תלת-ממד של תרבויות בנוכחות או היעדרות של כשהיו מצופים ב-cafs לאחר 8 ימים. קנה מידה ברים = 200 μm. (ג) ברייטפילד תמונות מראה שחרור דמעה בצורת acini להרכיב בתרבויות cocultures ללא קשר לקפה מצופה או שיתוף מוטבע ב ecm. קנה מידה של סרגלים = 200 μm. דמות זו השתנתה מ-חן ואח '9 ומשמשת באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התוצאות של הנציגה החיסונית והנוגדנים האימונוהיסטוכימיה. (א) נוגדן כתמים של acini עם סמנים של תאים גזע/מחולל קדמון (CXCR4 ו SOX2), מזנכימה (vimentin), אפיתל בידול (מעורבים), אפופטוזיס (ביקע-caspase-3) והתפשטות (Ki67) ירוק, dapi בכחול, E-קדהרין ו phalloidin אדום. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ב) אימונוהיסטוכימיה על סעיפים ffpe של TUM622 acini. סרגל קנה מידה = 100 יקרומטר (למעלה) ו 50 יקרומטר (למטה). דמות זו השתנתה מ-חן ואח '9 ומשמשת באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: TUM622 שיטת הרעילות 3D באמצעות מעכב מסלול Wnt. (א) קוונפיקציה של מספרים ספרואיד בצלחת 96-באר שבו TUM622 תאים טופלו עם diמתיל סולפוקסיד (בקרה) או XAV939. . כל תנאי ממוקם בטריפליטים קווי שגיאה מייצגים SD. (ב) כל התמונות היטב של הצלחת 24-הבאר נלקח עם צמידה מראה את ההשפעות העכבות של XAV939 על היווצרות acini. (ג) נציג ברייטפילד תמונות מהפקד לעומת בארות מטופלים הממחיש את השינויים מורפולוגיים שנגרמו על ידי טיפול XAV939. קנה מידה של סרגלים = 100 μm. דמות זו השתנתה מ-חן ואח '9 ומשמשת באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גידולים הם רקמות הטרוגנית מורכב של תאים סרטניים הקיימים זה לצד זה עם תאים סטרומה כגון סרטן הקשורים פיברותקיעות, תאים אנדותל ותאים חיסוניים בתוך ECM. יחד, אלה רכיבים מגוונים לחצות לדבר ולהשפיע על מיקרוסביבה הגידול, משחק תפקיד פעיל בנהיגה tuמוריגנזה, תהליך הכרוך שינויים מתקדמים בארכיטקטורת הגידול. באופן אידיאלי, מודל מבחנה של התפתחות הגידול צריך להיות מסוגל ללכוד את השינויים האדריכליים דינמי רקמה נצפתה בגידולים אנושיים ב vivo, הגומלין המורכבים של סוגי תאים מגוונים בתוך מיקרוסביבה הגידול באותו זמן היתר מניפולציה ניסיונית הן בתאי הגידול והן ברכיבי ה-TME. למרות התקדמות רבה נעשה במודלים סרטן 3D בשנים האחרונות, מודלים כאלה לא היו בקלות הקרובה ל LUSC. רוב הדגמים שדווחו עד היום משלבים רק כמה היבטים של תכונות חשובות אלה. כאן אנו מדווחים על שיטות עבור מערכת coculture 3D של LUSC אשר במקביל לוכדת רקמות מפתח שינויים אדריכליים שנצפו במהלך פיתוח LUSC, כמו גם אינטראקציות דינמיות בין תאים סרטניים ורכיבים עיקריים של TME, כולל ECM ו . בסדר, קפה

היכולת של מערכת זו מדויקת יותר מודל שינויים אדריכליים הרקמה מבוססת על המאפיין הייחודי של תאים TUM622 ב ויוצרים אורגנואידים עם מורפולוגיות כמו שכבתית כאשר מוטבעים ב-3D EC. נוצר מתוך תא בודד לחידוש עצמי, כל acinus מורכב של מונאולייר של תאים המקיפים לומן חלול. זה מונייר של תאים מציג את קוטביות התא הבזלי-בסיס נשאר לא פולשני, דמוי האדריכלות רקמה של אפיתל הריאה. בעוד TUM622 כמו מונו 3D תרבות להציג צמיחה היפרפלסטיק, התוספת של CAFs מגביר עוד יותר acinar מורפולגנזה וגורמת acinar יותר ויותר לטופס. חשוב מכך, CAFs להפעיל שינויים אדריכליים דינמיים רקמה בתאי TUM622 כאשר שני סוגי התא מגיעים לסמיכות, ומאפשר לתאי TUM622 לאבד את הקוטביות apical-בסיס ולפלוש למטריצה כלפי ה-CAFs. השינויים הפנופי האלה מושתנים הן בתחילת היפרפלזיה והן כמו גם בשלבים פולשניים מאוחרים של LUSC.

בניגוד מודלים רבים ספרוoid הגידול שבו כל ספרואיד נוצר על ידי הצבירה של תאים רבים, כל TUM622 acinus נגזר מתא אחד9. ב-אידה מבחנה, ההערכה היא שרק אוכלוסיית משנה משנית (≤ 0.02%) של תאים TUM622 יש קיבולת כזאת9. למרות נדיר, תאים אלה יכול לחדש את עצמו כפי שמעידים על ידי היכולת שלהם לעבור הפסשאייג ' סדרתי ב-3D, כמו גם להבדיל לאוכלוסייה הטרוגנית של תאים דומים לזה של הגידול המקורי. בשל תכונה ייחודית זו של תאים TUM622, זה קריטי כדי להבטיח אפילו הפצה של תאים TUM622 יחיד בתוך ECM בזמן הציפוי לניתוח מוצלח במורד הזרם. כדי להשיג מטרה זו, כמה נקודות מפתח צריך להיות בקפידה בפרוטוקול, כולל קביעת צפיפות הזריעה המתאימה, שמירה על כל הכלים וריאגנטים מגניב במהלך ערבוב של תאים ומטריצה כדי למנוע מיצוק מוקדמת, הימנעות המבוא של בועות בתהליך ערבוב ומאפשר מספיק זמן עבור מטריקס כדי לגבש לפני הוספת ביחד, אמצעי זהירות אלה יסייעו להשיג מצע מטריקס אחיד יותר ומצב תרבות עבור כל התאים המוטבעים.

לאחר שהוקמה בהצלחה, ניתן להשתמש בתרבות זו למגוון ניתוחי במורד הזרם כדי לנתח את התא ואת התהליך הביוכימי המסדירים את טווריגנזה. המספר והגודל של acini נוצר בכל הבאר ניתן לפקח על הזמן עם תקדמת שדה בהיר משמש כבדיקה עבור קיבולת מתרבים והתחדשות עצמית של תאים TUM622. דינמיקה מפורטת יותר של מורפוגנזה של כל acinus ניתן לצפות עם הדמיה חיה על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, עם או בלי שונים צבע תיוג. ניתן לאסוף את המדיום הממוזג בנקודות זמן מרובות במהלך תקופת התרבות לניתוח גורמים מסיסים שעשויים לתווך בין תאי תא לבין שיחות מקושרות באמצעות מטריצת תאים. TUM622 תאים שחולצו ישירות ECM באמצעות פרוטוקול 4 מתאימים RNA והפקת חלבון עבור ניתוח ביטוי גנים, לזרום cy, לנסות לכמת או מיון FACS המבוסס על סמני פני השטח התא. לחילופין, ניתן לתקן את התרבויות בחקר האימונולאואורוכימיה או במחקר האימונוהיסטוכימית כדי להבין את הפצות הזמן המרחבי של סמנים שונים. למרות דומה, אימונוהיסטוכימיה משלים שיטות immunofluorescence בכך שהוא מאפשר את הדגימה של acini שלם כי לא יכול להיות אפשרי בשל הגבלת ההדמיה-עומק של מטרות קונפוקלית. עבור שתי שיטות אלה, הזמן והטמפרטורה שבהם מבוצעים קיבעון וחדירות הם קריטיים, במיוחד בהתחשב בעובדה שTUM622 תאים מוטבעים במטריצה צפופה (> 90% מטריצות קרום המרתף) בניגוד לתרבויות תלת-ממד רבות אחרות שבהן צפיפות המטריצה נמוכה בהרבה. לכן, תשומת לב סטנדרטית ועקבית והעיבוד הוא הכרחי כדי לקבל תוצאות replicative.

באמצעות מערכת זו כפלטפורמה, אפשר לחקור כיצד שינויים בתוך התאים הפנימיים בתאי הגידול, כמו גם שינויים סלולריים החיצוני מיקרוסביבה הגידול, להשפיע על האדריכלות האפיתל ואת האירועים המוקדמים המעורבים היווצרות קרצינומה. לדוגמה, התפקידים של אונגנים או גנים מדכא הגידול בוויסות הארכיטקטורה רקמת הגידול יכול להיות למד על ידי להרוויח או אובדן של הפונקציה הניסוי המיקוד את הגן של העניין בתאי הגידול. אכן, הדגמנו כי מעל הביטוי של SOX2, אשר נצפה בדרך כלל ב LUSC, משנה את הפנוטיפ של TUM622 תאים כפי שמעידים על ידי אובדן של היפרפלזיה ב 3D והתקדמות לקראת צמיחה dy,9. מצד שני, אחד יכול להשוות נורמלי לעומת סרטן הקשורים פיברותקיעות בהגדרות התרבות הטבעית, לקבוע כיצד רכיבי מטריקס ההשפעה הנוקשות שלו צמיחה acini/מורפולוגיה/פלישה, ואם חסימת ציטוקינים מסוימים יכול להפריע לתקשורת תא התא בתורו להשפיע על הארכיטקטורה רקמה התקדמות הגידול. חשוב מכל, כל אלה שניתן לבצע בנוכחות או העדר של סוכנים טיפוליים מסוימים ולשמש ככלי כדי לקבוע את תגובת התרופה של תאים LUSC עם בדיקה רב מימדית11. חשוב גם לציין כי מערכת זו מוגבלת לגבי מסלולים זה יכול לשמש כדי לחקור, כמו רק כמה אבל לא כל מסלולים מרכזיים איתות להסדיר את הצמיחה ואת המבנה של TUM622 אורגנואידים בתרבות (כלומר, עיכוב של Wnt אבל לא מחריץ איתות משפיע על ממוחגנזה של TUM622 תאים)9.

לסיכום, אנו מדגימים כי מערכת אורגאיד זו מספקת פלטפורמה ייחודית ליצירת תובנות חדשות לתוך הגומלין הדינמי בין תאים LUSC ואת מיקרוסביבה הגידול במהלך התקדמות הגידול. אנו צופים כי מערכת המודל שלנו תהיה פלטפורמה רבת ערך לגילוי סמים ופיתוח. במובן זה, הקרנת רומן נגד סרטן therapeutics בהקשר רקמות יליד הגידול צריך לסייע בבחירה ופיתוח של therapeutics יעיל יותר לפילוח LUSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים הם עובדים ובעלי מניות של פייזר.

Acknowledgments

אנו מודים לmagali Guffroy, ג ' ון קרגר, ו סטפן Bisulco של הקבוצה פייזר-אונקולוגיה היסטואטולוגיה וקבוצת ביוארקר לתמיכה פתולוגיה/היסטולוגיה ומייקל ארסמן לסקירה קריטית של כתב היד. אנו גם מודים לתוכנית הפוסט-דוקטורט ולקבוצה האונקולוגית R & D, במיוחד רוברט אברהם, פוג'ה סאפרה, קארן וויבין וג טג'דה על תמיכתם בתוכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 157 3D coculture סרטן ריאות סרטן הקשורות פיברותקיעות מורפולטורה הגידול אורגנואידים
מערכת מרב התרבות Coculture מודל ריאות קשקש התקדמות קרצינומה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Giannakou, A., Golas, J.,More

Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter