Summary
Her præsenterede vi en multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering metode til profil genekspression i mus embryonale væv. Den droplet-baserede enkelt celle mRNA sekventering (scrna-SEQ) metode i kombination med multiplexing strategier kan profilere enkeltceller fra flere prøver samtidigt, hvilket reducerer reagens omkostningerne betydeligt og minimerer eksperimentelle batch effekter.
Abstract
Enkelt celle mRNA sekventering har gjort betydelige fremskridt i de sidste mange år og er blevet et vigtigt redskab inden for udviklingsmæssige biologi. Det er blevet brugt med succes til at identificere sjældne cellepopulationer, opdage nye markørgener, og afkode rumlige og tidsmæssige udviklingsmæssige oplysninger. Den enkelt celle metode har også udviklet sig fra den mikrofluidisk baseret fluidigm C1-teknologi til de droplet-baserede løsninger i de sidste to til tre år. Her brugte vi hjertet som et eksempel til at demonstrere, hvordan man profilere mus embryonale vævsceller ved hjælp af dråbe baseret scRNA-SEQ metode. Derudover har vi integreret to strategier i arbejdsprocessen for at profilere flere prøver i et enkelt eksperiment. Ved hjælp af en af de integrerede metoder, vi har samtidig profileret mere end 9.000 celler fra otte hjerte prøver. Disse metoder vil være værdifulde for udviklingsbiologi felt ved at give en omkostningseffektivmåde at samtidig profilere enkeltceller fra forskellige genetiske baggrunde, udviklingsmæssige stadier, eller anatomiske steder.
Introduction
Den transkriptionelle profil af hver enkelt celle varierer blandt cellepopulationer under fosterudviklingen. Selv om en enkelt Molekylær in situ-hybridisering kan bruges til at visualisere et lille antal gener1, giver enkelt celle mRNA-sekventering (scrna-SEQ) en upartisk tilgang til at illustrere Genome-dækkende udtryks mønstre af gener i enkeltceller. Efter at det først blev offentliggjort i 20092, er scrna-SEQ blevet anvendt til at studere flere væv på flere udviklingsmæssige stadier i de seneste år3,4,5. Også, som den menneskelige celle Atlas har lanceret sine udviklingsorienterede projekter for nylig, mere enkelt celledata fra humane embryonale væv forventes at blive genereret i den nærmeste fremtid.
Hjertet som det første organ til at udvikle spiller en afgørende rolle i fosterudviklingen. Hjertet består af flere celletyper og udviklingen af hver celletype er stramt reguleret tidsmæssigt og rumligt. I løbet af de sidste par år, oprindelse og celle Lineage af hjerte celler på tidlige udviklingsmæssige stadier har været karakteriseret6, som giver en enorm nyttig navigation værktøj til at forstå medfødt hjertesygdomme patogenese, samt for at udvikle mere teknologisk avancerede metoder til at stimulere kardiomyocyte Regeneration7.
Scrna-SEQ har gennemgået en hurtig ekspansion i de seneste år8,9,10. Med de nyudviklede metoder er design og analyse af enkelt celle eksperimenter blevet mere opnåelige11,12,13,14. Den metode, der præsenteres her, er en kommerciel procedure baseret på dråbe opløsninger (Se tabel over materialer)15,16. Denne metode har indfangning af celler og sæt af unikt barkodede perler i en olie-vand emulsion dråbe under kontrol af et mikrofluidisk controller system. Hastigheden af celle indlæsning i dråberne er ekstremt lav, så størstedelen af dråbe emulsioner indeholder kun én celle17. Procedurens geniale design kommer fra enkelt celleseparation til dråbe emulsioner, der opstår samtidig med barkodning, hvilket muliggør parallel analyse af individuelle celler ved hjælp af RNA-SEQ på en heterogen population.
Inkorporering af multiplexing strategier er en af de vigtige Tilføjelser til den traditionelle enkelt celle workflow13,14. Denne tilføjelse er meget nyttig i kassere celle doublets, reducere eksperimentelle omkostninger, og eliminere batch effekter18,19. En lipid-baseret barkodnings strategi og en antistof baseret barkodnings strategi (Se tabel over materialer) er de to mest anvendte multiplexing metoder. Specifikke stregkoder bruges til at mærke hver prøve i begge metoder, og de mærkede prøver blandes derefter for enkelt celle optagelse, biblioteks forberedelse og sekvensering. Bagefter kan de samlede sekvensering data adskilles ved at analysere stregkode sekvenser (figur 1)19. Der er dog betydelige forskelle mellem de to metoder. Den lipid-baserede barkodnings strategi er baseret på lipid-modificerede oligonukleotider, som ikke er blevet fundet at have nogen celletype præferencer. Mens antistof baseret barkodnings strategi kun kan detektere cellerne, som udtrykker antigen proteiner19,20. Derudover tager det ca. 10 minutter at plette lipiderne, men 40 min for at plette antistofferne (figur 1). Desuden er de lipid-modificerede oligonukleotider billigere end antistof-konjugeret oligonukleotider, men ikke kommercielt tilgængelige på tidspunktet for skrivning af denne artikel. Endelig, den lipid-baserede strategi kan multiplex 96 prøver i et eksperiment, men den antistof-baserede strategi i øjeblikket kun kan multiplex 12 prøver.
Det anbefalede celle nummer til multiplex i et enkelt eksperiment bør være lavere end 2,5 x 104, ellers vil det føre til en høj procentdel af celle form og potentiel omgivende mRNA-kontaminering. Gennem multiplexing strategier, omkostningerne ved enkelt celle indfangning, cDNA generation, og bibliotek forberedelse til flere prøver vil blive reduceret til omkostningerne ved en prøve, men sekventering omkostninger vil forblive den samme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den animalske procedure er i overensstemmelse med University of Pittsburgh det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC).
1. mus embryonale hjerte dissektion og enkelt celle suspension forberedelse
Bemærk: dette trin kan tage et par timer afhængigt af antallet af embryoner til dissekere.
- For at erhverve e 18.5 embryonale hjerter, aflive en gravid CD1-mus ved co2 administration. Brug en barberkniv til at fjerne uønsket hår i maveregionen og desinficere huden med 70% ethanol.
- Skær huden på maven ved hjælp af steriliseret saks og forsigtigt dissekere embryonerne ud og hurtigt sætte dem i kold fosfat-Buffered saltvand (PBS) på is.
- Isoler hjerter fra hvert enkelt embryon omhyggeligt i en 10 cm skål fyldt med kold PBS under et stereoskopisk mikroskop ved hjælp af pincet og saks.
Bemærk: hold de fire kamre intakt ved at dissekre lungerne med hjertet sammen og ikke direkte fange/trække hjertet med kirurgiske instrumenter. - Overfør ~ 10 hjerter til en ny 10 cm skål fyldt med kolde PBS og mikro-dissekere hjerter i venstre atrium, højre atrium, venstre ventrikel, og højre ventrikel.
Bemærk: dette antages at give mere end 1 x 106 celler fra hver prøve. Vi anbefaler at starte med mindst 1 x 105 celler pr. prøve. - Overfør hvert af de 4 kammer væv til et 1,5 mL rør og hak dem i stykker ved hjælp af en saks. Centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter for at indsamle vævene.
- Efter aspirering af supernatanten tilsættes 1 mL 0,25% trypsin/EDTA til hvert rør og Inkuber i et 37 °C vandbad i 10 min. Pipet forsigtigt op og ned 7-8 gange ved hjælp af en P1000-pipette.
- Hvis fosterstadiet er ældre end e 11.5, tilsættes 1 ml 10 mg/ml kollagenase A/B-blanding og inkubateres ved 37 °c i 10-20 min. forsigtigt pipet op og ned, indtil de fleste celler er dissocierede.
- Cellerne overføres til et 15 mL rør og tilsættes 8 mL Hank's balance saltopløsning (HBSS) for at fortynde enzymerne. Drej cellerne ned ved 300 x g i 5 min. Afbryd cellerne i 1 ml PBS, og overfør dem til et 1,5 ml rør. Filtrer cellerne gennem en 40 μm celle-si.
- Tag 15 μL volumen fra hver prøve og bland med den samme mængde 0,04% trypan og et blå. Indlæs dette på en celle tælle kammer og tælle cellerne i en celle tæller.
Bemærk: for at generere resultater af høj kvalitet anbefales cellelevedygtighed at være højere end 95%.
2. enkelt celle multiplexing Barcoding
Bemærk: dette trin tager mindst 40 min, som varierer baseret på antallet af behandlede prøver. En ren bænk område behandlet med RNase dekontaminerings opløsning er nødvendig for præ-forstærkning trin (trin 2,11 til 3,11), og en separat ren bænk område er påkrævet for efter amplifikation trin (trinene efter 3,11).
-
Lipid-baseret barkodnings procedure (valgfri procedure 1)
- Baseret på celle koncentration, holde mindre end 5 x 105 celler pr prøve. Sørg for, at cellesuspensionen er fri for snavs og celle aggregater.
- Forbered 2 μM anker/stregkode stamopløsning og 2 μM Co-Anchor stamopløsning til hver prøve (tabel 1).
Bemærk: anker og co-anker blev venligt begavet af Dr. ZEV J. gartner Lab. For at syntetisere disse lipid-modificerede oligonukleotider blev DNA-sekvenser konjugeret med fedtsyre på en solid støtte og renset ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC)18,19. - Vask cellerne to gange med PBS og saml cellerne ved 300 x g i 5 min. Afbryd cellerne i 180 μl PBS.
- Tilsæt 20 μL anker/stregkode stamopløsning, og pipér forsigtigt op og ned for at blande. Inkuber på is i 5 minutter.
- Tilsæt 20 μL Co-Anchor stamopløsning, og pipér forsigtigt op og ned for at blande, og Inkuber derefter på is i yderligere 5 minutter.
- Tilsæt 1 mL kold PBS med 1% BSA og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Vask mindst 2 gange mere med iskold 1% BSA i PBS.
- Kombiner alle prøver sammen og Filtrer gennem 40 μm celle-strainere. Tæl cellerne og hold cellesuspensionen på isen til brug i afsnit 3.
-
Antistof-baseret barkodnings procedure (valgfri procedure 2)
- Centrifuge 1 x 106-2 x 106 celler for hver prøve (fra trin 1,8) ved 300 x g i 5 min og suspendere dem i 100 μl farvning buffer (tabel 1) i 1,5 ml lav binde rør.
- Tilsæt 10 μL FC-blokerende reagens, og Inkuber i 10 min ved 4 °C.
- Forbered antistoffer (Se tabel over materialer) ved at centrifuger ved 14.000 x g i 10 min ved 2-8 °c.
- Tilsæt 1 μg af hvert oligo-konjugeret antistof til 50 μL celle farvnings buffer for at gøre antistof-Farvningsopløsningen20. Tilsæt én antistof farvningsopløsning til hvert prøveglas. Inkuber i 30 min ved 4 °C.
- Vask cellerne 3 gange med 1 mL PBS, spin i 5 min ved 350 x g ved 4 °c.
- Samle alle prøver i ønskede proportioner i 1 mL farvnings buffer, spin i 5 min ved 350 x g ved 4 °c.
- Resuspension af celler i PBS ved passende koncentration (op til 1.500 celler/μL) og filter celler gennem en 40 μm celle-si. Fortsæt straks til næste trin.
3. dråbedannelse og mRNA reverse transskription
Bemærk: dette trin tager ca. 90 min. for en multiplexed reaktion.
- Du kan ækvibrere gelperlerne (Se tabel over materialer) til stuetemperatur i 30 minutter. Tag reagenser fra gel perler-i-emulsion (ædelstene) Kit (Se tabel over materialer) og holde dem på deres angivne temperatur.
- Saml chip B i en chip holder (Se tabel over materialer).
- 75 μL 50% glycerolopløsning dispenserer i de ubrugte brønde i række 1. 40 μL i række 2; 280 μL i række 3. Tilsæt ikke glycerol i nogen genvindings brønde på den øverste række af chippen.
- Forbered masterblandingen på is i henhold til tabel 1. Tilsæt passende volumen af cellesuspension og nuklease frit vand til at mestre mix i henhold til en cellesuspension volumen lommeregner tabel17 og forsigtigt pipettere blandingen. 75 μL celle blanding dispenserer i midten af prøve eksemplet godt i række 1 uden at introducere bobler.
- Vortex gel perler for 30 s ved hjælp af en vortex adapter og langsomt dispensere 40 μL gel perler i det nederste centrum af gel perle godt i række 2 uden at indføre bobler.
Bemærk: det er vigtigt at vente på 30 s mellem at tilføje celler og gel perler for at undgå befugtning fiasko. - For partitioneringsolien godt i række 3, dispensere 280 μL af partitioneringsolie gennem sidevæggen af brønden.
Bemærk: indlæsning mindre end 270 μL af partitioneringsolie vil føre til unormal ædelstene generation. - Fastgør pakningen på chippen, må du ikke trykke ned på pakningen og holde den vandret for at undgå at futte pakningen.
- Ilæg den samlede chip med pakningen i Chromium-controlleren, og Kør chrom-enkelt celle B-programmet (Se tabel over materialer), og Fortsæt straks til næste trin, når programmet er færdigt.
- Tag chippen ud og kassér pakningen. Fold låget tilbage for at udsætte brønde ved 45 °, Kontroller væskestanden for at sikre, at der ikke er nogen træsko til stede.
- Langsomt aspirere 100 μL ædelstene fra de laveste punkter i opsvinget godt og kontrollere ensartetheden af ædelstene. Lad ædelstene løbe ud i en ny polymerasekæde reaktion (PCR) på isen med pipette spidserne mod sidevæggen på røret.
Bemærk: Hvis der observeres overskydende vandigt lag, foreslås det at re-forberede prøverne. Det er vigtigt at tage et billede af blandingen, når ædelstene stadig er i pipette spidserne. Dette billede kan fortælle, hvis der er en befugtning fiasko, delvist emulgeret perler, og reagens træsko. Fotografiet kan også bruges som bevis for at få refusion fra reagens firmaet med udskiftnings reagenser og chips. - Sæt røret i en termisk variator og udfør den omvendte transkriptionsprocedure (tabel 2).
Bemærk: stop her, eller Fortsæt til næste trin. PCR-produktet kan opbevares ved-20 °C i op til en uge.
4. cDNA-forstærkning
Bemærk: dette trin tager ca. 150 min.
- Post enkelt celle Reverse transkription oprydning
- Tag cDNA-forstærknings reagenserne ud af ædelstene (Se tabel over materialer), og opbevar dem ved den angivne temperatur.
- Tilsæt 125 μL nyttiggørelses middel til prøven ved stuetemperatur for at erhverve en bifasisk blanding. Ingen uigennemsigtig væske skal observeres og undgå pipettering eller vortexning af blandingen.
- Efter at have ventet på 60 s, fjerne langsomt 125 μL af Recovery agent fra bunden af røret.
- Vortex de magnetiske perler (Se tabel over materialer) grundigt for 30 s og straks bruge det til at forberede perler oprydning blanding (tabel 1). Reagenser skal tilsættes sekventielt som anført.
- Vortex perler oprydning blanding og tilsæt 200 μL til prøven. Afpipettér blandingen 10 gange, og Inkuber den i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt reagenserne sekventielt som anført i tabel 1 for at klargøre elueringsopløsningen og belyse cDNA som følger.
- Placer prøverne på magneten (høj position) (Se tabel over materialer), indtil opløsningen ryddes, og fjern derefter supernatanten.
- Tilsæt 200 μL 80% ethanol til pellet. Vent 30 s, og fjern derefter ethanol.
- Gentag trin 4.1.6.2 for yderligere 2 gange. Centrifugeres kortvarigt og placeres på magneten (lav position). Fjern forsigtigt den resterende ethanol og lufttørre i mindre end 2 min.
Bemærk: må ikke overskride lufttørring forbi 2 min, ellers elueringsgraden effektivitet vil falde. - Fjern prøven fra magneten. Tilsæt 35,5 μL elueringsopløsning og pipette for at blande 15 gange. Inkuber 2 min ved stuetemperatur.
- Placer prøven på magneten (høj position), indtil opløsningen ryddes. Overfør 35 μL af prøven til en ny rørstrimmel.
Bemærk: denne rensnings procedure bruges også i trin 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5,8, 6.1.10 og 6.2.6. Vær opmærksom på koncentrationen af magnetiske perler og mængden af EB buffer/ultrarent vand, der anvendes til at eluere prøverne på hvert trin.
- Kvantificere størrelsen, koncentrationen og integriteten af elueret cDNA ved hjælp af et automatiseret elektroforese instrument21 (Se tabel over materialer) (figur 2).
- Forstærkning af cDNA
-
cDNA-forstærkning ved hjælp af den lipid-baserede barkodnings strategi (valgfri procedure 1)
- Forbered forstærknings reaktionsblandingen (tabel 1) på is.
- Tilsæt forstærknings reaktionsblandingen til 35 μL cDNA-prøver (fra trin 4.1.6.7). Afpipettér blandingen, og centrifugeres kortvarigt. Blandingen inkubates i en termisk variator efter cDNA-forstærknings proceduren (tabel 2).
- Efter vortexning skal der tilsættes 120 μl Select reagens og 100 μl ultrarent vand til 100 μl prøve for at opnå en 0,6 x koncentration af Select reagens (Se tabel over materialer). Afpipettér blandingen i 15 gange.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur, og Placer derefter prøven på magnet, indtil løsningerne bliver klar.
Bemærk: endogene cDNA i perlerne fraktion og multiplexing Barcoded cDNA er i supernatanten. - Supernatanten overføres til et 1,5 mL Low bind tube til multiplexing Barcoded cDNA-Biblioteks konstruktion ved trin 6,1.
- Rengør det endogene cDNA ved at følge trinene i 4.1.6 og elueres dem med 40 μl EB-buffer.
- 1 μL renset cDNA-prøvekøres på et automatiseret elektroforese instrument (Se tabel over materialer) for at analysere/kvantificere cDNA.
- Alikvot cDNA til et nyt PCR-rør til endogen Biblioteks konstruktion.
Bemærk: stop her, eller Fortsæt til næste trin. Den resterende prøve kan opbevares i-20 °C i op til 4 uger for at generere yderligere biblioteker, hvis det er nødvendigt.
-
cDNA-forstærkning i den antistof baserede barkodnings strategi (valgfri procedure 2)
- Tilsæt 2 pmol af HTO og ADT additiv primer og 15 μL cDNA-primere til 50 μL amplifikationreaktions blanding (tabel 1), og Udfør cDNA-forstærkning med cDNA-amplifikationproceduren (tabel 2).
- Brug 0,6 x Vælg reagens til at adskille endogene cDNA (perler fraktion) og multiplexing Barcode cDNA (i supernatant). Husk at gemme supernatanten til at udføre DNA bibliotek byggeri i trin 6,2.
- Rense og eluere den endogene afskrift cDNA ved at følge trinene i 4.1.6, udføre kvalitetskontrol (QC) af bibliotekerne og alikvot 10 μl i en ny PCR tube til endogene bibliotek konstruktion.
-
cDNA-forstærkning ved hjælp af den lipid-baserede barkodnings strategi (valgfri procedure 1)
5. forberedelse af endogent transskription bibliotek
Bemærk: dette trin tager ca. 120 min.
- Hold genekspressions bibliotekets konstruktions reagenser fra Biblioteks sættet (Se tabel over materialer) ved den angivne temperatur.
- Forbered fragmenteringsblandingen (tabel 1) på is, pipette for at blande og centrifugeres kortvarigt.
- Tilsæt 25 μL EB-buffer til den 10 μL rensede cDNA-prøve (fra trin 4.2.1.8 eller 4.2.2.3), og tilsæt derefter den nyligt fremstillede 15 μL fragmenteringsblanding til prøven, pipette blandingen 15 gange på isen og centrifugeres kortvarigt.
- Prøven overføres til en forkølet termisk variator, og PCR-programmet iværksættes for fragmentering, reparation og a-handel (tabel 2).
- Vortex den valgte reagens til at suspendere magnetiske perler og successivt bruge 0,6 x og 0,8 x Vælg reagenser til at foretage en dobbeltsidet størrelse udvælgelse i henhold til brugervejledningen17,22. Brug 50 μl EB-buffer til at elueres DNA'et.
- Klargør adapter ligations blandingen (tabel 1), og pipetten derefter blandingen grundigt og centrifugeres kortvarigt.
- Tilsæt 50 μL adapter ligations blanding til 50 μL prøve, pipette blandes igen i 15 gange og centrifugeres kortvarigt. Udfør adapter ligationen som pr. protokol i en termisk variator (tabel 2).
- Brug 0,8 x Select reagens til at rense ligations produktet og elueres den oprensede prøve med 30 μl EB-buffer (Se trin 4.1.6).
- Klargør prøve indeks PCR-blandingen (tabel 1), og tilsæt 60 μl til den oprensede prøve. Der tilsættes 10 μl prøve indeks til prøven, pipette blandes op og ned i 5 gange og centrifugeres kortvarigt, Inkuber i en termisk variator efterprøve indeks protokollen (tabel 2).
Bemærk: stop her, eller Fortsæt til næste trin. Hvis der anvendes mere end én brønd, vælges et specifikt eksempel indeks (Se tabel over materialer) for hver brønd. Husk at registrere det indeks-ID, der bruges til hver brønd, og sørg for, at der ikke er overlap i en multiplexed sekvensering. - Brug successivt 0,6 x og 0,8 x Vælg reagenser for at foretage en dobbeltsidet valg af størrelse for at erhverve 35 μL renset endogent celle bibliotek DNA17.
- QC det endogene cellulære bibliotek før sekvensering (figur 2).
6. fremstilling af multiplexing prøve stregkode cDNA biblioteker
Bemærk: dette trin tager mindst 120 min.
-
Eksempel på generering af stregkode biblioteker for den lipid-baserede multiplexing-strategi (valgfri procedure 1)
- Tilsæt 520 μL Select reagens og 360 μL isopropanol for at prøve stregkode cDNA fra trin 4.2.1.5 for at få en 3,2 x Select reagens koncentration. Blandingen afpipetteres 10 gange og Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Placer røret på et magnetisk rack og vent på, at opløsningen er klar. Kassér derefter supernatanten.
- Brug 500 μL 80% ethanol til at vaske perler to gange på en magnet og vent 30 s efter hver vask.
- Centrifuger kortvarigt perlerne og Placer dem på en magnet. Fjern den resterende ethanol med en P10 mikropipette og Efterlad perler i 2 min.
- Fjern røret fra magnet stativet og resuspender perlerne i 50 μL EB-buffer. Pipet op og ned for at blande grundigt. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
- Returner røret til en magnet og vent på, at opløsningen er klar. Supernatanten (prøve stregkode cDNA) overføres til et nyt PCR-rør. Vær omhyggelig med ikke at overføre nogen perler.
- Kvantificere koncentrationen af prøve stregkode cDNA23.
- Forbered lipid-stregkode Biblioteks blandingen (tabel 1), tilsæt 3,5 ng af renset Barcoded cDNA (fra trin 6.1.6) og nuklease frit vand til et samlet volumen på 50 μl.
- Opbevar den i en termisk variator efter det lipid-baserede stregkode Biblioteks PCR (tabel 2).
- Brug 1,6 x Select reagens til at rense PCR-produktet og elueres DNA med 25 μl EB-buffer (Se trin 4.1.6).
- Kvantificere Biblioteks koncentrationen ved hjælp af en højfølsom DNA-analysemetode24 fra den oprindelige fortynding af 1:5 (figur 2).
-
Eksempel på generering af stregkode biblioteker for den antistof baserede multiplexing-strategi (valgfri procedure 2)
- Tilsæt yderligere 1,4 x reaktions volumen af Select reagens til supernatanten indeholdende prøve stregkoder erhvervet fra trin 4.2.2.3 for at få en 2x Select reagens ratio.
- Perlerne vaskes med 80% ethanol ved at følge trinene i 4.1.6 og elueres det barkodede cDNA med ultrarent vand.
- Udfør udvælgelses protokollen med 2x Vælg reagens for anden gang, og elueres med ultrarent vand.
- Forbered blanding af antistof stregkode bibliotek (tabel 1), og tilsæt 45 μl renset, Barkodet cDNA fra det sidste trin.
- Inkuber i en termisk variator efter antistof stregkode Biblioteks PCR (tabel 2)20.
- Brug 1,6 x Select reagens til at rense PCR-produktet og elueres den oprensede prøve med 30 μl ultrarent vand (Se trin 4.1.6).
7. Biblioteks sekvensering
Bemærk: flere næste generations sekvensering platforme såsom HiSeq 4000 og NovaSeq kan bruges til at rækkefølge de endogene transskriptionen biblioteker og multiplexing stregkode biblioteker.
- Brug en Next Generation sekventering platform af valg til at rækkefølge de endogene transskription biblioteker og multiplexing stregkode biblioteker.
- Fortynd bibliotekerne i henhold til anbefalingerne fra en ekspert på et sekventering-eller sekventering-anlæg. Minimum 20.000 læsninger pr. celle anbefales til det endogene transskriptbibliotek, og 3000 læser for stregkode bibliotekerne.
8. data analyse
Bemærk: de-multiplex sekvensering af data ved hjælp af det skybaserede ressource BaseSpace eller ved at køre bcl2fastq-pakken på en UNIX-server.
-
Endogene transcriptome-dataanalyse
- Med fastq data genereret fra demultiplexede software, køre "mkfastq" på den kommercielt tilgængelige dataanalyse pipeline (Se tabel over materialer) til yderligere Demultiplex hver ædelstene stregkode.
- Kør "count" for at udføre justering, filtrering, stregkode optælling og UMI-optælling.
- Du skal eventuelt køre "aggr" for at samle flere sekvensering af baner fra et enkelt eksperiment.
- Brug "Cell browser" (Se tabel over materialer) til at visualisere data, klynge celler, identificere differentielt udtrykte gener, og generere tsne eller genekspression heatmap plot.
- Alternativt kan du bruge en velholdt R-baseret platform25 (Se tabel over materialer) til at normalisere og skalere data, identificere differentielt udtrykte gener og generere tsne/UMAP-plots og genekspressions Heatmaps (figur 3).
-
Multiplexing stregkodedata analyse
-
Analyse af data fra lipid baseret barkodnings strategi
- Brug den kommercielt tilgængelige dataanalyse pipeline eller deMULTIplex R-pakke (https://github.com/Chris-McGinnis-UCSF/multi-SEQ) til at konvertere eksempel stregkode fastq-filerne til et eksempel på en stregkode Umi-tæller matrix.
- Indlæs stregkode UMI-tælle matrixen sammen med endogene transkriptomdata til en R-baseret platform (Se tabel over materialer) til integrations analyse (figur 3).
-
Analyse af data fra antistof-baserede barkodnings strategi
- Brug "count" fra den kommercielt tilgængelige dataanalyse pipeline til at tilknytte stregkoderne ved at angive CSV-filen til Biblioteks CSV-fil og hashtag-funktion.
- Indlæs output Unified feature-stregkode matrix, som indeholder genekspression tæller sammen med funktions stregkode tæller for hver Cellestreg kode, til en R-baseret platform for downstream-analyse.
-
Analyse af data fra lipid baseret barkodnings strategi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse brugte vi mus embryonale hjerte som et eksempel til at udstille hvordan multiplexed enkelt celle mRNA sekventering blev udført for at behandle de forskellige prøver fra separate dele af et organ samtidigt. E 18.5 CD1 mus hjerter blev isoleret og dissekeret i venstre atrium (LA), højre atrium (RA), venstre ventrikel (LV) og højre ventrikel (RV). De atriale og ventrikulære celler blev derefter barkodet selvstændigt ved hjælp af en lipid-baserede barkodnings procedure og blandet sammen før ædelstene generation og reverse-transskription. Skematisk oversigt vises i figur 1. Vi kvantificerede cDNA-koncentrationen før Biblioteks konstruktionen (figur 2A). En af forskellene i at udføre multiplexed scRNA-SEQ fra standard scRNA-SEQ er, at det endogene cDNA-bibliotek og prøve stregkode cDNA-biblioteket blev erhvervet separat efter cDNA-forstærkning og rensning (trin 4.2.1 og 4.2.2.2). De to biblioteker blev også kvalificeret i vores eksperiment (figur 2B, C). Næste generations sekvensering og dataanalyse blev udført efterfulgt af Biblioteks konstruktion og QC.
Vi brugte HiSeqX platform til at sekvens begge biblioteker i samme sekvensering Lane. Med sekvensering data, vi først adskilt de endogene transskriptionen data og stregkodedata ved hjælp af BaseSpace program. Derefter analyserede vi stregkode udtryk i hver enkelt celle og fandt 8 grupper af enkeltceller, som entydigt udtrykker en type stregkode, der repræsenterer celler fra 8 forskellige prøver (figur 3A). Derudover konstaterede vi også, at nogle celler ikke udtrykker nogen stregkode, som vi definerede som negative celler, og nogle celler udtrykker to forskellige stregkoder, som repræsenterer form (figur 3B). Sammenfattende konstaterede vi, at omkring 70% af cellerne er singlets, 25% af cellerne er negative, og 5% af cellerne er doublets.
Med singlet-cellerne kan vi udføre yderligere downstream-analyser for at forstå cellernes heterogenitet og molekylære regler. De potentielle analyser kan være celletype anmærkning(figur 4A), ny/sjælden celletype identifikation (figur 4B), anatomisk zone komparativ analyse (figur 4C) og gene Ontology pathway analyse såsom celle cyklus fase separationer (figur 4D).
Figur 1: Multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering workflow. Embryonale dag 18,5 fase hjerter blev analyseret ved hjælp af en multiplexed dråbe baseret enkelt celle sekvensering procedure. RT = omvendt transskription. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative QC resultater på forskellige trin. (A) QC-analyse af cDNA fra trin 4.1.7. Målfragmentets størrelse er 200 til 9000 BP. (B) endogene bibliotek og (C) stregkode bibliotek blev analyseret med et automatiseret elektroforese instrument. Målfragment størrelsen for det endogene bibliotek er 300-600 BP, og stregkode bibliotekets DNA-størrelse er omkring 172 BP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Demultiplexing sekvensering data fra lipid baseret barkodnings strategi. A) uovervåget analyse af stregkode udtrykket. X-aksen repræsenterer enkelte celler, og y-aksen repræsenterer stregkoder. Hver af de 8 enkelt cellepopulationer blev identificeret til entydigt at udtrykke en af de 8 stregkoder. Bemærk nogle celler udtrykker mere end én stregkode, og nogle celler udtrykker ikke stregkoder. B) t-sne-plot af singlet-cellerne, tvivlet-cellerne og negative celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: avanceret analyse af enkelt celle transkriptionelle data. (A-D) Enkelt celledata kan analyseres på forskellige måder for at forstå cellernes heterogenitet og molekylære veje. Vi har listet flere ansøgninger her som eksempler. Enkeltceller blev indlæst i en R-pakke for at identificere celletyper (A), sjældne cellepopulationer (B), celle anatomiske zoner (C) og celle cyklus faser (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på blanding | Sammensætning |
| Blanding af kollagenase | 10 mg/ml kollagenase A og 10 mg/ml kollagenase B, opløst i hbss + + med 40% FBS. |
| 2 μM anker/stregkode stamopløsning | Bland 50 μM anker og 10 μM stregkode streng i 1:1 molær ratio i PBS (uden FBS eller BSA) for et samlet volumen på 25 μL. |
| 2 μM Co-anker stamopløsning | 1 μL 50 μM Co-anker med 24 μL PBS (uden FBS eller BSA) fortyndes. |
| Farvnings buffer | PBS indeholdende 2% BSA, 0,01% Tween 20 |
| Master blanding | 20 μL RT-reagens, 3,1 μL oligo, 2 μL reduktionsmiddel B, 8,3 μL RT enzym C. |
| Perler oprydning blanding | 182 μL oprydnings buffer, 8 μL Selektionsreagens, 5 μL reduktionsmiddel B, 5 μL nuklease frit vand. |
| Blanding af forstærknings reaktion | 1 μL 10 μM lipid-mærket additiv primer, 15 μL cDNA-primer, 50 μL amp mix |
| Elueringsløsning | 98 μL buffer EB, 1 μL 10% Tween 20, 1 μL reduktionsmiddel B. |
| Fragmentering blanding | 5 μL fragmentering buffer, 10 μL fragmentering enzym. |
| Blanding af adapter-ligation | 20 μL Ligations buffer, 10 μL DNA-Ligase, 20 μL adapter Oligoer. |
| Prøve indeks PCR-blanding | 50 μL amp mix, 10 μL SI primer |
| Lipid stregkode bibliotek blanding | 26,25 μL af 2 × hot start Master Mix, 2,5 μL af 10 μM RPIX primer, 2,5 μL 10 μM TruSeq universal adapter primer (se tabel over materialer) |
| Antistof stregkode bibliotek blanding | 50 μL 2 × hot start Master Mix, 2,5 μL 10 μM RPIX primer, 2,5 μL 10 μM P5-Smart-PCR hybrid oligo |
Tabel 1: de reagens blandinger, der anvendes i protokollen.
| Inkuberet procedure | Temperatur(1) | Tid |
| GEM-RT inkubation | Låg temperatur 53 °C | |
| Trin 1 | 53 °C | 45 min |
| Trin 2 | 85 °C | 5 min |
| Trin 3 | 4 °C | Holde |
| 10x Genomics cDNA amplifikation | Låg temperatur 105 °C | |
| Trin 1 | 98 °C | 3 min |
| Trin 2 | 98 °C | 15 s |
| Trin 3 | 63 °C | 20 s |
| Trin 4 | 72 °C | 1 min |
| Trin 5 | Gentag trin 2 til 4 for 12 cyklusser i alt (2) | |
| Trin 6 | 72 °C | 1 min |
| Trin 7 | 4 °C | Holde |
| Bibliotek byggeri | Låg temperatur 65 °C | |
| Pre-cool blok | 4 °C | Holde |
| Fragmentering | 32 °C | 5 min |
| reparation og A-handel | 65 °C | : 30 minutters |
| Holde | 4 °C | Holde |
| Adapter ligering | Låg temperatur 30 °C | |
| Trin 1 | 20 °C | : 15 minutters |
| Trin 2 | 4 °C | Holde |
| Sample index PCR | Låg temperatur 105 °C | |
| Trin 1 | 98 °C | 45 s |
| Trin 2 | 98 °C | 20 s |
| Trin 3 | 54 °C | 30 s |
| Trin 4 | 72 °C | 20 s |
| Trin 5 | Gentag trin 2 til 4 for 12 cyklusser i alt (3) | |
| Trin 6 | 72 °C | 1 min |
| Trin 7 | 4 °C | Holde |
| Lipid stregkode bibliotek PCR | ||
| Trin 1 | 95 °C | 5 min |
| Trin 2 | 98 °C | 15 s |
| Trin 3 | 60 °C | 30 s |
| Trin 4 | 72 °C | 30 s |
| Trin 5 | Gentag trin 2 til 4 for 10 cyklusser i alt (4) | |
| Trin 6 | 72 °C | 1 min |
| Trin 7 | 4 °C | Holde |
| Antistof stregkode bibliotek PCR | ||
| Trin 1 | 95 °C | 3 min |
| Trin 2 | 95 °C | 20 s |
| Trin 3 | 60 °C | 30 s |
| Trin 4 | 72 °C | 20 s |
| Trin 5 | Gentag trin 2 til 4 for 8 cyklusser i alt (5) | |
| Trin 6 | 72 °C | 5 min |
| Trin 7 | 4 °C | Holde |
Tabel 2: den inkuberet procedure, der anvendes i protokollen. (1) Vær opmærksom på de forskellige låg temperatur, der anvendes i hver procedure. (2) Indstil samlede cyklus numre i henhold til celle belastningen: 13 cyklusser for < 500 celle belastning; 12 cyklusser for 500-6000 celle belastning; 11 cyklusser for > 6000 celle belastning. (3) Indstil samlede cyklus numre i henhold til cDNA-indgangen: 14-16 cyklusser for 1-25 ng cDNA; 12-14 cyklusser for 25-150 ng cDNA; 10-12 cyklusser for 150-500 ng cDNA; 8-10 cyklusser for 500-1000 ng cDNA; 6-8 cyklusser for 1000-1500 ng cDNA. (4) Indstil samlede cyklus numre i henhold til cDNA-indgangen: 8-12 cyklusser. (5) Indstil samlede cyklus numre i henhold til cDNA-indgangen: 6-10 cyklusser.
| Lipid baseret DNA oligonucleotides | |
| Anker LMO | 5 '-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGGTAACGATCCAGCTGTCACT-lipid-3 ' |
| Co-anker LMO | 5 '-lipid-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-3 ' |
| Stregkode oligo | 5 '-CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNNNA30-3 ' |
| Lipid DNA additiv primer | 5 '-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3 ' |
| RPIX primer | 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCC TTGGCACCCGAGAATTCCA-3 ' |
| Universal adapter primer | 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCT-3 ' |
| Antistof baseret barkodende oligonukleotider | |
| Antistof DNA oligo | 5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN NNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA * A * A-3 ' |
| HTO additiv primer | 5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC-3 ' |
| ADT additiv primer | 5 '-CCTTGGCACCCGAGAATTCC-3 ' |
| P5-Smart-PCR hybrid oligo | 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTGTCCGCGGAA GCAGTGGTATCAACGCAGAGT * A * C-3 ' |
Tabel 3: Oligonukleotidsekvenser, der anvendes i denne protokol. N = stregkode eller indeks sekvens; * = Phosphorothioat Bond
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse har vi demonstreret en protokol til at analysere enkelt celle transkriptionelle profiler. Vi har også givet to fakultative metoder til multiplex-prøver i arbejdsgangen for scRNA-SEQ. Begge metoder har vist sig at være gennemførlige på forskellige laboratorier og leverede løsninger til at køre en omkostningseffektiv og batch effekt-gratis enkelt celle eksperiment18,26.
Der er et par skridt, der bør følges nøje, når de går gennem protokollen. En ideel enkelt cellesuspension bør have > 90% af levedygtige celler og celletætheden bør også være inden for et bestemt interval27. Det er afgørende at opnå en god kvalitet af celler for at minimere tilstedeværelsen af cellulære aggregater, snavs og fibre. Cellulære aggregater har negativ indvirkning på prøve multiplexing og har en potentiel risiko for at tilstoppe den dråbe dannende maskine17. Generelt er en 30-40 μm cellefilter ideel til at fjerne store klumper og snavs, mens de bevarer celle prøverne, fordi de fleste celler vil skrumpe under 30 μm efter dissociation. Enkelt cellekerner anbefales at bruge i stedet, hvis celle diameteren er større end 30 μm. Ved tidlige embryonale stadier bør cellestørrelsen for alle typer museceller være mindre end 30 μm. Men på senere stadier, kardiomyocytterne i hjertet, neuroner i hjernen, muskelceller i lemmer, og nogle fedt celler kan have en Cellestørrelse større end 30 μm. cellestørrelsen skal måles for disse typer celler, før de enkelte celle eksperimenter påbegyndes.
De multiplexing strategier giver en måde at samtidig analysere et stort antal prøver på en omkostningseffektivmåde. Hertil kommer, ved at profilere flere prøver sammen, kan vi i høj grad undgå batch effekter og identificere celle doublets. Disse fordele vil være meget attraktive for det indre celle felt. Men, der er nogle faktorer, der kan begrænse deres brug. Da flere celler er multiplexed i et enkelt eksperiment, vil cellens Doublet-ratio også stige. Selv om disse form kan identificeres og fjernes ved at analysere multiplexing stregkodedata, vil det føre til et stort spild af sekvensering læser. Desuden, som flere celler samles sammen, cellerne er lettere at bryde og forårsage en forøgelse af den omgivende mRNA, som vil blive fanget i dråber med celler og forstyrre detekteringsfølsomhed. Vi forventer, at yderligere optimering af den eksperimentelle workflow eller Bioinformatik analyse pipeline vil løse disse to spørgsmål i den nærmeste fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker David M. Patterson og Christopher S. McGinnis fra Dr. ZEV J. gartner Lab for deres slags levering af de lipid-baserede barkodnings reagenser og forslag til eksperimentelle trin og dataanalyse. Dette arbejde blev grundlagt af National Institutes of Health (HL13347202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
- SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
- Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
- Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).
