Summary
Bruken av en RNA-basert tilnærming for å bestemme kvantitative immunprofiler av solid tumorvev og utnytte kliniske kohorter for immun-onkologi biomarkøroppdagelse er beskrevet gjennom en molekylær og informatikkprotokoller.
Abstract
Immunterapier viser løfte i behandlingen av onkologipasienter, men kompleks heterogenitet i tumormikromiljøet gjør det utfordrende å forutsi behandlingsrespons. Evnen til å løse de relative populasjonene av immunceller tilstede i og rundt tumorvevet har vist seg å være klinisk relevant for å forstå respons, men er begrenset av tradisjonelle teknikker som flow cytometri og immunohistochemistry ( IHC), på grunn av den store mengden vev som kreves, mangel på nøyaktige celletypemarkører og mange tekniske og logistiske hindringer. En analyse (f.eks. Immunprofileringsanalyse) overvinner disse utfordringene ved å imøtekomme både små mengder RNA og svært degradert RNA, vanlige trekk ved RNA hentet fra klinisk arkivert solid tumorvev. Analysen er tilgjengelig via et reagenssett og skybaserte informatikk som gir en ende-til-ende kvantitativ, høy gjennomstrømning immunprofileringsløsning for Illumina sekvenseringsplattformer. Forskere starter med så få som to deler av formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev eller 20-40 ng av total RNA (avhengig av prøvekvalitet), og protokollen genererer en immunprofilrapport som kvantifiserer åtte immuncelletyper og ti immunflukt gener, fange en fullstendig visning av svulsten mikromiljø. Ingen ytterligere bioinformatikkanalyse er nødvendig for å benytte de resulterende dataene. Med de riktige utvalgskohortene kan protokollen også brukes til å identifisere statistisk signifikante biomarkører i en pasientpopulasjon av interesse.
Introduction
Kvantifisering av tumorinfiltrerende lymfocytter (TILs) og andre immunrelaterte molekyler i formalin-fast og parafin innebygd (FFPE) solid tumor menneskelige vevsprøver har vist verdi i klinisk forskning1,2,3. Vanlige teknikker som flow cytometri og encellede ribonucleic acid (RNA) sekvensering er nyttige for ferskt vev og blod4,men er uegnet for analyse av FFPE-materialer på grunn av manglende evne til å skape levedyktige cellesuspensjoner. Nåværende metoder som har blitt brukt til å kvantifisere disse cellene i FFPE vev lider av store utfordringer. Immunhistokjemi (IHC) og andre lignende bildebehandlingsarbeidsflyter krever spesifikke antistoffer for å oppdage celleoverflateproteiner, noe som kan være vanskelig å standardisere på tvers av laboratorier for å muliggjøre reproduserbar kvantifisering5. Plattformer som nCounter-systemet er avhengige av uttrykk for enkeltgener for å definere viktige immunceller6,noe som begrenser følsomhetog spesifisitet ved deteksjon. Mer generiskE RNA sekvensering metoder, kombinert med frittstående programvareverktøy, er tilgjengelige, men krever betydelig optimalisering og validering før bruk7,8,9,10,11,12. Nylige fremskritt i å kombinere laserfangst mikrodisseksjon (LCM) med RNA sekvensering for FFPE vev har vist løfte; Men en mer høy gjennomstrømning, er nøkkelferdig løsning nødvendig for translasjonelle studier som tar sikte på å identifisere robuste biomarkører13,14. Metoder for å generere flerdimensjonale biomarkører, for eksempel Prediktiv immunmodellering, som definerer pasientkohorter, inkludert behandlingsrespondere, kreftsubtyper eller overlevelsesutfall med høy prediktiv nøyaktighet og statistisk signifikans blir stadig viktigere i en alder av presisjonsmedisin og immunterapi15,16.
For å løse dette behovet ble det utviklet en immunprofileringsanalyse for å muliggjøre sensitiv og spesifikk kvantifisering av immunceller i solid tumor FFPE-vev ved hjelp av standardiserte RNA-sekvenseringsreagenser og skybaserte informatikk. I tillegg til å imøtekomme degradert RNA fra FFPE-vev, er protokollen i stand til å imøtekomme RNA avledet fra å begrense vevsprøver som kjernenålbiopsier, nåleaspirater og mikro- eller makrodissekert vev. RNA-data fra hvert utvalg sammenlignes med en database med genuttrykksmodeller av immunceller, kalt immunhelseuttrykksmodeller, for å kvantifisere immunceller som en prosentandel av totale celler som finnes i prøven. Kort, disse modellene ble bygget ved hjelp av maskinlæringsmetoder for å identifisere unike multigene uttrykksmønstre fra hele transkripsjonsdata generert fra renset immuncellepopulasjoner (isolert ved hjelp av kanoniske celle-overflate markører)17,18. De flerdimensjonale helseuttrykksmodellene som ligger til grunn for teknologien gjør det mulig for analysen å kvantifisere hver immuncelle som en prosent av de totale cellene som finnes i den heterogene blandingen. Dette gjør det mulig for forskeren å generere inter- og intra-sample immuncelle sammenligninger, som har vist seg å ha klinisk verdi19,20. Andre bruksområder inkluderer kvantifisering av immunrespons før- og etterbehandling, som beskrevet i de representative resultatene. Analysen rapporterer om flere funksjoner i immunkontekstur av tumor og tumor mikromiljø inkludert de absolutte prosentandelene av åtte immuncelletyper (avledet fra genuttrykksmodeller): CD4+ T celler, CD8+ T celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B celler, CD14+ monocytter, Tregs, M1 makrofager, og M2 makrofager. I tillegg rapporterer analysen uttrykket (i transkripsjoner per million, eller TPM) av ti immunrømningsgener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 og ARG1.
Reagenssettet brukes til å gjøre biblioteker av høy kvalitet klare for sekvensering på en Illumina-plattform etter en hybrid opptaksbasert bibliotekforberedelsesmetode, som vist i figur 1. Hvis en forsker ikke har en Illumina sekvenseringsplattform i laboratoriet, kan de sende sine prøver til et kjernelaboratorium for sekvensering. Når de genereres, lastes sekvenseringsdata opp til Prism Portal for automatisert analyse, og en omfattende, kvantitativ profil for hvert enkelt utvalg, i form av immunrapporten (figur 2A),returneres til brukeren. Brukere kan også definere utvalgsgrupperinger i Prism Portal for å generere en Biomarker-rapport (figur 2B), og fremhever statistisk signifikante biomarkører som skiller to pasientkohorter. Viktigere, dataene som genereres av reagenssettet er kun for forskning bruk og kan ikke brukes til diagnostiske formål.
Figur 1: Oversikt over arbeidsflyt. I denne protokollen konverteres RNA først til cDNA. Sekvenseringsadaptere er ligated, og adapter-ligated cDNA forsterkes og strekkodes av PCR for å skape et pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder blir deretter hybridisert til spesifikke cDNA mål som deretter fanges ved hjelp av streptavidin perler. Ubundet, ikke-målrettet cDNA fjernes ved vasking. En endelig PCR-berikelse gir et bibliotek etter fangst klar for sekvensering. *Total RNA må være fra menneskelige prøver; intakt eller degradert (FFPE) RNA. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative immunrapporter. Arbeidsflyten genererer to rapporter, en individuell immunrapport (A) for hver prøve behandlet, og en biomarkørrapport (B) for definerte pasientkohorter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Protokollen krever ca. 16 timer forberedelsestid (fra total RNA til biblioteker klare for sekvensering); Det finnes imidlertid en rekke valgfrie stoppepunkter, som nevnt i protokollen. Analysen gjør bruk av den rike, dynamiske natur transkripsjonomics å bevege seg utover eldre single-analyte biomarkører til flerdimensjonale genuttrykk modeller, og dermed muliggjør omfattende biologisk karakterisering av vevprøver med standardisert reagenser og brukervennlige programvareverktøy. Det gir forskere mulighet til å bruke en moderne teknologi i sitt eget laboratorium, ved å utnytte maskinlæring og en database med Helseuttrykksmodeller for å utlede mer nøyaktige, kvantitative immunprofiler av dyrebare kliniske prøver, og oppdage flerdimensjonale RNA biomarkører med full statistisk analyse.
Protocol
De menneskelige vevsprøvene som benyttes i representative resultater som vises her, ble kjøpt fra en anerkjent enhet (TriStar Technology Group) og har informert donorsamtykke som tillater akademisk og kommersiell forskning, samt godkjenning fra en kompetent etisk Komiteen.
Del I: Forberedelse til forhåndsfangst av bibliotek
1. RNA Kvantifisering og kvalifisering
- Kvantifiser RNA ved hjelp av en fluoretrisk analyse for å bestemme riktig inngang til analysen. Vurder kvaliteten på inngangs-RNA ved hjelp av elektroforese for å bestemme RNA Integrity Number (RIN) og prosentandelen av fragmenter > 200 nukleotider (DV200) verdier.
- For intakt (RIN > 7) eller delvis degraderte RNA-prøver (RIN = 2 til 7) følg bibliotekets forberedelsestrinn for høy kvalitet/intakt RNA, som starter med trinn 2.1. Kvaliteten på RNA er viktig for å velge riktig fragmenteringstid i Thermal Cycler Program #1 (Tilleggstabell 2).
- For svært degraderte prøver (f.eks. RIN = 1 til 2 eller FFPE) bestemmer du DV200-verdien. Disse prøvene krever ikke fragmentering og vil følge instruksjonene for degradert RNA, som starter med trinn 2.2.
- Forbered riktig mengde total RNA for hver prøve for ved å fortynne 20 ng av RNA (Høy kvalitet / intakt RNA med RIN > 2) eller 40 ng RNA (Degradert / FFPE RNA med DV200 > 20%) til 5 μL i kjernefritt vann. Behandling av prøver med DV200 < 20% anbefales ikke. For kontrollen RNA-prøver som følger med settet, fortynn 1 μL av riktig RNA i 4 μL kjernefritt vann. Kontrollprøver vil følge samme behandling som beskrevet for enten Høy kvalitet (intakt) eller Degradert (FFPE) RNA-materialer, som merket. Se Tilleggstabell 1 for alle reagenser som er inkludert i settet.
2. RNA fragmentering og priming
- Følg trinn 2.1.1 for høy kvalitet/intakt RNA med RIN > 2.
- For høykvalitets RNA, sett sammen fragmentering og priming reaksjon på is i et kjernefritt PCR-rør i henhold til tabell 1.
- Bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Deretter, kort spinne ned prøvene i en microcentrifuge
MERK: For alle sentrifugespinn i protokollen anbefales en hastighet på ≥ 1000 x g i minst 3 s. - Plasser prøvene i en termisk syklusr og bruk Program #1 (Tilleggstabell 2).
- Overfør rørene umiddelbart til is og fortsett til First Strand cDNA Synthesis for High Quality RNA (trinn 3.1). For samtidig fremstilling av både Høy kvalitet og FFPE RNA, start utarbeidelsen av FFPE RNA (trinn 2.2) under fragmenteringinkubasjonen.
- Bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Deretter, kort spinne ned prøvene i en microcentrifuge
- For høykvalitets RNA, sett sammen fragmentering og priming reaksjon på is i et kjernefritt PCR-rør i henhold til tabell 1.
| Fragmentering og priming mix | Volum (μL) |
| Intakt eller delvis degradert RNA (20 ng) | 5 |
| Første trådsyntese reaksjonbuffer | 4 |
| Tilfeldige primere | 1 |
| Totalt volum | 10 |
Tabell 1: Fragmentering og priming reaksjon for høy kvalitet RNA. Komponenter av fragmentering og priming reaksjon for høy kvalitet RNA bør monteres og blandes på is i henhold til de viste volumene. En mesterblanding av First Strand Synthesis Reaction Buffer og Random Primers kan gjøres og legges til RNA-prøvene.
- Følg trinn 2.2.1 for Degradert/FFPE RNA med DV200 > 20 %.
- For svært degradert (FFPE) RNA som ikke krever fragmentering, montere grunning reaksjonen som beskrevet i tabell 2. For intakt RNA, husk å følge trinn 2.1.
- Bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Deretter, kort spinne ned prøvene i en microcentrifuge.
- Plasser prøvene i en termisk syklusr og bruk Program #2 (Tilleggstabell 2).
- Overfør rørene til is og fortsett til First Strand cDNA Synthesis for Highly Degradert (FFPE) RNA (trinn 3.2).
- For svært degradert (FFPE) RNA som ikke krever fragmentering, montere grunning reaksjonen som beskrevet i tabell 2. For intakt RNA, husk å følge trinn 2.1.
| Priming reaksjon | Volum (μL) |
| FFPE RNA (40 ng) | 5 |
| Tilfeldige primere | 1 |
| Totalt volum | 6 |
Tabell 2: Tilfeldig primingreaksjon for svært degradert RNA. Komponenter av priming reaksjonen for svært degradert RNA bør monteres på is i en kjernefri PCR rør.
3. Første Strand cDNA Syntese
- Følg trinn 3.1.1 for høy kvalitet/intakt RNA med RIN > 2.
- For intakt RNA (høy kvalitet), montere den første Strand Syntese reaksjon på is i en kjernefri PCR rør i henhold til tabell 3.
- Hold reaksjonene på is, bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Kort spinn ned prøvene i en mikrocentrifuge, og fortsett direkte til Første strandsyntese inkubasjon (trinn 4).
- For intakt RNA (høy kvalitet), montere den første Strand Syntese reaksjon på is i en kjernefri PCR rør i henhold til tabell 3.
| Første strandsyntese | Volum (μL) |
| Fragmentert og primet RNA (trinn 2.1.3) | 10 |
| Første Strand syntese spesifisitet reagens | 8 |
| Første strandsyntese enzym blanding | 2 |
| Totalt volum | 20 |
Tabell 3: Første Strand Syntesereaksjon for høy kvalitets RNA. Komponenter av fragmentering og priming reaksjon for høy kvalitet RNA bør monteres og blandes på is i henhold til de oppgitte volumene. En mesterblanding av First Strand Synthesis Specificity Reagens og First Strand Synthesis Enzyme Mix kan gjøres og legges til de fragmenterte og primede RNA-prøvene.
- Følg trinn 3.2.1 for Degradert/FFPE RNA med DV200 > 20 %.
- For svært degradert RNA (FFPE), monter den første Strand Syntese-reaksjonen på is i et kjernefritt PCR-rør i henhold til tabell 4.
- Hold reaksjonene på is, bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Kort spinn ned prøvene i en mikrocentrifuge, og fortsett direkte til Første strandsyntese inkubasjon (trinn 4).
- For svært degradert RNA (FFPE), monter den første Strand Syntese-reaksjonen på is i et kjernefritt PCR-rør i henhold til tabell 4.
| Første strandsyntese | Volum (μL) |
| Primet RNA (trinn 2.2.3) | 6 |
| Første trådsyntese reaksjonbuffer | 4 |
| Første Strand spesifisitet reagens | 8 |
| Første strandsyntese enzym blanding | 2 |
| Totalt volum | 20 |
Tabell 4: Første Strand Syntesereaksjon for svært degradert RNA. Komponenter av fragmentering og priming reaksjon for svært degradert RNA bør monteres og blandes på is i henhold til de viste volumene. En mesterblanding av First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Synthesis Specificity Reagent og First Strand Synthesis Enzyme Mix kan gjøres og legges til de primede RNA-prøvene.
4. Første Strand Syntese Inkubasjon
- Hold rørene på is, bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Spinn kort ned prøvene i en mikrocentrifuge. Inkuber prøvene i en forvarmet termisk syklusr etter Program #3 (Tilleggstabell 2).
5. Andre Strand cDNA Syntese
- Forbered den andre tråd cDNA-syntesereaksjonen på isen ved å montere komponentene som er oppført i tabell 5,inkludert det første strandreaksjonsproduktet fra trinn 4.1.
| Andre strandsyntese reaksjon | Volum (μL) |
| Første Strand Syntese Produkt (Trinn 4.1) | 20 |
| Andre strandsyntese reaksjonbuffer | 8 |
| Andre Strand Syntese Enzym Blanding | 4 |
| Kjernefritt vann | 48 |
| Totalt volum | 80 |
Tabell 5: Andre Strand Syntesereaksjon. Komponenter av den andre tråd cDNA syntese reaksjonen bør monteres og blandes på is i henhold til de viste volumene. En mesterblanding av den andre strandsyntesereaksjonsbufferen, Second Strand Synthesis Enzyme Mix og Nuclease-free Water kan gjøres og legges til det første strandsynteseproduktet.
- Hold rørene på is, bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Inkuber i en termisk syklusr etter Program #4 (Tilleggstabell 2).
6. cDNA opprydding ved hjelp av SPRI (Solid Fase Reversible Immobilisering) Perler
- La SPRI Perler varme til romtemperatur i minst 30 min før bruk, og deretter vortex SPRI Perler i ca 30 s å resuspendere.
- Tilsett 144 μL resuspenderte perler til den andre trådsyntesenreaksjonen (~80 μL). Bland godt ved pipettering opp og ned minst 10 ganger og inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Spinn rørene i en mikrocentrifuge kort og legg rørene på et magnetisk stativ for å skille perler fra supernatanten. Etter at oppløsningen er klar, fjern og kast supernatanten forsiktig. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene, som inneholder DNA.
- Tilsett 180 μL nylaget 80% etanol til rørene mens du er på magnetstativet. Inkuber ved romtemperatur i 30 s, og fjern deretter og kast deretter supernatanten forsiktig.
- Gjenta trinn 6,4 én gang for totalt 2 vasketrinn.
- Fjern gjenværende etanol helt. La rørene på magnetstativet og luft tørke perlene i ca 3 min med lokket åpent, eller til synlig tørr. Ikke tørk perlene, da dette kan føre til lavere gjenoppretting av DNA.
- Fjern rørene fra magneten og tilsett 53 μL 0,1x TE Buffer (inkludert i reagenssett, se Tilleggstabell 1) til perlene. Pipette opp og ned minst 10 ganger for å blande grundig. Inkuber i 2 min ved romtemperatur.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten. Overfør 50 μL av supernatanten for å rengjøre kjernefrie PCR-rør. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene. Dette er et valgfritt stoppested i protokollen, cDNA-prøver kan lagres ved -20 °C.
7. Slutt reparasjon av cDNA-biblioteket
- Monter endereparasjonsreaksjonen på isen ved å montere komponentene som er oppført i tabell 6, til det andre strandsynteseproduktet fra trinn 6.8.
| Slutt reparasjon reaksjon | Volum (μL) |
| Andre Strand Syntese Produkt (Trinn 6.8) | 50 |
| Buffer for sluttreparasjonsreaksjon | 7 |
| End Reparasjon Enzym Blanding | 3 |
| Totalt volum | 60 |
Tabell 6: Avslutt reparasjonsreaksjonen. Komponenter av sluttreparasjonsreaksjonen skal monteres og blandes på is i henhold til de viste volumene. En hovedblanding av sluttreparasjonsreaksjonsbufferen og end repair enzymblandingen kan gjøres og legges til det andre strandsynteseproduktet.
- Sett en pipette til 50 μL, og pipette deretter hele volumet opp og ned minst 10 ganger for å blande grundig. Kort sentrifuge for å samle all væske fra sidene av rørene. Det er viktig å blande godt. Tilstedeværelsen av en liten mengde bobler vil ikke forstyrre ytelsen.
- Inkuber prøvene i en termisk syklusr etter Program #5 (Tilleggstabell 2).
8. Adapter Ligation
- Før du setter opp ligation reaksjonen, fortynn adapteren i iskald adapter fortynning buffer som vist i tabell 7,multiplisere med ønsket antall prøver, pluss 10% ekstra. Hold den fortynnede adapteren på is.
| Ligation fortynning | Volum (μL) |
| Adapter | 0.5 |
| Adapter fortynning buffer | 2 |
| Totalt volum | 2.5 |
Tabell 7: Adapterfortynning. Adapteren skal fortynnes på is med adapterfortynningsbuffer i henhold til de viste volumene.
- Monter ligation reaksjonen på isen ved å legge komponentene som beskrevet i tabell 8,i den rekkefølgen som er oppført, til sluttprep reaksjon produktet fra trinn 7.3. Vær oppmerksom på at Ligation Master Mix og Ligation Enhancer kan blandes på forhånd. Denne blandingen er stabil i minst 8 timer ved 4 °C. Ikke bland Ligation Master Mix, Ligation Enhancer og Adapter før bruk i adapterligation trinn.
| Ligation reaksjon | Volum (μL) |
| Avslutt ferdig DNA (trinn 7.3) | 60 |
| Fortynnet adapter (trinn 8.1) | 2.5 |
| Ligation Enhancer | 1 |
| Ligation Master Mix | 30 |
| Totalt volum | 93.5 |
Tabell 8: Ligation reaksjon. Komponenter i adapteren stilringreaksjon bør monteres på is i henhold til volumene som vises i den rekkefølgen som vises. En mesterblanding av Ligation Enhancer og Ligation Master Mix kan gjøres og legges til end prepped DNA med fortynnet adapter. Ikke bland den fortynnede adapteren og Ligation Master Mix eller Ligation Enhancer før du blander med End Prepped DNA.
- Sett en pipette til 80 μL, og pipette deretter hele volumet opp og ned minst 10 ganger for å blande grundig. Utfør et raskt spinn for å samle all væske fra sidene av rørene. Ligation Master Mix er veldig viskøs. Pass på at det er tilstrekkelig blanding av ligasjonsreaksjonen, da ufullstendig blanding vil føre til redusert ligasjonseffektivitet. Tilstedeværelsen av en liten mengde bobler vil ikke forstyrre ytelsen.
- Inkuber følgende Program #6 (Tilleggstabell 2),og fjern deretter ligasjonsblandingen fra den termiske syklusren og tilsett 3 μL adapterbehandlingsenzyme, noe som resulterer i et totalt volum på 96,5 μL.
- Pipette opp og ned flere ganger for å blande godt, og deretter inkubere etter Program #7 (Supplerende tabell 2) før du fortsetter umiddelbart til rensing av Ligation Reaction.
9. Rensing av ligation reaksjon ved hjelp av SPRI Neads
- La SPRI Perler varme til romtemperatur i minst 30 min før bruk, og deretter vortex SPRI Perler i ca 30 s å resuspendere.
- Tilsett 87 μL resuspended SPRI Perler og bland godt ved pipettering opp og ned minst 10 ganger. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Spinn rørene i en mikrocentrifuge kort og legg rørene på et magnetisk stativ for å skille perler fra supernatanten. Etter at oppløsningen er klar (~ 5 min), fjern og kast forsiktig supernatanten. Ikke kast perlene.
- Tilsett 180 μL nylaget 80% etanol til rørene mens du er på magnetstativet. Inkuber ved romtemperatur i 30 s, og fjern deretter og kast deretter supernatanten forsiktig. Gjenta trinn 9,4 én gang for totalt 2 vasketrinn.
- Fjern gjenværende etanol helt. La rørene på magnetstativet og luft tørke perlene i ca 3 min med lokket åpent, eller til synlig tørr. Ikke tørk perlene, da dette kan føre til lavere gjenoppretting av DNA.
- Fjern rørene fra magneten og tilsett 17 μL 0,1 x TE-buffer til perlene. Pipette opp og ned minst 10 ganger for å blande grundig. Inkuber i 2 min ved romtemperatur, og plasser deretter rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten.
- Overfør 15 μL av supernatanten for å rengjøre kjernefrie PCR-rør. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene. Dette er et valgfritt stoppested i protokollen, det adapter-ligated DNA kan lagres ved -20 °C.
10. PCR berikelse av adapter ligated DNA
- Konfigurer PCR-reaksjonen som beskrevet i tabell 9. En Master Mix som inneholder Pre-Capture PCR Master Mix og Universal Primer kan gjøres og legges til adapteren ligated DNA. For flerkset sekvensering, bruk unike indeksprimere for hver reaksjon og legg til hver prøve individuelt.
| PCR berikelse | Volum (μL) |
| Adapter ligated DNA (trinn 10.1) | 15 |
| Pre-Capture PCR Master Mix | 25 |
| Universell PCR Primer | 5 |
| Indeks (X) Primer | 5 |
| Totalt volum | 50 |
Tabell 9: PCR berikelse av adapter ligated DNA. Komponenter av PCR berikelse av adapter ligated DNA reaksjon bør monteres og blandes på is i henhold til volumene som vises. En mesterblanding av Pre-Capture PCR Master Mix og Universal PCR Primer kan gjøres og legges til adapteren ligated DNA. For sekvensering med flere xerskalser bør hver prøve gis en unik indeksprimer.
- Bland godt ved å forsiktig pipettere opp og ned 10 ganger. Kort spinne rørene i en microcentrifuge og plassere i en termisk cycler og utføre PCR forsterkning ved hjelp av Program #8 (Supplerende tabell 2).
11. Rensing av PCR-reaksjonen ved hjelp av SPRI Perler
- La SPRI Perler varme til romtemperatur i minst 30 min før bruk, og deretter vortex SPRI Perler i ca 30 s å resuspendere.
- Tilsett 45 μL resuspenderte perler til hver PCR-reaksjon (~ 50 μL). Bland godt ved pipettering opp og ned minst 10 ganger, før du inkuberer i 5 min ved romtemperatur.
- Spinn rørene i en mikrocentrifuge kort og legg rørene på et magnetisk stativ for å skille perler fra supernatanten. Etter at oppløsningen er klar (~ 5 min), fjern og kast forsiktig supernatanten. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene som inneholder DNA.
- Tilsett 180 μL nylaget 80% etanol til rørene mens du er i magnetstativet. Inkuber ved romtemperatur i 30 s, og fjern deretter og kast deretter supernatanten forsiktig. Gjenta trinn 11,4 én gang for totalt 2 vasketrinn.
- Fjern gjenværende etanol helt. La rørene på magnetstativet og luft tørke perlene i ca 3 min med lokket åpent, eller til synlig tørr. Ikke tørk perlene, da dette kan føre til lavere gjenoppretting av DNA.
- Fjern rørene fra magneten og tilsett 23 μL 0,1 x TE Buffer til perlene. Pipette opp og ned minst 10 ganger for å blande grundig. Inkuber i 2 min ved romtemperatur.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten. Overfør 20 μL av supernatanten for å rengjøre kjernefrie PCR-rør. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene. Dette er et valgfritt stoppested i protokollen, pre-capture biblioteker kan lagres ved -20 °C.
12. Valider og kvantifiser forhåndsopptaksbibliotek
- Mål konsentrasjonen av pre-capture biblioteket ved hjelp av et fluorometer og høy følsomhet analyse kit. En minimumsavkastning på 200 ng er nødvendig for å gå videre til del II: Hybridisering og fangst.
- Kjør 1 μL bibliotek på et digitalt elektroforesesystem. Fortynn om nødvendig prøven for å unngå overbelastning av høyfølsomhetsbrikken, i henhold til produsentens protokollanbefalinger.
- Kontroller at elektropherogrammet viser en smal fordeling med en toppstørrelse på ca. 250-400 bp (se Representative resultater, figur 3 og figur 4).
- Hvis en 128 bp peak (adapter-dimer) er synlig i Bioanalyzer-sporene, og intensiteten av signalet er ≥ intensiteten på 250-400 bp biblioteksignal (se Representative resultater, figur 5),og deretter ta opp prøvevolumet (fra trinn 11,7) til 50 μL med 0,1 x TE Buffer og gjenta SPRI Perlerensing (trinn 11). Dette er et valgfritt stoppepunkt i protokollen, Pre-capture biblioteker kan lagres ved -20 °C før du går videre til del II: ImmunoPrism Hybridisering og fangst.
Del II: Hybridisering og fangst
13. Kombiner blokkering oligoer, cot-1 DNA, pre-capture bibliotek DNA, og tørr
- Bland strekkodet bibliotek utarbeidet i trinn 11 og Kvantifisert i trinn 12, med Cot-1 DNA og Blocking Oligos i en kjernefri PCR rør eller 1,5 ml mikrorør, som vist i tabell 10.
| Reagens | Antall/volum |
| Strekkodet bibliotek fra trinn 10.10 | 200 ng (andre) |
| Cot-1 DNA | 2 μg |
| Blokkere Oligos | 2 μL (2 μL) |
Tabell 10: Hybridisering Forberedelse og tørking ned. Komponenter som skal kombineres for tørking av biblioteker i utarbeidelsen av hybridisering bør monteres i henhold til de viste mengdene.
- Tørk innholdet i røret ved hjelp av en vakuumkonsentrator satt til 30-45 °C. Dette er et valgfritt stoppested i protokollen. Etter tørking kan rør lagres over natten ved romtemperatur (15-25 °C) eller lenger ved -20 °C.
14. HybridiserDNA Capture Probes med biblioteket
- Tin 2x bead wash buffer og hybridisering buffer, hybridisering buffer enhancer, immunoprism probe panel, 10x vaskebuffer 1, 10x vaskebuffer 2, 10x vaskebuffer 3 og 10x strenge vaskebuffer ved romtemperatur. Før bruk må du inspisere hybridiseringsbufferen for krystallisering av salter. Hvis krystaller er til stede, varme røret ved 65 °C, risting midlertidig, til bufferen er fullstendig løseløs.
- Ved romtemperatur, lag Hybridisering Master Mix i et rør. Multipliser volumer med antall prøver og legg til 10% ekstra, etter tabell 11.
| Hybridisering Master Mix | Volum (μL) |
| Hybridisering buffer | 8.5 |
| Hybridisering Buffer Enhancer | 2.7 |
| Immunprisme probe panel | 5 |
| Kjernefritt vann | 0.8 |
| Totalt volum | 17 |
Tabell 11: Hybridisering Master Mix. Komponenter av Hybridisering Master Mix bør monteres og blandes ved romtemperatur i henhold til de viste volumene.
- Vortex eller pipette opp og ned for å blande godt. Deretter legger du til 17 μL hybridisering Master Mix til hvert rør som inneholder tørket DNA. Forsegle rørene og inkubatoren i 5 min ved romtemperatur.
- Vortex prøvene, slik at de er helt blandet, og spinne ned prøvene kort i en microcentrifuge. Hvis det er aktuelt, kan du overføre hver prøve fra et mikrorør på 1,5 ml til et kjernefritt PCR-rør.
- Plasser prøvene i en termisk syklusr og kjør Program #9 (Tilleggstabell 2).
- Under inkubasjonen, forberede vaskebuffere (trinn 15) og streptavidin perler (trinn 16), slik at for tilstrekkelig tid til å forvarme buffere og likevekt streptavidin perler.
15. Klargjør vaskebuffere
MERK: Vaskebuffere leveres som 2x (Bead Wash Buffer) eller 10x (alle andre vaskebuffere) konsentrerte løsninger.
- Under hybridiseringinkubasjonen, fortynn 2x Bead Wash Buffer og 10x Wash Buffers for å lage 1x arbeidsløsninger, multiplisere med det nødvendige antall prøver og legge til 10% ekstra, etter tabell 12. Hvis 10x Wash Buffer 1 er overskyet, varme flasken i en 65 ° C vannbad eller varmeblokk for å resuspendere partikler. Frosne 1x Vaskebuffere skal blandes etter tining.
| Vaskebuffere | Konsentrert buffer (μL) | Kjernefritt vann (μL) | Totalt (μL) |
| Buffer for perlevask | 150 | 150 | 300 |
| Vaskebuffer 1 | 25 | 225 | 250 |
| Vaskebuffer 2 | 15 | 135 | 150 |
| Vaskebuffer 3 | 15 | 135 | 150 |
| Streng vaskebuffer | 30 | 270 | 300 |
Tabell 12: Vask bufferfortynning. Konsentrasjonsvaskebufferne skal fortynnes med kjernefritt vann ved romtemperatur i henhold til de viste volumene.
- Aliquot 1x Wash Buffers i kjernefrie PCR-rør og plasser ved de riktige temperaturene som angitt i tabell 13. Sørg for å inkludere tilstrekkelig overage for pipettering. For oppvarmede buffere, bruk en termisk cycler satt til 65 °C med lokket satt til 70 °C.
| Vaskebuffere | Holde temperatur | Volum/rør (μL) | Antall rør/prøve |
| Buffer for perlevask | RT (15-25 °C) | 100 | 3 |
| Vaskebuffer 1 | 65 °C | 100 | 1 |
| Vaskebuffer 1 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Vaskebuffer 2 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Vaskebuffer 3 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Streng vaskebuffer | 65 °C | 150 | 2 |
Tabell 13: Fortynnet vaskebuffere. De fortynnede vaskebufferne bør aliquotees i separate rør i henhold til volumer og antall rør per prøve vist. Vaskebuffere må holdes ved angitt temperatur før bruk.
- Forbered Bead Resuspension Mix ved romtemperatur som vist i tabell 14,multiplisere med ønsket antall prøver og legge til 10% ekstra.
| Perle resuspension Mix | Volum (μL) |
| Hybridisering buffer | 8.5 |
| Hybridisering Buffer Enhancer | 2.7 |
| Kjernefritt vann | 5.8 |
| Totalt volum | 17 |
Tabell 14: PerlerefjæringMix. Komponenter av Bead Resuspension Mix bør monteres og blandes ved romtemperatur i henhold til de viste volumene.
16. Forbered Streptavidin Perler
- Equilibrate streptavidin perler ved romtemperatur i minst 30 min før bruk. Bland perlene grundig ved å virvle i 15 s og aliquot 50 μL perler per fangst i et kjernefritt PCR-rør.
- Tilsett 100 μL 1x perlevaskebuffer (tilberedt i trinn 15.1) til hvert rør. Pipette forsiktig opp og ned 10 ganger for å blande. Plasser røret på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten.
- Fjern og kast den klare supernatanten. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene.
- Utfør følgende vask.
- Fjern fra magnetisk stativ. Tilsett 100 μL 1x perlevaskebuffer til hvert rør som inneholder perler, og pipette opp og ned 10 ganger for å blande.
- Plasser røret i magnetstativet, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten.
- Fjern og kast den klare supernatanten forsiktig.
- Gjenta trinn 16,4 én gang for totalt to vask.
- Fjern fra magnetisk stativ. Tilsett 17 μL perlerefjæring Mix fra trinn 15.3 til hvert rør. Pipette opp og ned flere ganger for å blande grundig. Pass på at perler ikke sitter fast på sidene av rørene. Om nødvendig, kort spinne rørene for å samle perlene nederst.
17. Bind hybridisert mål til Streptavidin perler
- Etter at 4-timers hybridiseringinkubasjon er fullført, fjern prøvene fra den termiske cycleren og sett den termiske cycleren til å inkubere ved 65 °C med det oppvarmede lokket satt til 70 °C.
- Bruk en flerkanals pipette til å overføre 17 μL fullstendig homogeniserte perler til prøvene. Bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger.
- Bind DNA-et til perlene ved å plassere rørene i den termiske syklusren etter Program #10 (Tilleggstabell 2). Under inkubasjonen fjerner du kort striperørene hver 10-12 min og forsiktig vortex i 3 s for å sikre at perlene forblir i suspensjon. Alternativt kan du blande ved å pipettere opp og ned flere ganger. Fortsett umiddelbart for å vaske Streptavidin Perler (trinn 18).
18. Vask Streptavidin Perler for å fjerne ubundet DNA
- Bruk 1x Wash Buffers fra trinn 15.2 og lagre oppvarmede buffere i den termiske cycleren under vaskene.
- Tilsett 100 μL forvarmet 1x Vaskebuffer 1 i rørene fra trinn 17.3. Bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger. Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten.
- Pipette og kast supernatanten, som inneholder ubundet DNA. Fjern fra magnetisk stativ.
- Utfør følgende 65 °C-vask.
- Tilsett 150 μL forvarmet 1x streng vaskebuffer.
- Bland grundig ved å pipettere opp og ned minst 10 ganger. Unngå bobler under pipettering. Pass på at perler er helt resuspended i alle rør.
- Inkuber i termisk syklusr ved 65 °C i 5 min.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten. Pipette og kast supernatanten, som inneholder ubundet DNA. Fjern fra magnetisk stativ.
- Gjenta trinn 18,4 for totalt to strenge vasker.
- Utfør den første romtemperaturvasken.
- Tilsett 150 μL romtemperatur 1x Vaskebuffer 1.
- Pipette opp og ned 10 til 20 ganger for å fullstendig resuspendere perlene.
- Forsegle rørene og inkuber i 2 min, vekslende mellom forsiktig virvlende i 30 s og hvile i 30 sekunder. Pass på at perler i alle brønner forblir helt resuspendert i alle rør gjennom hele inkubasjonen.
- Sentrifuger rørene kort.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten. Pipette og kast supernatanten.
- Forsegle rørene og kort sentrifuge. Gå tilbake til magnetstativet og bruk en 10 μl pipette for å fjerne eventuell gjenværende vaskebuffer.
- Utfør den andre romtemperaturvasken.
- Tilsett 150 μL romtemperatur 1x Vaskebuffer 2.
- Pipette opp og ned 10 til 20 ganger for å fullstendig resuspendere perlene.
- Forsegle rørene og inkuber i 2 min, vekslende mellom forsiktig virvlende i 30 s og hvile i 30 sekunder. Pass på at perler i alle brønner forblir helt resuspendert i alle rør gjennom hele inkubasjonen.
- Sentrifuger rørene kort.
- Overfør hele volumet av perler resuspended i Wash Buffer 2 for å rengjøre kjernefrie PCR-rør. Viktig: Overføring av perlene til friske rør er viktig for å unngå off-target forurensning.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten. Pipette og kast supernatanten.
- Forsegle rørene og kort sentrifuge. Gå tilbake til magnetstativet og bruk en 10 μl pipette for å fjerne eventuell gjenværende vaskebuffer.
- Utfør den tredje romtemperaturvasken.
- Tilsett 150 μL romtemperatur 1x Vaskebuffer 3.
- Pipette opp og ned 10 til 20 ganger for å fullstendig resuspendere perlene.
- Forsegle rørene og inkuber i 2 min, vekslende mellom forsiktig virvlende i 30 s og hvile i 30 sekunder. Pass på at perler i alle brønner forblir helt resuspendert i alle rør gjennom hele inkubasjonen.
- Sentrifuger rørene kort.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ, slik at perler kan skilles helt fra supernatanten. Pipette og kast supernatanten.
- Forsegle rørene og kort sentrifuge. Gå tilbake til magnetstativet og bruk en 10 μL pipette for å fjerne eventuell gjenværende vaskebuffer.
- Fjern fra magnetstativet og tilsett 20 μL kjernefritt vann til perlene.
- Pipette opp og ned 10 ganger for å sikre at noen perler som sitter fast på siden av rørene, er suspendert på nytt.
- Viktig: Ikke kast perlene. Bruk hele 20 μL av resuspenderte perler med fanget DNA i trinn 19.
19. Utfør endelig, post-capture PCR berikelse
- Klargjør Post-Capture PCR Master Mix i henhold til følgende tabell, multiplisere med det nødvendige antall prøver og legge til 10% ekstra, i henhold til tabell 15.
| Post-Capture PCR Master Mix Komponent | Volum (μL) |
| Etter-Capture PCR MasterMix | 25 |
| Post-Capture PCR Primer Mix | 1.25 |
| Kjernefritt vann | 3.75 |
| Totalt volum | 30 |
Tabell 15: Pcr-mastermiks etter opptak. Komponenter av Post-Capture PCR Master Mix skal monteres og blandes på is i henhold til de viste volumene.
- Tilsett 30 μL av Post-Capture PCR Master Mix til hver prøve for et endelig reaksjonsvolum på 50 μL. Bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger.
- Plasser PCR-rørene i den termiske cycleren og inkuber etter Program #11 (Tilleggstabell 2).
20. Rense Post-capture PCR Fragmenter
- La SPRI Perler varme til romtemperatur i minst 30 min før bruk, og deretter vortex SPRI Perler i ca 30 s å resuspendere.
- Tilsett 75 μL resuspenderte perler til hver PCR-beriket fangst (50 μL). Bland godt ved pipettering opp og ned minst 10 ganger. Streptavidin perler vil ikke forstyrre SPRI perle rensing. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Spinn rørene i en mikrocentrifuge kort og legg rørene på et magnetisk stativ for å skille perler fra supernatanten. Etter at oppløsningen er klar, fjern og kast supernatanten forsiktig. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene, som inneholder DNA.
- Tilsett 180 μL nylaget 80% etanol til røret mens du er i magnetstativet. Inkuber ved romtemperatur i 30 s, og fjern deretter og kast deretter supernatanten forsiktig.
- Gjenta trinn 20,4 én gang for totalt 2 vasketrinn.
- Fjern gjenværende etanol helt. La røret stå på magnetstativet og lufttørke 3 min med lokket åpent, eller til det er synlig tørt. Ikke tørk for mye perlene. Dette kan føre til lavere gjenoppretting av DNA.
- Fjern røret fra magneten. Elute DNA fra perlene ved å legge til 22 μL av 0,1 x TE Buffer. Bland godt ved pipettering opp og ned flere ganger. Inkuber i 2 min ved romtemperatur. Plasser røret på magnetstativet til oppløsningen er klar.
- Fjern 20 μL av supernatanten og overfør til et rent kjernefritt PCR-rør, vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene. Dette er et valgfritt stoppested i protokollen, biblioteker kan lagres ved -20 °C.
21. Valider og kvantifiser e-bibliotek
- Mål konsentrasjonen av det fangede biblioteket ved hjelp av et fluorometer og analysesett med høy følsomhet.
- Mål den gjennomsnittlige fragmentlengden på det fangede biblioteket ved hjelp av en digital elektroforese høy følsomhet DNA-chip og beregn den gjennomsnittlige fragmentstørrelsen for hvert bibliotek ved hjelp av systemprogramvaren. Gjennomsnittlig fragmentstørrelse bør være ca. 250-400 bp (se Representative resultater, figur 6 og figur 7). Dette er et valgfritt stoppested i protokollen, fullførte biblioteker kan lagres ved -20 °C.
22. Sekvensering på en sekvenseringsplattform
- For sekvensering, fortynn biblioteker til 2 nM og følg produsentens retningslinjer for lasting og drift av sequenceren. Sekvensbiblioteker til en minimumsdybde på 15 millioner enkeltende leser av minst 50 bp i lengde.
23. Analyse av sekvenseringsdata for å generere immunprofiler og oppdage biomarkører med Prism Portal, et skybasert informatikkverktøy
- Opprett en prismekonto ved å gå til https://prism.cofactorgenomics.com/
- Når du er logget på, klikker du send nytt prosjekt på den øverste verktøylinjen fra en hvilken som helst side i Prisme for å laste opp de demultiplekserte FASTQ-sekvenseringsfilene, eller laste opp filer som er lagret på BaseSpace med Prisme-kontoen.
- Fyll ut skjemaet Nytt prosjekt, inkludert prosjektnavnet og eksemplene etter gruppe eller kohort. Gruppering av eksempler, og tilsvarende grupperingsnavn, er nødvendig for å generere Biomarker Discovery Report. Vær oppmerksom på at minst 3 prøver per gruppe er nødvendig for å generere Biomarker Discovery Report. Klikk Start søknad-knappen for å sende inn skjemaet. en bekreftelsesside vises hvis den lykkes.
- Når du er logget på, klikker du På Se resultater på den øverste verktøylinjen eller en hvilken som helst side i Prisme. Prisme gjør det mulig for en bruker å se statusen for innsendte prosjekter og vise utvalgs- og biomarkørrapporter per prosjekt. Det vil være en tabell over prosjekter brukeren har opprettet på Prism. Tabellen har tre kolonner for status, navn og innsendingsdato.
MERK: Statusen for hvert prosjekt kan være:
• "Løping", der prosjektanalysen kjører, eller,
• "Suksess", hvor prosjektanalysen er fullført og rapporter er tilgjengelige. - Hvis et prosjekt er ferdig analyse (angitt med statusen "Vellykket"), kan du vise de individuelle eksempelrapportene og en Biomarker Discovery Report. Vær oppmerksom på at Biomarker Discovery Report bare vil være tilgjengelig hvis prosjektet inneholder det nødvendige minimumet av tre prøver per gruppe.
- Hvis du vil ha tilgang til disse rapportene, går du tilbake til tabellen for prosjekter og klikker på navnet på prosjektet. På denne prosjektsiden vil det være en tabell med en rad for hvert eksempel i prosjektet. Klikk koblingen i hver rad, under Rapport-kolonnen for å få tilgang til den individuelle rapporten for hvert eksempel. Rett under tabellen klikker du på koblingen for Biomarker Discovery Report. Hvis ingen koblinger er på denne siden, har ikke prosjektet fullført analysen.
Representative Results
Det finnes en rekke kontrollpunkter i hele protokollen som gjør det mulig for en bruker å evaluere kvaliteten og kvantiteten av genererte materialer. Etter trinn 12 beskrevet i protokollen genereres et elektropherogram som vist i figur 3, representant for et typisk forhåndsopptaksbibliotek for en intakt RNA-prøve (RIN = 7,8).
Figur 3: Typisk Pre-capture Library Bioanalyzer spor for en intakt RNA-prøve. Pre-capture biblioteker vises som en bred topp rundt 250-400 base par (bp) i størrelse. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Forsiktighet bør utvises for å unngå overamplifisering, som angitt av den andre toppen rundt 1000 bp vist i figur 4,et representativt elektropherogram av et pre-capture bibliotek generert fra en FFPE RNA prøve (DV200 = 46). Hvis denne toppen er liten i forhold til hovedtoppen (rundt 250-400 basispar (bp), som vist), vil den ikke forstyrre nedstrøms trinn eller analyse. Hvis den andre toppen er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket gjenskapes med færre PCR sykluser for å redusere overamplifisering.
Figur 4: Typisk Pre-capture Library Bioanalyzer-sporing for et FFPE RNA-eksempel. Den andre toppen rundt 1000 bp er et tegn på overforsterkning. Hvis denne toppen er liten i forhold til hovedtoppen rundt 250-400 bp (som vist), vil den ikke forstyrre nedstrøms trinn eller analyse. Hvis den andre toppen er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket gjenskapes med færre PCR sykluser for å redusere over-forsterkning. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Som beskrevet i trinn 12.1.3, bør tilstedeværelsen av adapterdimmer evalueres for å avgjøre om ytterligere opprydding er nødvendig. Elektropherogrammer vist i figur 5 er representative for uakseptabelt (Figur 5A,DV200 = 33) og akseptabelt(Figur 5B,DV200 = 46) nivåer av adapterdimmer, vises som den skarpe toppen rundt 128 bp.
Figur 5: Bioanalysatorspor for forhåndsopptaksbibliotek. Adapterdimmen vises som en skarp topp rundt 128 bp. (A) Overdreven adapterdimmer er til stede i dette elektropherogrammet. (B) Akseptabel adapter dimmenivåer er avbildet i denne sporingen. Begge sporene viser tegn på mild overforsterkning, men dette bør ikke forstyrre ImmunoPrism-analysen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Ved ferdigstillelse av protokollen, før sekvensering, blir de endelige bibliotekene igjen evaluert ved hjelp av digital elektroforese. Biblioteker laget av FFPE RNA har en tendens til å ha en mindre gjennomsnittlig størrelsesfordeling enn biblioteker laget av intakt RNA. For intakte RNA-prøver skal den resulterende sporingen se ut som figur 6 (RIN = 9,5). For degradert eller FFPE RNA, bør den resulterende sporingen se ut som figur 7 (DV200 = 36).
Figur 6: Typisk bioanalysatorspor for sluttbibliotek for en intakt RNA-prøve. Endelige biblioteker vises som en bred topp rundt 250-400 basispar (bp) i størrelse. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Typisk Bioanalysatorspor for sluttbibliotek for et FFPE RNA-eksempel. Biblioteker laget av FFPE RNA har en tendens til å ha en mindre gjennomsnittlig størrelsesfordeling enn biblioteker laget av intakt RNA. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Som beskrevet kan resultatene som genereres med denne protokollen, brukes på to viktige måter, som vist i figur 8.
Figur 8: To brukstilfeller av protokollen. Resultatene som genereres av denne immunprofileringanalysen, brukes i to viktige translasjonelle applikasjoner. (A) Den første brukssaken starter fra humant solid tumorvev (inkludert FFPE-arkiver) og genererer en individuell immunprofil for prøven. (B) Når de genereres for en kohort av menneskelige prøver, kombineres dataene ved hjelp av Prism Portal for å generere en flerdimensjonal biomarkør og tilsvarende Biomarker-rapport. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
For å demonstrere hvert av disse brukstilfellene, inkluderes representative data fra en liten translasjonell studie21. Prøvene som brukes i denne studien er et sett med prøver fra 7 pasienter diagnostisert og behandlet for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Prøvene er pasienttilpasset fast tumorvev fra biopsier før og etter behandling. Først ble individuelle prøver analysert for å generere en immunprofil, for eksempel eksempelrapporten som vises i figur 9.
Figur 9: Eksempel individuell immunrapport for et NSCLC-utvalg. Prism Portal-rørledningen genererer en grafisk rapport for hvert utvalg behandlet, med en representativ rapport generert for en NSCLC solid tumorprøve vist her. (A) Forsiden av rapporten viser grafisk nedbrytning av immunceller tilstede i RNA-prøven ekstrahert fra FFPE-vevet. (B) Baksiden av rapporten inkluderer en tabell over immunceller (i absolutte prosenter) og unnslippe genuttrykk (i transkripsjoner per million, eller TPM), samt en erklæring om ytelse for analysen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Immunprofilene før og etter behandlingen kan brukes til å forstå hvordan en terapi (kjemoterapi eller stråling, i denne studien) har endret tumormikromiljøet. Et eksempel er vist i figur 10, hvor endringene i prosentandel for hver immuncelle og totalt immuninnhold vises pre- og post kjemoterapi, for en enkelt pasient.
Figur 10: Eksempel resultater for pre og etter behandling. Individuelle immuncelle- og totale immuninnholddata generert fra pre- og post-treatment prøver fra en enkelt NSCLC pasient er vist. I dette eksemplet fikk pasienten et kjemoterapiregime som behandling. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Pasienter kan grupperes etter kriterier som kliniske resultater eller fenotyper til sammenligning. For eksempel, i figur 11,ble prøvene i NSCLC-studien sammenlignet i henhold til tid til sykdomsprogresjon etter behandling. En undergruppe av pasientene viste sykdomstilbakefall i > 18 måneder, og en annen undergruppe utviklet seg raskere, i ≤18 måneder. Median deltaverdi (forskjell mellom verdier før og etter behandling) sammenlignes for hver prøve for å identifisere putative biomarkører for sykdomsprogresjon.
Figur 11: Eksempel på sammenligning av klinisk utfall. Kvantitative endringer mellom immuncelleprosentene i samsvarende NSCLC-prøver før og etter behandling ble beregnet og rapportert som "delta"-verdien. De som er uthevet i gult viser klare signalendringer mellom overlevelsesstatusen. Blå barer representerer median deltaverdier i >18 måneder til sykdomsprogresjon, oransje barer representerer median deltaverdier i ≤18 måneder til sykdomsprogresjon. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Til slutt kan lignende prøvegrupperinger brukes til å se spesielt på pre-behandlingsprøver for å identifisere prediktive biomarkører ved hjelp av Prism Portal for å generere en Biomarker-rapport. Vist i figur 12definerer den samme kliniske fenotypen (sykdomsprogresjon) som beskrevet ovenfor prøvegrupperingene. I dette eksemplet ble to immunrømningsgener identifisert som statistisk signifikante differensiere av prøvegrupperingene (CD47 og OX40, vist i det nedre panelet i figur 12A). I dette eksemplet, fordi de enkelte genbiomarkører er robuste med klar statistisk signifikans, legger den flerdimensjonale biomarkøren ikke til betydelig prediktiv verdi (ImmunoPrism, som merket i øverste høyre stolpediagram av figur 12B). Den fullstendige tabellen med data, inkludert resultater for alle de 18 analytter for analysen, oppsummeres på baksiden av rapporten, inkludert statistisk analyse og et kort metodesammendrag.
Figur 12: Eksempel på Biomarkørrapport for NSCLC-eksempler. Biomarker Discovery-rørledningen leverer en visuell rapport om individuelle biomarkører, og en flerdimensjonal biomarkør for maskinlæring, med detaljert statistikk. (A) For denne studien identifiserte rørledningen to individuelle biomarkører (CD47 og OX40) som statistisk signifikant for å definere sykdomsprogresjon med en terskel på 18 måneder. (B) Detaljer om metoden og fullstendige resultater er inkludert på baksiden av rapporten. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstabell 1: Reagenssettmaterialer. En liste over materialer som følger med i ImmunoPrism Kit er oppført, sammen med delenumrene som det refereres til i produsentens protokoll. Alt annet utstyr og materialer som kreves, er oppført i materialtabellen. Gå til https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ for sikkerhetsdatablad (SDS). Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggstabell 2: Termiske cycler programmer. De anbefalte sykkelprogrammer referert gjennom protokollen er oppsummert for enkel programmering. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggstabell 3: Sekvensering av indeksveiledning. Indeksprimere som følger med i reagenssettet, er oppført. en unik primer legges til hver reaksjon for ettersekvensering av multipleksing. Anbefalte kombinasjoner på lavt nivå er også tilgjengelig. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Protokollen krever 20 ng intakt eller 40 ng svært degradert (FFPE) RNA. RNA-prøven skal være fri for DNA, salter (f.eks. mg2+eller guanidiniumsalter), ulike kationerterte chelaterende midler (f.eks. EDTA, EGTA, citrate) eller organiske stoffer (f.eks. fenol og etanol). Det anbefales ikke å fortsette med RNA-prøver som har en DV200 <20%. Bruk av in-kit kontroll RNA anbefales sterkt som disse kontrollene gir et middel til å evaluere ytelsen gjennom hele protokollen, fra bibliotek forberedelse til analyse.
Protokollen er utformet for å utføres ved hjelp av 0,2 ml PCR-striperør. Hvis den foretrekkes, kan protokollen også utføres ved hjelp av brønnene i en 96-brønns PCR-plate. Bare bruk brønnene til en 96-brønnpcrplate i stedet for alle referanser til PCR-rør eller striperør. Bruk PCR-plater kun med klare brønner, da det er avgjørende å visuelt bekrefte fullstendig resuspensjon av perler under perlerensing og vasketrinn.
Gjennom hele protokollen, hold reagenser frosset eller på is med mindre annet er spesifisert. Ikke bruk reagenser før de er helt tint. Pass på å blande alle reagenser grundig før bruk.
Oppbevar enzymer ved -20 °C til de er klare til bruk og gå tilbake til -20 °C umiddelbart etter bruk. Bruk bare kjernevann av molekylær karakter; det anbefales ikke å bruke DEPC-behandlet vann. Ved pipettering for å blande, forsiktig aspirer og dispenser minst 50% av det totale volumet til løsningene er godt blandet. Pipette blander alle masterblandinger som inneholder enzymer. Bruk av vortex for å blande enzymene kan føre til denaturering og kompromittere ytelsen. Under perlerensing, bruk nylagde 80% etanolløsninger fra molekylær karakter etanol. Bruk av etanolløsninger som ikke er friske, kan føre til lavere utbytter. Unngå over tørking av perlene, da dette kan redusere elutioneffektivitet (perler ser sprukket ut hvis de tørkes).
Som beskrevet i trinn 10, legges unike indeksprimere til hver reaksjon. Basert på sekvensene av disse indeksene, for lavnivå multipleksing, er visse indekskombinasjoner optimale. Sekvensene av disse indeksene er nødvendige for å demultiplexing dataene etter sekvensering. Sekvensene og anbefalte multipleksingkombinasjoner er gitt i tilleggstabell 3. I dette samme trinnet er det viktig å merke seg at antall anbefalte PCR-sykluser varierer avhengig av kvaliteten på RNA som brukes, og noen optimalisering kan være nødvendig for å forhindre PCR overforsterkning. For ImmunoPrism Intakt Control RNA og andre høykvalitets RNA, start optimalisering med 10 PCR sykluser. For ImmunoPrism FFPE Control RNA og andre svært degraderte/FFPE RNA, start optimalisering med 15 PCR sykluser. Å produsere et testbibliotek ved hjelp av RNA-representant for materialet som skal analyseres for å optimalisere PCR-sykluser anbefales. Minimum antall PCR sykluser som konsekvent gir tilstrekkelig pre-capture bibliotek gir (> 200 ng) bør brukes. En sekundær topp rundt 1000 bp på Bioanalyzer-sporet indikerer overforsterkning (figur 4). Overforsterkning bør minimeres, men tilstedeværelsen av en liten sekundær topp vil ikke forstyrre analyseresultatene.
For å minimere prøvetap og unngå å bytte rør, kan trinn 13 utføres i PCR-rør, striperør eller en 96-brønns PCR-plate i stedet for 1,5 ml mikrorør, hvis vakuumkonsentratoren tillater det. Rotoren kan fjernes på mange konsentratorer. Dette gjør at striperørene eller platene får plass i vakuumet. Vakuumkonsentrasjonen kan deretter kjøres ved hjelp av den vandige uttørkingsinnstillingen uten sentrifugering. Se manualen for vakuumkonsentratoren for instruksjoner. Hvis prøvene tørkes ned i striperør eller en 96-brønnplate, kan hybridiseringstrinnet utføres i samme fartøy.
I trinn 17, sørg for å virvle hver 10-12 min for å øke perle fangst effektivitet. Hold forsiktig hettene på de varme striperørene når du blander for å hindre at rørene åpnes.
Vaskene som er beskrevet i trinn 18, er kritiske for å unngå høy uspesifikk kontaminering og må følges nøye. Pass på at du setter perlene helt på nytt ved hver vask, fjern vaskebufferne helt, og under Vask buffer 2-vasken overfører du prøvene til et friskt striperør (trinn 18.6.5). Sørg for at streptavidinperlene er helt suspendert og forblir i suspensjon under hele inkubasjonen. Sprutpå rørhettene vil ikke påvirke fangsten negativt. Under romtemperaturvaskene kan en mikroplatevortexmikser brukes til å virvle prøvene for hele den to minutter lange inkubasjonsperioden for lettere resuspensjon. Ikke la streptavidinperlene tørke ut. Om nødvendig, utvide inkubasjoner i bufferne for å unngå tørking av perlene. Hvis du bruker mer enn ett striperør, arbeid med ett striperør om gangen for hver vask mens de andre striperørene sitter i termocycleren. Dette kan bidra til å unngå tørking av perlene eller rushing, noe som resulterer i dårlig resuspensjon eller andre sub-optimale teknikker. For førstegangsbrukere anbefales det ikke å behandle mer enn 8 bibliotekreaksjoner om gangen.
Nåværende immunprofileringsteknikker leverer et kontinuum av informasjon - fra tusenvis av datapunkter som krever betydelig tolkning (RNA-sekvensering) til et individuelt, diskret datapunkt (single-plex IHC). Protokollen som er beskrevet her representerer en tilnærming som er et sted i midten, med et fokusert omfang som muliggjør høy følsomhet, men fanger bare et delsett av klinisk relevante transkripsjonsdata. På grunn av arten av bulk RNA utvinning, denne protokollen gir ikke informasjon om de romlige relasjoner mellom immunceller og tumor mikromiljøet, men resultatene kan suppleres med bildeteknologi for å legge til denne informasjonen. Det finnes en myriade av applikasjoner for data generert av denne protokollen, da det er mye å lære om kreftbiologi som sykdom, og terapiene som utvikles for å behandle den. Som vist i de representative resultatene, er den enkelte immunrapport nyttig for å forstå hvordan en pasients immunprofil kan endres som svar på hendelser som sykdomsprogresjon eller behandling. Mens resultatene som presenteres her gir noen eksempel brukstilfeller, er andre bruksområder, inkludert å undersøke virkningsmekanismen til en terapi og identifisere putative biomarkører av kliniske resultater som progresjonsfri og total overlevelse, også Praktisk. Når du bruker denne protokollen for biomarkør oppdagelsesapplikasjoner, er det viktig å praktisere god studiedesign for å sikre at homogene populasjoner analyseres, tilstrekkelige prøver er inkludert for statistisk kraft, og kilder til bias vurderes. På grunn av analysens fokuserte, strømlinjeformede natur, er det mulig å forestille seg en vei mot klinisk validering og nedstrøms anvendelse av disse biomarkørene en gang oppdaget.
Disclosures
Alle forfattere er ansatt av Cofactor Genomics, Inc., selskapet som utviklet og produserer ImmunoPrism reagenssett og informatikkverktøy som brukes i denne artikkelen. ImmunoPrism-analysen er kun til forskningsbruk, og er ikke til bruk i diagnostiske prosedyrer.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne TriStar Technology Group for å gi de biologiske prøvene for de representative resultatene, samt hele molekylære, analyse-, produkt- og kommersielle team hos Cofactor Genomics for deres tekniske ekspertise og Støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
- Brambilla, E., et al. Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).
- Iacono, D., et al. Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations. Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).
- Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
- Sierant, M. C., Choi, J. Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools. Genomics Inform. 16, (2018).
- Klauschen, F., et al. Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning. Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).
- Danaher, P., et al. Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).
- Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).
- Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
- Becht, E., et al. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).
- Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. Data normalization considerations for digital tumor dissection. Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).
- Chen, S. H., et al. A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues. BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).
- Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications. 4, 2612 (2013).
- Foley, J. W., et al. Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ. Genome Research. , (2019).
- Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482 (2019).
- PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs. JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).
- Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma. Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).
- Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer. Human Pathology. 69, 110-117 (2017).
- Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).
