Summary
Solid tümör dokularının kantitatif immün profillerini belirlemek ve immün-onkoloji biyomarker keşfi için klinik kohortlardan yararlanmak için RNA tabanlı bir yaklaşımın kullanımı moleküler ve enformatik protokollerle açıklanmıştır.
Abstract
İmmünoterapiler onkoloji hastalarının tedavisinde umut vaat eder, ancak tümör mikroortamının karmaşık heterojenliği tedavi yanıtını öngörmeyi zorlaştırır. Tümör dokusu nda ve çevresinde bulunan bağışıklık hücrelerinin göreceli popülasyonlarını çözme yeteneğinin yanıtı anlamak için klinik olarak uygun olduğu gösterilmiştir, ancak akış sitometrisi ve immünohistokimya gibi geleneksel tekniklerle sınırlıdır ( IHC), gerekli doku büyük miktarda nedeniyle, doğru hücre tipi belirteçleri eksikliği, ve birçok teknik ve lojistik engeller. Bir titreci (örneğin, ImmunoPrism Immune Profiling Tsay) rna hem küçük miktarlarda ve son derece bozulmuş RNA, rna ortak özellikleri klinik olarak arşivlenmiş katı tümör dokusu ndan çıkarılan barındırarak bu zorlukların üstesinden. Teste, Illumina sıralama platformları için uçtan uca nicel, yüksek iş letimatif immün profilleme çözümü sağlayan bir reaktif kiti ve bulut tabanlı bilişim aracılığıyla erişilir. Araştırmacılar formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku veya toplam RNA 20-40 ng (örnek kalitesine bağlı olarak) iki bölüm kadar az ile başlar ve protokol sekiz bağışıklık hücresi tipleri ve on bağışıklık kaçış niceliksel bir bağışıklık profili raporu oluşturur genler, tümör mikroortamının tam bir görünümünü yakalama. Elde edilen verilerden yararlanmak için ek biyoinformatik analiz gerekmez. Uygun örnek kohortlarla protokol, hasta kitlesi içinde istatistiksel olarak anlamlı biyobelirteçleri tanımlamak için de kullanılabilir.
Introduction
Tümör-infiltrasyon lenfositler (TILs) ve formalin-sabit ve parafin gömülü parafin diğer bağışıklık ile ilgili moleküllerin sayısallaştırılması (FFPE) katı tümör insan dokusu örnekleri klinik araştırma değeri göstermiştir1,2,3. Akış sitometrisi ve tek hücreli ribonükleik asit (RNA) dizilimi gibi yaygın teknikler taze doku ve kan4için yararlıdır, ancak canlı hücre süspansiyonları oluşturamamaktan dolayı FFPE malzemelerinin analizi için uygun değildir. FFPE dokusundaki bu hücreleri ölçmek için kullanılan mevcut yöntemler büyük zorluklardan muzdarip. İmmünohistokimya (IHC) ve diğer benzer görüntüleme iş akışları hücre yüzeyi proteinleri tespit etmek için özel antikorlar gerektirir, hangi tekrarlanabilir nicelleştirme sağlamak için laboratuvarlar arasında standartlaştırmak zor olabilir5. nCounter sistemi gibi platformlar, anahtar bağışıklık hücrelerini tanımlamak için tek genlerin ekspresyonuna dayanır6, duyarlılık ve algılama özgüllüğünü sınırlayan. Daha genel RNA sıralama yöntemleri, bağımsız yazılım araçları ile birleştiğinde, mevcuttur ama kullanmadan önce önemli optimizasyon ve doğrulama gerektirir7,8,9,10,11,12. FFPE doku için RNA dizilimi ile lazer yakalama mikrodisseksisi (LCM) birleştirerek son gelişmeler umut göstermiştir; ancak, sağlam biyobelirteçleri13,14tanımlamayı amaçlayan çeviri çalışmaları için daha yüksek işhacmi,anahtar teslimi çözüm gereklidir. Tedavi yanıtlayıcıları, kanser alt tipleri veya yüksek öngörülü doğruluk ve istatistiksel anlamlılıkla sağkalım sonuçlarını tanımlayan Predictive Immune Modeling gibi çok boyutlu biyobelirteçler oluşturma yöntemleri, hassas tıp ve immünoterapi çağında giderek daha önemli hale gelmektedir15,16.
Bu ihtiyacı gidermek için, standart RNA dizilimi reaktifleri ve bulut tabanlı bilişim kullanılarak solid tümör FFPE dokusundaki bağışıklık hücrelerinin hassas ve spesifik olarak ölçülmesini sağlamak için bir immün profil testi geliştirilmiştir. Protokol, FFPE dokusundan bozulmuş RNA'yı karşılamanın yanı sıra, çekirdek iğne biyopsileri, iğne aspireleri ve mikro veya makro-parçalanmış doku gibi sınırlayıcı doku örneklerinden elde edilen RNA'yı da barındırabilir. Her örnekten gelen RNA verileri, bağışıklık hücrelerinin bağışıklık sağlığı ekspresyonu modelleri olarak adlandırılan gen ekspresyonu modellerinin bir veritabanıile karşılaştırılır ve bağışıklık hücrelerini örnekte bulunan toplam hücrelerin yüzdesi olarak ölçer. Kısaca, bu modeller saflaştırılmış bağışıklık hücresi popülasyonlarından üretilen tüm transkriptom verilerinden benzersiz multijenik ifade desenleri tanımlamak için makine öğrenme yöntemleri kullanılarak inşa edilmiştir (kanonik hücre yüzeyi belirteçleri kullanılarak izole)17,18. Teknolojinin altında yatan çok boyutlu Sağlık İfade Modelleri, her bağışıklık hücresinin heterojen karışımda bulunan toplam hücrelerin yüzdesi olarak ölçülmesini sağlar. Bu, araştırmacının klinik değeri19,20olduğu gösterilmiştir inter- ve intra-örnek bağışıklık hücresi karşılaştırmaları oluşturmak için olanak sağlar. Diğer uygulamalar arasında temsili sonuçlarda açıklandığı gibi immün yanıt ın tedavi öncesi ve sonrası niceliği yer almaktadır. Sekiz bağışıklık hücre tipinin mutlak yüzdeleri de dahil olmak üzere tümör ve tümör mikroortamının bağışıklık kondoku larının birden fazla özelliği (gen ekspresyonu modellerinden türetilmiştir): CD4+ T hücreleri, CD8+ T hücreleri, CD56+ Doğal Öldürücü hücreler, CD19+ B hücreleri, CD14+ monositler, Tregs, M1 makrofajlar ve M2 makrofajları. Buna ek olarak, tahmin on bağışıklık kaçış geninin ifadesini (transkriptlerde veya TPM olarak) bildirir: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 ve ARG1.
Reaktif kiti, Şekil 1'degösterildiği gibi, hibrit yakalama tabanlı kütüphane hazırlama yöntemini takiben illumina platformunda sıralamaiçin yüksek kaliteli kütüphaneleri hazır hale getirmek için kullanılır. Bir araştırmacının laboratuvarında Illumina sıralama platformu yoksa, numunelerini sıralama için bir çekirdek laboratuvara gönderebilir. Oluşturulduktan sonra, sıralama verileri otomatik analiz için Prism Portal'a yüklenir ve her bir örnek için, İmmün Raporu(Şekil 2A)şeklinde kapsamlı, nicel bir profil kullanıcıya iade edilir. Kullanıcılar ayrıca Prism Portal'da örnek gruplandırmaları tanımlayarak iki hasta grubunu birbirinden ayıran istatistiksel olarak anlamlı biyobelirteçleri vurgulayan bir Biyomarker Raporu(Şekil 2B)oluşturabilirler. Daha da önemlisi, reaktif kiti tarafından oluşturulan veriler yalnızca araştırma amaçlıdır ve tanılama amacıyla kullanılamaz.
Şekil 1: İş Akışına Genel Bakış. Bu protokolde, RNA ilk cDNA dönüştürülür. Sıralama adaptörleri ligated ve adaptör-ligated cDNA güçlendirilmiş ve pcr tarafından barkodlu bir ön yakalama kitaplığı oluşturmak için. Biyotinylated problar daha sonra streptavidin boncukkullanılarak yakalanan belirli cDNA hedeflerine hibridize edilir. Bağlanmamış, hedefsiz cDNA yıkanarak çıkarılır. Son bir PCR zenginleştirme, sıralamaya hazır bir yakalama sonrası kitaplık sağlar. *Toplam RNA insan örneklerinden olmalıdır; bozulmamış veya bozulmuş (FFPE) RNA olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili Bağışıklık Raporları. İş akışı iki rapor, işlenen her örnek için ayrı bir bağışıklık raporu(A)ve tanımlanmış hasta kohortları için bir biyomarker raporu(B)oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protokol yaklaşık 16 saat hazırlık süresi gerektirir (toplam RNA'dan sıralamaya hazır kütüphanelere kadar); ancak, protokolde belirtildiği gibi, isteğe bağlı durdurma noktaları vardır. Test, transkriptomiklerin zengin, dinamik doğasını kullanarak eski tek analitik biyobelirteçlerin ötesine geçerek çok boyutlu gen ekspresyonu modellerine yönelerek doku örneklerinin standartlaştırılmış olarak kapsamlı biyolojik karakterizasyonunu sağlar. reaktifler ve kullanımı kolay yazılım araçları. Araştırmacıların, değerli klinik örneklerin daha doğru, nicel bağışıklık profillerini elde etmek ve keşfetmek için makine öğreniminden ve Sağlık İfade Modelleri veritabanından yararlanarak kendi laboratuvarlarında çağdaş bir teknolojiyi kullanmalarını sağlar. tam istatistiksel analiz ile çok boyutlu RNA biyobelirteçleri.
Protocol
Burada gösterilen Temsili Sonuçlarda kullanılan insan doku örnekleri saygın bir kuruluştan (TriStar Teknoloji Grubu) satın alınmış ve akademik ve ticari araştırmalara izin veren donör onayı ve yetkili bir etik Komitesi.
Bölüm I: Kitaplık Hazırlama yı önceden yakalama
1. RNA Nicelik ve Yeterlilik
- RNA'yı, töze uygun girişi belirlemek için florometrik bir töz kullanarak ölçün. RNA Bütünlük Numarası (RIN) ve parçaların yüzdesini belirlemek için elektroforez kullanarak giriş RNA kalitesini ve parçaların yüzdesini değerlendirmek >200 nükleotit (DV200) değerleri.
- Sağlam (RIN > 7) veya kısmen bozulmuş RNA örnekleri (RIN = 2 -7) için, Adım 2.1'den başlayarak yüksek kalite/bozulmamış RNA için kitaplık hazırlama adımlarını izleyin. RNA kalitesi Termal Cycler Programı #1 doğru parçalanma süresi seçmek için önemlidir (Ek Tablo 2).
- Yüksek derece bozulmuş numuneler için (örneğin, RIN = 1 - 2 veya FFPE), DV200 değerini belirleyin. Bu örnekler parçalanma gerektirmez ve Adım 2.2 ile başlayarak bozulmuş RNA yönergelerini izler.
- 20 ng RNA (RIN > 2 ile Yüksek Kaliteli/Bozulmamış RNA) veya 40 ng RNA (DV200 > 20%) ile Bozulmuş/FFPE RNA seyrelterek her numune için uygun miktarda toplam RNA hazırlayın nükleaz içermeyen suda 5 μL'ye kadar. DV200 < %20 ile işlenmesi tavsiye edilmez. Kitile sağlanan kontrol RNA örnekleri için, 4 μL'lik nükleaz içermeyen suda uygun RNA'nın 1 μL'sini seyreltin. Kontrol örnekleri, etiketlenmiş olarak Yüksek Kaliteli (Bozulmamış) veya Bozulmuş (FFPE) RNA malzemeleri için açıklandığı işlemi takip edecektir. Kitte dahil olan tüm reaktifler için Ek Tablo 1'e bakınız.
2. RNA Parçalanma ve Astarlama
- RIN > 2 ile Yüksek Kaliteli/Bozulmamış RNA için Adım 2.1.1'i izleyin.
- Yüksek kaliteli RNA için, tablo 1'egöre çekirdeksiz bir PCR tüpünde buz üzerinde parçalanma ve astar reaksiyonu bir araya getirin.
- Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın. Sonra, kısaca bir mikrosantrifüj örnekleri aşağı spin
NOT: Protokoldeki tüm santrifüj dönüşler için en az 3 s için ≥ 1.000 x g hız önerilir. - Numuneleri termal bir döngüye yerleştirin ve Program #1 kullanın (Ek Tablo 2).
- Tüpleri hemen buza aktarın ve Yüksek Kaliteli RNA için First Strand cDNA Sentezine geçin (Adım 3.1). Hem Yüksek Kalite hem de FFPE RNA'nın eşzamanlı hazırlanması için, Parçalanma Kuluçka Sırasında FFPE RNA'nın (Adım 2.2) hazırlanmasına başlayın.
- Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın. Sonra, kısaca bir mikrosantrifüj örnekleri aşağı spin
- Yüksek kaliteli RNA için, tablo 1'egöre çekirdeksiz bir PCR tüpünde buz üzerinde parçalanma ve astar reaksiyonu bir araya getirin.
| Parçalanma ve AstarLama Karışımı | Hacim (3L) |
| Bozulmamış veya kısmen bozulmuş RNA (20 ng) | 5 |
| İlk İplik Sentezreaksiyonu Tampon | 4 |
| Rastgele Astarlar | 1 |
| Toplam Hacim | 10 |
Tablo 1: Yüksek kaliteli RNA için parçalanma ve astar reaksiyonu. Yüksek kaliteli RNA için parçalanma ve astar reaksiyonbileşenleri monte edilmeli ve gösterilen hacimlere göre buz üzerinde karıştırılmalıdır. İlk İplik Sentezi Reaksiyon Buffer ve Random Astarlar bir ana karışımı yapılabilir ve RNA örneklerine eklenebilir.
- DV 200 >%20 ile Bozulmuş/FFPE RNA için Adım 2.2.1'i izleyin.
- Parçalanma gerektirmeyen yüksek oranda bozulmuş (FFPE) RNA için Tablo 2'deaçıklandığı gibi astar reaksiyonunu birleştirin. Sağlam RNA için Adım 2.1'i izlemeyi unutmayın.
- Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın. Sonra, kısaca bir mikrosantrifüj içinde örnekleri aşağı spin.
- Numuneleri termal bir döngüye yerleştirin ve program #2 kullanın (Ek Tablo 2).
- Tüpleri buza aktarın ve Yüksek Oranda Bozulmuş (FFPE) RNA (Step 3.2) için First Strand cDNA Sentezine geçin.
- Parçalanma gerektirmeyen yüksek oranda bozulmuş (FFPE) RNA için Tablo 2'deaçıklandığı gibi astar reaksiyonunu birleştirin. Sağlam RNA için Adım 2.1'i izlemeyi unutmayın.
| Astar Reaksiyonu | Hacim (3L) |
| FFPE RNA (40 ng) | 5 |
| Rastgele Astarlar | 1 |
| Toplam Hacim | 6 |
Tablo 2: Yüksek oranda bozulmuş RNA için rastgele astarlama reaksiyonu. Yüksek oranda bozulmuş RNA için astar reaksiyonunun bileşenleri nükleaz içermeyen bir PCR tüpünde buz üzerinde monte edilmelidir.
3. İlk İplik cDNA Sentezi
- RIN > 2 ile Yüksek Kaliteli/Bozulmamış RNA için Adım 3.1.1'i izleyin.
- Bozulmamış RNA (yüksek kaliteli) için, Tablo 3'egöre nükleaz içermeyen PCR tüpünde buz üzerinde Birinci İplik Sentezreaksiyonu biraraya getirin.
- Buz üzerinde reaksiyonlar tutulması, iyice yukarı ve aşağı birkaç kez pipetleme tarafından karıştırın. Kısaca bir mikrosantrifüj örnekleri aşağı spin ve doğrudan İlk iplikçik sentezi kuluçka (Adım 4) devam edin.
- Bozulmamış RNA (yüksek kaliteli) için, Tablo 3'egöre nükleaz içermeyen PCR tüpünde buz üzerinde Birinci İplik Sentezreaksiyonu biraraya getirin.
| İlk İplik Sentezi | Hacim (3L) |
| Parçalanmış ve Astarlanmış RNA (Adım 2.1.3) | 10 |
| İlk İplik Sentezi Özgüllük Reaktifi | 8 |
| İlk İplik Sentezi Enzim Karışımı | 2 |
| Toplam Hacim | 20 |
Tablo 3: Yüksek kaliteli RNA için ilk iplikçik sentezreaksiyonu. Yüksek kaliteli RNA için parçalanma ve astar reaksiyonbileşenleri monte edilmeli ve verilen hacimlere göre buz üzerinde karıştırılmalıdır. İlk İplik Sentezi Özgüllük Reaktifi ve İlk İplik Sentezi Enzim Karışımının ana karışımı, parçalanmış ve astarlanmış RNA örneklerine eklenebilir.
- DV 200 >%20 ile Bozulmuş/FFPE RNA için Adım 3.2.1'i izleyin.
- Yüksek derece bozulmuş RNA (FFPE) için, Tablo 4'egöre çekirdeksiz BIR PCR tüpünde buz üzerinde Birinci İplik Sentezreaksiyonu biraraya getirin.
- Buz üzerinde reaksiyonlar tutulması, iyice yukarı ve aşağı birkaç kez pipetleme tarafından karıştırın. Kısaca bir mikrosantrifüj örnekleri aşağı spin ve doğrudan İlk iplikçik sentezi kuluçka (Adım 4) devam edin.
- Yüksek derece bozulmuş RNA (FFPE) için, Tablo 4'egöre çekirdeksiz BIR PCR tüpünde buz üzerinde Birinci İplik Sentezreaksiyonu biraraya getirin.
| İlk İplik Sentezi | Hacim (3L) |
| Astarlı RNA (Adım 2.2.3) | 6 |
| İlk İplik Sentezreaksiyonu Tampon | 4 |
| İlk İplik Özgüllük Reaktifi | 8 |
| İlk İplik Sentezi Enzim Karışımı | 2 |
| Toplam Hacim | 20 |
Tablo 4: Yüksek oranda bozulmuş RNA için ilk iplikçik sentezreaksiyonu. Son derece bozulmuş RNA için parçalanma ve astar reaksiyonbileşenleri monte edilmeli ve gösterilen hacimlere göre buz üzerinde karıştırılmalıdır. First Strand Synthesis Reaksiyon Tampon, İlk İplik Sentezi Özgüllük Reaktifi ve İlk İplik Sentezi Enzim Karışımının ana karışımı yapılabilir ve astarlanmış RNA örneklerine eklenebilir.
4. İlk İplik Sentezi Kuluçka
- Buz tüpleri tutulması, iyice yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın. Kısaca bir mikrosantrifüj içinde örnekleri aşağı spin. Örnekleri Program #3'den sonra önceden ısıtılmış termal döngücüde kuluçkaya yatırın(Ek Tablo 2).
5. İkinci İplik cDNA Sentezi
- Adım 4.1'deki ilk iplikreaksiyon ürünü de dahil olmak üzere Tablo 5'telistelenen bileşenleri birleştirerek buz üzerinde ikinci iplikçik cDNA sentez reaksiyonu hazırlayın.
| İkinci İplik Sentez reaksiyonu | Hacim (3L) |
| İlk İplik Sentezi Ürünü (Adım 4.1) | 20 |
| İkinci İplik Sentezreaksiyonu Tampon | 8 |
| İkinci İplik Sentezi Enzim Karışımı | 4 |
| Nükleazsız Su | 48 |
| Toplam Hacim | 80 |
Tablo 5: İkinci İplik Sentezi reaksiyonu. İkinci iplikçik cDNA sentez reaksiyonunun bileşenleri, gösterilen hacimlere göre biraraya getirilmeli ve buz üzerinde karıştırılmalıdır. İkinci İplik Sentezi Reaksiyon Buffer, İkinci İplik Sentezi Enzim Karışımı ve Nükleaz içermeyen Su ana karışımı yapılabilir ve Birinci İplik Sentezi Ürün eklenebilir.
- Buz tüpleri tutulması, iyice yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın. Program #4 aşağıdaki bir termal döngüiçinde kuluçka (Ek Tablo 2).
6. CDNA Temizleme SPRI kullanarak (Katı Faz Geri Dönüşümlü Immobilizasyon) Boncuklar
- SPRI Boncuklar kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığına ısınmak için izin, ve daha sonra girdap SPRI Boncuklar yaklaşık 30 s askıya almak için.
- İkinci iplikçik sentez reaksiyonuna (~80 μL) 144 μL resuspended boncuk ekleyin. En az 10 kez yukarı ve aşağı boru lar karıştırArak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kısaca bir mikrocentrifuge tüpleri spin ve supernatant boncuk ayırmak için bir manyetik raf tüpleri yerleştirin. Çözelti netleştikten sonra, dikkatlice çıkarın ve supernatant atın. DNA içeren boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Manyetik raf üzerinde tüplere 180 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 s oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra dikkatle kaldırmak ve supernatant atın.
- Toplam 2 yıkama adımı için Adım 6.4'ü bir kez tekrarlayın.
- Tamamen artık etanol kaldırın. Tüpleri manyetik rafta bırakın ve hava, kapakları açık veya gözle görülür bir şekilde kuruyana kadar yaklaşık 3 dakika boyunca boncukları kurutun. Bu DNA'nın daha düşük kurtarma neden olabilir gibi, boncuklar üzerinde kuru etmeyin.
- Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve boncuklara 53°L 0.1x TE Tampon ekleyin (reaktif kitine bakınız, Ek Tablo 1'e bakınız). Pipet yukarı ve aşağı en az 10 kez iyice karıştırmak için. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka.
- Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar. Nükleaz içermeyen PCR tüplerini temizlemek için süpernatantın 50 μL'sini aktarın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat et. Bu protokolde isteğe bağlı bir durma noktasıdır, cDNA örnekleri -20 °C'de saklanabilir.
7. CDNA Kütüphanesinin Onarımı
- Tablo 6'da listelenen bileşenleri Adım 6.8'den ikinci iplik sentezi ürününe monte ederek buz üzerinde son onarım reaksiyonu biraraya getirin.
| Son Onarım Reaksiyonu | Hacim (3L) |
| İkinci İplik Sentezi Ürünü (Adım 6.8) | 50 |
| Onarım Sonu Reaksiyon Arabelleği | 7 |
| Son Onarım Enzim Karışımı | 3 |
| Toplam Hacim | 60 |
Tablo 6: Onarım ı sona erdirme reaksiyonu. Son onarım reaksiyonunun bileşenleri, gösterilen hacimlere göre monte edilmeli ve buz üzerine karıştırılmalıdır. End Repair Reaksiyon Tampon ve Son Onarım Enzim Karışımı bir ana karışımı yapılabilir ve İkinci Strand Sentez Ürün eklenebilir.
- Bir pipeti 50°L'ye ayarlayın ve ardından tüm hacmi en az 10 kez yukarı ve aşağı doğru iyice karıştırmak için pipetleyin. Kısaca tüplerin yanlarından tüm sıvı toplamak için santrifüj. İyi karıştırmak önemlidir. Küçük miktarda kabarcıkların varlığı performansı engellemez.
- #5 Programı 'ndan sonra numuneleri termal döngücüde kuluçkaya yatırın (Ek Tablo 2).
8. Adaptör Ligasyonu
- Ligasyon reaksiyonu ayarlamadan önce, Adaptörü Tablo 7'degösterildiği gibi buz gibi adaptör seyreltme , gerekli numune sayısı ile çarparak, artı% 10 ekstra. Seyreltilmiş adaptörü buzüzerinde tutun.
| Ligasyon Seyreltme | Hacim (3L) |
| Adaptör | 0.5 |
| Adaptör Seyreltme Tampon | 2 |
| Toplam Hacim | 2.5 |
Tablo 7: Adaptör Seyreltme. Adaptör gösterilen hacimlere göre adaptör seyreltme tamponu ile buz üzerinde seyreltilmelidir.
- Tablo 8'deaçıklanan bileşenleri listelenen sıraya ekleyerek buz üzerindeki ligasyon reaksiyonunu Adım 7.3'ten son hazırlık reaksiyon ürününe birleştirin. Ligation Master Mix ve Ligation Enhancer önceden karıştırılabilir unutmayın. Bu karışım 4 °C'de en az 8 saat stabildir. Adaptör Ligasyon Adımı'nda kullanılmadan önce Ligasyon Master Mix, Ligasyon Arttırıcı ve Adaptörü önceden karıştırmayın.
| Ligasyon Reaksiyonu | Hacim (3L) |
| Son Prepped DNA (Adım 7.3) | 60 |
| Seyreltilmiş Adaptör (Adım 8.1) | 2.5 |
| Ligasyon Arttırıcı | 1 |
| Ligasyon Master Mix | 30 |
| Toplam Hacim | 93.5 |
Tablo 8: Ligasyon reaksiyonu. Adaptör ligasyon reaksiyonunun bileşenleri gösterilen sıraya göre buz üzerinde monte edilmelidir. Ligasyon Arttırıcı ve Ligasyon Master Mix bir ana karışımı yapılabilir ve Seyreltilmiş Adaptör ile Son Prepped DNA eklenebilir. Seyreltilmiş Adaptörü ve Ligasyon Master Mix veya Ligation Arttırıcı'yı End Prepped DNA ile karıştırmadan önce karıştırmayın.
- Bir pipeti 80°L'ye ayarlayın ve ardından tüm hacmi en az 10 kez yukarı ve aşağı doğru iyice karıştırmak için pipetleyin. Tüplerin yanlarından tüm sıvı toplamak için hızlı bir spin gerçekleştirin. Ligation Master Mix çok viskoz olduğunu. Tamamlanmamış karıştırma ligasyon verimliliğinin azalmasına neden olacağından, ligasyon reaksiyonunun yeterli şekilde karıştırılmasını sağlamaya özen inin. Küçük miktarda kabarcıkların varlığı performansı engellemez.
- Program #6 takip eden inkübat (Ek Tablo 2), ve sonra termal döngüceden ligasyon karışımını çıkarın ve adaptör işleme enziminin 3 μL'sini ekleyerek toplam 96,5 μL hacim elde edin.
- Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez iyi karıştırmak için, ve daha sonra Ligasyon Reaksiyon uarındırma hemen geçmeden önce Program #7(Ek Tablo 2)aşağıdaki kuluçka.
9. SPRI Neads kullanarak Ligasyon Reaksiyonu Arıtma
- SPRI Boncuklar kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığına ısınmak için izin, ve daha sonra yaklaşık 30 s suspend için girdap SPRI Boncuklar.
- 87 μL'lik resuspended SPRI Boncukekleyin ve en az 10 kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
- Kısaca bir mikrocentrifuge tüpleri spin ve supernatant boncuk ayırmak için bir manyetik raf tüpleri yerleştirin. Çözelti netleştikten sonra (~5 dk), supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları atmayın.
- Manyetik raf üzerinde tüplere 180 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 s oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra dikkatle kaldırmak ve supernatant atın. Toplam 2 yıkama adımı için Adım 9.4'ü bir kez tekrarlayın.
- Tamamen artık etanol kaldırın. Tüpleri manyetik rafta bırakın ve hava, kapakları açık veya gözle görülür bir şekilde kuruyana kadar yaklaşık 3 dakika boyunca boncukları kurutun. Bu DNA'nın daha düşük kurtarma neden olabilir gibi, boncuklar üzerinde kuru etmeyin.
- Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve boncuklara 0,1x TE tamponunun 17 0L'sini ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı en az 10 kez iyice karıştırmak için. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka, ve sonra boncuk tamamen supernatant ayrı izin, bir manyetik raf üzerine tüpler yerleştirin.
- Nükleaz içermeyen PCR tüplerini temizlemek için süpernatantın 15 0L'sini aktarın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat et. Bu protokolde isteğe bağlı bir durdurma noktasıdır, Adaptör-ligated DNA -20 °C'de saklanabilir.
10. Adaptör Ligatlı DNA PCR Zenginleştirme
- Tablo 9'daaçıklandığı gibi PCR reaksiyonu ayarlayın. Pre-Capture PCR Master Mix ve Universal Primer içeren bir Master Mix yapılabilir ve Adaptör ligated DNA eklenebilir. Çok katlı sıralama için, her reaksiyon için benzersiz dizin astarları kullanın ve her örneğe ayrı ayrı ekleyin.
| PCR Zenginleştirme | Hacim (3L) |
| Adaptör ligated DNA (Adım 10.1) | 15 |
| Ön Yakalama PCR Master Mix | 25 |
| Evrensel PCR Astar | 5 |
| Dizin (X) Astarı | 5 |
| Toplam Hacim | 50 |
Tablo 9: Adaptörün PCR zenginleştirme siDNA'sı. Adaptör ligated DNA reaksiyonunun PCR zenginleştirme bileşenleri biraraya getirilmeli ve gösterilen hacimlere göre buz üzerinde karıştırılmalıdır. Pre-Capture PCR Master Mix ve Universal PCR Primer'ın ana karışımı yapılabilir ve adaptöre bağlanabilir DNA'ya eklenebilir. Çok katlı sıralama için, her örnek benzersiz bir Index Primer verilmelidir.
- 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Kısaca bir mikrocentrifuge tüpleri spin ve bir termal döngüiçinde yer ve Program #8 kullanarak PCR amplifikasyon gerçekleştirmek (Ek Tablo 2).
11. SPRI Boncuklar Kullanarak PCR Reaksiyonunun Saflaştırılması
- SPRI Boncuklar kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığına ısınmak için izin, ve daha sonra yaklaşık 30 s suspend için girdap SPRI Boncuklar.
- Her PCR reaksiyonuna 45 μL yeniden askıda boncuk ekleyin (~50 μL). Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırmadan önce en az 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın.
- Kısaca bir mikrocentrifuge tüpleri spin ve supernatant boncuk ayırmak için bir manyetik raf tüpleri yerleştirin. Çözelti netleştikten sonra (~5 dk), supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın. DNA içeren boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Manyetik rafta tüplere 180 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 s oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra dikkatle kaldırmak ve supernatant atın. Toplam 2 yıkama adımı için Adım 11.4'ü bir kez tekrarlayın.
- Tamamen artık etanol kaldırın. Tüpleri manyetik rafta bırakın ve hava, kapakları açık veya gözle görülür bir şekilde kuruyana kadar yaklaşık 3 dakika boyunca boncukları kurutun. Bu DNA'nın daha düşük kurtarma neden olabilir gibi, boncuklar üzerinde kuru etmeyin.
- Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve boncuklara 23°L 0.1x TE Tampon ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı en az 10 kez iyice karıştırmak için. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka.
- Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar. Nükleaz içermeyen PCR tüplerini temizlemek için süpernatantın 20 0L'lik kısmını aktarın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat et. Bu protokolde isteğe bağlı bir durdurma noktasıdır, Ön Yakalama Kütüphaneleri -20 °C'de saklanabilir.
12. Yakalama Öncesi Kitaplığı Doğrula ve Ölçün
- Florometre ve yüksek hassasiyetli bir amortisör kiti kullanarak yakalama öncesi kitaplığın konsantrasyonunu ölçün. Bölüm II: Hybridization ve Capture'e geçmek için en az 200 ng verim gereklidir.
- Dijital elektroforez sisteminde 1 μL kitaplık çalıştırın. Gerekirse, üreticinin protokol önerilerine göre, Yüksek HassasiyetLi Fiş aşırı yüklenmesiönlemek için numuneseyreltin.
- Elektroperogramın yaklaşık 250-400 bp'lik bir tepe boyutunda dar bir dağılım gösterdiğini kontrol edin (Bkz. Temsil sonuçları, Şekil 3 ve Şekil 4).
- Bioanalyzer izlerinde 128 bp tepe noktası (adaptör-dimer) görülebiliyorsa ve sinyalin yoğunluğu ≥ 250-400 bp kütüphane sinyalinin yoğunluğuysa (Bkz.Temsili Sonuçlar, Şekil 5), ve örnek hacmi (11.7'den 50 μL'ye) 0,1x TE Tampon ile getirir ve SPRI Boncuk arınmasını tekrarlayın (Adım 11). Bu protokolde isteğe bağlı bir durdurma noktasıdır, Ön yakalama kütüphaneleri Bölüm II geçmeden önce -20 °C'de saklanabilir: İmmünPrizma Hibridizasyon ve Yakalama.
Bölüm II: Hibridizasyon ve Yakalama
13. Blokaj Oligos, Cot-1 DNA, Ön yakalama Kütüphane DNA ve Kuru birleştirin
- Adım 11'de hazırlanan ve Adım 12'de ölçülen barkodlu kütüphaneyi, Tablo 10'dagösterildiği gibi, çekirdeksiz PCR tüpünde veya 1,5 mL mikrotüpte Cot-1 DNA'sı ve Blokaj Oligoları ile karıştırın.
| Reaktif | Miktar/Hacim |
| Adım 10.10 barkodlu kütüphane | 200 ng |
| Karyola-1 DNA | 2 μg |
| Oligoların Engellenmesi | 2 μL |
Tablo 10: Hibridizasyon Hazırlığı ve kurutulma. Melezleme hazırlıklarında kütüphanelerin kurutulması için birleşim edilecek bileşenler, gösterilen miktarlara göre monte edilmelidir.
- 30-45 °C'ye ayarlanmış bir vakum konsantratörü kullanarak tüpün içeriğini kurutun. Bu, protokoldeki isteğe bağlı bir durdurma noktasıdır. Kurutmadan sonra tüpler gece boyunca oda sıcaklığında (15-25 °C) veya -20 °C'de daha uzun süre saklanabilir.
14. KÜTÜPHANE İlE DNA Yakalama Problarını Melezleştirin
- Çözülme 2x Boncuk Yıkama Tampon ve Hibridizasyon Tampon, Hibridizasyon Tampon Arttırıcı, İmmünPrizma Prob Paneli, 10x Yıkama Tampon 1, 10x Yıkama Tampon 2, 10x Yıkama Tampon 3, ve oda sıcaklığında 10x Sıkı Yıkama Tampon. Kullanmadan önce, tuzların kristalizasyonu için Hibridizasyon Tamponu'nu inceleyin. Kristaller varsa, tampon tamamen çözünene kadar tüpü 65 °C'de aralıklı olarak titreyerek ısıtın.
- Oda sıcaklığında, bir tüp hibridizasyon Master Mix oluşturun. Tablo 11'densonra hacimleri örnek sayısına göre çarpın ve %10 ekstra ekleyin.
| Hibridizasyon Master Mix | Hacim (3L) |
| Hibritleştirme Arabelleği | 8.5 |
| Hibridizasyon Tampon Arttırıcı | 2.7 |
| İmmünoPrizma Prob Paneli | 5 |
| Nükleazsız Su | 0.8 |
| Toplam Hacim | 17 |
Tablo 11: Hibridizasyon Master Mix. Hybridization Master Mix bileşenleri, gösterilen hacimlere göre oda sıcaklığında monte edilmeli ve karıştırılmalıdır.
- Girdap veya pipet yukarı ve aşağı iyi karıştırmak için. Daha sonra, kurutulmuş DNA içeren her tüpe 17 μL Hybridization Master Mix ekleyin. Tüpleri kapatın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Girdap örnekleri, tamamen karışık olduğundan emin olmak, ve bir mikrosantrifüj kısa bir süre aşağı örnekleri spin. Varsa, her numuneyi 1,5 mL'lik bir mikrotüpten nükleaz içermeyen pcr tüpüne aktarın.
- Örnekleri termal bir döngüye yerleştirin ve Program #9 çalıştırın(Ek Tablo 2).
- Kuluçka sırasında, yıkama tamponları (Adım 15) ve streptavidin boncuk (Adım 16), tamponlar ön ısıtma kıvranmak ve streptavidin boncukları dengelemek için yeterli zaman sağlayan hazırlamak.
15. Yıkama Tamponları Hazırlayın
NOT: Yıkama tamponları 2x (Boncuk Yıkama Tamponu) veya 10x (diğer tüm yıkama tamponları) konsantre çözeltiler olarak verilir.
- Hibritleştirme kuluçka sırasında, 2x Boncuk Yıkama Tamponu ve 10x Yıkama Tamponları seyreltmek için 1x çalışma çözümleri oluşturmak için, gerekli sayıda örnek ile çarparak ve% 10 ekstra ekleyerek, Tablo 12aşağıdaki . 10x Yıkama Tampon uçağı 1' de yse, şişeyi 65 ° C' lik bir su banyosu veya Isıtma bloğu yla Isıtlayıp partikülleri yeniden sıcaklık. Dondurulmuş 1x Yıkama Tamponlar çözüldükten sonra karıştırılmalıdır.
| Buffers Yıkayın | Konsantre Tampon (3L) | Nükleaziçermeyen su (3L) | Toplam (3L) |
| Boncuk Yıkama Tampon | 150 | 150 | 300 |
| Yıkama Tamponu 1 | 25 | 225 | 250 |
| Yıkama Tampon u 2 | 15 | 135 | 150 |
| Yıkama Tampon 3 | 15 | 135 | 150 |
| Sıkı Yıkama Tamponu | 30 | 270 | 300 |
Tablo 12: Arabellek Seyreltme yıkayın. Konsantrasyon yıkama tamponları, gösterilen hacimlere göre oda sıcaklığında çekirdeksiz su ile seyreltilmelidir.
- Aliquot 1x Yıkama Tamponları nükleaz içermeyen PCR tüpleriçine ve Tablo 13'tebelirtildiği gibi uygun sıcaklıklarda yerleştirin. Pipetleme için yeterli fazlalık içerdiğinden emin olun. Isıtmalı tamponlar için, kapak 70 °C'ye ayarlanmış 65 °C'ye ayarlanmış bir termal çevrimleyici kullanın.
| Buffers Yıkayın | Tutma Sıcaklığı | Hacim/Tüp (3L) | Tüp/Örnek Sayısı |
| Boncuk Yıkama Tampon | RT (15-25 °C) | 100 | 3 |
| Yıkama Tamponu 1 | 65 °C | 100 | 1 |
| Yıkama Tamponu 1 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Yıkama Tampon u 2 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Yıkama Tampon 3 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Sıkı Yıkama Tamponu | 65 °C | 150 | 2 |
Tablo 13: Seyreltilmiş Yıkama Tamponları. Seyreltilmiş yıkama tamponları, gösterilen numune başına hacimve tüp sayısına göre ayrı tüpler halinde aliquotalyapılmalıdır. Yıkama tamponları kullanılmadan önce belirtilen sıcaklıkta tutulmalıdır.
- Boncuk Resuspension Mix'i Tablo 14'tegösterildiği gibi oda sıcaklığında hazırlayın, gerekli numune sayısıyla çarpın ve %10 ekstra ekleyerek.
| Boncuk Resuspension Mix | Hacim (3L) |
| Hibritleştirme Arabelleği | 8.5 |
| Hibridizasyon Tampon Arttırıcı | 2.7 |
| Nükleazsız Su | 5.8 |
| Toplam Hacim | 17 |
Tablo 14: Boncuk Resuspension Mix. Boncuk Resuspension Mix bileşenleri, gösterilen hacimlere göre oda sıcaklığında monte edilmeli ve karıştırılmalıdır.
16. Streptavidin Boncukları Hazırlayın
- Streptavidin boncuklarını kullanmadan önce en az 30 dk oda sıcaklığında dengeleyin. 15 s ve aliquot 50 μL'lik yakalama başına boncukları çekirdeksiz bir PCR tüpüne girdaplayarak boncukları iyice karıştırın.
- Her tüpe 100°L 1x Boncuk Yıkama Tamponu (Adım 15.1'de hazırlanır) ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar.
- Temiz supernatant'ı çıkarın ve atın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat et.
- Aşağıdaki yıkama yıkayın.
- Manyetik raftan çıkarın. Boncuk içeren her tüpe 100°L 1x Boncuk Yıkama Tamponu ekleyin ve sonra pipeti karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı ekleyin.
- Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar.
- Temiz supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın.
- Toplam iki yıkama için Adım 16.4'ü bir kez tekrarlayın.
- Manyetik raftan çıkarın. Her tüpe Adım 15.3'ten 17 μL Boncuk Resuspension Mix ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için birkaç kez. Boncukların tüplerin kenarlarına yapışmadığından emin olun. Gerekirse, kısaca alt boncuk toplamak için tüpler spin.
17. Streptavidin Boncuklar Için Bind Hibrid Hedef
- 4 saatlik Hibridizasyon kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, termal döngücüden numuneleri çıkarın ve ısıl ısıtılan kapak 70 °C'ye ayarlanmış 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, 17 μL'lik tam homojenize boncukları numunelere aktarın. 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın.
- #10 Programı 'ndan sonra tüpleri termal döngüye yerleştirerek DNA'yı boncuklara bağlayın(Ek Tablo 2). Kuluçka sırasında, kısaca şerit tüpleri her 10-12 dk ve hafifçe girdap kaldırmak 3 s boncuk süspansiyon kalmasını sağlamak için. Alternatif olarak, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Hemen Wash Streptavidin Boncuk (Adım 18) devam edin.
18. Yıkama Streptavidin Boncuklar Sınırsız DNA kaldırmak için
- Adım 15.2'deki 1x Yıkama Tamponlarını kullanın ve yıkama sırasında ısıl da ısıtıcı tamponları termal döngüde saklayın.
- Adım 17.3'ten tüplere önceden ısıtılmış 1x Yıkama Tampon1 ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar.
- Pipet ve sınırsız DNA içeren supernatant atın. Manyetik raftan çıkarın.
- Aşağıdaki 65 °C yıkamayı gerçekleştirin.
- Önceden ısıtılmış 150 μL 1x Sıkı Yıkama Tamponu ekleyin.
- En az 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Pipetleme sırasında kabarcıklar kaçının. Boncukların tüm tüplerde tamamen askıya alındıklarından emin olun.
- 5 dakika boyunca 65 °C'de termal döngüde kuluçka.
- Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar. Pipet ve sınırsız DNA içeren supernatant atın. Manyetik raftan çıkarın.
- Toplam iki Sıkı Yıkama için Adım 18.4'ü yineleyin.
- İlk oda sıcaklığında yıkama gerçekleştirin.
- Oda sıcaklığında 150 μL ekleyin 1x Yıkama Tampon 1.
- Pipet yukarı ve aşağı 10-20 kez tamamen boncuklar yeniden askıya almak için.
- Tüpleri kapatın ve 2 dakika kuluçka, yavaşça 30 s girdap ve 30 saniye dinlenme arasında dönüşümlü. Tüm kuyularda boncuk tamamen tüm kuluçka boyunca tüm tüplerde resuspended kalır emin olun.
- Kısaca tüpleri santrifüj.
- Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar. Pipet ve supernatant atın.
- Mühür tüpler ve kısaca santrifüj. Manyetik rafa dönün ve kalan yıkama tamponlarını çıkarmak için 10 l'lik bir pipet kullanın.
- İkinci oda sıcaklığında yıkama gerçekleştirin.
- Oda sıcaklığında 150 μL ekleyin 1x Yıkama Tampon 2.
- Pipet yukarı ve aşağı 10-20 kez tamamen boncuklar yeniden askıya almak için.
- Tüpleri kapatın ve 2 dakika kuluçka, yavaşça 30 s girdap ve 30 saniye dinlenme arasında dönüşümlü. Tüm kuyularda boncuk tamamen tüm kuluçka boyunca tüm tüplerde resuspended kalır emin olun.
- Kısaca tüpleri santrifüj.
- Çamaşır Arabelleği 2'de yeniden askıya alınan boncukların tüm hacmini çekirdeksiz PCR tüplerini temizlemek için aktarın. Önemli: Boncukların yeni tüplere aktarılması hedef dışı kontaminasyonu önlemek için önemlidir.
- Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar. Pipet ve supernatant atın.
- Mühür tüpler ve kısaca santrifüj. Manyetik rafa dönün ve kalan yıkama tamponlarını çıkarmak için 10 l'lik bir pipet kullanın.
- Üçüncü oda sıcaklığında yıkama gerçekleştirin.
- Oda sıcaklığında 150 μL ekleyin 1x Yıkama Tampon 3.
- Pipet yukarı ve aşağı 10-20 kez tamamen boncuklar yeniden askıya almak için.
- Tüpleri kapatın ve 2 dakika kuluçka, yavaşça 30 s girdap ve 30 saniye dinlenme arasında dönüşümlü. Tüm kuyularda boncuk tamamen tüm kuluçka boyunca tüm tüplerde resuspended kalır emin olun.
- Kısaca tüpleri santrifüj.
- Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların süpernatanttan tamamen ayrılmasını sağlar. Pipet ve supernatant atın.
- Mühür tüpler ve kısaca santrifüj. Manyetik rafa dönün ve kalan yıkama tamponlarını çıkarmak için 10 μL'lik bir pipet kullanın.
- Manyetik raftan çıkarın ve boncuklara 20°L çekirdeksiz su ekleyin.
- Pipet, tüplerin yan tarafına yapışmış boncukların askıya alınmasını sağlamak için 10 kez yukarı ve aşağı.
- Önemli: Boncukları atmayın. Adım 19'da yakalanan DNA ile yeniden askıya alınan boncukların tüm 20 μL kullanın.
19. Son, Post-yakalama PCR Zenginleştirme gerçekleştirin
- Post-Capture PCR Master Mix'i aşağıdaki tabloya göre hazırlayın, gerekli numune sayısıyla çarpArak ve Tablo 15'egöre %10 ekstra ekleyerek.
| Post-Capture PCR Master Mix Bileşeni | Hacim (3L) |
| Post-Capture PCR MasterMix | 25 |
| Yakalama Sonrası PCR Primer Mix | 1.25 |
| Nükleazsız Su | 3.75 |
| Toplam Hacim | 30 |
Tablo 15: Post-Capture PCR Master Mix. Post-Capture PCR Master Mix bileşenleri, gösterilen hacimlere göre monte edilmeli ve buz üzerinde karıştırılmalıdır.
- 50 μL'lik son reaksiyon hacmi için her numuneye 30 μL Post-Capture PCR Master Mix ekleyin.
- PCR tüplerini termal döngüce yerleştirin ve Program #11'ı takiben kuluçkaya yatırın(Ek Tablo 2).
20. Yakalama Sonrası PCR Parçalarını ArındırMak
- SPRI Boncuklar kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığına ısınmak için izin, ve daha sonra yaklaşık 30 s suspend için girdap SPRI Boncuklar.
- HER PCR ile zenginleştirilmiş yakalamaya (50 μL) 75 μL yeniden askıda boncuk ekleyin. En az 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Streptavidin boncuksi SPRI boncuk arınmasını engellemez. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
- Kısaca bir mikrocentrifuge tüpleri spin ve supernatant boncuk ayırmak için bir manyetik raf tüpleri yerleştirin. Çözelti netleştikten sonra, dikkatlice çıkarın ve supernatant atın. DNA içeren boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Manyetik raftayken tüpe 180 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 s oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra dikkatle kaldırmak ve supernatant atın.
- Toplam 2 yıkama adımı için Adım 20.4'ü bir kez tekrarlayın.
- Tamamen artık etanol kaldırın. Tüpü manyetik rafta bırakın ve hava kapağı açık 3 dk veya gözle görülür şekilde kuruyana kadar kurutun. Boncukları fazla kurutmayın. Bu DNA'nın daha düşük iyileşmesine neden olabilir.
- Tüpü mıknatıstan çıkarın. 0.1x TE Tampon 22 μL ekleyerek boncukDNA elute. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka. Çözelti temizlenene kadar tüpü manyetik rafa yerleştirin.
- Boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin, süpernatantın 20 μL'sini çıkarın ve temiz bir nükleaz içermeyen PCR tüpüne aktarın. Bu protokolde isteğe bağlı bir durdurma noktasıdır, kütüphaneler -20 °C'de saklanabilir.
21. Kütüphaneyi Doğrulama ve Ölçme
- Yakalanan kitaplığın konsantrasyonunu florometre ve Yüksek Hassasiyetli Assa Kiti kullanarak ölçün.
- Dijital elektroforez Yüksek Duyarlılıklı DNA yongasını kullanarak yakalanan kitaplığın ortalama parça uzunluğunu ölçün ve sistem yazılımını kullanarak her kitaplığın ortalama parça boyutunu hesaplayın. Ortalama parça boyutu yaklaşık 250-400 bp olmalıdır (Bkz. Temsili Sonuçlar, Şekil 6 ve Şekil 7). Bu protokolde isteğe bağlı bir durdurma noktasıdır, tamamlanan kütüphaneler -20 °C'de saklanabilir.
22. Sıralama Platformunda Sıralama
- Sıralama için, kitaplıkları 2 nM'ye seyreltin ve sıralayıcıyı yükleme ve çalıştırma için üreticinin yönergelerine uyun. Sıra kitaplıkları en az 15 milyon tek uç derinliği en az 50 bp uzunluğunda okur.
23. Bulut Tabanlı Bir Bilişim Aracı olan Prizma Portalı ile Bağışıklık Profilleri Oluşturmak ve Biyobelirteçleri Keşfetmek Için Veri Sıralama analizi
- https://prism.cofactorgenomics.com/ ziyaret ederek bir Prizma hesabı oluşturun
- Oturum açtıktan sonra, demultiplexed FASTQ sıralama dosyalarını yüklemek veya Prism hesabı yla BaseSpace'te depolanan dosyaları yüklemek için Prism'deki herhangi bir sayfadan en üst araç çubuğuna Yeni Proje Gönder'i tıklatın.
- Proje adını ve grup veya kohorta göre örnekleri içeren Yeni Proje formunu doldurun. Biyomarker Bulma Raporu'nu oluşturmak için örneklerin ve buna karşılık gelen gruplandırma adlarının gruplanması gereklidir. Biomarker Discovery Report'u oluşturmak için grup başına en az 3 örnek gerektiğini unutmayın. Formu göndermek için Başlat Uygulamasını tıklatın; başarılı olursa bir onay sayfası görüntülenir.
- Oturum açtığınızda, üst araç çubuğunda veya Prism'in herhangi bir sayfasında Sonuçları Gör'ü tıklatın. Prizma, kullanıcının gönderilen projelerin durumunu görmesini ve proje başına örnek ve biyomarker raporlarını görüntülemesini sağlar. Kullanıcının Prism üzerinde oluşturduğu projeler tablosu olacaktır. Tabloda durum, ad ve teslim tarihi için üç sütun vardır.
NOT: Her projenin durumu:
• Proje analizinin şu anda çalıştığı "Running", veya
• Proje analizinin tamamlandığı ve raporların sunulduğu "Başarı". - Bir proje çözümlemesi tamamlarsa ("Başarı" durumuyla gösterilir), Bireysel Örnek Raporları ve Biyomarker Bulma Raporu'nu görüntüleyin. Biyomarker Bulma Raporu'nun yalnızca proje grup başına gerekli en az üç örnek içeriyorsa kullanılabilir olacağını unutmayın.
- Bu raporlara erişmek için projeler tablosuna dönün ve projenin adını tıklatın. Bu proje sayfasında, projedeki her örnek için bir satır içeren bir tablo olacaktır. Her bir örneğin Bireysel Raporuna erişmek için Rapor sütununun altındaki her satırdaki bağlantıyı tıklatın. Tablonun hemen altında, Biyomarker Bulma Raporu için bağlantıyı tıklatın. Bu sayfada bağlantı yoksa, projeniz çözümlemesi tamamlamamıştır.
Representative Results
Protokol boyunca, kullanıcının oluşturulan malzemelerin kalitesini ve miktarını değerlendirmesini sağlayan birkaç denetim noktası vardır. Protokolde açıklanan Adım 12'den sonra Şekil 3'tegösterildiği gibi, bozulmamış bir RNA örneği için tipik bir ön yakalama kitaplığını temsil eden bir elektroferogram oluşturulur (RIN = 7.8).
Şekil 3: Bozulmamış bir RNA örneği için tipik Yakalama Öncesi Kütüphane Biyoanalizörü izi. Yakalama öncesi kütüphaneler 250-400 baz çiftleri (bp) boyutu nda geniş bir tepe olarak görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
FfPERNA örneğinden (DV200 = 46) üretilen bir ön yakalama kütüphanesinin temsili elektrofeogramı olan Şekil 4'te gösterilen 1.000 bp civarındaki ikinci tepede belirtildiği gibi aşırı amplifikasyonu önlemeye özen gösterilmelidir. Bu tepe ana tepeye göre küçükse (gösterildiği gibi yaklaşık 250-400 baz çifti (bp), akış aşağı adımlarına veya analizlerine engel olmaz. İkinci tepe 250-400 bp tepeye göre büyükse, aşırı amplifikasyonu azaltmak için ön yakalama kitaplığı daha az PCR döngüsüyle yeniden yapılabilir.
Şekil 4: FFPE RNA örneği için tipik Yakalama Öncesi Kütüphane Biyoanalizörü izi. 1.000 bp civarındaki ikinci zirve aşırı amplifikasyonun göstergesidir. Bu tepe 250-400 bp civarında ana tepeye göre küçük ise (gösterildiği gibi), aşağı adımlar veya analiz müdahale etmez. İkinci tepe 250-400 bp tepeye göre büyükse, aşırı amplifikasyonu azaltmak için ön yakalama kitaplığı daha az PCR döngüsüyle yeniden yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Adım 12.1.3'te açıklandığı gibi, ek temizleme gerekip gerekip gerekip gerekmediğini belirlemek için adaptör dimerlerinin varlığı değerlendirilmelidir. Şekil 5'te gösterilen elektropherogramlar kabul edilemez(Şekil 5A, DV200 = 33) ve kabul edilebilir(Şekil 5B, DV200 = 46) adaptör dimer düzeyleri, 128 bp civarında keskin tepe olarak görünen temsil eder.
Şekil 5: Yakalama öncesi kütüphane Bioanalyzer izleri. Adaptör dimer 128 bp. civarında keskin bir tepe olarak gösterir. (A) Aşırı adaptör dimerler bu elektrofeogram mevcuttur. (B) Kabul edilebilir adaptör dimer düzeyleri bu izde gösterilmiştir. Her iki iz de hafif aşırı amplifikasyon kanıt göstermek, ancak bu ImmunoPrism Assay müdahale etmemelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protokolün tamamlanmasından önce, sıralamadan önce, son kütüphaneler tekrar dijital elektroforez kullanılarak değerlendirilir. FFPE RNA'dan yapılan kütüphaneler, bozulmamış RNA'dan yapılan kütüphanelere göre ortalama boyut dağılımından daha küçüktür. Bozulmamış RNA örnekleri için elde edilen iz Şekil 6'ya benzer olmalıdır (RIN = 9.5). Bozulmuş veya FFPE RNA için elde edilen iz Şekil 7'ye benzer olmalıdır (DV200 = 36).
Şekil 6: Bozulmamış bir RNA örneği için Tipik Final Library Bioanalyzer izi. Son kütüphaneler boyutu 250-400 baz çiftleri (bp) etrafında geniş bir tepe olarak görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: FFPE RNA örneği için Tipik Final Library Bioanalyzer izi. FFPE RNA'dan yapılan kütüphaneler, bozulmamış RNA'dan yapılan kütüphanelere göre ortalama boyut dağılımından daha küçüktür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Açıklandığı gibi, bu protokolle oluşturulan sonuçlar Şekil 8'degösterildiği gibi iki anahtar şekilde uygulanabilir.
Şekil 8: Protokolün iki kullanım örneğinde kullanılır. Bu immün profilleme tahsini ile oluşturulan sonuçlar iki temel çeviri uygulamasında uygulanır. (A) İlk kullanım olgusu insan solid tümör dokusundan (FFPE arşivleri dahil) başlar ve örnek için bireysel bir bağışıklık profili oluşturur. (B) Bir kez insan örnekleri bir kohort için oluşturulan, veri prizma Portal ı kullanılarak çok boyutlu bir biyomarker ve ilgili Biyomarker Raporu oluşturmak için birleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu kullanım örneklerinin her birini göstermek için, küçük bir çeviri çalışmasından elde edilen temsili veriler21'edahildir. Bu çalışmada kullanılan örnekler, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) tanısı konan ve tedavi edilen 7 hastadan alınan örneklerden bir erlerdir. Örnekler tedavi öncesi ve sonrası biyopsilerden hasta ile eşleşen solid tümör dokusu. İlk olarak, şekil 9'dagösterilen örnek rapor gibi bir bağışıklık profili oluşturmak için tek tek örnekler analiz edilmiştir.
Şekil 9: NSCLC örneği için örnek bireysel immün rapor. Prism Portal boru hattı, burada gösterilen bir NSCLC katı tümör örneği için oluşturulan temsili bir rapor ile, işlenen her örnek için bir grafik raporu oluşturur. (A) Raporun ön yüzü FFPE dokusundan alınan RNA örneğinde bulunan bağışıklık hücrelerinin dökümünü grafik olarak gösteriştir. (B) Raporun ters tarafında bağışıklık hücreleri tablosu (mutlak yüzdeler halinde) ve kaçış gen ekspresyonu (milyon başına transkript veya TPM) yanı sıra tsay için performans ifadesi içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bağışıklık profilleri öncesi ve sonrası tedavi nasıl bir tedavi (kemoterapi veya radyasyon, bu çalışmada) tümör mikroçevre modifiye olduğunu anlamak için kullanılabilir. Bir örnek Şekil 10'dagösterilmiştir , her bir bağışıklık hücresi ve toplam immün içerik için yüzde değişiklikleri kemoterapi öncesi ve sonrası gösterilmiştir, tek bir hasta için.
Şekil 10: Örnek Tedavi Öncesi ve Sonrası Sonuçlar. Tek bir NSCLC hastasından alınan tedavi öncesi ve sonrası örneklerden elde edilen bireysel immün hücre ve toplam immün içerik verileri gösterilmiştir. Bu örnekte hastaya tedavi olarak kemoterapi rejimi verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hastalar klinik sonuçlar veya karşılaştırma için fenotipler gibi kriterlere göre gruplandırılabilir. Örneğin, Şekil 11'de,NSCLC çalışmasındaki örnekler tedavi sonrası hastalığın ilerlemesi ile zamana göre karşılaştırıldı. Hastaların bir alt kümesi >18 ay içinde hastalık nüks gösterdi ve başka bir alt küme ≤18 ay içinde daha hızlı ilerledi. Ortanca delta değeri (tedavi öncesi ve sonrası değerler arasındaki fark) hastalığın ilerlemesinin putatif biyobelirteçlerini belirlemek için her örnek için karşılaştırılır.
Şekil 11: Örnek Klinik Sonuç Karşılaştırması. Eşleşen tedavi öncesi ve sonrası NSCLC örneklerinde bağışıklık hücresi yüzdeleri arasındaki nicel değişiklikler hesaplanmış ve "delta" değeri olarak bildirilmiştir. Sarı renkte vurgulananlar hayatta kalma durumu arasında net sinyal değişiklikleri gösterir. Mavi çubuklar hastalığın ilerlemesine kadar >18 ay, turuncu çubuklar ise hastalığın ilerlemesine kadar olan 18 ay boyunca ortanca delta değerlerini temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, benzer örnek gruplandırmaları, biyomarker Raporu oluşturmak için Prizma Portalını kullanarak tahmine dayalı biyobelirteçleri belirlemek için özellikle tedavi öncesi numunelere bakmak için kullanılabilir. Şekil 12'degösterilen, yukarıda açıklandığı gibi aynı klinik fenotip (hastalık progresyonu) örnek gruplandırmaları tanımlar. Bu örnekte, iki immün kaçış geni örnek gruplandırmalarının istatistiksel olarak anlamlı ayırıcıları olarak tanımlanmıştır (ŞEKIL 12A'nınalt panelinde gösterilen CD47 ve OX40). Bu örnekte, bireysel gen biyobelirteçleri net istatistiksel anlamlılığa sahip sağlam olduğundan, çok boyutlu biyomarker anlamlı bir tahmin değeri eklemez (İmmünPrizma, Şekil 12B'ninsağ üst çubuk grafiğinde etiketlenmiş olarak). Tahlil için tüm 18 analit sonuçları da dahil olmak üzere veri tam tablo, istatistiksel analiz ve kısa bir yöntem özeti de dahil olmak üzere raporun ters tarafında özetlenir.
Şekil 12: Örnek NSCLC örnekleri için Biyomarker Raporu. Biomarker Discovery boru hattı, bireysel biyobelirteçlerin görsel bir raporunu ve ayrıntılı istatistikleriçeren çok boyutlu bir makine öğrenimi biyomarkerini sunar. (A) Bu çalışma için, boru hattı 18 aylık eşiği ile hastalık ilerlemesini tanımlamak için istatistiksel olarak anlamlı olarak iki ayrı biyobelirteç (CD47 ve OX40) tespit etti. (B) Yöntem ve tam sonuçlarla ilgili ayrıntılar raporun ters tarafında yer almıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Reaktif Kiti Malzemeleri. İmmünoPrizma Kiti'nde sağlanan malzemelerin listesi, üreticiprotokolünde belirtilen parça numaralarıyla birlikte listelenir. Gerekli diğer tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Güvenlik Veri Sayfaları (SDS) için https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ ziyaret edin. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Tablo 2: Termal Cycler Programları. Protokol boyunca başvurulan önerilen döngücü programlar programlama kolaylığı için özetlenir. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Tablo 3: Sıralama Dizin Kılavuzu. Reaktif kitinde sağlanan dizin astarları listelenir; ayrıştırma sonrası demultiplexing için her reaksiyona benzersiz bir astar eklenir. Önerilen düşük seviyeli çoklama kombinasyonları da sağlanır. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Discussion
Protokol 20 ng bozulmamış veya 40 ng yüksek oranda bozulmuş (FFPE) RNA gerektirir. RNA örneği DNA, tuzlar (örneğin, Mg2+veya guanidinium tuzları), divalent katyon şelat ajanları (örneğin, EDTA, EGTA, sitrat) veya organik (örn. fenol ve etanol) içermez. DV200 <%20 olan RNA örnekleri ile devam etmek önerilmez. Bu denetimler, kitaplık hazırlamadan çözümedomaya kadar tüm protokol boyunca performansı değerlendirmek için bir araç sağladığından, kit içi denetim RNA'nın kullanımı önemle tavsiye edilir.
Protokol 0.2 mL PCR şerit tüpler kullanılarak yapılacak şekilde tasarlanmıştır. Tercih edilirse, protokol 96 kuyulu PCR plakalı kuyular kullanılarak da yapılabilir. PCR tüpleri veya şerit tüpleri tüm referanslar yerine 96-iyi PCR plaka kuyuları kullanın. Boncuk arınmaları ve yıkama adımları sırasında boncukların tamamen yeniden askıya alınmasını görsel olarak onaylamak kritik olduğundan, PCR plakaları yalnızca açık kuyularla kullanın.
Protokol boyunca, aksi belirtilmedikçe reaktifleri dondurulmuş veya buz üzerinde tutun. Tamamen çözülene kadar reaktifkullanmayın. Kullanmadan önce tüm reaktifleri iyice karıştırdığından emin olun.
Enzimleri kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de tutun ve kullanımdan hemen sonra -20 °C'ye dönün. Sadece moleküler dereceli nükleaz içermeyen su kullanın; DEPC ile işlenmiş su kullanılması tavsiye edilmez. Karıştırmak için pipetting, yavaşça aspire ve çözeltiler iyice karıştırılır kadar toplam hacminin en az% 50 dağıtmak. Pipet enzimiçeren tüm ana karışımları karıştırın. Enzimleri karıştırmak için girdap kullanmak denatürasyona yol açabilir ve performanslarını tehlikeye atabilir. Boncuk arınmaları sırasında, moleküler sınıf etanol taze yapılmış% 80 etanol çözeltileri kullanın. Taze olmayan etanol solüsyonlarının kullanılması verimin düşmesine neden olabilir. Bu elüsyon verimliliğini azaltabilir gibi boncuklar kurutma üzerinde kaçının (boncuk kurutulmuş üzerinde kırık görünüyor).
Adım 10'da açıklandığı gibi, her reaksiyona benzersiz dizin astarları eklenir. Bu endekslerin dizilerine göre, düşük seviyeli çoklama için, bazı dizin kombinasyonları en iyisidir. Bu endekslerin dizileri, sıralama sonrası verilerin demultiplexing için gereklidir. Diziler ve önerilen çoklama kombinasyonları Ek Tablo 3'teverilmiştir. Aynı adımda, önerilen PCR döngülerinin sayısının kullanılan RNA'nın kalitesine bağlı olarak değiştiğine ve PCR'nin aşırı amplifikasyonu önlemek için bazı optimizasyonların gerekli olabileceğini unutmayın. ImmunoPrism Intact Control RNA ve diğer yüksek kaliteli RNA için, 10 PCR döngüleri ile optimizasyon abaşlayın. İmmünoPrizma FFPE Control RNA ve diğer yüksek oranda bozulmuş/FFPE RNA için 15 PCR döngüsü ile optimizasyona başlayın. PCR döngülerini optimize etmek için analiz edilecek malzemenin RNA temsilcisi kullanılarak bir test kitaplığı oluşturmaönerilir. Sürekli olarak yeterli ön yakalama kitaplığı verimi (>200 ng) sağlayan minimum PCR çevrimi kullanılmalıdır. Bioanalyzer iz üzerinde 1000 bp civarında ikincil bir tepe aşırı amplifikasyon göstergesidir(Şekil 4). Aşırı amplifikasyon en aza indirilmelidir, ancak küçük bir ikincil tepenin varlığı taht sonuçlarını etkilemez.
Numune kaybını en aza indirmek ve tüp değiştirmeyi önlemek için, Vakum konsantratörünüz izin veriyorsa, 1,5 mL mikrotüpler yerine PCR tüplerde, şerit tüplerde veya 96 kuyulu PCR plakada Adım 13 yapılabilir. Rotor birçok konsantratörde çıkarılabilir. Bu, şerit tüplerinin veya plakaların vakuma sığmasını sağlar. Vakum konsantrasyonu daha sonra hiçbir santrifüj ile sulu desiccation ayarı kullanılarak çalıştırılabilir. Talimatlar için vakum konsantratörünüz için kılavuza başvurun. Numuneler şerit tüpler veya 96 kuyulu bir plaka içinde kurutulursa, hibridizasyon adımı aynı kapta yapılabilir.
Adım 17 sırasında, boncuk yakalama verimliliğini artırmak için her 10-12 dakika girdap emin olun. Tüplerin açılmasını önlemek için karıştırma yaparken sıcak şerit tüplerinin kapaklarını dikkatlice tutun.
Adım 18'de tanımlanan yıkarlar yüksek spesifik olmayan kontaminasyonu önlemek için önemlidir ve yakından takip edilmelidir. Her yıkamada boncukları tamamen askıya aldığından, yıkama tamponlarını tamamen çıkardığından ve Yıkama Tamponu 2 yıkama sırasında numuneleri taze bir şerit tüpüne aktardığından emin olun (Adım 18.6.5). Streptavidin boncuktamamen resuspended ve tüm kuluçka sırasında süspansiyon kalır emin olun. Tüp kapaklarına sıçrama, yakalamayı olumsuz etkilemez. Oda sıcaklığında yıkar sırasında, daha kolay yeniden süspansiyon için iki dakikalık kuluçka süresinin tamamı için numuneleri girdaplamak için bir mikroplaka girdap karıştırıcı kullanılabilir. Streptavidin boncukları kurumasına izin vermeyin. Gerekirse, boncukların kurumasını önlemek için tamponlarda kuluçka süresini uzatın. Birden fazla şerit tüp kullanıyorsanız, diğer şerit tüpler termocycler içinde oturup her yıkama için bir seferde bir şerit tüp ile çalışın. Bu boncuk kurutma veya acele üzerinde önlemek yardımcı olabilir, kötü resuspension veya diğer sub-optimal teknikleri ile sonuçlanan. İlk kez kullanankullanıcılar için, aynı anda 8'den fazla kitaplık reaksiyonlarını işlemek önerilmez.
Mevcut immün profilleme teknikleri, önemli yorumlanması (RNA sıralaması) gerektiren binlerce veri noktasından bireysel, ayrık bir veri noktasına (tek pleksli IHC) kadar sürekli bilgi sunar. Burada açıklanan protokol, yüksek hassasiyet sağlayan odaklanmış bir kapsama sahip, ancak klinik olarak ilgili transkripsiyonel verilerin yalnızca bir alt kümesini yakalayan, ortada bir yerde olan bir yaklaşımı temsil eder. Toplu RNA çıkarma doğası nedeniyle, bu protokol bağışıklık hücreleri ve tümör mikroçevre arasındaki mekansal ilişkiler hakkında bilgi sağlamaz, ancak, sonuçlar bu bilgileri eklemek için görüntüleme teknolojileri ile tamamlanabilir. Bu protokol tarafından oluşturulan veriler için sayısız uygulama vardır, çünkü kanserin bir hastalık olarak biyolojisi hakkında öğrenilecek çok şey vardır ve tedavi etmek için geliştirilen tedaviler. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, bireysel bağışıklık raporu, hastalığın ilerlemesi veya tedavisi gibi olaylara yanıt olarak hastanın bağışıklık profilinin nasıl değişebileceğini anlamak için yararlıdır. Burada sunulan sonuçlar bazı örnek kullanım durumlarını sağlarken, bir tedavinin etki mekanizmasının araştırılması ve progresyonsuz ve genel sağkalım gibi klinik sonuçların putatif biyobelirteçlerinin belirlenmesi de dahil olmak üzere diğer uygulamalar da Pratik. Biyomarker keşif uygulamaları için bu protokolü kullanırken, homojen popülasyonların analiz edilmesini, istatistiksel güç için yeterli numunelerin dahil edilmesini ve önyargı kaynaklarının dikkate alınmasını sağlamak için iyi bir çalışma tasarımı nın uygulanması önemlidir. İdrarın odaklanmış, aerodinamik doğası nedeniyle, bu biyobelirteçlerin bir kez keşfedildikten sonra klinik doğrulama ve aşağı akım uygulamasına doğru bir yol hayal etmek mümkündür.
Disclosures
Tüm yazarlar Cofactor Genomics, Inc, geliştirilen ve Bu makalede kullanılan ImmunoPrism reaktif kiti ve bilişim araçları üreten şirket tarafından istihdam edilmektedir. İmmünoPrizma Tsay Sadece Araştırma Kullanımı içindir ve tanı prosedürlerinde kullanım için değildir.
Acknowledgments
Yazarlar, TriStar Technology Group'un temsili sonuçların yanı sıra Cofactor Genomics'teki tüm moleküler, analiz, ürün ve ticari ekiplerin teknik uzmanlıkları ve Destek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
- Brambilla, E., et al. Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).
- Iacono, D., et al. Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations. Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).
- Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
- Sierant, M. C., Choi, J. Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools. Genomics Inform. 16, (2018).
- Klauschen, F., et al. Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning. Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).
- Danaher, P., et al. Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).
- Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).
- Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
- Becht, E., et al. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).
- Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. Data normalization considerations for digital tumor dissection. Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).
- Chen, S. H., et al. A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues. BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).
- Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications. 4, 2612 (2013).
- Foley, J. W., et al. Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ. Genome Research. , (2019).
- Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482 (2019).
- PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs. JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).
- Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma. Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).
- Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer. Human Pathology. 69, 110-117 (2017).
- Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).
