Summary
Et in vitro-modellsystem ble utviklet for å fange vevarkitektoniske endringer under lungeplatekarsinom (LUSC) progresjon i en 3-dimensjonal (3D) co-kultur med kreft-assosierte fibroblaster (CAFs). Dette organoidsystemet gir en unik plattform for å undersøke rollene til ulike tumorcelle-iboende og ekstriniske endringer som modulerer tumorfenotypen.
Abstract
Tumor-stroma interaksjoner spiller en avgjørende rolle i utviklingen av lunge plateepitelkarsinom (LUSC). Men å forstå hvordan disse dynamiske interaksjonene bidrar til vevarkitektoniske endringer observert under tumorigenesis er fortsatt utfordrende på grunn av mangel på passende modeller. I denne protokollen beskriver vi genereringen av en 3D-kokulturmodell ved hjelp av en LUSC primærcellekultur kjent som TUM622. TUM622 celler ble etablert fra en LUSC pasientavledet xenograft (PDX) og har den unike egenskapen til å danne acinar-lignende strukturer når de seedes i en kjellermembranmatrise. Vi viser at TUM622 acini i 3D-kokultur rekapitulerer viktige trekk ved vevsarkitektur under LUSC-progresjon, samt de dynamiske interaksjonene mellom LUSC-celler og komponenter i tumormikromiljøet (TME), inkludert de ekstracellulære matrise (ECM) og kreftassosierte fibroblaster (CAFs). Vi tilpasser vår viktigste 3D-ponturprotokoll ytterligere for å demonstrere hvordan dette systemet kan brukes til ulike nedstrømsanalyser. Samlet sett skaper denne organoidmodellen en biologisk rik og tilpasningsdyktig plattform som gjør det mulig å få innsikt i celle-iboende og extrinsic mekanismer som fremmer forstyrrelsen av epitelarkitekturer under karsinomprogresjon og vil hjelpe søket etter nye terapeutiske mål og diagnostiske markører.
Introduction
Lungekreft er den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet over hele verden. Lungeplatecellekarsinom (LUSC), som er den nest vanligste typen ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og står for ca. 30 % av all lungekreft, diagnostiseres ofte ved avanserte stadier og har en dårlig prognose1. Behandlingsalternativer for LUSC-pasienter er et stort udekket behov som kan forbedres ved en bedre forståelse av de underliggende cellulære og molekylære mekanismene som driver LUSC tumorigenesis.
Som med de fleste menneskelige kreftformer, er patogenesen av LUSC preget av forstyrrelsen av den intakte, velbestilte epitelvevsarkitekturen2. Under denne prosessen går riktig apikal-basalcellepolaritet, cellecelle- og cellematrisekontakter tapt, noe som tillater ukontrollert vekst og invasiv oppførsel av tumorcellene. Det er nå allment verdsatt at de ondartede egenskapene til kreftceller ikke kan manifesteres uten et viktig samspill mellom kreftceller og deres lokale tumormikromiljø (TME)3. Viktige komponenter i TME inkludert ekstracellulær matrise (ECM), kreft-assosierte fibroblaster (CAFs) samt endotelceller og infiltrere immunceller aktivt forme TME og driver tumorigenesis4. Likevel er vår nåværende forståelse av hvordan tumorcellene og disse nøkkelkomponentene i TME samhandler for å drive vevarkitektoniske endringer under LUSC-progresjon svært begrenset.
Tredimensjonal (3D) kultur er et viktig verktøy for å studere de biologiske aktivitetene til celle-iboende og extrinsic endringer i regulering av vev arkitektoniske endringer i både normalt og sykt vev5. 3D-kulturer gir riktig strukturell og funksjonell kontekst som vanligvis mangler i tradisjonelle todimensjonale (2D) kulturer. De ekstra dimensjonene av slike systemer etterlignevev i vivo i mange aspekter av cellefysiologi og cellulær atferd, inkludert spredning, differensiering, migrasjon, proteinuttrykk og respons på narkotikabehandling. De siste årene har innsats fra ulike laboratorier ført til utvikling av in vitro 3D-modeller for både normal lunge samt NSCLC6,,7,8. Imidlertid var en modell for lungeplatekarsinom som kan rekapitulere både de dynamiske vevarkitektoniske endringene under tumorigenese samt innlemme viktige stromalkomponenter utilgjengelig.
Her beskriver vi metodene for å etablere et nytt 3-dimensjonalt (3D) kokultursystem ved hjelp av primære PDX-avledede LUSC-celler (kalt TUM622) og CAFs9,10. Både TUM622 og CAFs er avledet fra NSCLC pasient med dårlig differensierte svulster10. Når den er innebygd som enkeltceller i ECM, har en sjelden underpopulasjon av TUM622-celler kapasitet til å danne organoider med acinar-lignende strukturer som viser riktig apikal-basal cellepolaritet. Disse acinar-lignende strukturer er hyperplastisk, viser heterogene uttrykk for stammelignende og differensieringmarkører som ligner på den opprinnelige svulsten mens de forblir ikke-invasive, og dermed etterligner den tidligste fasen av LUSC-utvikling. Viktigere, viste vi at vevsarkitekturen til acinar-lignende strukturer kunne endres ved hemming av celle-iboende signalveier med små molekylhemmere eller tillegg av viktige komponenter i ECM som CAFs, hvorav sistnevnte forbedrer acini-formasjonen og ytterligere provoserer acinien til å bli invasiv når de er i nærheten. Sammen tyder disse dataene på at dette 3D-kokultursystemet av LUSC-organoider gir en verdifull plattform for utredning av den dynamiske gjensidigheten mellom LUSC-celler og TME og kan tilpasses for å overvåke responsen fra LUSC-celler til narkotikabehandling11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Passering og dyrking av TUM622-celler og CAF-er i 2D-kulturer
- Passering og dyrking av TUM622-celler
- Varme 3D-kulturmedium- og celledissosiasjonsreagenser (se materialtabell) for TUM622-celler ved 37 °C.
- Passasje TUM622 celler på 80% samløpet i 2D kolber. Vanligvis skjer dette 1 uke etter passering.
- Kast gammelt medium fra en T75 kolbe og vask én gang med 6 ml HEPES-buffer. Unngå pipettering direkte på cellene.
- Aspirere HEPES buffer. Tilsett 4 ml trypsin/EDTA (0,25 mg/ml, se Materialtabellen) for rask skylling og kast trypsin/EDTA.
- Tilsett 2 ml trypsin/EDTA og inkuber ved 37 °C i 5 min. Fjern flasker fra inkubatoren og trykk på kolbene for å løsne cellene uten å lage luftbobler og returner flasker til inkubatoren i ytterligere 5 min.
MERK: Langvarig eksponering for trypsin vil irreversibelt skade cellene og endre fenotypen, og dermed anbefales det å begrense tidscellene utsettes for trypsin. - Bekreft at celler har løsnet og dissosiert under et lysmikroskop (4x eller 10x). Legg til 4 ml nøytraliseringsbuffer (TNS-buffer) (se underkulturreagensinformasjon i materialtabellen) etterfulgt av 10 ml 3D-kulturmedium (se Materialtegnstabell).
- Pipette opp og ned forsiktig for å ytterligere dissosiere cellene ved hjelp av en 10 ml pipette. Overfør suspensjonen gjennom en 40 μm cellesil til et 50 ml konisk rør.
- Telle cellenumre ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller.
- Frø 0,8 x 106 celler/T75 kolbe i 20 ml 3D-kulturmedium (se Materialtabellen).
- Mate cellene annenhver dag ved å erstatte halvparten av det brukte mediet med friskt medium.
- Passaging og culturing CAFs
- Passasje CAFs når cellene når samløpet. Vanligvis skjer dette etter 5 dager med kuling fra en 1:2 splitt.
- Forbered CAF medium ved hjelp av RPMI basal medium med 20% varmeinaktivert føtal storfe serum, 1% L-Glutamin og 1% Penicillin / Streptomycin. Varm mediet til 37 °C.
- I en T75 kolbe, skyll CAFs med fosfatbufret saltvann (PBS) en gang tilsett 2 ml trypsin/ EDTA og inkuber ved 37 °C i 5 min.
- Vær oppmerksom under et lysmikroskop for å sikre at cellene har dissosiert i kolben (4x eller 10x). Hvis ikke, utvide inkubasjonen for en annen 2-3 min.
- Når cellene har løsnet og dissosiert, legg til 10 ml 3D-kulturmedium for å nøytralisere trypsin / EDTA og pipette opp og ned flere ganger for å ytterligere dissosiere CAFs.
- Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml konisk rør og snurre ned på 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspend pelleten i et passende volum av 3D-kulturmedium (se Materialtabellen) og passasje inn i to nye T75 kolber.
2. Plating TUM622 celler i ekstracellulær matrise for 3D-kuling
- Dagen før eksperimentet, tine hetteglass med kjellermembran matrise i en 4 °C kjøleskap over natten. Nedkjøling av plastpipetter (2 ml) og tips ved -20 °C over natten.
MERK: Ikke alle mange kjellermembranmatriser har samme kapasitet til å støtte 3D-veksten av TUM622-celler. Derfor er det nødvendig å skaffe og teste flere masse kjellermembranmatrise for å identifisere de som støtter robust acini-dannelse. Vanligvis krever dette en høyere proteinkonsentrasjon (16-18 mg/ml) i matrisen. - På dagen for eksperimentet, varm 3D kultur medium, HEPES buffer, trypsin / EDTA og trypsin nøytralisering buffer (TNS) i en 37 °C vannbad. Umiddelbart før du setter opp kulturen, ta den tinte kjellermembranmatrisen ut av kjøleskapet og legg hetteglasset på is.
- Avkjøl vevskulturplatene på en metallplattformkjøler plassert på is. Plasser sentrifugerør på et metallkjølestativ på is.
- Ved hjelp av TUM622 celler hentet fra trinn 1.1.7, beregne ønsket antall celler som trengs for plating. Vanligvis er 15.000-30.0000 celler nødvendig per brønn av en 24-brønn plate. Lavere tetthet er mer egnet for bildebehandling og kvantifisering, mens høyere tetthet foretrekkes ved innsamling av celler for RNA-ekstraksjon eller vestlig blotting.
- Overfør cellesuspensjon til et avkjølt sentrifugerør (hvert rør som inneholder celler for triplicateplating) og snurr ned på 300 x g i en hengende bøtte sentrifuge ved 4 °C i 5 min.
- Aspirer supernatanten nøye med en aspiratrør festet til en ufiltrert spiss (20 μL), og etterlater ca. 100 μL av mediet i røret (bruk markeringer på røret som en guide).
- Trykk forsiktig på siden av røret for å løsne og dissosiere pelleten før du returnerer den til kjølestativet.
- Ved hjelp av de 2 ml forhåndskjølte pipetter, bland forsiktig matrisen ved å pipe opp og ned et par ganger mens hetteglasset er i kontakt med isen. Pipette med jevn og moderat hastighet slik at ingen bobler blir introdusert i matrisen under denne prosedyren.
- Overfør riktig volum av matrisen til hvert sentrifugerør. For plating triplicates i en 24-brønnplate, tilsett 1,1 ml kjellermembran matrise til hvert rør.
- Ved hjelp av forhåndskjølte tips, pipette matrisen i hvert rør opp og ned ca 10 ganger for å lage en jevn celle suspensjon.
- Overfør 310 μL celle/matrisesuspensjon til hver brønn av en forhåndskjølt 24-brønnplate. Pipetten er plassert i en 90° vinkel til plateoverflaten og suspensjonen lagt til midten av brønnen. Fjæringen skal spre seg og dekke hele brønnen uten å måtte vippe platen.
- For å lette nedstrøms immunfluorescensanalyse, plate cellen / matrise suspensjon parallelt i 2-brønn kammer lysbilder. Overfør 100 μL celle/matrisesuspensjon til midten av en brønn med 2-brønnkammerlysbilde (se materialtabellen). Dette gjør at matrisen kan danne en kuppellignende struktur med mye mindre volum.
- Returner platen og kammeret glir tilbake til en vevkulturinkubator og inkuber i 30 minutter for å la matrisen stivne. Undersøk platen/lysbildet under et lysmikroskop for å sikre at enkeltceller fordeles jevnt i matrisen (4x eller 10x).
- Legg til 1 ml pre-varmet 3D kultur komplett medium i hver brønn og 1,5 ml 3D kultur medium til hver brønn av kammeret lysbildet deretter returnere dem til inkubatoren.
3D-coculturing av TUM622-celler og CAF-er i den ekstracellulære matrisen
- Forbered cellesuspensjoner av TUM622 og CAFs i henhold til avsnitt 2.
- Tell CAF-celletettheten ved å ta 10 μL cellesuspensjon og bland den med 10 μL trypan blå.
- Tilsett 10 μL av blandingen til hvert av de to kamrene på et hemacytometer for å telle og beregne celletetthet.
MERK: CAF-er har uregelmessige figurer og telles kanskje ikke nøyaktig på en automatisk celleteller. - Co-embedding TUM622 celler og CAFs i kjelleren membran matrise
- Basert på celletetthetsinformasjonen beregner du ønsket antall celler som brukes til plating. CAFs seedes med et 2:1-forhold på TUM622-celler. For eksempel, for 30.000 TUM622 celler seeded, 60.000 CAFs er co-innebygd.
- Overfør riktig volum av TUM622 samt CAFs cellesuspensjon i samme sentrifugerør og følg trinn 2,5-2,11 for plating i 24-brønnplater. For immunfluorescens blandes 60 μL tum622/CAFs til kammersklier som beskrevet i trinn 2.12).
- Coculturing TUM622 med overlaid CAFs i kjelleren membran matrise (se Tabell over materialer)
- Sett opp TUM622 monokultur i henhold til trinn 2.5-2.13.
- Overfør dobbelt så mange CAFs suspensjon (sammenlignet med antall TUM622 celler seeded) til en sentrifuge rør og spinne ned på 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspend cafs i 1 ml 3D kultur medium.
- Overfør 1 ml CAFs suspensjon til brønnen som inneholder de innebygde TUM622 cellene.
4. Høsting AV TUM622 Acini for RNA/Proteinekstraksjon og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
- Forbered vaskebuffer og cellehøstingsbuffer i henhold til 3D-cellehøstingssettprotokollen dagen før og chill over natten ved 4 °C.
- Oppbevar platene på en tallerkenkjøler og andre reagenser på is før du starter utvinningsprosessen.
- Aspirer medier fra 3D-kulturbrønner uten å berøre matrisen og vask brønnen forsiktig 3 ganger med 1 ml vaskebuffer.
- Aspirer den endelige vasken og tilsett 1 ml cellehøstingsbuffer til hver brønn.
- Bruk en p1000 pipettespiss til å skrape matrisen av hver brønn.
- Pipette opp og ned for å dissosiere matrisen ytterligere.
- Overfør 1 ml av blandingen til et forkjølt 15 ml konisk rør. Tilsett en annen 1 ml høsting buffer til samme brønn.
- Gjenta trinn 4,5-4,7, og overfør all blanding av samme brønn til ett 15 ml konisk rør.
- Cap rørene og stein ved 4 °C i 30 min.
- Fyll hvert rør med iskald PBS opp til 10 ml og deretter sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten uten å berøre pelleten. Supernatanten bør inneholde matrisefragmenter, men spheroidene skal alle samles på bunnen av røret.
- Tilsett iskald PBS for en ekstra vask. Inverter røret et par ganger for å dissosiere pelleten. Snurr ned på 300 x g i 5 min.
- Under spinning, forberede lysis buffer for protein og RNA samling.
- Aspirere forsiktig supernatantog legge lysis buffer for nedstrøms behandling for å samle protein eller RNA. Alternativt kan celler bli suspendert på nytt for flytanalyse/FACS-sortering eller seriell passingaging.
5. Immunfluorescens av TUM622 Acini
- Forbered immunfluorescensbuffer (IF buffer: PBS med 0,1% storfe serum albumin (BSA), 0,2% Triton X-100 og 0,05% Tween-20), primær blokkeringbuffer (IF buffer med 10% geitserum), sekundær blokkeringbuffer (primær blokkeringsbuffer med 20 μg/ml geit anti-mus F(ab')2)
- Aspirer medium fra 2-brønnkammersklier, skyll en gang med PBS og sett lysbildet på metallplatekjøleren på is. Kammersklien skal forbli på metallplatekjøleren for resten av protokollen.
- Tilsett prekjølt 4% PFA for å fikse acini og inkuber på is i 20 min.
- Fjern 4% PFA og vask tre ganger med 2 ml forhåndskjølt PBS hver i 5 min med mild gynge på en rocker.
- Aspirer PBS og permeabilize med 1,5 ml 0,5% Triton X-100 i PBS (pre-kjølt) i 20 min. Ved slutten av denne prosedyren vil den kuppellignende strukturen løsne.
- Slå forsiktig aspireringsbufferen fra kammersklien for å unngå prøvetap. Dette oppnås ved å legge til en fin spiss (20 μL) til aspiratpipetten og trykke spissen mot hjørnet av kammeret.
- Vask tre ganger med 2 ml forhåndskjølt PBS hver i 5 min med mild gynge på en rocker.
- Blokker prøven med den primære blokkeringsbufferen på is i 1 t.
- Fjern primær blokkeringsbuffer og legg til sekundær blokkeringsbuffer og blokker i 30 minutter.
- Tilsett primære antistoffer i primær blokkeringsbuffer og inkuber over natten ved 4 °C.
MERK: Konsentrasjonen av antistoffene som brukes her bør være høyere enn normalt brukt til flekker celler i 2D-kultur. De fleste av de primære antistoffene som brukes i denne studien fortynnes ved 1:100 fortynning (se Materialtabellen). - Fjern primære antistoffer og vask prøven 3 ganger med 2 ml kald IF-buffer.
MERK: Prøvene kan være løse, vær ekstra forsiktig når du er aspirerende. - Inkuber prøvene i sekundære antistoffer fortynnet i primær blokkeringsbuffer i 1 h ved RT. De foretrukne sekundære antistoffene bør være svært kryssadsorbed for å redusere bakgrunnsfarging. De fleste sekundære antistoffer som brukes i denne studien fortynnes ved 1:200 fortynning.
- Fjern sekundære antistoffer og vask prøven 3 ganger med 2 ml kald IF-buffer.
MERK: Prøvene kan være løse, vær ekstra forsiktig når du er aspirerende. - Tilsett PBS med DAPI (1:1,000 fortynning) under den siste vasken for å flekke kjernen. Utføre ytterligere 2 vasker i PBS.
- Bilde prøvene på et konfokalmikroskop innen 3 dager.
MERK: På grunn av størrelsen på organoidene og grensene i målets arbeidsavstand, er prøver vanligvis avbildet ved 10x eller 20x forstørrelse.
6. Utarbeide 3D kultur prøver for immunohistochemistry
- Aspirer medium fra 2-brønnkammersklier og skyll en gang med PBS.
- Fiks 3D-kulturer i 4 % PFA ved 37 °C over natten.
- Fjern 4 % PFA, surroundkulturer med 2,5 ml histologiprøvegel (se materialbord) og plasser lysbildet ved 4 °C for å stivne i minst 1 time.
- Overfør prøver omgitt av histologisk prøvegel til vevskassetter og behandlet i en automatisert vevsprøveprosessor over natten.
- Bygg inn prøver i parafinvoks og klargjør for snitting12.
7. 3D Cytotoxicity Analyse for sammensatt screening (Eksempel for en 96-brønn Plate)
- Sett en 96-brønnplate på en platekjøler, et 25 ml reservoar på en reservoarkjøler og 15 ml koniske rør på is før du starter eksperimentet.
- Forbered cellematrisesuspensjoner av TUM622-celler i et forkjølt 15 ml polypropylenkonisk rør ved å legge til riktig volum av kjellermembranmatrise til celler. Ønsket tetthet for TUM622 celler er 10.000 celler per 70-75 μL kjellermembranmatrise. Pipette opp og ned et par ganger for å tillate jevn blanding av celler i matrisen.
- Flytt platen med platekjøler og reservoar med en reservoarkjøler vekk fra isen til en tørr overflate for å unngå kontakt med kjellermembranmatrise med is under overføring.
- Overfør matrisecelleblandingen til kjølereservoaret uten å lage bobler.
- Ved hjelp av en mekanisk flerkanals pipette (10-300 μL), overføre 70-75 μL av blandecellene til hver passende brønn av en 96-brønnplate.
- Inkuber plate ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 min for at kjellermembranmatrisen skal stivne.
- Tilsett 100 μL med i alle rader og sett platen tilbake til inkubatoren.
- Start sammensatt dosering neste dag eller senere, avhengig av målet for eksperimentet.
- Spheroids kan re-matet og re-doseres hver 2-3 dager i opptil 10 dager, ved å fjerne brukte medier med en 8- eller 12-brønn vakuum manifold og erstatte med friske medier med eller uten ønskede forbindelser.
- Antall TUM622-sheroider kan kvantifiseres ved hjelp av 3D-imager i henhold til produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TUM622 og CAFs i 2D-kultur
Figur 1 presenterer den typiske morfologien til TUM622-celler og CAF-er i 2D-kultur. TUM622 celler er avrundet med store kjerner mens CAFs er flate og langstrakt. TUM622 celler kan nå 80%-90% samløpet i kultur. Ytterligere spredning fører til mer, men mindre celler aggregert i kolonier som ikke kommer i direkte kontakt. I motsetning foretrekker CAFs å vokse ved høyere celletetthet og vil fortsette å spre seg ved full samløpet hvis tilstrekkelige næringsstoffer er gitt.
Vekst og morfologi av TUM622 acini i 3D ECM
Figur 2 presenterer et time-course eksperiment av TUM622 celler sådd i 3D-kultur. Data viser at enkelt TUM622 celler er i stand til å danne organoider med acinar-lignende morfologier når innebygd. Mellom dag 5 og 7 blir en lumen tydelig i de acinarlignende strukturene og forblir hule deretter (figur 2A). Hver acinus, bestående av et monolayer av celler rundt den hule lumen, viser riktig apical-basal polaritet som ligner på lungeepitel in vivo (Figur 2B). Disse acinar-lignende strukturene er hyperplastiske og fortsetter å vokse så lenge tilstrekkelige næringsstoffer er gitt. Kulturen kan opprettholdes i opptil 24 dager før ECM går helt i oppløsning (figur 2C). Gjennom begrensning av fortynningsanalyse (LDA) (data ikke vist), er det anslått at bare en sjelden underpopulasjon av TUM622-celler (<0,02 %) har kapasitet til å danne acinar-lignende strukturer9.
Vekst og morfologi av TUM622-CAFs coculture
Figur 3 viser oppsett og representative resultater av TUM622-CAF cocultures. CAFs kan integreres i kokulturen ved enten å overlegge på toppen av matrisen eller co-innebygd med TUM622-cellene. Uavhengig av oppsettet, tilstedeværelsen av CAFs sterkt forbedret antall og størrelse på spheroids dannet (Figur 3B). Interessant, når TUM622 acini kommer i nærheten med CAFs, induserer de acinien til å bli invasive og migrere mot CAFs, danner "tear-drop" som strukturer (Figur 3C). Vær oppmerksom på at TUM622 acini i monokultur ikke viser invasiv atferd og bare danner "tear-drop" som strukturer når nær CAFs.
Representative immunfluorescerende og immunhistokjemi flekker resultater
Figur 4 viser representative resultater fra immunfluorescens og immunhistokjemifarging av TUM622 acini etter 10 dager med kuling. Konfokale bilder ble tatt ved ekvatorialplanet av immunofluorescerende farget TUM622 acini (Figur 4A). I motsetning kan hver del fra immunohistochemistry-prøven fange acini på forskjellige plan (Figur 4B). Begge resultatene viste heterogenuttrykk for stilklignende og differensierte celler i hver acinus.
TUM622 3D cytotoksisitetsanalyse ved bruk av en Wnt-banehemmer
Figur 5 viser doseresponsen til TUM622 acini behandlet med XAV939, en tankyrasehemmer (figur 5A,B). XAV939 ble lagt til kulturen 1 dag etter plating og oppdatert hver 2 dager i totalt 10 dager. På slutten av eksperimentet ble antall acini kvantifisert av en imager. Brightfield bilder ved høyere forstørrelse ble også kjøpt for å fange morfologien av spheroider i kontroll versus XAV939-behandlede brønner (Figur 5C). Totalt viser XAV939 doseavhengig hemming på acini-dannelse og endrer vevsarkitekturen til spheroidene som dannes. Disse resultatene tyder på at aktivering av den kanoniske Wnt banen er nødvendig under TUM622 acinar morfoogenese.
Figur 1: TUM622 og CAFs i 2D-kultur. Representative lyse feltbilder av TUM622-celler og CAFer dyrket i 2D. Skalabar = 100 μm. Dette tallet er endret fra Chen et al.9 og brukt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vekst og morfologi av TUM622 acini i 3D ECM. (A) Tidsforløpsbilder av TUM622 celler dyrket i kjellermembranmatrise over en 10-dagers periode. Skala bar = 100 μm. (B) Immunofluorescence av TUM622 acini farget med apical-basal celle polaritet markører, Golgi-enzymet (GM-130, grønn, apical) og Integrin alfa 6 (CD49f, basal, rød). (C) Kvantifisering av acini-nummer (høyre y-akse, rød) og den gjennomsnittlige størrelsen på acini (venstre y-akse, blå) belagt i triplicate i en 24-brønnplate over 24 dager i kulturen. Feilfelt representerer SD. Dette tallet er endret fra Chen et al.9 og brukt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vekst og morfologi av TUM622-CAFs coculture. (A) Skjematisk tegning av oppsettet av TUM622-CAFs coculture. CAFs er overlaid eller co-innebygd med TUM62 celler i ECM. Etter 6-12 dager i coculture, TUM622 celler er i stand til å danne mer og større acini sammenlignet med mono-kultur og invadere ECM når i umiddelbar nærhet og direkte kontakt med CAFs. Vær oppmerksom på at den invasive fenotypen bare kunne observeres i kokulturen. (B) Brightfield bilde av TUM622 3D kulturer i nærvær eller fravær av overlaid CAFs etter 8 dager. Skala barer = 200 μm. (C) Brightfield bilder som viser tear-drop formet acini forming i cocultures uavhengig av CAFs er overlaid eller co-innebygd i ECM. Skala stenger = 200 μm. Dette tallet er endret fra Chen et al.9 og brukt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative immunfluorescerende og immunhistokjemi flekker resultater. (A) Antistofffarging av acini med markører av stamceller (CXCR4 og SOX2), mesenchyme (Vimentin), epiteldifferensiering (Involucrin), apoptose (Cleaved-Caspase-3) og spredning (Ki67) i grønt, DAPI i blått, E-kadherin og Phalloidin i rødt. Skala stang = 50 μm. (B) Immunhistokjemi på FFPE deler av TUM622 acini. Skalabar = 100 μm (topp) og 50 μm (nederst). Dette tallet er endret fra Chen et al.9 og brukt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TUM622 3D cytotoksisitetsanalyse ved bruk av en Wnt-banehemmer. (A) Kvantifisering av spheroidtall i en 96-brønnplate hvor TUM622-celler ble behandlet med dimetylsulfoksid (kontroll) eller XAV939. Hver tilstand er analyse tissert i triplicates. Feilstenger representerer SD. (B) Hele brønnbilder fra en 24-brønnplate tatt med en imager som viser de hemmende effektene av XAV939 på acini-formasjonen. (C) Representative brightfield bilder fra kontrollen vs. behandlede brønner som viser morfologiske endringer forårsaket av XAV939 behandling. Skala stenger = 100 μm. Dette tallet er endret fra Chen et al.9 og brukt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Svulster er heterogene vev som består av kreftceller som er sameksisterende side om side med stromale celler som kreftassosierte fibroblaster, endotelceller og immunceller i ECM. Sammen krysser disse ulike komponentene og påvirker tumormikromiljøet, og spiller en aktiv rolle i å drive tumorigenesis, en prosess som innebærer progressive endringer i tumorarkitektur. Ideelt sett bør en in vitro-modell av tumorutvikling kunne fange de dynamiske vevsarkitektoniske endringene observert i menneskelige svulster in vivo, det komplekse samspillet mellom ulike celletyper i tumormikromiljøet og samtidig tillate eksperimentell manipulering på både tumorceller og komponenter i TME. Selv om det har blitt gjort mye fremgang i 3D-kreftmodeller de siste årene, har slike modeller ikke vært lett kommende for LUSC. De fleste modeller rapportert til dags dato bare innlemme noen få aspekter av disse viktige funksjonene. Her rapporterer vi metodene for et 3D-kokultursystem av LUSC som samtidig fanger viktige vevarkitektoniske endringer observert under LUSC-utvikling, samt dynamiske interaksjoner mellom tumorceller og hovedkomponenter i TME, inkludert ECM og CAFs.
Evnen til dette systemet til å mer nøyaktig modellere vev arkitektoniske endringer er basert på den unike egenskapen til TUM622 celler i forming organoider med acinar-lignende morfologier når innebygd i 3D EC. Hver acinus er dannet av en selvfornyende enkeltcelle, og består av et monolayer av celler som omgir en hul lumen. Denne monolayer av celler viser apical-basal celle polaritet og forblir ikke-invasiv, ligner vev arkitektur av lunge epitel. Mens TUM622 som en 3D monokultur viser hyperplastisk vekst, forbedrer tillegg av CAFs ytterligere acinar morfogenese og induserer mer og større acini til å danne. Viktigere, CAFs påberope dynamiskvev arkitektoniske endringer i TUM622 celler når de to celletypene kommer i nærheten, slik at TUM622 cellene å miste sin apical-basal polaritet og invadere matrisen mot CAFs. Disse fenotypiske endringene rekapitulerer både tidlig hyperplasi samt sene invasive stadier av LUSC.
I motsetning til mange tumor spheroid modeller hvor hver spheroid er dannet ved aggregering av mange celler, hver TUM622 acinus er avledet fra en enkelt celle9. Ved in vitro LDA er det anslått at bare en mindre underpopulasjon (≤0,02 %) av TUM622 celler har slik kapasitet9. Selv om sjeldne, disse cellene kan selv fornye som det fremgår av deres evne til å gjennomgå seriell passering i 3D samt skille seg inn i en heterogen populasjon av celler som ligner på den opprinnelige svulsten. På grunn av denne unike funksjonen i TUM622-celler, er det avgjørende å sikre jevn distribusjon av enkelt TUM622-celler i ECM på tidspunktet for plating for vellykket kuling og nedstrøms analyse. For å oppnå dette målet må flere viktige punkter følges nøye i protokollen, inkludert fastsettelse av passende seeding tetthet, holde alle verktøy og reagenser kjølig under blanding av celler og matrise for å forhindre for tidlig størkning, unngå innføring av bobler under blandeprosessen og tillate tilstrekkelig tid for matrise å fullt størkne før du legger til kulturmedium. Sammen vil disse forholdsreglene bidra til å oppnå en mer ensartet matrisesubstrat og kulturtilstand for alle innebygde celler.
Når vellykket etablert, denne kulturen kan brukes til en rekke nedstrøms analyser for å dissekere cellen og biokjemisk prosess som regulerer tumorigenesis. Antallet og størrelsen på acini dannet i hver brønn kan overvåkes over tid med lyse feltimagers og brukes som en avlesning for proliferativ og selvfornyelseskapasitet av TUM622-celler. Mer detaljert dynamikk i morfogenese av hver acinus kan observeres med live-imaging på et konfokalmikroskop, med eller uten ulike merking fargestoffer. Det betingede mediet kan samles på flere tidspunkter i kulturperioden for å analysere løselige faktorer som kan megle cellecelle- eller cellematrisekrysssamtaler. TUM622-celler hentet direkte fra ECM ved hjelp av protokoll 4 er egnet for RNA og proteinekstraksjon for genuttrykksanalyse, flow cytometrikvantifisering eller FACS-sortering basert på celleoverflatemarkører. Alternativt kan kulturene løses for in situ immunofluorescence eller immunohistochemistry studier for å forstå romlige temporale fordelinger av ulike markører. Selv om lignende, immunohistochemistry utfyller immunofluorescens metoder ved at det tillater prøvetaking av hele acini som kanskje ikke er mulig på grunn av begrensende bildebehandling-dybde av konfokale mål. For begge disse metodene er tid og temperatur der fiksering og permeabilisering utføres, kritiske, spesielt gitt at TUM622-celler er innebygd i en tett matrise (> 90% kjellermembranmatrise) i motsetning til mange andre 3D-kulturer der matrisetettheten er mye lavere. Derfor er det nødvendig med oppmerksomhet til standardisert og konsekvent fiksering og behandling for å oppnå replikert resultater.
Ved hjelp av dette systemet som en plattform, kan man deretter undersøke hvordan celle-iboende endringer i tumorcellene, samt celle-extrinsic endringer i tumor mikromiljøet, påvirke epitelarkitektur og modellere tidlige hendelser involvert i karsinomdannelse. For eksempel kan rollene til onkogener eller tumorsuppressorgener i regulering av tumorvevarkitektur studeres ved å oppnå- eller tap av funksjon eksperiment rettet mot genet av interesse i tumorcellene. Faktisk viste vi at over-uttrykk av SOX2, som vanligvis observeres i LUSC, endrer fenotypen av TUM622-celler som det fremgår av tap av hyperplasi i 3D og progresjon mot dysplastisk vekst9. På den annen side kan man sammenligne normale versus kreftassosierte fibroblaster i kokulturinnstillinger, bestemme hvordan matrisekomponenter eller stivhetseffekt acini vekst / morfologi / invasjon, og hvis blokkering av visse cytokiner kan forstyrre cellecellekommunikasjon og i sin tur påvirke vevsarkitektur og tumorprogresjon. Viktigere, alle disse analysene kan utføres i nærvær eller fravær av visse terapeutiske midler og brukes som et verktøy for å bestemme stoffet respons av LUSC celler med en flerdimensjonal avlesning11. Det er også viktig å merke seg at dette systemet er begrenset i forhold til banene det kan brukes til å avhøre, da bare noen, men ikke alle store signalveier regulerer vekst og morfologi av TUM622 organoider i kultur (dvs. hemming av Wnt, men ikke Hakk signalering påvirker acinar mogenesphois av TUM622 celler)9.
Oppsummert viser vi at dette organoidsystemet gir en unik plattform for å generere ny innsikt i det dynamiske samspillet mellom LUSC-celler og tumormikromiljøet under tumorprogresjon. Vi forventer at vårt modellsystem vil være en verdifull plattform for narkotikaoppdagelse og utvikling. I denne forbindelse bør screening av nye anti-kreft-terapeutiske midler i en innfødt tumorvevskontekst hjelpe til med valg og utvikling av mer effektive terapeutiske midler rettet mot LUSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ansatte og aksjonærer i Pfizer Inc.
Acknowledgments
Vi takker Magali Guffroy, John Kreeger og Stephani Bisulco fra Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker group for patologi/histologistøtte og Michael Arensman for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi takker også Pfizer Postdoctoral Program og Oncology R&D-gruppen, spesielt Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin og Jennifer Tejeda for deres støtte til programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
