Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

Published: January 7, 2020 doi: 10.3791/60647
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

هنا قدمنا مضاعفه خليه واحده mRNA أسلوب التسلسل إلى التعبير الجيني الشخصي في الانسجه الجنينية الماوس. الخلية المفردة القائمة علي القطرات mRNA التسلسل (scRNA-Seq) الأسلوب في تركيبه مع استراتيجيات تعدد الإرسال يمكن الملفات الشخصية خلايا واحده من عينات متعددة في وقت واحد ، مما يقلل بشكل كبير من تكاليف الكاشف ويقلل من اثار الدفعة التجريبية.

Abstract

وقد أحرز التسلسل التسلسلي للخلية الواحدة تقدما كبيرا في السنوات العديدة الماضية وأصبح أداه هامه في مجال البيولوجيا التنموية. وقد استخدمت بنجاح لتحديد السكان الخلايا النادرة ، واكتشاف الجينات علامة الرواية ، وفك المعلومات التنموية المكانية والزمانيه. وقد تطورت طريقه الخلية الواحدة أيضا من تكنولوجيا Fluidigm C1 المستندة إلى ميكروفلوديميك إلى الحلول القائمة علي القطرات في السنتين أو الثلاث سنوات الماضية. هنا استخدمنا القلب كمثال لشرح كيفيه التعريف خلايا الانسجه الجنينية الماوس باستخدام الطريقة التي تستند إلى القطرة scRNA-Seq. الاضافه إلى ذلك ، قمنا بدمج استراتيجيتين في سير العمل لتشكيل عينات متعددة في تجربه واحده. باستخدام واحده من الأساليب المتكاملة ، لدينا في وقت واحد لمحه أكثر من 9,000 خلايا من عينات القلب ثمانيه. ستكون هذه الأساليب ذات قيمه لمجال البيولوجيا التنموية من خلال توفير طريقه فعاله من حيث التكلفة لتشكيل خلايا منفردة في ان واحد من خلفيات وراثيه مختلفه أو مراحل تنموية أو مواقع تشريحيه.

Introduction

ويختلف الملف التعريفي لكل خليه من خلايا الخلية الواحدة بين مجموعات الخلايا اثناء النمو الجنيني. علي الرغم من ان التهجين الجزيئي الواحد في الموقع يمكن استخدامه لتصور التعبير عن عدد صغير من الجينات1، فان تسلسل الخلايا الاحاديه الخلية (Scrna-Seq) يوفر نهجا غير متحيز لتوضيح أنماط التعبير علي نطاق الجينوم للجينات في الخلايا المفردة. بعد نشرها لأول مره في 20092، تم تطبيق scrna-Seq لدراسة الانسجه المتعددة في مراحل تنموية متعددة في السنوات الاخيره3،4،5. كما انه نظرا لان أطلس الخلايا البشرية قد أطلق مؤخرا مشاريعه التي تركز علي التنمية ، فمن المتوقع ان تتولد في المستقبل القريب بيانات أكثر من خليه واحده من الانسجه الجنينية البشرية.

يلعب القلب كالجهاز اولي ان يطور دور حاسمه في تطوير جنينيه. يتالف القلب من يتعدد خليه أنواع والتطوير من كل خليه نوع يكون باحكام ينظم وقتيا و [سبتيلي]. علي مدي السنوات القليلة الماضية ، وقد تميزت سلاله المنشا والخلية من خلايا القلب في مراحل النمو المبكر6، والتي توفر أداه الملاحة مفيده هائله لفهم المسببة للامراض القلب الخلقية ، وكذلك لتطوير أساليب أكثر تقدما من الناحية التكنولوجية لتحفيز التجدد عضله7.

خضع ال [سكرنا-تلي] توسع سريعة في سنون أخيره8,9,10. مع الأساليب التي تم تطويرها حديثا ، وتصميم وتحليل التجارب خليه واحده أصبحت أكثر قابليه للتحقيق11،12،13،14. الطريقة المعروضة هنا هي اجراء تجاري يستند إلى حلول الحبريه (انظر جدول المواد)15,16. هذه الطريقة ميزات التقاط الخلايا ومجموعات من الخرز المرمزة بشكل فريد في قطره مستحلب زيت الماء تحت السيطرة علي نظام تحكم ميكروفلويدريك. معدل تحميل الخلية في قطرات منخفضه للغاية بحيث الغالبية العظمي من المستحلبات الحبريه تحتوي علي خليه واحده فقط17. وياتي التصميم البارع للاجراء من فصل الخلايا الواحدة إلى المستحلبات التجميعية التي تحدث في وقت واحد مع الترميز ، والتي تمكن التحليل الموازي للخلايا الفردية باستخدام الحمض الريبي-المتسلسل علي السكان غير المتجانسين.

دمج استراتيجيات تعدد الإرسال هي واحده من الإضافات الهامه لسير العمل التقليدية خليه واحده13,14. هذه الاضافه مفيده جدا في التخلص من الشكوك الخلية ، والحد من التكاليف التجريبية ، والقضاء علي اثار الدفعات18،19. استراتيجية الترميز القائم علي الدهن واستراتيجية الترميز المضادة القائمة علي الأضداد (انظر جدول المواد) هي الطريقتين الأكثر استخداما لتعدد الإرسال. تستخدم الباركود المحددة لتسميه كل عينه في كلا الأسلوبين ، ومن ثم يتم خلط العينات المسمية للتقاط خليه واحده ، واعداد المكتبة ، والتسلسل. بعد ذلك ، يمكن فصل بيانات التسلسل المجمع عن طريق تحليل تسلسلات الباركود (الشكل 1)19. ومع ذلك ، توجد اختلافات كبيره بين الطريقتين. وتستند استراتيجية الترميز القائم علي الدهن علي الدهون المعدلة قله الكريات التي لم يتم العثور علي اي تفضيلات نوع الخلية. في حين ان الأجسام المضادة القائمة علي استراتيجية الترميز يمكن فقط الكشف عن الخلايا التي تعبر عن البروتينات مستضد19,20. الاضافه إلى ذلك ، فانه ياخذ حوالي 10 دقيقه لتلطيخ الدهون ولكن 40 دقيقه لوصمه عار الأجسام المضادة (الشكل 1). وعلاوة علي ذلك ، فان قله الكريات الدهنية المعدلة بالدهن أرخص من الأجسام المضادة-قله الكريات الوحيدة المترافقة ولكنها ليست متاحه تجاريا في وقت كتابه هذه المقالة. وأخيرا ، يمكن للاستراتيجية القائمة علي الدهن تعدد العينات 96 في تجربه واحده ، ولكن الاستراتيجية القائمة علي الأجسام المضادة لا يمكن حاليا الا تعدد 12 عينات.

يجب ان يكون رقم الخلية الموصي بها لتعدد الإرسال في تجربه واحده اقل من 2.5 × 104، والا ، فانه سيؤدي إلى نسبه عاليه من الشكوك الخلية والتلوث mrna المحيطة المحتملة. من خلال استراتيجيات تعدد الإرسال ، سيتم تخفيض تكلفه التقاط خليه واحده ، وجيل cDNA ، واعداد المكتبة لعينات متعددة إلى تكلفه عينه واحده ولكن تكلفه التسلسل ستبقي هي نفسها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الاجراء حيوانيه وفق الجامعة من [بيتسبورغ] مؤسسه رعاية حيوانيه واستعمال لجنه ([اياكوك]).

1. الماوس الجنينية تشريح القلب والاعداد تعليق خليه واحده

ملاحظه: قد تستغرق هذه الخطوة بضع ساعات اعتمادا علي اعداد الاجنه لتشريحها.

  1. للحصول علي E 18.5 القلوب الجنينية ، موت ببطء الحامل CD1 الماوس من قبل CO2 الاداره. استخدام شفره حلاقه لأزاله الشعر غير المرغوب فيه في منطقه البطن وتطهير الجلد مع 70 ٪ الايثانول.
  2. قطع الجلد من البطن باستخدام مقص معقم وتشريح بعناية الاجنه ووضعها بسرعة في الباردة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) علي الجليد.
  3. عزل القلوب من كل جنين الفردية بعناية في صحن 10 سم مليئه بالبرد التلفزيوني تحت المجهر مجسمه باستخدام ملقط ومقص.
    ملاحظه: الحفاظ علي الغرف الاربعه سليمه من خلال تشريح الرئة معا القلب معا وعدم الصيد مباشره/سحب القلب مع الاداات الجراحية.
  4. نقل ~ 10 قلوب في طبق جديد 10 سم مليئه الباردة والدقيقة تشريح القلوب في الأذين الأيسر ، الأذين الأيمن ، البطين الأيسر ، والبطين الأيمن.
    ملاحظه: هذا يفترض ان ينتج أكثر من 1 × 106 خلايا من كل عينه. نوصي للبدء مع ما لا يقل عن 1 × 105 خلايا لكل عينه.
  5. نقل كل من انسجه الغرفة 4 إلى أنبوب 1.5 mL وتقطيعها إلى قطع باستخدام مقص. الطرد المركزي في 300 x g ل 3 دقيقه لجمع الانسجه.
  6. بعد شفط supernatant ، أضافه 1 مل من 0.25 ٪ التريبسين/أدتا إلى كل أنبوب واحتضان في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده 10 دقيقه Pipet صعودا وهبوطا بلطف 7-8 مرات باستخدام ماصه P1000.
  7. إذا كانت المرحلة الجنينية أقدم من E 11.5 ، أضافه 1 مل من 10 ملغ/مل كولاجيناز A/B خليط واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 10-20 دقيقه. ماصه pipet-x بلطف صعودا وهبوطا حتى يتم فصل معظم الخلايا.
  8. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل وأضافه 8 مل محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) لتخفيف الانزيمات. تدور أسفل الخلايا في 300 x g لمده 5 دقيقه. تعليق الخلايا في 1 مل من تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب 1.5 ml. تصفيه الخلايا من خلال مصفاه خليه 40 μm.
  9. خذ 15 μL من وحده التخزين من كل عينه وتخلط مع نفس المبلغ من 0.04 ٪ التركان الأزرق. تحميل هذا علي خليه جرد الغرفة وحساب الخلايا في عداد خليه.
    ملاحظه: لتوليد نتائج عاليه الجودة ، من المستحسن بقاء الخلية اعلي من 95%.

2. خليه واحده تعدد الشفرات الترميز

ملاحظه: تاخذ هذه الخطوة علي الأقل 40 دقيقه التي تختلف استنادا إلى عدد العينات التي تمت معالجتها. وهناك حاجه إلى منطقه مقعد نظيفه تعامل مع محلول أزاله التلوث RNase لخطوات ما قبل التضخيم (الخطوة 2.11 إلى 3.11) ، ومطلوب منطقه مقاعد البدلاء نظيفه منفصلة للخطوات ما بعد التضخيم (الخطوات بعد 3.11).

  1. اجراء الترميز القائم علي الدهن (الاجراء الاختياري 1)
    1. علي أساس تركيز الخلية ، والحفاظ علي اقل من 5 × 105 خلايا لكل عينه. تاكد من ان تعليق الخلية خاليه من الركام والمجاميع الخلية.
    2. اعداد 2 μM مرساه/الباركود حل الأسهم و 2 μM المشترك مرساه حل الأسهم لكل عينه (الجدول 1).
      ملاحظه: المرساة وشارك في مرساه والموهوبين من قبل الدكتور Zev ج. غارتنر مختبر. ولتوليف هذه القلة المعدلة من الدهون ، كانت متواليات الحمض النووي مترافقة مع الأحماض الدهنية علي دعم قوي ومنقي بواسطة الفصل اللوني السائل عالي الأداء (hplc)18،19.
    3. غسل الخلايا مرتين مع تلفزيوني وجمع الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق تعليق الخلايا في 180 μl من تلفزيوني.
    4. أضافه 20 μL من مرساه/الباركود حل الأسهم وماصه لاعلي وأسفل بلطف لخلط. احتضان علي الجليد لمده 5 دقائق.
    5. أضف 20 μL من محلول الأسهم المشتركة والماصة للأعلى والأسفل برفق للمزج ، ثم حضن علي الثلج لمده 5 دقائق أخرى.
    6. أضافه 1 مل من تلفزيونيه الباردة مع 1 ٪ بوسنيا والطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c. يغسل علي الأقل 2 مرات أكثر مع الجليد الباردة 1 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية.
    7. الجمع بين جميع العينات معا وتصفيه من خلال 40 ميكرومتر الخلية المصافي. عد الخلايا والحفاظ علي تعليق الخلية علي الجليد لاستخدامها في القسم 3.
  2. اجراء الترميز القائم علي الأجسام المضادة (الاجراء الاختياري 2)
    1. الطرد المركزي 1 × 106-2 × 106 خلايا لكل عينه (من الخطوة 1.8) في 300 x ز لمده 5 دقائق وتعليقها في 100 μl من تلطيخ العازلة (الجدول 1) في 1.5 mL أنابيب ربط منخفضه.
    2. أضافه 10 μL Fc حجب الكاشف واحتضان لمده 10 دقيقه في 4 ° c.
    3. اعداد الأجسام المضادة (انظر جدول المواد) بواسطة يطرد في 14,000 x g لمده 10 دقيقه عند 2-8 درجه مئوية.
    4. أضافه 1 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المترافقة oligo إلى 50 μL من العازلة تلطيخ الخلية لجعل حل تلطيخ الأجسام المضادة20. أضافه حل واحد تلطيخ الأجسام المضادة لكل أنبوب عينه. احتضان لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية.
    5. غسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من تلفزيوني ، تدور لمده 5 دقائق في 350 x g في 4 درجه مئوية.
    6. تجمع جميع العينات في النسب المطلوبة في 1 مل من تلطيخ العازلة ، تدور لمده 5 دقائق في 350 x g في 4 درجه مئوية.
    7. أعاده التعليق الخلايا في الاذاعه التلفزيونية في التركيز المناسب (تصل إلى 1,500 خلايا/μL) وتصفيه الخلايا من خلال مصفاه الخلية 40 μm. انتقل فورا إلى الخطوة التالية.

3. الجيل الحبريه والنسخ العكسي mRNA

ملاحظه: هذه الخطوة يستغرق حوالي 90 دقيقه لرد فعل واحد معدد الإرسال.

  1. تتوازن الخرز هلام (انظر جدول المواد) إلى درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه. إخراج الكواشف من هلام الخرز في مستحلب (الأحجار الكريمة) عده (انظر جدول المواد) والاحتفاظ بها في درجه الحرارة المشار اليها.
  2. تجميع رقاقه B في حامل رقاقه (انظر جدول المواد).
  3. الاستغناء 75 μL من 50 ٪ محلول الجلسرين في الآبار غير المستخدمة في الصف 1 ؛ 40 μL في الصف 2; 280 μL في الصف 3. لا تقم باضافه الجلسرين في اي ابار الانتعاش علي الصف العلوي من رقاقه.
  4. اعداد المزيج الرئيسي علي الجليد وفقا للجدول 1. أضافه الحجم المناسب من تعليق الخلية والمياه الخالية من النيوداز لإتقان مزيج وفقا لحجم تعليق خليه اله حاسبه الجدول17 وماصه بلطف المزيج. الاستغناء عن 75 μL من خليط الخلايا في المركز السفلي من العينة جيدا في الصف 1 دون إدخال فقاعات.
  5. دوامه الخرز هلام لمده 30 ثانيه باستخدام محول دوامه والاستغناء ببطء 40 μL من الخرز هلام في المركز السفلي من حبه هلام جيدا في الصف 2 دون إدخال فقاعات.
    ملاحظه: من الضروري الانتظار لمده 30 ثانيه بين أضافه الخلايا والخرز هلام لتجنب ترطيب الفشل.
  6. لتقسيم النفط جيدا في الصف 3 ، الاستغناء 280 μL من تقسيم النفط من خلال جدار من البئر.
    ملاحظه: تحميل اقل من 270 μL من تقسيم النفط سوف يؤدي إلى جيل الأحجار الكريمة غير طبيعيه.
  7. نعلق طوقا علي رقاقه ، لا تضغط علي لأسفل علي طوقا والحفاظ عليه الأفقي لتجنب ترطيب طوقا.
  8. تحميل رقاقه تجميعها مع طوقا في وحده تحكم الكروم وتشغيل الكروم خليه واحده برنامج B (انظر جدول المواد) ، انتقل فورا إلى الخطوة التالية عند اكتمال البرنامج.
  9. اخرج الرقاقة وتخلص من الطوق اضعاف الغطاء مره أخرى لفضح الآبار في 45 درجه مئوية ، والتحقق من مستوي السائل للتاكد من عدم وجود القباقيب.
  10. يستنشق ببطء 100 μL من الأحجار الكريمة من ادني النقاط من الانتعاش جيدا والتحقق من التوحيد من الأحجار الكريمة. الاستغناء عن الأحجار الكريمة في أنبوب تفاعل البلمره الجديد (PCR) علي الجليد مع نصائح ماصه ضد جدار الأنبوب.
    ملاحظه: إذا لوحظ الطبقة المائية الزائدة ، فمن المقترح أعاده اعداد العينات. الأهم من ذلك ، التقاط صوره من الخليط عندما الأحجار الكريمة لا تزال في نصائح ماصه. هذه الصورة يمكن ان أقول إذا كان هناك فشل ترطيب ، والأحجار الكريمة مستحلب جزئيا ، والقباقيب كاشف. كما يمكن استخدام الصورة كدليل للحصول علي التعويض من شركه الكاشف مع الكواشف البديلة والرقائق.
  11. وضع الأنبوب في الدورية الحرارية وتنفيذ اجراء النسخ العكسي (الجدول 2).
    ملاحظه: إيقاف هنا أو الانتقال إلى الخطوة التالية. ويمكن تخزين المنتج PCR في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى أسبوع.

4. التضخيم cDNA

ملاحظه: هذه الخطوة يستغرق حوالي 150 دقيقه.

  1. وظيفة تنظيف النسخ العكسي لخليه واحده
    1. إخراج الكواشف التضخيم cDNA من عده الأحجار الكريمة (انظر جدول المواد) والاحتفاظ بها في درجه الحرارة المشار اليها.
    2. أضافه 125 μL من عامل الاسترداد إلى العينة في درجه حرارة الغرفة للحصول علي خليط بيهاسيك. لا ينبغي ملاحظه السائل غير الشفاف وتجنب الأنابيب أو المزج بين الخليط.
    3. بعد انتظار 60 s ، ببطء أزاله 125 μL من عامل الاسترداد من الجزء السفلي من الأنبوب.
    4. دوامه الخرز المغناطيسي (انظر جدول المواد) تماما لمده 30 ثانيه وعلي الفور استخدامه لاعداد الخرز تنظيف الخليط (الجدول 1). وينبغي أضافه الكواشف بالتتابع كما هو مذكور.
    5. دوامه خليط تنظيف الخرز وأضافه 200 μL إلى العينة. ماصه الخليط 10 مرات ثم احتضانه لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    6. أضافه الكواشف بالتتابع كما هو مبين في الجدول 1 لاعداد حل التملص و الوت cdna علي النحو التالي.
      1. وضع العينات علي المغناطيس (موقف عاليه) (انظر جدول المواد) حتى يتم مسح الحل ، ثم أزاله supernatant.
      2. أضافه 200 μL من 80 ٪ الايثانول إلى بيليه. انتظر 30 ثانيه ، ثم قم بازاله الايثانول.
      3. كرر الخطوة 4.1.6.2 مره أخرى 2. الطرد المركزي لفتره وجيزة ووضع علي المغناطيس (موقف منخفض). أزاله الايثانول المتبقية بعناية والهواء الجاف لمده اقل من 2 دقيقه.
        ملاحظه: لا تتجاوز تجفيف الهواء الماضي 2 دقيقه ، والا فان كفاءه التهرب انخفاض.
      4. أزاله العينة من المغناطيس. أضف 35.5 μL من محلول الامتصاص والماصة لمزج 15 مره. احتضان 2 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
      5. وضع العينة علي المغناطيس (موقف عاليه) حتى يتم مسح الحل. نقل 35 μL من العينة إلى شريط أنبوب جديد.
        ملاحظه: يتم استخدام هذا الاجراء تنقيه أيضا في الخطوات 4.2.1.6 ، 4.2.2.3 ، 5.8 ، 6.1.10 ، و 6.2.6. التفات إلى تركيز الخرز المغناطيسي وحجم العازلة EB/نقاء المياه المستخدمة في الوت العينات في كل خطوه.
    7. القياس الكمي لحجم وتركيز وسلامه اله الكهربائية باستخدام أداه الكهربي الألى21 (انظر جدول المواد) (الشكل 2).
  2. تضخيم cDNA
    1. التضخيم cDNA باستخدام استراتيجية الترميز القائمة علي الدهون (الاجراء الاختياري 1)
      1. اعداد خليط رد فعل التضخيم (الجدول 1) علي الجليد.
      2. أضافه خليط رد فعل التضخيم إلى 35 μL من عينات cDNA (من الخطوة 4.1.6.7). ماصه المزيج ، والطرد المركزي لفتره وجيزة. احتضان الخليط في الدورية الحرارية بعد اجراء التضخيم cDNA (الجدول 2).
      3. بعد vortexing جيدا ، أضافه 120 μl من تحديد كاشف و 100 μl من المياه نقاء إلى 100 μl من عينه للحصول علي تركيز 0.6 x من الكاشف حدد (انظر جدول المواد). ماصه الخليط لمده 15 مره.
      4. احتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة ومن ثم وضع العينة علي المغناطيس حتى تصبح الحلول واضحة.
        ملاحظه: cDNA الذاتية في جزء الخرز وتعدد الإرسال المشفرة cDNA في supernatant.
      5. نقل ماده طافي إلى 1.5 mL أنبوب ربط منخفضه لتعدد الإرسال المبرمج cdna مكتبه البناء في الخطوة 6.1.
      6. تنظيف cdna الذاتية باتباع الخطوات في 4.1.6 و الوت لهم مع 40 μl من المخزن المؤقت EB.
      7. تشغيل 1 μL من العينة المنقية cDNA علي أداه الكهربائي الألى (انظر جدول المواد) لتحليل/قياس cdna.
      8. Aliquot 10 μL من cDNA إلى أنبوب PCR جديد لبناء المكتبات الذاتية.
        ملاحظه: إيقاف هنا أو الانتقال إلى الخطوة التالية. يمكن تخزين العينة المتبقية في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 4 أسابيع لإنشاء مكتبات اضافيه إذا لزم الأمر.
    2. التضخيم cDNA في استراتيجية الترميز المضاد القائم علي الأضداد (الاجراء الاختياري 2)
      1. أضافه 2 بمول من hto والتمهيدي المضافة في المحاسبة و 15 μl من الإشعال cdna إلى 50 μl من التضخيم تفاعل الخليط (الجدول 1) وأداء cdna التضخيم مع اجراء التضخيم cdna (الجدول 2).
      2. استخدام 0.6 x تحديد كاشف لفصل cDNA الذاتية (الخرز الجزء) وتعدد الباركود cDNA (في supernatant). تذكر لإنقاذ ماده طافي لأداء بناء مكتبه الترميز في الخطوة 6.2.
      3. تنقيه و الوت النسخة الذاتية cdna باتباع الخطوات في 4.1.6 ، وأداء مراقبه الجودة (QC) من المكتبات و قسامه 10 μl في أنبوب PCR جديده لبناء المكتبة الذاتية.

5-اعداد المكتبة الذاتية للمحاضر

ملاحظه: هذه الخطوة يستغرق حوالي 120 دقيقه.

  1. الحفاظ علي الجينات التعبير الجيني بناء المكتبة من مجموعه المكتبة (انظر جدول المواد) في درجه الحرارة المشار اليها ، علي التوالي.
  2. اعداد خليط التفتيت (الجدول 1) علي الجليد ، ماصه لخلط والطرد المركزي لفتره وجيزة.
  3. أضافه 25 μL EB المخزن المؤقت إلى عينه cDNA المنقية 10 μL (من الخطوة 4.2.1.8 أو 4.2.2.3) ثم قم باضافه خليط تجزئه 15 μL المعدة حديثا إلى العينة ، ماصه الخليط 15 مرات علي الجليد والطرد المركزي لفتره وجيزة.
  4. نقل العينة إلى الدورية الحرارية المبردة مسبقا وبدء برنامج PCR للتجزئة ، وإصلاح نهاية و A-المخلفات (الجدول 2).
  5. دوامه الكاشف حدد لتعليق الخرز المغناطيسي واستخدامها علي التوالي 0.6 x و 0.8 x حدد الكواشف لجعل اختيار حجم مزدوج الجانب وفقا لدليل المستخدم17,22. استخدام 50 μl من المخزن المؤقت EB إلى الوت الحمض النووي.
  6. اعداد خليط ربط محول (الجدول 1) ، ثم ماصه الخليط جيدا والطرد المركزي لفتره وجيزة.
  7. أضافه 50 μL من خليط محول ربط إلى 50 μL من عينه ، مزيج ماصه مره أخرى لمده 15 مره والطرد المركزي لفتره وجيزة. قم باجراء ربط المحول وفقا للبروتوكول في التدوير الحراري (الجدول 2).
  8. استخدام الكاشف 0.8 x لتنقيه المنتج ربط و الوت عينه تنقيه مع 30 μl من العازلة EB (انظر الخطوة 4.1.6).
  9. اعداد نموذج الفهرس PCR الخليط (الجدول 1) وأضافه 60 μl إلى العينة المنقية. أضافه 10 μL من نموذج الفهرس إلى العينة ، ومزيج ماصه صعودا وهبوطا لمده 5 مرات والطرد المركزي لفتره وجيزة ، احتضان في الدورية الحرارية بعد نموذج بروتوكول الفهرس (الجدول 2).
    ملاحظه: إيقاف هنا أو الانتقال إلى الخطوة التالية. إذا تم استخدام أكثر من بئر واحده ، اختر مؤشر عينه محدده واحده (انظر جدول المواد) لكل بئر. تذكر لتسجيل معرف الفهرس المستخدمة لكل بئر وضمان عدم وجود تداخل في تسلسل تعدد الإرسال تشغيل.
  10. علي التوالي استخدام 0.6 x و 0.8 x تحديد الكواشف لجعل اختيار حجم الوجهين للحصول علي 35 μL من تنقيه الخلوية الذاتية مكتبه الحمض النووي17.
  11. QC المكتبة الخلوية الذاتية قبل التسلسل (الشكل 2).

6. اعداد الإرسال المعدد عينه الباركود cDNA المكتبات

ملاحظه: تستغرق هذه الخطوة علي الأقل 120 دقيقه.

  1. نموذج إنشاء مكتبه الباركود للاستراتيجية القائمة علي تعدد الدهون (الاجراء الاختياري 1)
    1. أضافه 520 μl من تحديد كاشف و 360 μl من الايزوبروبانول لعينه الباركود cdna من الخطوة 4.2.1.5 للحصول علي 3.2 x تحديد تركيز الكاشف. ماصه الخليط 10 مرات واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق.
    2. وضع أنبوب علي رف المغناطيسي والانتظار للحل لمسح. ثم تجاهل سوبرناتانت.
    3. استخدام 500 μL من 80 ٪ الايثانول لغسل الخرز مرتين علي المغناطيس والانتظار لمده 30 ثانيه بعد كل غسل.
    4. لفتره وجيزة الطرد المركزي الخرز ومكان علي المغناطيس. أزاله الايثانول المتبقية مع الماصة المجهرية P10 وترك الخرز لمده 2 دقيقه.
    5. أزاله الأنبوب من رف المغناطيس وأعاده تعليق الخرز في 50 μL من المخزن المؤقت EB. Pipet صعودا وهبوطا لخلط جيدا. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه.
    6. أعاده الأنبوب إلى المغناطيس وانتظر الحل لمسح. نقل ماده طافي (نموذج الباركود cdna) إلى أنبوب PCR جديده. يجب الحرص علي عدم نقل اي الخرز.
    7. قياس تركيز نموذج الباركود cDNA23.
    8. اعداد خليط مكتبه الباركود الدهون (الجدول 1) ، أضافه 3.5 ng من المنقي المشفرة cdna (من الخطوة 6.1.6) والمياه الخالية من النيوداز لحجم الكلي من 50 μl.
    9. الاحتفاظ بها في الدورية الحرارية بعد مكتبه الباركود المستندة إلى الدهون PCR (الجدول 2).
    10. استخدام 1.6 x تحديد كاشف لتنقيه المنتج PCR و الوت الحمض النووي مع 25 μl من العازلة EB (انظر الخطوة 4.1.6).
    11. قياس تركيز المكتبة باستخدام طريقه تحليل الحمض النووي عاليه الحساسية24 من التخفيف الاولي 1:5 (الشكل 2).
  2. نموذج إنشاء مكتبه الباركود لاستراتيجية الأجسام المضادة القائمة علي تعدد الإرسال (الاجراء الاختياري 2)
    1. أضافه حجم التفاعل 1.4 x اضافيه من الكاشف تحديد إلى ماده طافي التي تحتوي علي الباركود عينه المكتسبة من الخطوة 4.2.2.3 للحصول علي 2x تحديد نسبه الكاشف.
    2. غسل الخرز مع 80 ٪ الايثانول عن طريق اتباع الخطوات في 4.1.6 و الوت في cdna المشفرة مع المياه نقاء.
    3. تنفيذ بروتوكول الاختيار مع 2x تحديد كاشف للمرة الثانية و الوت باستخدام المياه نقاء.
    4. اعداد خليط مكتبه الباركود الأجسام المضادة (الجدول 1) ، وأضافه 45 μl من المنقي المشفرة cdna من الخطوة الاخيره.
    5. احتضان في الدورية الحرارية بعد الأجسام المضادة مكتبه الباركود PCR (الجدول 2)20.
    6. استخدام 1.6 x تحديد كاشف لتنقيه المنتج PCR و الوت عينه تنقيه مع 30 μl من المياه نقاء (انظر الخطوة 4.1.6).

7. تسلسل المكتبة

ملاحظه: يمكن استخدام عده منصات تسلسل الجيل التالي مثل HiSeq 4000 و NovaSeq لتسلسل مكتبات النصوص الذاتية ومكتبات الباركود متعددة الإرسال.

  1. استخدام الجيل القادم من النظام الأساسي التسلسل الاختيار لتسلسل مكتبات النصوص الذاتية والمكتبات الباركود متعددة الإرسال.
  2. تمييع المكتبات وفقا للتوصيات من خبير في شركه التسلسل أو مرفق التسلسل. ويوصي الحد الأدنى 20,000 قراءه لكل خليه لمكتبه النصوص الذاتية و 3000 يقرا لمكتبات الباركود.

8. تحليل البيانات

ملاحظه: De-تعدد الإرسال بيانات التسلسل باستخدام الموارد المستندة إلى مجموعه النظراء BaseSpace أو عن طريق تشغيل الحزمة bcl2fastq علي ملقم UNIX.

  1. تحليل البيانات الذاتية الناسخة
    1. مع البيانات fastq المتولدة من البرمجيات demultiplexing ، تشغيل "mkfastq" علي خط أنابيب تحليل البيانات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) لمزيد من demultiplex كل الباركود الأحجار الكريمة.
    2. تشغيل "العد" لأداء المحاذاة ، والتصفية ، والعد الباركود ، والعد اومي.
    3. بشكل اختياري ، تشغيل "aggr" لتجميع مسارات تسلسل متعددة من تجربه واحده.
    4. استخدام "متصفح الخلية" (انظر جدول المواد) لتصور البيانات ، وخلايا الكتلة ، وتحديد الجينات المعرب عنها بشكل مختلف ، وتوليد tsne أو التعبير الجينات خريطة الحرارة المؤامرات.
    5. وبشكل اختياري ، استخدم النظام الأساسي القائم علي البحث والتطوير25 (انظر جدول المواد) لتطبيع البيانات وقياسها ، وتحديد الجينات المعرب عنها بشكل مختلف ، وتوليد مخططات TSNE/umap وخرائط التعبير الجيني (الشكل 3).
  2. تحليل بيانات الرمز الشريطي المضاعف
    1. تحليل البيانات المستمدة من استراتيجية الترميز القائمة علي الدهن
      1. استخدام خط أنابيب تحليل البيانات المتاحة تجاريا أو deMULTIplex R حزمه (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq) لتحويل نموذج الملفات fastq الباركود في عينه الباركود اومي العد مصفوفة.
      2. تحميل مصفوفة العد اومي الباركود مع البيانات الداخلية الناسخ إلى منصة القائم علي R (انظر جدول المواد) لتحليل التكامل (الشكل 3).
    2. تحليل البيانات المستمدة من استراتيجية الترميز القائمة علي الأجسام المضادة
      1. استخدم "count" من خط أنابيب تحليل البيانات المتاحة تجاريا لتعيين الرموز الشريطية عن طريق توفير ملف csv الخاص بالمكتبة وملف CSV المرجعي لميزه الوسم.
      2. تحميل الإخراج الموحدة ميزه-مصفوفة الباركود ، والذي يحتوي علي عدد التعبيرات الجينية إلى جانب تعداد الباركود ميزه لكل الباركود الخلية ، إلى منصة المستندة إلى R للتحليل المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الدراسة ، استخدمنا الماوس القلب الجنيني كمثال لإظهار كيفيه الإرسال المتعدد خليه واحده mRNA التسلسل تم تنفيذها لمعالجه عينات مختلفه من أجزاء منفصلة من الجهاز في وقت واحد. تم عزل e 18.5 CD1 الماوس قلوب وتشريحها في الأذين الأيسر (LA) ، الأذين الأيمن (RA) ، البطين الأيسر (LV) والبطين الأيمن (RV). ثم تم تلوين الخلايا الاذينيه والبطينية بشكل مستقل باستخدام اجراء الترميز القائم علي الدهن ومزجها معا قبل توليد الأحجار الكريمة والنسخ العكسي. وترد النظرة العامة التخطيطية في الشكل 1. ونحن كميه تركيز cDNA قبل بناء المكتبة (الشكل 2ا). واحده من الاختلافات في أداء الإرسال المضاعف scRNA-Seq من معيار scRNA-Seq هو ان مكتبه cDNA الذاتية والعينة الباركود cDNA مكتبه تم الحصول عليها بشكل منفصل بعد cDNA التضخيم وتنقيه (الخطوة 4-2-1 و 4.2.2.2). وقد تاهلت المكتبتان أيضا في تجربتنا (الشكل 2ب ، ج). واجري الجيل التالي من التسلسل وتحليل البيانات تليها بناء المكتبات ومراقبه الجودة.

استخدمنا منصة HiSeqX لتتابع كلتا المكتبتين في نفس المسار التسلسلي. مع بيانات التسلسل ، قمنا أولا بفصل بيانات النسخة المحلية وبيانات الباركود باستخدام برنامج BaseSpace. ثم حللنا التعبير الباركود في كل خليه واحده وجدت 8 مجموعات من الخلايا الوحيدة التي تعبر بشكل فريد عن نوع واحد من الباركود ، والتي تمثل خلايا من 8 عينات مختلفه (رقم 3ا). الاضافه إلى ذلك ، وجدنا أيضا ان بعض الخلايا لا تعبر عن اي الباركود ، والتي تعرفنا بأنها الخلايا السلبية ، وبعض الخلايا التعبير عن اثنين من الباركود مختلفه ، والتي تمثل المشككين (الشكل 3ب). وباختصار ، وجدنا ان حوالي 70 ٪ من الخلايا هي singlets ، 25 ٪ من الخلايا السلبية و 5 ٪ من الخلايا هي المشككين.

مع الخلايا المفردة ، يمكننا اجراء المزيد من التحاليل المجرية لفهم التغاير الخلوي والانظمه الجزيئية. ويمكن ان تكون التحليلات المحتملة هي التعليق التوضيحيلنوعالخلية (الشكل 4ا) ، وتحديد نوع الخلية الجديدة/النادرة (الشكل 4ب) ، والتحليل المقارن للمناطق التشريحية (الشكل 4(ج)) ، وتحليل مسار علم الجينوم الجيني مثل فصل مراحل دوره الخلية.

Figure 1
الشكل 1: تعدد الإرسال التسلسلي لخليه واحده سير العمل. تم تحليل اليوم الجنيني 18.5 المرحلة القلوب باستخدام اجراء التسلسل خليه واحده متعددة المستندة إلى الحبريه. RT = النسخ العكسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية لمراقبه الجودة في خطوات مختلفه. (ا) تحليل لمراقبه الجودة من cdna من الخطوة 4.1.7. حجم الجزء الهدف هو 200 إلى 9000 bp. (ب) المكتبة المحلية و (ج) تم تحليل مكتبه الباركود مع أداه الكهربائي الألى. حجم الجزء الهدف للمكتبة الذاتية هو 300-600 bp ، ومكتبه الباركود حجم الحمض النووي حول 172 bp. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أزاله بيانات التسلسل من استراتيجية الترميز القائمة علي الدهن. (ا) التحليل غير الخاضع للرقابة لتعبير الباركود. يمثل المحور س الخلايا المفردة ، ويمثل المحور ص الباركود. تم تحديد كل من 8 خلايا واحده السكان للتعبير بشكل فريد واحد من الباركود 8. لاحظ بعض الخلايا التعبير عن أكثر من الباركود واحد ، وبعض الخلايا لا تعبر عن اي الباركود. (ب) مؤامرة t-sne من الخلايا المفردة ، والخلايا صدر ، والخلايا السالبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحليل المتقدم لبيانات الخلية الواحدة. (الف-دال) يمكن تحليل البيانات أحاديه الخلية بطرق مختلفه لفهم التغاير الخلوي والمسارات الجزيئية. وقد أدرجنا عده تطبيقات هنا كامثله. تم تحميل الخلايا المفردة في حزمه R للتعرف علي أنواع الخلايا (A) ، ومجموعات الخلايا النادرة (B) ، والمناطق التشريحية للخلايا (C) ، ومراحل دوره الخلايا (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

اسم الخليط تكوين
خليط كولاجيناز 10 ملغ/مل كولاجيناز A و 10 ملغ/مل كولاجيناز ب ، المذاب في HBSS + + مع 40 ٪.
2 ميكرون مرساه/الباركود الحل الأسهم مزيج 50 μM مرساه و 10 ميكرون حبلا الباركود في 1:1 نسبه المولي في الاذاعه التلفزيونية (بدون أو جيش صرب الجمهورية) لحجم إجمالي من 25 μL.
2 μM المشارك مرساه الحل الأسهم تمييع 1 μL 50 μM Co-مرساه مع 24 μL التلفزيونية (بدون الجيش الصربي أو الصرب البوسنيين).
تلطيخ العازلة [ببس] يحتوي 2% [بوسني], 0.01% [توين] 20
الخليط الرئيسي 20 μL RT الكاشف ، 3.1 μL Oligo ، 2 μL الحد من وكيل B ، 8.3 μL RT انزيم C.
الخرز تنظيف الخليط 182 المخزن المؤقت تنظيف μL ، 8 μL الكاشف التحديد ، 5 μL الحد من العامل B ، 5 μL النيوداز-المياه الحرة.
التضخيم تفاعل الخليط 1 μL من 10 μM الدهون--الموسومة التمهيدي المضافة ، 15 μL cDNA التمهيدي ، 50 μL أمبير ميكس
حل التملص 98 μl العازلة EB ، 1 μL 10 ٪ توين 20 ، 1 μL الحد من عامل B.
خليط التفتيت 5 μL تجزئه المخزن المؤقت ، 10 μL تجزئه انزيم.
خليط محول الربط 20 μL العازلة الربط ، 10 μL الحمض النووي Ligase ، 20 μL محول Oligos.
نموذج مؤشر PCR المخلوط 50 μL أمبير ميكس ، 10 μL SI التمهيدي
خليط مكتبه الباركود الدهون 26.25 μL من 2 × الساخنة بدء المزيج الرئيسي ، 2.5 μL من 10 μM RPIX التمهيدي ، 2.5 μL من 10 μM دعامات محول العالمي التمهيدي (انظر جدول المواد)
خليط مكتبه الباركود الأجسام المضادة 50 μl من 2 × الساخنة بدء المزيج الرئيسي ، 2.5 μl من 10 μm rpix التمهيدي ، 2.5 μl من 10 μm 5-الذكية pcr اليغو الهجين

الجدول 1: خلائط الكاشف المستخدمة في البروتوكول.

إجراءات الاحتضان درجه الحرارة(1) الوقت
حضانة جوهره-RT غطاء درجه الحرارة 53 درجه مئوية
الخطوة 1 53 درجه مئوية 45 دقيقه
الخطوة 2 85 درجه مئوية 5 دقائق
الخطوة 3 4 درجه مئوية عقد
10x الجينوم cDNA التضخيم غطاء درجه الحرارة 105 درجه مئوية
الخطوة 1 98 درجه مئوية 3 دقائق
الخطوة 2 98 درجه مئوية 15 ثانيه
الخطوة 3 63 درجه مئوية 20 ثانيه
الخطوة 4 72 درجه مئوية 1 دقيقه
الخطوة 5 كرر الخطوات من 2 إلى 4 لدورات 12 في المجموع (2)
الخطوة 6 72 درجه مئوية 1 دقيقه
الخطوة 7 4 درجه مئوية عقد
بناء المكتبات غطاء درجه الحرارة 65 درجه مئوية
قبل بارد كتله 4 درجه مئوية عقد
التجزئه 32 درجه مئوية 5 دقائق
نهاية الإصلاح والمخلفات 65 درجه مئوية 30 دقيقه
عقد 4 درجه مئوية عقد
محول ربط درجه حرارة الغطاء 30 درجه مئوية
الخطوة 1 20 درجه مئوية 15 دقيقه
الخطوة 2 4 درجه مئوية عقد
نموذج مؤشر PCR غطاء درجه الحرارة 105 درجه مئوية
الخطوة 1 98 درجه مئوية 45 s
الخطوة 2 98 درجه مئوية 20 ثانيه
الخطوة 3 54 درجه مئوية 30 ثانيه
الخطوة 4 72 درجه مئوية 20 ثانيه
الخطوة 5 كرر الخطوات من 2 إلى 4 لدورات 12 في المجموع (3)
الخطوة 6 72 درجه مئوية 1 دقيقه
الخطوة 7 4 درجه مئوية عقد
مكتبه الباركود الدهون PCR
الخطوة 1 95 درجه مئوية 5 دقائق
الخطوة 2 98 درجه مئوية 15 ثانيه
الخطوة 3 60 درجه مئوية 30 ثانيه
الخطوة 4 72 درجه مئوية 30 ثانيه
الخطوة 5 كرر الخطوات من 2 إلى 4 لمده 10 دورات في المجموع (4)
الخطوة 6 72 درجه مئوية 1 دقيقه
الخطوة 7 4 درجه مئوية عقد
الأجسام المضادة مكتبه الباركود PCR
الخطوة 1 95 درجه مئوية 3 دقائق
الخطوة 2 95 درجه مئوية 20 ثانيه
الخطوة 3 60 درجه مئوية 30 ثانيه
الخطوة 4 72 درجه مئوية 20 ثانيه
الخطوة 5 كرر الخطوات من 2 إلى 4 ل 8 دورات في المجموع (5)
الخطوة 6 72 درجه مئوية 5 دقائق
الخطوة 7 4 درجه مئوية عقد

الجدول 2: إجراءات الاحتضان المستخدمة في البروتوكول. (1) إيلاء الاهتمام لدرجه حرارة الغطاء المختلفة المستخدمة في كل اجراء. (2) مجموعه أرقام دوره مجموع وفقا لحموله الخلية: 13 دورات ل < 500 خليه الحمل ؛ 12 دورات ل 500-6000 خليه تحميل; 11 دورات ل > 6000 خليه تحميل. (3) مجموعه أرقام دوره مجموع وفقا لإدخال cDNA: 14-16 دورات لل 1-25 ng cDNA; 12-14 دورات ل25-150 ng cDNA; 10-12 دورات ل150-500 ng cDNA; 8-10 دورات لل 500-1000 نانوغرام cDNA; 6-8 دورات لل 1000-1500 ng cDNA. (4) مجموعه أرقام دوره مجموع وفقا لإدخال cDNA: 8-12 دورات. (5) مجموعه أرقام دوره مجموع وفقا لإدخال cDNA: 6-10 دورات.

الدهن القائم علي الكتابة الخيطية لقله الكريات
مرساه الكائن المحور 5 '-TGGAATTCTCGGGTGAAGGGTAACGATAGCTGTCACT-الدهن-3 '
شارك في مرساه الكائن المحور 5 '-الدهن-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-3 '
الباركود Oligo 5 '-CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNNNA30-3 '
الشفرة المضافة للدهون 5 '-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3 '
RPIX التمهيدي 5 '-كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتنننننجتجاكتجاجتكك
TTGGCACCCGAGAATTCCA-3 '
محول التمهيدي العالمي 5 '-اتجاتاكجبغاكاكريكاتكتاكستكاكتوكتاكسكتاكككتاك
GCTCTTCCGATCT-3 '
الأجسام المضادة القائمة علي الترميز قله الكريات
الأجسام المضادة الترميز اليغو 5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN
المجموعة الثالثة * ا * ا-3 ' (الانجليزيه)
التمهيدي المضافة HTO 5 '-GTGACTGGAGTTCAGGTGCTC-3 '
التمهيدي المضافة المحاسبة 5 '-CCTTGGCACCCGAGAATTCC-3 '
[ف 5-سمارت-بكر] هجينة [اولغو] 5 '-اتجاتاكغغكباكاكجكاتكتاكسكتاكغستكككتكوجبغا
GCAGTGGTATCAACGCAGAGT * A * C-3 '

الجدول 3: المتواليات المستخدمة في هذا البروتوكول. N = الباركود أو تسلسل الفهرس; * = السندات الفوسفرووثيواتي

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة ، وقد أظهرنا بروتوكول لتحليل الملفات الشخصية الاحاديه الخلية. كما قدمنا طريقتين اختياريه لعينات متعددة الإرسال في سير العمل المتسلسل scRNA. وقد ثبت ان كلا الأسلوبين ممكنة في مختبرات مختلفه وقدمت حلولا لتشغيل تجربه خليه واحده فعاله من حيث التكلفة وخاليه من التاثير الدفعي18,26.

هناك بعض الخطوات التي ينبغي اتباعها بعناية عند الذهاب من خلال البروتوكول. وينبغي ان يكون التعليق المثالي للخلية الواحدة > 90 ٪ من الخلايا القابلة للحياة وينبغي ان تكون كثافة الخلايا أيضا ضمن نطاق محدد27. من الضروري الحصول علي نوعيه جيده من الخلايا للتقليل من وجود المجاميع الخلوية ، والحطام ، وألياف. المجاميع الخلوية لها تاثير سلبي علي الإرسال المضاعف للعينه ولديها مخاطر محتمله لتسد اله توليد الحبريه17. عموما ، 30-40 ميكرون مصفاه الخلية مثاليه لأزاله كتل كبيره والحطام مع الحفاظ علي عينات الخلية لان معظم الخلايا سوف يتقلص اقل من 30 μm بعد التفكك. ويوصي نوى خليه واحده لاستخدام بدلا من ذلك إذا كان قطر الخلية أكبر من 30 μm. في المراحل الجنينية المبكرة ، يجب ان يكون حجم الخلية لجميع أنواع خلايا الماوس أصغر من 30 μm. ومع ذلك ، في مراحل لاحقه ، والعضلي في القلب ، والخلايا العصبية في الدماغ ، العضلات في الأطراف ، وبعض الخلايا الدهنية قد يكون حجم الخلية أكبر من 30 μm. يجب قياس حجم الخلية لهذه الأنواع من الخلايا قبل بدء التجارب خليه واحده.

وتوفر استراتيجيات تعدد الإرسال طريقه للتحليل المتزامن لعدد كبير من العينات بطريقه فعاله من حيث التكلفة. الاضافه إلى ذلك ، من خلال تنميط عينات متعددة معا ، يمكننا تجنب بشكل كبير اثار الدفعات وتحديد المشككات الخلية. هذه المزايا سوف تكون جذابة جدا لحقل خليه واحده. ومع ذلك ، هناك بعض العوامل التي قد تحد من استخدامها. وكلما زاد عدد الخلايا المعددة في تجربه واحده ، ستزداد أيضا نسبه الخلية المضاعفة. علي الرغم من ان هذه الشكوك يمكن تحديدها وأزالها عن طريق تحليل بيانات الباركود الإرسال المضاعف ، فانه سيؤدي إلى مضيعه كبيره من التسلسل يقرا. الاضافه إلى ذلك ، كلما تم تجميع المزيد من الخلايا معا ، تكون الخلايا أسهل في الكسر وتسبب زيادة في المحيط ، والتي سيتم التقاطها في قطرات مع الخلايا وتتداخل مع حساسية الكشف. ونحن نتوقع ان المزيد من التحسين في سير العمل التجريبي أو خط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية سيحل هاتين المسالتين في المستقبل القريب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي صاحبي البلاغ اي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نشكر ديفيد م. باترسون وكريستوفر س. ماجينس من مختبر الدكتور زيف غارتنر لتوريدها النوع من الكواشف الشفرة القائمة علي الدهن واقتراحات بشان الخطوات التجريبية وتحليل البيانات. تاسست هذه الاعمال من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HL13347202).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
  22. SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
  23. Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
  24. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).

Tags

علم الاحياء التنموي العدد 155 خليه واحده mRNA-التسلسل الانسجه الجنينية الماوس تطوير القلب الباركود متعدد دي الإرسال المتعدد تحليل البيانات
مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, W., Przysinda, A., Li, G.… More

Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter