Summary
Brugen af en RNA-baseret tilgang til at bestemme kvantitative immunprofiler af fast tumorvæv og udnytte kliniske kohorter til immun-onkologi biomarkør opdagelse er beskrevet gennem en molekylær og informatik protokoller.
Abstract
Immunterapier viser lovende i behandlingen af onkologi patienter, men komplekse heterogenitet af tumor mikromiljøet gør forudsige behandling svar udfordrende. Evnen til at løse de relative populationer af immunceller til stede i og omkring tumorvævet har vist sig at være klinisk relevant for forståelse nikke, men er begrænset af traditionelle teknikker såsom flow cytometri og immunhistokemi ( IHC), på grund af den store mængde væv, der kræves, mangel på nøjagtige celle type markører, og mange tekniske og logistiske forhindringer. En analyse (f.eks ImmunoPrism Immune Profilering Assay) overvinder disse udfordringer ved at imødekomme både små mængder RNA og stærkt nedbrudt RNA, fælles træk ved RNA udvundet fra klinisk arkiveret fast tumorvæv. Analysen er tilgængelig via et reagenskit og skybaserede informatik, der giver en end-to-end kvantitativ, høj-throughput immun-profilering løsning til Illumina sekventering platforme. Forskere starter med så få som to sektioner af formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv eller 20-40 ng af den samlede RNA (afhængigt af prøvens kvalitet), og protokollen genererer en immunprofil rapport kvantificere otte immuncelletyper og ti immun flugt gener, indfange et komplet overblik over tumor mikromiljøet. Der kræves ingen yderligere bioinformatik analyse for at gøre brug af de resulterende data. Med de relevante stikprøvekohorter kan protokollen også anvendes til at identificere statistisk signifikante biomarkører inden for en patientpopulation af interesse.
Introduction
Kvantificering af tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs) og andre immun-relaterede molekyler i formalin-fast og paraffin indlejret (FFPE) fast tumor humant væv prøver har vist værdi i klinisk forskning1,2,3. Almindelige teknikker såsom flow cytometri og encellede ribonucleic acid (RNA) sekventering er nyttige for frisk væv og blod4,men er uegnede til analyse af FFPE materialer på grund af manglende evne til at skabe levedygtige cellesuspensioner. Nuværende metoder, der er blevet brugt til at kvantificere disse celler i FFPE væv lider af store udfordringer. Immunhistokemi (IHC) og andre lignende billedbehandlingsarbejdsgange kræver specifikke antistoffer for at påvise celleoverfladeproteiner, hvilket kan være vanskeligt at standardisere på tværs af laboratorier for at muliggøre reproducerbar kvantificering5. Platforme som nCounter-systemet er afhængige af ekspression af enkelte gener for at definere centrale immunceller6,hvilket begrænser følsomheden og specificiteten af detektion. Mere generiske RNA sekventering metoder, kombineret med standalone softwareværktøjer, er tilgængelige, men kræver betydelig optimering og validering før brug7,8,9,10,11,12. Nylige fremskridt i at kombinere laser capture mikrodædi (LCM) med RNA sekventering for FFPE væv har vist lovende; der kræves dog en mere høj gennemløbs-, nøglefærdig løsning til translationelle undersøgelser med henblik på at identificere robuste biomarkører13,14. Metoder til at generere flerdimensionale biomarkører, såsom Predictive Immune Modeling, der definerer patient kohorter, herunder terapi responders, kræft undertyper, eller overlevelse resultater med høj prædiktiv nøjagtighed og statistisk signifikans bliver stadig vigtigere i en alder af præcision medicin og immunterapi15,16.
For at imødekomme dette behov blev der udviklet en immunprofilanalyse for at muliggøre følsom og specifik kvantificering af immunceller i fast tumor FFPE-væv ved hjælp af standardiserede RNA-sekventeringsreagenser og skybaserede informatik. Ud over at imødekomme nedbrudt RNA fra FFPE væv, protokollen er i stand til at rumme RNA stammer fra at begrænse vævsprøver såsom centrale nål biopsier, nål aspirater, og mikro- eller makro-dissekeret væv. RNA-data fra hver prøve sammenlignes med en database over genekspressionsmodeller af immunceller, kaldet immunsundhedsudtryksmodeller, for at kvantificere immunceller som en procentdel af de samlede celler, der findes i prøven. Kort sagt blev disse modeller bygget ved hjælp af maskinlæringsmetoder til at identificere unikke flergene udtryksmønstre fra hele transskriptionsdata genereret fra rensede immuncellepopulationer (isoleret ved hjælp af kanoniske celleoverflademarkører)17,18. De flerdimensionale Health Expression Models underliggende teknologi gør det muligt for analysen at kvantificere hver immuncelle som en procentdel af de samlede celler til stede i den heterogene blanding. Dette gør det muligt for forskeren at generere sammenligninger mellem og intra-prøve immuncelle, som har vist sig at have klinisk værdi19,20. Andre anvendelser omfatter kvantificering af immunrespons før og efter behandling, som beskrevet i de repræsentative resultater. Analysen rapporterer om flere funktioner i immun contexture af tumor og tumor mikromiljø, herunder de absolutte procenter af otte immuncelletyper (afledt af genekspression modeller): CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B celler, CD14+ monocytter, Tregs, M1 makrofager, og M2 makrofager. Hertil kommer, at analysen rapporterudtrykket (i udskrifter per million, eller TPM) af ti immun flugt gener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1, og ARG1.
Reagenssættet bruges til at gøre biblioteker af høj kvalitet klar til sekventering på en Illumina-platform efter en hybrid opsamlingsbaseret biblioteksforberedelsesmetode, som vist i figur 1. Hvis en forsker ikke har en Illumina sekventering platform i deres laboratorium, kan de indsende deres prøver til et centralt laboratorium for sekventering. Når de er genereret, overføres sekventeringsdata til Prism-portalen til automatiseret analyse, og en omfattende, kvantitativ profil for hver enkelt prøve i form af immunrapporten (figur 2A) returneres til brugeren. Brugerne kan også definere prøvegrupper i Prism-portalen for at generere en Biomarkørrapport (figur 2B),der fremhæver statistisk signifikante biomarkører, der skelner mellem to patientkohorter. Det er vigtigt, at de data, der genereres af reagenssættet, kun anvendes til forskningsbrug og må ikke bruges til diagnostiske formål.
Figur 1: Oversigt over arbejdsgange. I denne protokol konverteres RNA først til cDNA. Sekventeringsadaptere er ligated, og adapter-ligated cDNA forstærkes og stregkodes af PCR for at skabe en pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder derefter hybridiseres til specifikke cDNA mål, som derefter fanges ved hjælp af streptavidin perler. Ubundet, ikke-målrettet cDNA fjernes ved vask. En endelig PCR berigelse giver en post-capture bibliotek klar til sekventering. *Det samlede RNA skal være fra humane prøver. kan være intakt eller nedbrudt RNA(FFPE). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative immunrapporter. Arbejdsprocessen genererer to rapporter, en individuel immunrapport (A) for hver behandlet prøve og en biomarkørrapport (B) for definerede patientkohorter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protokollen kræver ca. 16 timers tilberedningstid (fra totalRNA til biblioteker, der er klar til sekventering). Der er dog en række valgfrie stoppesteder, som anført i protokollen. Analysen gør brug af den rige, dynamiske karakter af transskriptionomics at bevæge sig ud over arv enkelt-analysand biomarkører til flerdimensionale genekspression modeller, hvilket muliggør omfattende biologisk karakterisering af vævsprøver med standardiserede reagenser og brugervenlige softwareværktøjer. Det giver forskerne mulighed for at udnytte en moderne teknologi i deres eget laboratorium, ved at udnytte machine-learning og en database over Health Expression Models til at udlede mere præcise, kvantitative immunprofiler af dyrebare kliniske prøver, og opdage flerdimensionale RNA biomarkører med fuld statistisk analyse.
Protocol
De humane vævsprøver, der anvendes i de repræsentative resultater, der blev vist her, blev købt fra en velrenommeret enhed (TriStar Technology Group) og har informeret donorsamtykke, der tillader akademisk og kommerciel forskning, samt godkendelse fra en kompetent etisk Udvalget.
Del I: Forberedelse af biblioteket før opfange
1. RNA-kvantificering og kvalificering
- Kvantificer RNA ved hjælp af en fluorometrisk analyse til at bestemme det relevante input til analysen. Vurder kvaliteten af indgangs-RNA'en ved hjælp af elektroforese til bestemmelse af RIN-værdierne (RNA Integrity Number) og procentdelen af fragmenter >200 nukleotider (DV200).
- For intakte (RIN > 7) eller delvist nedbrudte RNA-prøver (RIN = 2 til 7) skal du følge bibliotekets forberedelsestrin for høj kvalitet/intakt RNA, begyndende med trin 2.1. Kvaliteten af RNA er vigtig for at vælge den korrekte fragmenteringstid i Thermal Cycler Program #1 (supplerende tabel 2).
- For højt nedbrudte prøver (f.eks. Disse prøver kræver ikke fragmentering og følger instruktionerne for nedbrudt RNA, begyndende med trin 2.2.
- Den passende mængde samlet RNA til klargør for hver prøve ved fortynding af 20 n RNA (rna af høj kvalitet/intakt med RIN > 2) eller 40 n RNA (Nedbrudt/FFPE RNA med DV200 > 20%) til 5 μL i nuklease-fri vand. Behandling af prøver med DV200 < 20% anbefales ikke. For de kontrolRNA-prøver, der følger med sættet, fortyndes 1 μL af det relevante RNA i 4 μL nukleasefrit vand. Kontrolprøver følger den samme behandling som beskrevet for enten rna-materialer af høj kvalitet (intakt) eller forringet (FFPE) som mærket. Se supplerende tabel 1 for alle reagenser, der er inkluderet i sættet.
2. RNA Fragmentering og priming
- Følg trin 2.1.1 for høj kvalitet/intakt RNA med RIN > 2.
- For RNA af høj kvalitet skal fragmenteringen og primingreaktionen samles på is en nuklease-fri PCR-rør i henhold til tabel 1.
- Bland grundigt ved pipetting op og ned flere gange. Drej derefter kortvarigt prøverne ned i en mikrocentrifuge
BEMÆRK: For alle centrifugespins i protokollen anbefales en hastighed på ≥ 1.000 x g for mindst 3 s. - Prøverne anbringes i en termisk cycler, og brug Program #1 (supplerende tabel 2).
- Straks overføre rørene til is og gå videre til First Strand cDNA Syntese for høj kvalitet RNA (Trin 3.1). For samtidig forberedelse af både høj kvalitet og FFPE RNA, begynde forberedelsen af FFPE RNA (trin 2.2) under fragmentering inkubationen.
- Bland grundigt ved pipetting op og ned flere gange. Drej derefter kortvarigt prøverne ned i en mikrocentrifuge
- For RNA af høj kvalitet skal fragmenteringen og primingreaktionen samles på is en nuklease-fri PCR-rør i henhold til tabel 1.
| Fragmentering og priming mix | Volumen (μL) |
| Intakt eller delvist nedbrudt RNA (20 ng) | 5 |
| Første strand syntese reaktion buffer | 4 |
| Tilfældige primere | 1 |
| Samlet volumen | 10 |
Tabel 1: Fragmentering og priming reaktion for høj kvalitet RNA. Komponenter af fragmenteringen og priming reaktion for høj kvalitet RNA bør samles og blandes på is i henhold til de viste mængder. En master blanding af First Strand Synthesis Reaction Buffer og Random Primes kan laves og føjes til RNA prøver.
- Følg trin 2.2.1 for Nedbrudt/FFPE RNA med DV200 > 20 %.
- For stærkt nedbrudt RNA (FFPE), der ikke kræver fragmentering, samles primingreaktionen som beskrevet i tabel 2. For intakt RNA skal du huske at følge trin 2.1.
- Bland grundigt ved pipetting op og ned flere gange. Drej derefter kortvarigt prøverne ned i en mikrocentrifuge.
- Prøverne anbringes i en termisk cycler, og brug Program #2 (supplerende tabel 2).
- Overfør rørene til is og fortsæt til First Strand cDNA Syntese for stærkt nedbrudt (FFPE) RNA (Trin 3.2).
- For stærkt nedbrudt RNA (FFPE), der ikke kræver fragmentering, samles primingreaktionen som beskrevet i tabel 2. For intakt RNA skal du huske at følge trin 2.1.
| Priming reaktion | Volumen (μL) |
| FFPE RNA (40 ng) | 5 |
| Tilfældige primere | 1 |
| Samlet volumen | 6 |
Tabel 2: Tilfældig primingreaktion for stærkt nedbrudt RNA. Komponenter i primingreaktionen for stærkt nedbrudt RNA skal samles på is i et nuklease-frit PCR-rør.
3. Første streng cDNA syntese
- Følg trin 3.1.1 for høj kvalitet/intakt RNA med RIN > 2.
- For intaktRNA (høj kvalitet) samles den første strandsyntesereaktion på is en nuklease-fri PCR rør i henhold til tabel 3.
- Holde reaktionerne på is, blandes grundigt ved at pibe op og ned flere gange. Spin forsigtigt prøverne ned i en mikrocentrifuge, og fortsæt direkte til Første strengsynteseinkubation (Trin 4).
- For intaktRNA (høj kvalitet) samles den første strandsyntesereaktion på is en nuklease-fri PCR rør i henhold til tabel 3.
| Første Strand syntese | Volumen (μL) |
| Fragmenteret og primet RNA (trin 2.1.3) | 10 |
| Første Strand Syntese Specificitet Reagens | 8 |
| Første Strand Syntese Enzym Mix | 2 |
| Samlet volumen | 20 |
Tabel 3: Første strandsyntesereaktion for RNA af høj kvalitet. Komponenter af fragmenteringen og priming reaktion for høj kvalitet RNA bør samles og blandes på is i henhold til de givne mængder. En master blanding af First Strand Syntese Specificitet Reagens og First Strand Syntese Enzym Mix kan laves og føjes til de fragmenterede og primede RNA prøver.
- Følg trin 3.2.1 for Nedbrudt/FFPE RNA med DV200 > 20 %.
- For stærkt nedbrudt RNA (FFPE) samles den første strandsyntesereaktion på is en nuklease-fri PCR-rør i henhold til tabel 4.
- Holde reaktionerne på is, blandes grundigt ved at pibe op og ned flere gange. Spin forsigtigt prøverne ned i en mikrocentrifuge, og fortsæt direkte til Første strengsynteseinkubation (Trin 4).
- For stærkt nedbrudt RNA (FFPE) samles den første strandsyntesereaktion på is en nuklease-fri PCR-rør i henhold til tabel 4.
| Første Strand syntese | Volumen (μL) |
| Primisat RNA (trin 2.2.3) | 6 |
| Første strand syntese reaktion buffer | 4 |
| Første Strand Specificitet Reagens | 8 |
| Første Strand Syntese Enzym Mix | 2 |
| Samlet volumen | 20 |
Tabel 4: Første strandsyntesereaktion for stærkt nedbrudt RNA. Komponenter af fragmenteringen og priming reaktion for stærkt nedbrudt RNA bør samles og blandes på is i henhold til de viste mængder. En master blanding af First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Syntese Specificitet Reagens, og First Strand Syntese Enzym Mix kan foretages og føjes til primet RNA prøver.
4. Første strandsynteseinkubation
- Holde rørene på is, blandes grundigt ved pipetting op og ned flere gange. Spin forsigtigt prøverne ned i en mikrocentrifuge. Inkuber prøverne i en forvarmet termisk cycler efter program #3 (supplerende tabel 2).
5. Anden Streng cDNA syntese
- Den anden streng-cDNA-syntesereaktion på isen forberedes ved at samle de komponenter, der er anført i tabel 5, herunder det første strandreaktionsprodukt fra trin 4.1.
| Anden strand syntese reaktion | Volumen (μL) |
| Første strandsyntese produkt (trin 4.1) | 20 |
| Anden streng syntese reaktion buffer | 8 |
| Anden Strand Syntese Enzym Mix | 4 |
| Nuclease-fri vand | 48 |
| Samlet volumen | 80 |
Tabel 5: Anden strandsyntesereaktion. Komponenter i den anden streng cDNA syntese reaktion bør samles og blandes på is i henhold til de viste mængder. En master blanding af den anden Strand Syntese Reaktion Buffer, Anden Strand Syntese Enzym Mix, og Nuclease-fri vand kan gøres og føjes til den første Strand Syntese Produkt.
- Holde rørene på is, blandes grundigt ved pipetting op og ned flere gange. Inkuberi i en termisk cycler efter Program #4 (Supplerende tabel 2).
6. cDNA Oprydning Ved hjælp af SPRI (Solid Phase Reversible Immobilisering) Perler
- Lad SPRI Perlerne varme til stuetemperatur i mindst 30 minutter før brug, og derefter vortex SPRI Perler for ca 30 s at resuspendere.
- Der tilsættes 144 μL genophængte perler til den anden strengsyntesereaktion (~80 μL). Bland godt ved pipetting op og ned mindst 10 gange og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Drej kort rørene i en mikrocentrifuge, og placer rørene på et magnetisk rack for at adskille perler fra supernatanten. Når opløsningen er klar, skal supernatanten fjernes og kasseres omhyggeligt. Pas på ikke at forstyrre perlerne, som indeholder DNA.
- Der tilsættes 180 μL frisklavet 80% ethanol til rørene, mens de er på det magnetiske rack. Inkuberved stuetemperatur i 30 s, og fjern og kassér derefter supernatanten omhyggeligt.
- Gentag trin 6.4 én gang for i alt 2 vasketrin.
- Fjern helt restethanolen. Lad rørene være på den magnetiske rist, og luften tørres i ca. 3 minutter, eller indtil de er synligt tørre. Må ikke over tørre perlerne, da dette kan resultere i lavere inddrivelse af DNA.
- Fjern rørene fra magneten og tilsæt 53 μL 0,1 x TE Buffer (inkluderet i reagenskit, se Supplerende tabel 1)til perlerne. Pipette op og ned mindst 10 gange for at blande grundigt. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant. Overfør 50 μL af supernatantet for at rengøre nuklease-fri PCR rør. Pas på ikke at forstyrre perlerne. Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen, cDNA-prøver kan opbevares ved -20 °C.
7. Reparation af cDNA-bibliotek
- Samlet endereparationsreaktionen på isen ved at samle de komponenter, der er anført i tabel 6, til det andet strandsynteseprodukt fra trin 6.8.
| End reparation reaktion | Volumen (μL) |
| Andet strandsynteseprodukt (trin 6.8) | 50 |
| End Reparation reaktion buffer | 7 |
| End Repair Enzym Mix | 3 |
| Samlet volumen | 60 |
Tabel 6: End Repair reaktion. Komponenter i endereparationsreaktionen skal samles og blandes på is i henhold til de viste mængder. En master blanding af End Repair Reaction Buffer og End Repair Enzyme Mix kan laves og føjes til den anden strand syntese produkt.
- Indstil en pipette til 50 μL, og pipetter derefter hele lydstyrken op og ned mindst 10 gange for at blandes grundigt. Centrifugeret kortvarigt for at indsamle al væske fra siderne af rørene. Det er vigtigt at blande godt. Tilstedeværelsen af en lille mængde bobler vil ikke forstyrre ydeevnen.
- Inkuber prøverne i en termisk cycler efter program #5 (supplerende tabel 2).
8. AdapterLigation
- Før ligationsreaktionen tages i brug, fortyndes adapteren i iskold adapterfortyndingsbuffer som vist i tabel 7,multipliceres med det krævede antal prøver plus 10 % ekstra. Hold den fortyndede adapter på is.
| Ligation Fortynding | Volumen (μL) |
| Adapter | 0.5 |
| Adapterfortyndingsbuffer | 2 |
| Samlet volumen | 2.5 |
Tabel 7: Fortynding stil. Adapteren skal fortyndes på is med adapterfortyndingsbuffer i henhold til de viste mængder.
- Ligation reaktion på is ved at tilføje komponentersom beskrevet i tabel 8, i den angivne rækkefølge, til slutningen prep reaktion produkt fra trin 7.3. Bemærk, at Ligation Master Mix og Ligation Enhancer kan blandes i forvejen. Denne blanding er stabil i mindst 8 timer ved 4 °C. Bland ikke Ligation Master Mix, Ligation Enhancer og Adapter før brug i Adapterligation Step.
| Ligation reaktion | Volumen (μL) |
| End Prepped DNA (Trin 7.3) | 60 |
| Fortyndet adapter (trin 8.1) | 2.5 |
| Ligation Forstærker | 1 |
| Ligation Master Mix | 30 |
| Samlet volumen | 93.5 |
Tabel 8: Ligation reaktion. Komponenter af adapteren ligation reaktion bør samles på is i henhold til de mængder, der er vist i den viste rækkefølge. En master blanding af Ligation Enhancer og Ligation Master Mix kan laves og føjes til End Prepped DNA med fortyndet adapter. Bland ikke den fortyndede adapter og Ligation Master Mix eller Ligation Enhancer før blanding med End Prepped DNA.
- Indstil en pipette til 80 μL, og pipetter derefter hele lydstyrken op og ned mindst 10 gange for at blandes grundigt. Udfør et hurtigt spin for at indsamle al væske fra siderne af rørene. Ligation Master Mix er meget tyktflydende. Sørg for at sikre en passende blanding af ligationens reaktion, da ufuldstændig blanding vil resultere i nedsat ligationeffektivitet. Tilstedeværelsen af en lille mængde bobler vil ikke forstyrre ydeevnen.
- Inkuber efter Program #6 (supplerende tabel 2), og fjern derefter ligationblandingen fra den termiske cycler og tilsættes 3 μL adapterforarbejdningsenzym, hvilket resulterer i et samlet volumen på 96,5 μL.
- Pipette op og ned flere gange for at blande godt, og derefter inkubere efter Program #7(Supplerende tabel 2),før du fortsætter straks til rensning af Ligation Reaction.
9. Rensning af Ligation Reaktion Ved hjælp af SPRI Neads
- Lad SPRI Perler varme til stuetemperatur i mindst 30 minutter før brug, og derefter vortex SPRI Perler for ca 30 s at resuspendere.
- Tilsæt 87 μL resuspended SPRI Perler og bland godt ved pipetting op og ned mindst 10 gange. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Drej kort rørene i en mikrocentrifuge, og placer rørene på et magnetisk rack for at adskille perler fra supernatanten. Når opløsningen er klar (~ 5 min), skal supernatanten fjernes og kasseres omhyggeligt. Må ikke kasseres perlerne.
- Der tilsættes 180 μL frisklavet 80% ethanol til rørene, mens de er på det magnetiske rack. Inkuberved stuetemperatur i 30 s, og fjern og kassér derefter supernatanten omhyggeligt. Gentag trin 9.4 én gang for i alt 2 vasketrin.
- Fjern helt restethanolen. Lad rørene være på den magnetiske rist, og luften tørres i ca. 3 minutter, eller indtil de er synligt tørre. Må ikke over tørre perlerne, da dette kan resultere i lavere inddrivelse af DNA.
- Fjern rørene fra magneten og tilsæt 17 μL 0,1 x TE buffer til perlerne. Pipette op og ned mindst 10 gange for at blande grundigt. Inkubere i 2 minutter ved stuetemperatur, og placer derefter rørene på et magnetisk rack, så perlerne helt kan adskilles fra supernatanten.
- Overfør 15 μL af supernatantet for at rengøre nuklease-fri PCR rør. Pas på ikke at forstyrre perlerne. Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen, kan det adaptor-ligaterede DNA opbevares ved -20 °C.
10. PCR Berigelse af adaptor ligeret DNA
- Konfigurer PCR-reaktionen som beskrevet i tabel 9. En Master Mix, der indeholder Pre-Capture PCR Master Mix og Universal Primer kan laves og føjes til adapteren ligated DNA. Ved multiplexed sekvensering skal du bruge unikke indeksprimere til hver reaktion og tilføje til hver prøve individuelt.
| PCR-berigelse | Volumen (μL) |
| Adapter ligated DNA (Trin 10.1) | 15 |
| Pre-Capture PCR Master Mix | 25 |
| Universal PCR Primer | 5 |
| Indeks (X) Primer | 5 |
| Samlet volumen | 50 |
Tabel 9: PCR-berigelse af adapterligated DNA. Komponenter ne i PCR-berigelsen af adapterens ligated DNA-reaktion skal samles og blandes på is i henhold til de viste mængder. En master blanding af Pre-Capture PCR Master Mix og Universal PCR Primer kan laves og føjes til adapteren ligated DNA. Ved multiplexed sekvensering skal hver prøve have en unik indeksprimer.
- Bland godt ved forsigtigt pipetting op og ned 10 gange. Spin kort rørene i en mikrocentrifuge og anbring i en termisk cycler, og udfør PCR forstærkning ved hjælp af Program #8 (Supplerende tabel 2).
11. Rensning af PCR-reaktionen ved hjælp af SPRI-perler
- Lad SPRI Perler varme til stuetemperatur i mindst 30 minutter før brug, og derefter vortex SPRI Perler for ca 30 s at resuspendere.
- Der tilsættes 45 μL genophængte perler til hver PCR-reaktion (~50 μL). Bland godt ved pipetting op og ned mindst 10 gange, før du inkuberer i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Drej kort rørene i en mikrocentrifuge, og placer rørene på et magnetisk rack for at adskille perler fra supernatanten. Når opløsningen er klar (~ 5 min), skal supernatanten fjernes og kasseres omhyggeligt. Pas på ikke at forstyrre de perler, der indeholder DNA.
- Der tilsættes 180 μL frisklavet 80% ethanol til rørene, mens de er i det magnetiske rack. Inkuberved stuetemperatur i 30 s, og fjern og kassér derefter supernatanten omhyggeligt. Gentag trin 11.4 én gang for i alt 2 vasketrin.
- Fjern helt restethanolen. Lad rørene være på den magnetiske rist, og luften tørres i ca. 3 minutter, eller indtil de er synligt tørre. Må ikke over tørre perlerne, da dette kan resultere i lavere inddrivelse af DNA.
- Fjern rørene fra magneten, og tilsæt 23 μL 0,1 x TE Buffer til perlerne. Pipette op og ned mindst 10 gange for at blande grundigt. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant. Overfør 20 μL af supernatantet for at rengøre nuklease-fri PCR rør. Pas på ikke at forstyrre perlerne. Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen, kan Pre-Capture Biblioteker gemmes på -20 °C.
12. Validere og kvantificere pre-capture Bibliotek
- Mål koncentrationen af pre-capture biblioteket ved hjælp af et fluorometer og høj følsomhed analysekit. Der kræves et minimumsudbytte på 200 ng for at gå videre til del II: Hybridisering og indfangning.
- Kør 1 μL bibliotek på et digitalt elektroforesesystem. Om nødvendigt fortyndes prøven for at undgå overbelastning af højfølsomhedschippen i henhold til producentens protokolanbefalinger.
- Kontroller, at elektropherogramet viser en smal fordeling med en spidsbelastning på ca. 250-400 bp (se repræsentative resultater, figur 3 og figur 4).
- Hvis en 128 bp peak (adapter-dimer) er synlig i Bioanalyzer spor, og intensiteten af signalet er ≥ intensiteten af 250-400 bp bibliotek signal (se repræsentative resultater, figur 5), og derefter opdrage prøven volumen (fra trin 11,7) til 50 μL med 0,1x TE Buffer og gentag SPRI Bead rensning (trin 11). Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen, Pre-capture biblioteker kan lagres på -20 °C, før du går videre til del II: ImmunoPrism Hybridisering og Capture.
Del II: Hybridisering og opsamling
13. Kombiner blokering Oligos, Cot-1 DNA, Pre-capture Library DNA, og Tør
- Bland stregkodede bibliotek udarbejdet i trin 11 og kvantificeret i trin 12, med Cot-1 DNA og blokering Oligos i en nuclease-fri PCR rør eller 1,5 ml microtube, som vist i tabel 10.
| Reagens | Antal/volumen |
| Stregkodet bibliotek fra trin 10.10 | 200 ng |
| Cot-1 DNA | 2 μg |
| Blokering af Oligos | 2 μL |
Tabel 10: Hybridisering Forberedelse og tørring. Komponenter, der skal kombineres til udtørring af biblioteker som forberedelse til hybridisering, bør samles i overensstemmelse med de viste mængder.
- Rørets indhold tørres ved hjælp af en vakuumkoncentrator, der er indstillet til 30-45 °C. Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen. Efter tørring kan rør opbevares natten over ved stuetemperatur (15-25 °C) eller længere ved -20 °C.
14. Hybridiser DNA Capture Sonder med biblioteket
- Tø 2x Bead Wash Buffer og Hybridization Buffer, Hybridization Buffer Forstærker, ImmunoPrism Probe Panel, 10x Vask Buffer 1, 10x Vask Buffer 2, 10x Vask Buffer 3, og 10x Streng Vask Buffer ved stuetemperatur. Før brug skal hybridiseringsbufferen undersøges for krystallisering af salte. Hvis der er krystaller til stede, opvarmes røret ved 65 °C og rystes periodisk, indtil bufferen er fuldstændig opløselig.
- Ved stuetemperatur skal du oprette Hybridiseringmastermixet i et rør. Formere mængder ne med antallet af prøver og tilsættes 10 % ekstra efter tabel 11.
| Mastermix til hybridisering | Volumen (μL) |
| Hybridiseringsbuffer | 8.5 |
| Forstærker af hybridiseringsbuffer | 2.7 |
| Immunoprisme Sonde Panel | 5 |
| Nuclease-frit vand | 0.8 |
| Samlet volumen | 17 |
Tabel 11: Hybridisering master mix. Komponenter af Hybridization Master Mix skal samles og blandes ved stuetemperatur i henhold til de viste mængder.
- Vortex eller pipette op og ned for at blande godt. Derefter tilsættes 17 μL af Hybridiseringmastermixet til hvert rør, der indeholder tørret DNA. Forsegle rørene og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vortex prøverne, sikre, at de er helt blandet, og spin ned prøverne kort i en mikrocentrifuge. Hvis det er relevant, overføres hver prøve fra et 1,5 ml mikrorør til et nuclease-frit PCR-rør.
- Prøverne anbringes i en termisk cycler, og kør program #9 (supplerende tabel 2).
- Under inkubationen skal vaskebufferne (trin 15) og streptavidinperler (trin 16) forberedes, så der er tilstrækkelig tid til at forvarme buffere og ligevægte streptavidinperlerne.
15. Forbered vaskebuffere
BEMÆRK: Vaskebuffere leveres som 2x (Bead Wash Buffer) eller 10x (alle andre vaskebuffere) koncentrerede opløsninger.
- Under hybridiseringsinkubationen fortyndes 2x bead wash bufferen og 10x vaskebufferne for at skabe 1x arbejdsløsninger, multiplicere med det krævede antal prøver og tilsætning 10% ekstra efter tabel 12. Hvis 10x Wash Buffer 1 er uklar, opvarmes flasken i et 65 °C vandbad eller en varmeblok for at ophænge partikler. Frosne 1x vaskebuffere skal blandes efter optøning.
| Vask buffere | Koncentreret buffer (μL) | Nuclease-frit vand (μL) | I alt (μL) |
| Bead Vask Buffer | 150 | 150 | 300 |
| Vask buffer 1 | 25 | 225 | 250 |
| Vask buffer 2 | 15 | 135 | 150 |
| Vask buffer 3 | 15 | 135 | 150 |
| Streng vaskebuffer | 30 | 270 | 300 |
Tabel 12: Vask bufferfortynding. Koncentrationsskyllebufferne skal fortyndes med nukleasefrit vand ved stuetemperatur i henhold til de viste mængder.
- Aliquot 1x Vask Buffere i nuclease-fri PCR rør og sted ved de relevante temperaturer som anført i tabel 13. Sørg for at inkludere tilstrækkelig overage til pipetting. Til opvarmede buffere skal du bruge en termisk cycler, der er indstillet til 65 °C, med låget sat til 70 °C.
| Vask buffere | Holdetemperatur | Volumen/rør (μL) | Antal rør/prøve |
| Bead Vask Buffer | RT (15-25 °C) | 100 | 3 |
| Vask buffer 1 | 65 °C | 100 | 1 |
| Vask buffer 1 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Vask buffer 2 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Vask buffer 3 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Streng vaskebuffer | 65 °C | 150 | 2 |
Tabel 13: Fortyndede vaskebuffere. De fortyndede vaskebuffere skal alinoteres i separate rør i henhold til mængderne og antallet af viste rør pr. viste prøve. Vaskebuffere skal opbevares ved den angivne temperatur før brug.
- Bead Resuspension Mix ved stuetemperatur som vist i tabel 14,multiplicere med det krævede antal prøver og tilsæt 10% ekstra.
| Bead Resuspension Mix | Volumen (μL) |
| Hybridiseringsbuffer | 8.5 |
| Forstærker af hybridiseringsbuffer | 2.7 |
| Nuclease-frit vand | 5.8 |
| Samlet volumen | 17 |
Tabel 14: Perlerefjedring mix. Komponenter af Bead Resuspension Mix skal samles og blandes ved stuetemperatur i henhold til de viste mængder.
16. Forbered Streptavidin Perler
- Equilibrate streptavidin perler ved stuetemperatur i mindst 30 minutter før brug. Bland perlerne grundigt ved vortexing i 15 s og aliquot 50 μL perler pr fange i en nuclease-fri PCR rør.
- Der tilsættes 100 μL 1x bead wash buffer (fremstillet i trin 15.1) til hvert rør. Forsigtigt pipette op og ned 10 gange for at blande. Placer røret på en magnetisk rack, så perler ne til helt at adskille fra supernatant.
- Fjern og kassér den klare supernatant. Pas på ikke at forstyrre perlerne.
- Udfør følgende vask.
- Fjern fra magnetisk rack. Tilsæt 100 μL 1x perlevaskbuffer til hvert rør, der indeholder perler, og derefter pipette op og ned 10 gange for at blande.
- Placer røret i den magnetiske rack, så perler ne til helt at adskille fra supernatant.
- Fjern og kassér forsigtigt det klare supernatant.
- Gentag trin 16.4 én gang for i alt to vasker.
- Fjern fra magnetisk rack. Der tilsættes 17 μL bead resuspension mix fra trin 15.3 til hvert rør. Pipette op og ned flere gange for at blande. Sørg for, at perlerne ikke sidder fast på siderne af rørene. Hvis det er nødvendigt, skal du kort dreje rørene for at samle perlerne i bunden.
17. Bind hybridiseret mål til Streptavidin Perler
- Når den fire timers hybridiseringsinkubation er afsluttet, skal prøverne fjernes fra den termiske cycler, og den termiske cycler inkuberes ved 65 °C med det opvarmede låg sat til 70 °C.
- Ved hjælp af en flerkanals pipette overføres 17 μL fuldt homogeniserede perler til prøverne. Bland grundigt ved pipetting op og ned 10 gange.
- Binde DNA til perlerne ved at placere rørene i den termiske cycler efter Program #10 (Supplerende tabel 2). Under inkubationen skal du kort fjerne strimlen rør hver 10-12 min og forsigtigt vortex for 3 s for at sikre, at perlerne forbliver i suspension. Alternativt blandes ved pipetting op og ned flere gange. Fortsæt straks til Wash Streptavidin Perler (Trin 18).
18. Vask Streptavidin Perler for at fjerne ubundet DNA
- Brug 1x vaskebuffere fra trin 15.2, og opbevar opvarmede buffere i den termiske cycler under vasker.
- Der tilsættes 100 μL forvarmet 1x Vask buffer 1 til rørene fra trin 17.3. Bland grundigt ved pipetting op og ned 10 gange. Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant.
- Pipette og kassér supernatanten, som indeholder ubundet DNA. Fjern fra magnetisk rack.
- Udfør følgende 65 °C vask.
- Der tilsættes 150 μL forvarmet 1x streng vaskebuffer.
- Bland grundigt ved pipetting op og ned mindst 10 gange. Undgå bobler under pipettering. Sørg for, at perlerne er helt ophængt i alle rør.
- Inkuber i den termiske cycler ved 65 °C i 5 min.
- Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant. Pipette og kassér supernatanten, som indeholder ubundet DNA. Fjern fra magnetisk rack.
- Gentag trin 18.4 for i alt to strenge vasker.
- Udfør den første rumtemperaturvask.
- Der tilsættes 150 μL rumtemperatur 1x vaskbuffer 1.
- Pipette op og ned 10 til 20 gange for helt at resuspendere perlerne.
- Forsegle rørene og inkubere i 2 min, skiftevis mellem blidt vortexing i 30 s og hvile i 30 sekunder. Sørg for perler i alle brønde forbliver helt suspenderet i alle rør i hele inkubationen.
- Centrifuger kort rørene.
- Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant. Pipette og kassér supernatanten.
- Forsegle rørene og kort centrifuge. Vend tilbage til magnetisk rack og brug en 10 μl pipette til at fjerne eventuelle resterende vask buffer.
- Udfør den anden rumtemperaturvask.
- Der tilsættes 150 μL rumtemperatur 1x vaskbuffer 2.
- Pipette op og ned 10 til 20 gange for helt at resuspendere perlerne.
- Forsegle rørene og inkubere i 2 min, skiftevis mellem blidt vortexing i 30 s og hvile i 30 sekunder. Sørg for perler i alle brønde forbliver helt suspenderet i alle rør i hele inkubationen.
- Centrifuger kort rørene.
- Overfør hele mængden af perler, der er ophængt igen i Wash Buffer 2, for at rengøre nuklease-fri PCR-rør. Vigtigt: Overførsel af perler til friske rør er vigtigt at undgå off-target forurening.
- Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant. Pipette og kassér supernatanten.
- Forsegle rørene og kort centrifuge. Vend tilbage til magnetisk rack og brug en 10 μl pipette til at fjerne eventuelle resterende vask buffer.
- Udfør den tredje rumtemperaturvask.
- Der tilsættes 150 μL rumtemperatur 1x vaskbuffer 3.
- Pipette op og ned 10 til 20 gange for helt at resuspendere perlerne.
- Forsegle rørene og inkubere i 2 min, skiftevis mellem blidt vortexing i 30 s og hvile i 30 sekunder. Sørg for perler i alle brønde forbliver helt suspenderet i alle rør i hele inkubationen.
- Centrifuger kort rørene.
- Placer rørene på en magnetisk rack, så perlerne til helt at adskille fra supernatant. Pipette og kassér supernatanten.
- Forsegle rørene og kort centrifuge. Vend tilbage til magnetisk rack og brug en 10 μL pipette til at fjerne eventuelle resterende vask buffer.
- Fjern fra den magnetiske rack og tilsæt 20 μL nuklease-fri vand til perlerne.
- Pipette op og ned 10 gange for at sikre, at alle perler, der sidder fast på siden af rørene, er blevet ophængt igen.
- Vigtigt: Må ikke kasseres perlerne. Brug hele 20 μL af resuspenderede perler med fanget DNA i trin 19.
19. Udfør endelig PCR-berigelse efter hentning
- Forbered Post-Capture PCR Master Mix i henhold til følgende tabel, multiplicere med det nødvendige antal prøver og tilføje 10% ekstra, ifølge tabel 15.
| Komponent til pcr-mastermix efter hentning | Volumen (μL) |
| Post-Capture PCR MasterMix | 25 |
| Post-Capture PCR Primer Mix | 1.25 |
| Nuclease-frit vand | 3.75 |
| Samlet volumen | 30 |
Tabel 15: Post-Capture PCR Master Mix. Komponenter af Post-Capture PCR Master Mix skal samles og blandes på is i henhold til de viste mængder.
- Der tilsættes 30 μL af post-capture PCR Master Mix til hver prøve for et endeligt reaktionsvolumen på 50 μL. Bland grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange.
- Placer PCR-rørene i den termiske cycler og inkubering efter program #11 (supplerende tabel 2).
20. Purify Post-capture PCR Fragmenter
- Lad SPRI Perler varme til stuetemperatur i mindst 30 minutter før brug, og derefter vortex SPRI Perler for ca 30 s at resuspendere.
- Der tilsættes 75 μL resuspenderede perler til hver PCR-beriget opsamling (50 μL). Bland godt ved pipetting op og ned mindst 10 gange. Streptavidin perlerne vil ikke forstyrre SPRI perlerensning. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Drej kort rørene i en mikrocentrifuge, og placer rørene på et magnetisk rack for at adskille perler fra supernatanten. Når opløsningen er klar, skal supernatanten fjernes og kasseres omhyggeligt. Pas på ikke at forstyrre perlerne, som indeholder DNA.
- Der tilsættes 180 μL frisklavet 80% ethanol til røret, mens det er i det magnetiske rack. Inkuberved stuetemperatur i 30 s, og fjern og kassér derefter supernatanten omhyggeligt.
- Gentag trin 20.4 én gang for i alt 2 vasketrin.
- Fjern helt restethanolen. Lad røret stå på den magnetiske rist og lufttørre3 min med låget åbent, eller indtil synligt tør. Perlerne må ikke overtørres. Dette kan resultere i lavere inddrivelse af DNA.
- Fjern røret fra magneten. Elute DNA fra perlerne ved at tilføje 22 μL af 0,1 x TE Buffer. Bland godt ved pipetting op og ned flere gange. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur. Anbring røret på det magnetiske rack, indtil opløsningen er klar.
- Fjern 20 μL af supernatantet og overfør til et rent nuklease-frit PCR-rør, og pas på ikke at forstyrre perlerne. Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen, biblioteker kan gemmes på -20 °C.
21. Valider og kvantificere bibliotek
- Mål koncentrationen af det tilfangetagne bibliotek ved hjælp af et fluorometer og høj følsomhedassaykit.
- Mål den gennemsnitlige fragmentlængde for det tilfangetagne bibliotek ved hjælp af en digital elektroforese høj følsomhed s-DNA-chip og beregne den gennemsnitlige fragment størrelse for hvert bibliotek ved hjælp af systemsoftwaren. Den gennemsnitlige fragmentstørrelse bør være ca. 250-400 bp (se repræsentative resultater, figur 6 og figur 7). Dette er et valgfrit stoppunkt i protokollen, kan færdige biblioteker opbevares ved -20 °C.
22. Sekvensering på en sekventeringsplatform
- Til sekvensering skal biblioteker fortyndes til 2 nM, og følg producentens retningslinjer for lastning og drift af sequenceren. Sekvensbiblioteker til en mindste dybde på 15 millioner enkelt ende læser af mindst 50 bp i længden.
23. Analyse af sekventeringsdata for at generere immunprofiler og opdage biomarkører med Prisme Portal, et cloudbaseret informatikværktøj
- Opret en Prism-konto ved at besøge https://prism.cofactorgenomics.com/
- Når du er logget ind, skal du klikke på Send nyt projekt på den øverste værktøjslinje fra en hvilken som helst side i Prism for at overføre de multiplexed FASTQ-sekvensfiler eller overføre filer, der er gemt på BaseSpace, med Prism-kontoen.
- Udfyld formen Nyt projekt, herunder projektnavnet, og eksempler efter gruppe eller kohorte. Grupperingen af prøver og de tilsvarende grupperingsnavne er nødvendige for at generere rapporten om registrering af biomarkører. Bemærk, at der kræves mindst 3 prøver pr. gruppe for at generere rapporten om registrering af biomarkører. Klik på knappen Startprogram for at sende formularen. der vises en bekræftelsesside, hvis den lykkes.
- Klik på Se Resultater på den øverste værktøjslinje eller en hvilken som helst side i Prisme, mens du er logget ind. Prism gør det muligt for en bruger at se status for indsendte projekter og få vist eksempel- og biomarkørrapporter pr. projekt. Der vil være en tabel over projekter, som brugeren har oprettet på Prism. Tabellen har tre kolonner til status, navn og afsendelsesdato.
BEMÆRK: Status for hvert projekt kan være:
• "Running", hvor projektanalysen er i øjeblikket i gang, eller
• "Succes", hvor projektanalysen er afsluttet, og rapporter er tilgængelige. - Hvis et projekt er afsluttet med analysen (angivet med statussen "Succes", skal du se de enkelte eksempelrapporter og en rapport om registrering af biomarkører. Bemærk, at biomarkørregistreringsrapporten kun vil være tilgængelig, hvis projektet indeholder de krævede minimum tre prøver pr. gruppe.
- Hvis du vil have adgang til disse rapporter, skal du vende tilbage til projekttabellen og klikke på navnet på projektet. På denne projektside vil der være en tabel med en række for hvert eksempel i projektet. Klik på linket i hver række under kolonnen Rapport for at få adgang til den enkelte rapport for hvert eksempel. Klik på linket til rapporten Om registrering af biomarkør er lige under tabellen. Hvis der ikke findes links på denne side, er projektet ikke fuldført.
Representative Results
Der er en række kontrolpunkter i hele protokollen, der gør det muligt for en bruger at evaluere kvaliteten og mængden af genererede materialer. Efter trin 12, der er beskrevet i protokollen, genereres der et elektrofherogram som vist i figur 3, der er repræsentativt for et typisk præfangstbibliotek for en intakt RNA-prøve (RIN = 7.8).
Figur 3: Typisk forfange bibliotek Bioanalyzer spor for en intakt RNA prøve. Pre-capture biblioteker vises som en bred top omkring 250-400 base par (bp) i størrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Der bør udvises forsigtighed for at undgå overforstærkning, som det fremgår af den anden top på ca. 1.000 bp, der er vist i figur 4, et repræsentativt elektrofherogram af et forfangebibliotek, der er genereret fra en FFPE RNA-prøve (DV200 = 46). Hvis denne top er lille i forhold til de vigtigste peak (omkring 250-400 base par (bp), som vist), vil det ikke forstyrre nedstrøms trin eller analyse. Hvis den anden top er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket genskabes med færre PCR cykler for at reducere overforstærkning.
Figur 4: Typisk forhentningsbibliotekSbioanalysatorsporing til en FFPE RNA-prøve. Den anden top omkring 1.000 bp er tegn på over-forstærkning. Hvis dette højdepunkt er lille i forhold til de vigtigste top omkring 250-400 bp (som vist), vil det ikke forstyrre nedstrøms trin eller analyse. Hvis den anden top er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket genskabes med færre PCR cykler for at reducere over-forstærkning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Som beskrevet i trin 12.1.3 bør tilstedeværelsen af adapterdimer evalueres for at afgøre, om yderligere oprydning er nødvendig. De elektropherogrammer, der er vist i figur 5, er repræsentative for uacceptable (figur 5A, DV200 = 33) og acceptable(figur 5B, DV200 = 46) niveauer af adapterdimer, der fremstår som den skarpe top omkring 128 bp.
Figur 5: Pre-capture bibliotek Bioanalyzer spor. Adapteren dimer viser sig som en skarp top omkring 128 bp. (A) Overdreven adapter dimers er til stede i denne elektropherogram. (B) Acceptable adapterdimer er afbildet i dette spor. Begge spor viser tegn på mild overforstærkning, men dette bør ikke forstyrre ImmunoPrism Assay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved afslutningen af protokollen, før sekvensering, er de endelige biblioteker igen evalueret ved hjælp af digital elektroforese. Biblioteker lavet af FFPE RNA tendens til at have en mindre gennemsnitlig størrelse fordeling end biblioteker lavet af intaktRNA. For intakte RNA-prøver skal det resulterende spor ligne figur 6 (RIN = 9.5). For nedbrudt RNA eller FFPE RNA skal det resulterende spor ligne figur 7 (DV200 = 36).
Figur 6: Typisk testspor af det endelige bibliotek bioanalysator for en intakt RNA-prøve. Endelige biblioteker vises som en bred top omkring 250-400 base par (bp) i størrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Typisk testspor af det endelige bibliotek bioanalysator for en FFPE RNA-prøve. Biblioteker lavet af FFPE RNA tendens til at have en mindre gennemsnitlig størrelse fordeling end biblioteker lavet af intaktRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Som beskrevet kan de resultater, der genereres med denne protokol, anvendes på to nøglemåder, som vist i figur 8.
Figur 8: To anvendelsestilfælde i protokollen. Resultaterne genereret af denne immunprofilering assay anvendes i to centrale translationelle applikationer. (A) Den første brug sag starter fra humant fast tumorvæv (herunder FFPE arkiver) og genererer en individuel immunprofil for prøven. (B) Når dataene er genereret for en kohorte af humane prøver, kombineres de ved hjælp af Prism Portalen til at generere en flerdimensional biomarkør og tilsvarende Biomarkør-rapport. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at påvise hvert af disse use cases er repræsentative data fra en lille translationel undersøgelse inkluderet21. De prøver, der anvendes i denne undersøgelse, er et sæt prøver fra 7 patienter, der diagnosticeres og behandles for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Prøverne er patient-matchede solid tumorvæv fra før og efter behandling biopsier. For det første blev individuelle prøver analyseret for at generere en immunprofil, f.eks.
Figur 9: Eksempel på individuel immunrapport for en NSCLC-prøve. Prism Portal-rørledningen genererer en grafisk rapport for hver prøve, der behandles, med en repræsentativ rapport genereret til en NSCLC solid tumor prøve vist her. (A) Forsiden af rapporten viser grafisk nedbrydningen af de immunceller, der findes i RNA-prøven, der er udvundet af FFPE-vævet. (B) Bagsiden af rapporten indeholder en tabel over immunceller (i absolutte procenter) og undslippe genekspression (i udskrifter pr. million, eller TPM), samt en erklæring om ydeevne for analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Immunprofilerne før og efter behandlingen kan anvendes til at forstå, hvordan en behandling (kemoterapi eller stråling, i denne undersøgelse) har ændret tumor mikromiljøet. Et eksempel er vist i figur 10, hvor ændringerne i procent for hver immuncelle og totalt immunindhold vises før og efter kemoterapi for en enkelt patient.
Figur 10: Eksempel resultater før og efter behandling. Individuelle immuncelle- og totalimmunindholdsdata fra prøver før og efter behandling fra en enkelt NSCLC-patient vises. I dette eksempel fik patienten et kemoterapiregime som behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Patienter kan grupperes efter kriterier såsom kliniske resultater eller fænotyper til sammenligning. I figur 11blev prøverne i NSCLC-studiet f.eks. En delmængde af patienterne viste sygdomstilbagefald i >18 måneder, og en anden delmængde udviklede sig hurtigere i ≤18 måneder. Mediandeltaværdien (forskellen mellem værdier før og efter behandling) sammenlignes for hver prøve for at identificere formodede biomarkører for sygdomsprogression.
Figur 11: Sammenligning af kliniske resultatsammenligninger. Kvantitative ændringer mellem immuncelleprocenterne i matchede NSCLC-prøver før og efter behandlingen blev beregnet og rapporteret som "deltaværdien". De, der fremhæves med gult, viser klare signalændringer mellem overlevelsesstatus. Blå bjælker repræsenterer mediandeltaværdier for >18 måneder, indtil sygdomsprogression, orange stænger repræsenterer mediandeltaværdier for ≤18 måneder indtil sygdomsprogression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig kan lignende stikprøvegrupper anvendes til specifikt at se på prøver til forbehandling for at identificere prædiktive biomarkører ved hjælp af Prism-portalen til at udarbejde en Biomarkørrapport. I figur 12definerer den samme kliniske fænotype (sygdomsprogression) som beskrevet ovenfor prøvegrupperinger. I dette eksempel blev to immunflugtsgener identificeret som statistisk signifikante differentiatorer af prøvegrupperinger (CD47 og OX40, vist i det nederste panel i figur 12A). I dette eksempel, fordi de enkelte genbiomarkører er robuste med klar statistisk betydning, tilføjer den flerdimensionale biomarkør ikke signifikant prædiktiv værdi (ImmunoPrism, som mærket i det øverste højre søjlediagram i figur 12B). Den fulde datatabel, herunder resultater for alle 18 analysander til analysen, er sammenfattet på bagsiden af rapporten, herunder statistisk analyse og en kort oversigt over metoder.
Figur 12: Eksempel Biomarkørrapport for NSCLC-prøver. Biomarker Discovery-rørledningen leverer en visuel rapport over individuelle biomarkører og en flerdimensional biomarkør med maskinel læring med detaljerede statistikker. (A) I forbindelse med denne undersøgelse identificerede rørledningen to individuelle biomarkører (CD47 og OX40) som statistisk signifikante for at definere sygdomsprogression med en tærskel på 18 måneder. B) Nærmere oplysninger om metoden og de fuldstændige resultater er medtaget på bagsiden af rapporten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Reagenskit materialer. En liste over materialer i ImmunoPrism Kit er opført, sammen med de varenumre, der refereres til i producentens protokol. Alt andet udstyr og andet materiale, der kræves, er opført i materialetabellen. Besøg https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ for sikkerhedsdatablade (SDS). Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Supplerende tabel 2: Termisk cycler programmer. De anbefalede cycler-programmer, der refereres til i hele protokollen, opsummeres for at gøre det nemmere at programmere. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Supplerende tabel 3: Indeksvejledning for sekvensering. Indeksprimere i reagenssættet er angivet. en unik primer føjes til hver reaktion til post-sekventering demultiplexing. Anbefalede kombinationer med multixing på lavt niveau er også til rådighed. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Discussion
Protokollen kræver 20 ng intakt eller 40 ng stærkt nedbrudt (FFPE) RNA. RNA-prøven skal være fri for DNA, salte (f.eks. mg2+eller guanidiniumsalte), divalente kationchelatingsmidler (f.eks. EDTA, EGTA, citrat) eller organiske stoffer (f.eks. phenol og ethanol). Det anbefales ikke at fortsætte med RNA-prøver, der har en DV200 <20%. Brug af in-kit kontrol RNA anbefales kraftigt, da disse kontroller giver et middel til at evaluere ydeevnen i hele protokollen, fra bibliotek forberedelse til analyse.
Protokollen er designet til at blive udført ved hjælp af 0,2 ml PCR striprør. Hvis det foretrækkes, kan protokollen også udføres ved hjælp af brøndene i en 96-brønd skrupmaskine plade. Du skal blot bruge brøndene i en 96-brønd PCR plade i stedet for alle henvisninger til PCR rør eller strip rør. Brug kun PCR-plader med klare brønde, da det er afgørende visuelt at bekræfte fuldstændig resuspension af perler under perlerensninger og vasketrin.
Under hele protokollen skal reagenserne holdes frosne eller på is, medmindre andet er angivet. Brug ikke reagenser, før de er helt optøet. Sørg for at blande alle reagenser grundigt før brug.
Hold enzymer ved -20 °C, indtil de er klar til brug og vende tilbage til -20 °C straks efter brug. Brug kun molekylært nuklease-frit vand; Det anbefales ikke at bruge DEPC-behandlet vand. Når pipettering blandes, skal du forsigtigt aspirere og dispensere mindst 50 % af det samlede volumen, indtil opløsningerne er godt blandede. Pipette blandes alle masterblandinger indeholdende enzymer. Brug vortex til at blande enzymer kan føre til denaturering og kompromittere deres ydeevne. Under perlerensninger skal du bruge frisklavede 80 % ethanolopløsninger fra ethanol af molekylær kvalitet. Brug af ethanolopløsninger, der ikke er friske, kan resultere i lavere udbytter. Undgå over tørring af perlerne, da dette kan reducere elution effektivitet (perler ser revnet, hvis over tørret).
Som beskrevet i trin 10 føjes unikke indeksprimere til hver reaktion. Baseret på sekvenser af disse indekser, for lav-niveau multiplexing, visse indeks kombinationer er optimale. Sekvenserne af disse indeks er nødvendige for at demultiplexing dataene efter sekvensering. Sekvenserne og de anbefalede multiplexingkombinationer findes i supplerende tabel 3. I samme trin er det vigtigt at bemærke, at antallet af anbefalede PCR-cyklusser varierer afhængigt af kvaliteten af det anvendte RNA, og nogle optimeringer kan være nødvendige for at forhindre PCR overforstærkning. For ImmunoPrism Intakt Control RNA og andre høj kvalitets-RNA skal du starte optimering med 10 PCR-cyklusser. For ImmunoPrism FFPE Control RNA og andre stærkt nedbrudte/FFPE RNA skal du starte optimering med 15 PCR-cyklusser. Det anbefales at producere et testbibliotek ved hjælp af RNA-repræsentant for det materiale, der skal analyseres for at optimere PCR-cyklusser. Det mindste antal PCR-cyklusser, der konsekvent giver tilstrækkelige forhåndsfangebiblioteksudbytter (>200 ng), bør anvendes. En sekundær top omkring 1000 bp på Bioanalyzer spor er tegn på over-forstærkning (Figur 4). Overforstærkning bør minimeres, men tilstedeværelsen af en lille sekundær top vil ikke forstyrre analyseresultater.
For at minimere prøvetab og undgå at skifte rør kan trin 13 udføres i PCR-rør, strimmelrør eller en 96-brønds PCR-plade i stedet for 1,5 ml mikrorør, hvis vakuumkoncentratoren tillader det. Rotoren kan fjernes på mange koncentratorer. Dette gør det muligt for strimmelrørene eller pladerne at passe ind i vakuum. Vakuumkoncentrationen kan derefter køres ved hjælp af den vandige udtørringsindstilling uden centrifugering. Se vejledningen for at få vejledning i vakuumkoncentratoren. Hvis prøverne tørres ned i strimmelrør eller en 96-brøndsplade, kan hybridiseringstrinnet udføres i samme beholder.
Under trin 17 skal du sørge for at vortex hver 10-12 min at øge perle fange effektivitet. Hold forsigtigt hætterne på de varme båndrør, når de blandes for at forhindre rør i at åbne.
De vasker, der er beskrevet i trin 18, er afgørende for at undgå høj uspecifik kontaminering og skal følges nøje. Sørg for at sætte perlerne helt i stå ved hver vask, helt fjerne vaskebufferne, og under vask buffer 2 vasken overføres prøverne til et frisk strimmelrør (trin 18.6.5). Sørg for, at streptavidin perlerne er helt opslæmes og forbliver i suspension under hele inkubationen. Sprøjt på rørhætterne vil ikke påvirke opfangetagdet negativt. Under rumtemperaturvasken kan der anvendes en mikropladevortexmixer til at vortexere prøverne i hele inkubationstiden på to minutter for lettere resuspension. Lad ikke streptavidin perlerne tørre ud. Hvis det er nødvendigt, udvide inkubationer i buffere for at undgå tørring af perlerne. Hvis du bruger mere end ét strimmelrør, skal du arbejde med et strimmelrør ad gangen for hver vask, mens de andre strimmelrør sidder i termohjulet. Dette kan hjælpe med at undgå over tørring af perlereller farende, hvilket resulterer i dårlig resuspension eller andre sub-optimale teknikker. For første gang brugere, anbefales det ikke at behandle mere end 8 bibliotek reaktioner ad gangen.
Nuværende immunprofileringteknikker leverer et kontinuum af information - fra tusindvis af datapunkter, der kræver betydelig fortolkning (RNA sekventering) til en person, diskret datapunkt (single-plex IHC). Den protokol, der er beskrevet her, repræsenterer en tilgang, der er et sted i midten, med et fokuseret anvendelsesområde, der muliggør høj følsomhed, men kun at fange en delmængde af klinisk relevante transkripomiske data. På grund af arten af bulk RNA udvinding, denne protokol giver ikke oplysninger om de rumlige relationer mellem immunceller og tumor mikromiljø, dog, resultater kan suppleres med billeddannelse teknologier til at tilføje disse oplysninger. Der er et utal af ansøgninger om de data, der genereres af denne protokol, da der er meget at lære om biologi af kræft som en sygdom, og de behandlinger, der udvikles til behandling af det. Som vist i de repræsentative resultater, den enkelte immunrapport er nyttig til at forstå, hvordan en patients immunprofil kan ændre sig som reaktion på hændelser såsom sygdomsprogression eller behandling. Mens de resultater, der præsenteres her, giver nogle eksempler på anvendelsestilfælde, er andre anvendelser, herunder undersøgelse af virkningsmekanismen i en behandling og identifikation af formodede biomarkører for kliniske resultater såsom progressionsfri og samlet overlevelse, også Praktiske. Når du bruger denne protokol til biomarkør opdagelse applikationer, er det vigtigt at praktisere god undersøgelse design for at sikre homogene populationer analyseres, tilstrækkelige prøver er inkluderet for statistisk magt, og kilder til bias overvejes. På grund af den fokuserede, strømlinede karakter af analysen, er det muligt at forestille sig en vej mod klinisk validering og downstream anvendelse af disse biomarkører engang opdaget.
Disclosures
Alle forfattere er ansat af Cofactor Genomics, Inc., den virksomhed, der udviklede og producerer ImmunoPrism reagens kit og informatik værktøjer, der anvendes i denne artikel. ImmunoPrism Assay er kun til forskningsbrug og er ikke til brug i diagnostiske procedurer.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende TriStar Technology Group for at levere de biologiske prøver til de repræsentative resultater, samt hele molekylære, analyse, produkt og kommercielle teams på Cofactor Genomics for deres tekniske ekspertise og Støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
- Brambilla, E., et al. Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).
- Iacono, D., et al. Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations. Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).
- Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
- Sierant, M. C., Choi, J. Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools. Genomics Inform. 16, (2018).
- Klauschen, F., et al. Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning. Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).
- Danaher, P., et al. Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).
- Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).
- Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
- Becht, E., et al. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).
- Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. Data normalization considerations for digital tumor dissection. Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).
- Chen, S. H., et al. A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues. BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).
- Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications. 4, 2612 (2013).
- Foley, J. W., et al. Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ. Genome Research. , (2019).
- Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482 (2019).
- PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs. JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).
- Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma. Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).
- Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer. Human Pathology. 69, 110-117 (2017).
- Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).
