Summary
Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.
Abstract
Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einem wichtigen Instrument auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie geworden. Es wurde erfolgreich verwendet, um seltene Zellpopulationen zu identifizieren, neue Markergene zu entdecken und räumliche und zeitliche Entwicklungsinformationen zu entschlüsseln. Die Einzelzellmethode hat sich in den letzten zwei bis drei Jahren auch von der mikrofluidischen Fluidigm C1-Technologie zu den Tropfen-basierten Lösungen entwickelt. Hier haben wir das Herz als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie man die embryonalen Gewebezellen der Maus mit der tröpfchenbasierten scRNA-Seq-Methode profiliert. Darüber hinaus haben wir zwei Strategien in den Workflow integriert, um mehrere Samples in einem einzigen Experiment zu profilieren. Mit einer der integrierten Methoden haben wir gleichzeitig mehr als 9.000 Zellen aus acht Herzproben profiliert. Diese Methoden werden für den Bereich der Entwicklungsbiologie wertvoll sein, indem sie eine kostengünstige Möglichkeit bieten, einzelne Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen, Entwicklungsstadien oder anatomischen Orten gleichzeitig zu profilieren.
Introduction
Das Transkriptionsprofil jeder einzelnen Zelle variiert zwischen den Zellpopulationen während der embryonalen Entwicklung. Obwohl die einzelne molekulare In-situ-Hybridisierung verwendet werden kann, um die Expression einer kleinen Anzahl von Genen1zu visualisieren, bietet die einzellige mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) einen unvoreingenommenen Ansatz zur Veranschaulichung genomweiter Expressionsmuster von Genen in Einzelzellen. Nach der erstveröffentlichung im Jahr 20092wurde scRNA-Seq in den letzten Jahren zur Untersuchung mehrerer Gewebe in mehreren Entwicklungsstadienangewendet 3,4,5. Da der Atlas der menschlichen Zellen in jüngster Zeit seine entwicklungsorientierten Projekte gestartet hat, werden in naher Zukunft weitere Einzelzelldaten aus menschlichen embryonalen Geweben erwartet.
Das Herz als erstes Organ, das sich entwickelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung. Das Herz besteht aus mehreren Zelltypen und die Entwicklung jedes Zelltyps ist zeitlich und räumlich streng reguliert. In den letzten Jahren wurden der Ursprung und die Zellabstammung von Herzzellen in frühen Entwicklungsstadien charakterisiert6, die ein enormes nützliches Navigationswerkzeug für das Verständnis der angeborenen Krankheitspathogenese bieten, sowie für die Entwicklung technologisch fortschrittlicherer Methoden zur Stimulierung der Kardiomyozytenregeneration7.
Der scRNA-Seq hat sich in den letzten Jahren rasant erweitert8,9,10. Mit den neu entwickelten Methoden ist design und analysis of single cell experiments um11,12,13,14erreichbarer geworden. Die hier vorgestellte Methode ist ein kommerzielles Verfahren, das auf den Tröpfchenlösungen basiert (siehe Materialtabelle)15,16. Diese Methode verfügt über die Erfassung von Zellen und Sets von eindeutig barcoded Perlen in einem Öl-Wasser-Emulsionströpfchen unter der Kontrolle eines mikrofluidischen Steuerungssystems. Die Rate der Zellbelastung in die Tröpfchen ist extrem niedrig, so dass die Mehrheit der Tröpfchenemulsionen nur eine Zelle17enthält. Das ausgeklügelte Design des Verfahrens ergibt sich aus der Einzelzelltrennung in Tröpfchenemulsionen, die gleichzeitig mit Barcoding auftreten, was die parallele Analyse einzelner Zellen mit RNA-Seq an einer heterogenen Population ermöglicht.
Die Integration von Multiplexing-Strategien ist eine der wichtigen Ergänzungen des traditionellen Einzelzell-Workflows13,14. Diese Ergänzung ist sehr nützlich, um Zelldoublets zu verwerfen, die experimentellen Kosten zu senken und Batcheffekte zu eliminieren18,19. Eine lipidbasierte Barcoding-Strategie und eine Antikörper-basierte Barcoding-Strategie (siehe Tabelle der Materialien) sind die beiden meist verwendeten Multiplexing-Methoden. Bestimmte Barcodes werden verwendet, um jedes Beispiel in beiden Methoden zu beschriften, und die beschrifteten Proben werden dann für die Einzelzellenerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung gemischt. Anschließend können die gepoolten Sequenzierungsdaten durch Analyse der Barcodesequenzen getrennt werden (Abbildung 1)19. Zwischen den beiden Methoden bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Die lipidbasierte Barcoding-Strategie basiert auf lipidmodifizierten Oligonukleotiden, die keine Zelltyppräferenzen haben. Während die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie kann nur die Zellen, die die Antigen-Proteine19,20. Darüber hinaus dauert es etwa 10 min, um die Lipide zu färben, aber 40 min, um die Antikörper zu färben (Abbildung 1). Darüber hinaus sind die lipidmodifizierten Oligonukleotide billiger als antikörperkonjugierte Oligonukleotide, aber zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels nicht kommerziell erhältlich. Schließlich kann die Lipid-basierte Strategie 96-Proben in einem Experiment multiplexen, aber die Antikörper-basierte Strategie kann derzeit nur Multiplex 12 Proben.
Die empfohlene Zellzahl zum Multiplex in einem einzigen Experiment sollte niedriger als 2,5 x 104sein, da sie andernfalls zu einem hohen Anteil an Zelldoublets und einer potenziellen mRNA-Kontamination in der Umgebung führt. Durch die Multiplexing-Strategien werden die Kosten für die Einzelzellerfassung, cDNA-Generierung und Bibliotheksvorbereitung für mehrere Samples auf die Kosten für eine Probe reduziert, aber die Sequenzierungskosten bleiben gleich.
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Protocol
Das Tierverfahren entspricht dem Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der University of Pittsburgh (IACUC).
1. Maus Embryonale Herzsektion und Einzelzellsuspension Separpreparation
HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Anzahl der zu sezierenden Embryonen einige Stunden dauern.
- Um E18.5 embryonale Herzen zu erwerben, einschläfern Sie eine schwangere CD1-Maus durchCO2-Verabreichung. Verwenden Sie ein Rasiermesser, um die unerwünschten Haare im Bauchbereich zu entfernen und die Haut mit 70% Ethanol zu desinfizieren.
- Schneiden Sie die Darmhaut mit einer sterilisierten Schere ab und sezieren Sie die Embryonen vorsichtig aus und legen Sie sie schnell in kalte phosphatgepufferte Saline (PBS) auf Eis.
- Isolieren Sie die Herzen von jedem einzelnen Embryo sorgfältig in einer 10 cm Schale, die mit kaltem PBS unter einem stereoskopischen Mikroskop gefüllt ist, mit Zangen und Schere.
HINWEIS: Halten Sie die vier Kammern intakt, indem Sie die Lunge mit Herz zusammen sezieren und nicht direkt fangen / ziehen Sie das Herz mit chirurgischen Instrumenten. - Übertragen Sie 10 Hearts in eine neue 10 cm Schale, gefüllt mit kaltem PBS und mikrosezieren Sie die Herzen in den linken Vorhof, rechten Vorhof, linken Ventrikel und rechten Ventrikel.
HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass dies mehr als 1 x 106 Zellen aus jeder Probe ergibt. Wir empfehlen, mit mindestens 1 x 105 Zellen pro Probe zu beginnen. - Jedes der 4 Kammergewebe in ein 1,5 ml-Rohr geben und mit einer Schere in Stücke schneiden. Zentrifuge bei 300 x g für 3 min, um das Gewebe zu sammeln.
- Nach dem Ansaugen des Überstandes 1 ml 0,25% Trypsin/EDTA zu jedem Rohr geben und in einem 37 °C-Wasserbad für 10 min inkubieren. 7-8 Mal mit einer P1000 Pipette auf und ab pfeifen.
- Wenn das embryonale Stadium älter als E11.5 ist, 1 ml 10 mg/ml Kollagennase A/B-Mischung hinzufügen und bei 37 °C für 10-20 min inkubieren. Sanft nach oben und unten pipet, bis die meisten Zellen getrennt sind.
- Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Rohr und fügen Sie 8 ml Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) hinzu, um die Enzyme zu verdünnen. Drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Rohr. Filtern Sie die Zellen mit einem 40-m-Zellsieb.
- Nehmen Sie 15 l Volumen aus jeder Probe und mischen Sie mit der gleichen Menge von 0,04% Trypan blau. Laden Sie diese auf eine Zellzählkammer, und zählen Sie die Zellen in einem Zellzähler.
HINWEIS: Um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen, wird empfohlen, die Zelllebensfähigkeit über 95 % zu erhöhen.
2. Single Cell Multiplexing Barcoding
HINWEIS: Dieser Schritt dauert mindestens 40 min, was je nach Anzahl der verarbeiteten Proben variiert. Für Vorverstärkungsschritte ist ein mit RNase-Dekontaminationslösung behandelter sauberer Bankbereich erforderlich (Schritt 2.11 bis 3.11), und für die Nachverstärkungsschritte (die Schritte nach 3.11) ist ein separater Sauberer Tischbereich erforderlich.
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Lipidbasiertes Barcoding-Verfahren (optionales Verfahren 1)
- Auf der Grundlage der Zellkonzentration, halten Sie weniger als 5 x 105 Zellen pro Probe. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension frei von Schmutz und Zellaggregaten ist.
- Bereiten Sie für jede Probe 2 -M Anker-/Barcode-Lagerlösung und 2 -M-Co-Anchor-Stock-Lösung für jede Probe vor (Tabelle 1).
HINWEIS: Der Anker und der Co-Anchor wurden freundlicherweise von Dr. Zev J. Gartner Lab geschenkt. Um diese lipidmodifizierten Oligonukleotide zu synthetisieren, wurden DNA-Sequenzen mit Fettsäure auf einer festen Stütze konjugiert und durch umgekehrte Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)18,19gereinigt. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und sammeln Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Suspend Zellen in 180 l PBS.
- Fügen Sie 20 L Anker/Barcode-Lagerlösung und Pipette sanft nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen. 5 min auf Eis bebrüten.
- Fügen Sie 20 L Co-Anker-Lagerlösung und Pipette nach oben und unten sanft nach oben und unten zu mischen, dann auf Eis für weitere 5 min inkubieren.
- 1 ml kalte PBS mit 1% BSA und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen. Mindestens 2 weitere Male mit eiskalt 1% BSA in PBS waschen.
- Kombinieren Sie alle Proben zusammen und filtern Sie sie durch 40 m Zellsiebe. Zählen Sie die Zellen und halten Sie die Zellsuspension auf Eis, um sie in Abschnitt 3 zu verwenden.
-
Antikörperbasiertes Barcoding-Verfahren (optionales Verfahren 2)
- Zentrifuge 1 x 106-2 x 106 Zellen für jede Probe (ab Schritt 1,8) bei 300 x g für 5 min und hängen sie in 100 l Färbepuffer (Tabelle 1) in 1,5 ml Niedrigbindungsrohren auf.
- Fügen Sie 10 L Fc-Blockierreagenz hinzu und brüten Sie 10 min bei 4 °C.
- Bereiten Sie Antikörper (siehe Materialtabelle) durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min bei 2-8 °C vor.
- Fügen Sie 1 g von jedem oligokonjugierten Antikörper zu 50 l Zellfärbepuffer hinzu, um eine Antikörper-Färbelösung zu bilden20. Fügen Sie jedem Probenröhrchen eine Antikörper-Färbelösung hinzu. 30 min bei 4 °C inkubieren.
- 3mal mit 1 ml PBS die Zellen waschen, 5 min bei 350 x g bei 4 °C drehen.
- Alle Proben in gewünschten Proportionen in 1 ml Färbepuffer bündeln, 5 min bei 350 x g bei 4 °C drehen.
- ResuspendZellen in PBS in entsprechender Konzentration (bis zu 1.500 Zellen/L) und Filterzellen durch ein 40-m-Zellsieb. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
3. Tröpfchengenerierung und mRNA Reverse Transkription
HINWEIS: Dieser Schritt dauert etwa 90 min für eine Multiplex-Reaktion.
- Die Gelperlen (siehe Materialtabelle)auf Raumtemperatur für 30 min ausstatten. Nehmen Sie Reagenzien aus dem Kit für Gelperlen-in-Emulsion (GEMs) heraus (siehe Materialtabelle)und halten Sie sie auf ihrer angegebenen Temperatur.
- Montieren Sie den Chip B in einen Chiphalter (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 75 l 50% Glycerinlösung in die ungenutzten Brunnen in Reihe 1; 40 l in Zeile 2; 280 l in Zeile 3. Fügen Sie Glycerin nicht in alle Erholungsbrunnen in der oberen Reihe des Chips hinzu.
- Bereiten Sie die Master-Mischung auf Eis nach Tabelle 1vor. Fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellsuspension und nukleasefreies Wasser hinzu, um die Mischung nach einem Zellsuspensionsvolumenrechner Tabelle17 zu meistern und die Mischung sanft zu pipetten. Geben Sie 75 l Zellgemisch in die untere Mitte der Probe gut in Zeile 1, ohne Blasen einzuführen.
- Vortex die Gelperlen für 30 s mit einem Wirbeladapter und langsam geben 40 l Gelperlen in der unteren Mitte der Gelperle gut in Reihe 2 ohne Blasen.
HINWEIS: Es ist wichtig, 30 s zwischen dem Hinzufügen von Zellen und Gelperlen zu warten, um einen Benetzungsfehler zu vermeiden. - Für den Trennölbrunnen in Reihe 3 280 L Trennöl durch die Seitenwand des Brunnens geben.
ANMERKUNG: Das Laden von weniger als 270 l Trennöl führt zu einer abnormalen GEMs-Generierung. - Befestigen Sie die Dichtung am Chip, drücken Sie nicht auf die Dichtung und halten Sie sie horizontal, um eine Benetzung der Dichtung zu vermeiden.
- Laden Sie den montierten Chip mit der Dichtung in den Chromregler und führen Sie das Chrom-Einzelzellen-B-Programm (siehe Tabelle der Materialien)aus, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn das Programm abgeschlossen ist.
- Nehmen Sie den Chip heraus und entsorgen Sie die Dichtung. Falten Sie den Deckel zurück, um Brunnen bei 45° freizulegen, überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand, um sicherzustellen, dass keine Clogs vorhanden sind.
- Saugen Sie langsam 100 l GEMs von den tiefsten Punkten des Bergungsbrunnens an und überprüfen Sie die Homogenität der GEMs. Geben Sie GEMs in ein neues Polymerase-Kettenreaktionsrohr (PCR) auf Eis mit den Pipettenspitzen gegen die Seitenwand des Rohres.
HINWEIS: Wenn überschüssige wässrige Schicht beobachtet wird, wird empfohlen, die Proben neu vorzubereiten. Wichtig ist, nehmen Sie ein Bild der Mischung, wenn die GEMs noch in den Pipettenspitzen sind. Dieses Bild kann erkennen, ob es einen Benetzungsfehler, teilweise emulgierte GEMs und Reagenzien-Clogs gibt. Das Foto kann auch als Nachweis verwendet werden, um eine Rückerstattung von der Reagenzienfirma mit Ersatzreagenzien und Chips zu erhalten. - Legen Sie das Rohr in einen thermischen Cycler und führen Sie die umgekehrte Transkriptionsprozedur durch (Tabelle 2).
HINWEIS: Stoppen Sie hier oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Das PCR-Produkt kann bis zu einer Woche bei -20 °C gelagert werden.
4. cDNA-Verstärkung
HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 150 min.
- Nach der Rektion der einzelnen Zelle
- Nehmen Sie die cDNA-Amplifikationsreagenzien aus dem GEMs-Kit (siehe Materialtabelle)heraus und halten Sie sie auf ihrer angegebenen Temperatur.
- Fügen Sie der Probe bei Raumtemperatur 125 l Desrückgewinnungsmittel hinzu, um eine biphasische Mischung zu erhalten. Es sollte keine undurchsichtige Flüssigkeit beobachtet werden und das Pipettieren oder Wirbeln des Gemischs vermeiden.
- Nachdem Sie auf 60 s gewartet haben, entfernen Sie langsam 125 L des Wiederherstellungsmittels von der Unterseite des Rohres.
- Wirbel die magnetischen Perlen (siehe Tabelle der Materialien) gründlich für 30 s und sofort verwenden, um Perlen Reinigung Mischung vorzubereiten ( Tabelle1). Reagenzien sollten sequenziell wie aufgeführt hinzugefügt werden.
- Wirbel die Perlen Cleanup-Mischung und fügen Sie 200 l in die Probe. Pipette die Mischung 10 mal dann inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie die Reagenzien sequenziell wie in Tabelle 1 aufgeführt hinzu, um die Elutionslösung vorzubereiten und die cDNA wie folgt zu ergänzen.
- Legen Sie die Proben auf den Magneten (hohe Position) (siehe Materialtabelle), bis die Lösung sich entfernt, und entfernen Sie dann den Überstand.
- Fügen Sie dem Pellet 200 l 80 % Ethanol hinzu. Warten Sie 30 s, dann entfernen Sie das Ethanol.
- Wiederholen Sie Schritt 4.1.6.2 für weitere 2 Mal. Zentrifuge kurz und auf den Magneten legen (niedrige Position). Entfernen Sie das restliche Ethanol vorsichtig und trocknen Sie die Luft für weniger als 2 min.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Lufttrocknung nach 2 min, sonst verringert sich die Elutionseffizienz. - Entfernen Sie die Probe vom Magneten. Fügen Sie 35,5 l Elutionslösung und Pipette hinzu, um 15 Mal zu mischen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Probe auf den Magneten (hohe Position), bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 35 l der Probe auf einen neuen Rohrstreifen.
HINWEIS: Dieses Reinigungsverfahren wird auch in den Schritten 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 und 6.2.6 verwendet. Achten Sie auf die Konzentration von magnetischen Perlen und das Volumen von EB-Puffer / Reinstwasser verwendet, um die Proben bei jedem Schritt zu elute.
- Quantifizieren Sie die Größe, Konzentration und Integrität der eluierten cDNA mit einem automatisierten Elektrophorese-Instrument21 (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2).
- Amplifikation von cDNA
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cDNA-Verstärkung mit der lipidbasierten Barcoding-Strategie (optionales Verfahren 1)
- Amplifikationsreaktionsmischung (Tabelle 1) auf Eis vorbereiten.
- Fügen Sie das Amplifikationsreaktionsgemisch zu 35 l cDNA-Proben hinzu (ab Schritt 4.1.6.7). Die Mischung anpfeifen und kurz zentrieren. Inkubieren Sie das Gemisch in einem thermischen Cycler nach dem cDNA-Amplifikationsverfahren (Tabelle 2).
- Nach gründlicher Wirbelung 120 l ausgewähltes Reagenz und 100 l Reinstwasser zu 100 l Probe hinzufügen, um eine 0,6-fache Konzentration von ausgewählten Reagenzen zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien). Pipette die Mischung für 15 Mal.
- 5 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann die Probe auf den Magneten legen, bis die Lösungen klar werden.
HINWEIS: Endogene cDNA in der Perlenfraktion und Multiplexing-Barcode-cDNA ist im Überstand. - Übertragen Sie den Überstand in ein 1,5 ml Niedrigbindungsrohr für Multiplexing-Barcode-cDNA-Bibliotheksbau bei Schritt 6.1.
- Reinigen Sie die endogene cDNA, indem Sie die Schritte in 4.1.6 befolgen und sie mit 40 l EB-Puffer löschen.
- Führen Sie 1 L gereinigte cDNA-Probe auf einem automatisierten Elektrophorese-Instrument (siehe Tabelle der Materialien) aus, um die cDNA zu analysieren/quantifizieren.
- Aliquot 10 l cDNA in ein neues PCR-Rohr für den endogenen Bibliotheksbau.
HINWEIS: Stoppen Sie hier oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Die restliche Probe kann bis zu 4 Wochen in -20 °C gelagert werden, um bei Bedarf zusätzliche Bibliotheken zu generieren.
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cDNA-Verstärkung in der Antikörper-basierten Barcode-Strategie (optionales Verfahren 2)
- Fügen Sie 2 pmol HTO und ADT Additivprimer und 15 l cDNA-Primer zu 50 l Amplifikationsreaktionsmischung hinzu (Tabelle 1) und führen Sie cDNA-Verstärkung mit dem cDNA-Amplifikationsverfahren durch (Tabelle 2).
- Verwenden Sie 0.6x Select Reagenz, um endogene cDNA (Perlenfraktion) und Multiplexing Barcode cDNA (im Überstand) zu trennen. Denken Sie daran, den Überstand zu speichern, um den Konstruktionsaufbau einer Barcoding-Bibliothek in Schritt 6.2 durchzuführen.
- Reinigen und elute die endogene Transkript cDNA, indem Sie die Schritte in 4.1.6, führen Sie Qualitätskontrolle (QC) der Bibliotheken und aliquot 10 l in eine neue PCR-Röhre für den endogenen Bibliotheksbau.
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cDNA-Verstärkung mit der lipidbasierten Barcoding-Strategie (optionales Verfahren 1)
5. Endogene Transkriptbibliothek Vorbereitung
HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 120 min.
- Halten Sie die Reagenzien der Genexpression-Bibliothekskonstruktion aus dem Bibliothekskit (siehe Tabelle der Materialien) bei ihrer angegebenen Temperatur.
- Bereiten Sie die Fragmentierungsmischung (Tabelle 1) auf Eis, Pipette zu mischen und Zentrifugen kurz vorzubereiten.
- Fügen Sie der 10-L-gereinigten cDNA-Probe (ab Schritt 4.2.1.8 oder 4.2.2.3) einen 25-L-EB-Puffer hinzu und fügen Sie dann das neu hergestellte 15-L-Fragmentierungsgemisch in die Probe ein, pipetteieren Sie das Gemisch 15 Mal auf Eis und Zentrifugen kurz.
- Übertragen Sie die Probe in einen vorgekühlten Thermocycler und initiieren Sie das PCR-Programm für Fragmentierung, Endreparatur und A-Tailing (Tabelle 2).
- Vortex das ausgewählte Reagenz, um magnetische Perlen aufzuhängen und sukzessive 0,6x und 0,8x select reagenzien zu verwenden, um eine doppelseitige Größenauswahl gemäß der Bedienungsanleitung17,22zu treffen. Verwenden Sie 50 l EB-Puffer, um die DNA zu löschen.
- Adaptor-Ligationsmischung vorbereiten (Tabelle 1), dann Pipette die Mischung gründlich und Zentrifuge kurz.
- Fügen Sie 50 l Adaptor-Ligationsmischung zu 50 l Probe, Pipette-Mix wieder für 15 Mal und Zentrifuge kurz. Führen Sie die Adapterligation gemäß dem Protokoll in einem thermischen Cycler (Tabelle 2) durch.
- Verwenden Sie 0,8x Reagenz, um das Ligationsprodukt zu reinigen und die gereinigte Probe mit 30 l EB-Puffer zu reinigen (siehe Schritt 4.1.6).
- Bereiten Sie die Probenindex-PCR-Mischung vor (Tabelle 1) und fügen Sie der gereinigten Probe 60 l hinzu. Fügen Sie der Probe 10 L Probenindex, Pipettenverwechslung 5-mal und Zentrifuge für 5 Mal und Zentrifugen kurz hinzu, inkubieren Sie in einem thermischen Cycler nach dem Probenindexprotokoll (Tabelle 2).
HINWEIS: Stoppen Sie hier oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn mehr als ein Brunnen verwendet wird, wählen Sie für jeden Brunnen einen bestimmten Beispielindex (siehe Materialtabelle). Denken Sie daran, die Index-ID aufzuzeichnen, die für jeden Brunnen verwendet wird, und stellen Sie sicher, dass es keine Überlappung in einem multiplexen Sequenzierungslauf gibt. - Verwenden Sie sukzessive 0,6x und 0,8x ausgewählte Reagenzien, um eine doppelseitige Größenauswahl zu treffen, um 35 l gereinigte endogene Zellbibliothek DNA17zu erwerben.
- QC die endogene Zellbibliothek vor der Sequenzierung (Abbildung 2).
6. Vorbereitung von Multiplexing Sample Barcode cDNA Bibliotheken
HINWEIS: Dieser Schritt dauert mindestens 120 min.
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Beispiel-Barcode-Bibliotheksgenerierung für die lipidbasierte Multiplexing-Strategie (optionales Verfahren 1)
- Fügen Sie 520 l ausgewähltere Reagenz und 360 l Isopropanol zu Probe-Barcode-cDNA ab Schritt 4.2.1.5 hinzu, um eine 3,2-fache Select-Reagenzkonzentration zu erhalten. Pipette die Mischung 10 Mal und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Legen Sie das Rohr auf ein magnetisches Rack und warten Sie, bis die Lösung klar ist. Dann entsorgen Sie den Überstand.
- Verwenden Sie 500 l 80% Ethanol, um Perlen zweimal auf einem Magneten zu waschen und nach jeder Wäsche 30 s zu warten.
- Kurz zentrifugieren Sie die Perlen und legen Sie sie auf einen Magneten. Entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer P10-Mikropipette und lassen Sie Perlen für 2 min.
- Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetgestell und setzen Sie die Perlen in 50 l EB-Puffer wieder auf. Pipetten Sie nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
- Stellen Sie das Rohr zu einem Magneten zurück und warten Sie, bis die Lösung abgeklärt ist. Übertragen Sie den Überstand (Sample Barcode cDNA) auf ein neues PCR-Rohr. Achten Sie darauf, keine Perlen zu übertragen.
- Quantifizieren Sie die Konzentration des Proben-Barcodes cDNA23.
- Bereiten Sie Lipid-Barcode-Bibliotheksmischung (Tabelle 1), 3,5 ng gereinigte Barcode-cDNA (ab Schritt 6.1.6) und nukleasefreies Wasser für ein Gesamtvolumen von 50 l hinzu.
- Bewahren Sie es in einem Thermocycler nach der lipidbasierten Barcode-Bibliothek PCR (Tabelle 2).
- Verwenden Sie 1.6x Select Reagenz, um das PCR-Produkt zu reinigen und die DNA mit 25 L EB-Puffer zu reinigen (siehe Schritt 4.1.6).
- Quantifizieren Sie die Bibliothekskonzentration mit einer hochempfindlichen DNA-Analysemethode24 aus der anfänglichen Verdünnung von 1:5 (Abbildung 2).
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Beispiel-Barcode-Bibliotheksgenerierung für die Antikörper-basierte Multiplexing-Strategie (optionales Verfahren 2)
- Fügen Sie dem Überstand, der Proben-Barcodes enthält, die ab Schritt 4.2.2.3 erworben wurden, zusätzliches 1,4-faches Reaktionsvolumen des ausgewählten Reagenzes hinzu, um ein 2x select Reagenzverhältnis zu erhalten.
- Waschen Sie die Perlen mit 80% Ethanol, indem Sie den Schritten in 4.1.6 folgen und die Barcode-cDNA mit reinem Reinstwasser ausdünnen.
- Führen Sie das Auswahlprotokoll mit 2x Select Reagenz ein zweites Mal und Elute mit Reinstwasser.
- Bereiten Sie antikörper barcode library mixture (Tabelle 1) vor, und fügen Sie 45 l gereinigte barcoded cDNA aus dem letzten Schritt hinzu.
- Inkubieren in einem thermischen Cycler nach der Antikörper-Barcode-Bibliothek PCR (Tabelle 2)20.
- Verwenden Sie 1.6x Select Reagenz, um das PCR-Produkt zu reinigen und die gereinigte Probe mit 30 l Reinstwasser zu reinigen (siehe Schritt 4.1.6).
7. Bibliothekssequenzierung
HINWEIS: Mehrere Sequenzierungsplattformen der nächsten Generation wie HiSeq 4000 und NovaSeq können verwendet werden, um die endogenen Transkriptbibliotheken und Multiplexing-Barcodebibliotheken zu sequenzieren.
- Verwenden Sie eine Sequenzierungsplattform der nächsten Generation ihrer Wahl, um die endogenen Transkriptbibliotheken und Multiplexing-Barcodebibliotheken zu sequenzieren.
- Verdünnen Sie die Bibliotheken gemäß den Empfehlungen eines Experten eines Sequenzierungsunternehmens oder einer Sequenzierungseinrichtung. Für die endogene Transkriptbibliothek werden mindestens 20.000 Lesevorgänge pro Zelle und für die Barcode-Bibliotheken 3000 empfohlen.
8. Datenanalyse
HINWEIS: De-multiplex die Sequenzierungsdaten mit der cloudbasierten Ressource BaseSpace oder durch Ausführen des bcl2fastq-Pakets auf einem UNIX-Server.
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Endogene Transkriptom-Datenanalyse
- Mit den fastq-Daten, die von der Entmultiplexing-Software generiert werden, führen Sie "mkfastq" auf der kommerziell verfügbaren Datenanalysepipeline (siehe Tabelle der Materialien) aus, um jeden GEMs-Barcode weiter zu entmultiplexen.
- Führen Sie "Count" aus, um die Ausrichtung, Filterung, Barcodezählung und UMI-Zählung durchzuführen.
- Führen Sie optional "aggr" aus, um mehrere Sequenzierungsspuren aus einem einzelnen Experiment zu aggregieren.
- Verwenden Sie "Zellbrowser" (siehe Tabelle der Materialien), um Daten zu visualisieren, Zellen zu bündeln, differenziell exprimierte Gene zu identifizieren und tSNE- oder Genexpressions-Heatmap-Plots zu generieren.
- Optional verwenden Sie eine gut gepflegte R-basierte Plattform25 (siehe Materialtabelle), um Daten zu normalisieren und zu skalieren, differenziell exprimierte Gene zu identifizieren und tSNE/UMAP-Plots und Heatmaps für Genexpression zu generieren (Abbildung 3).
-
Multiplexing Barcode-Datenanalyse
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Analyse der Daten aus der lipidbasierten Barcode-Strategie
- Verwenden Sie die kommerziell erhältliche Datenanalysepipeline oder das DeMULTIplex R-Paket (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq), um die Beispiel-Barcode-FASTQ-Dateien in eine Beispiel-Barcode-UMI-Zählmatrix zu konvertieren.
- Laden Sie die Barcode-UMI-Zählmatrix zusammen mit endogenen Transkriptomdaten auf eine R-basierte Plattform (siehe Materialtabelle) für die Integrationsanalyse (Abbildung 3).
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Analyse der Daten aus der antikörperbasierten Barcode-Strategie
- Verwenden Sie "Count" aus der kommerziell verfügbaren Datenanalysepipeline, um die Barcodes zuzuordnen, indem Sie die CSV-Datei der Bibliothek und die Hashtag-Feature-Referenz-CSV-Datei bereitstellen.
- Laden Sie die ausgabeeinheitliche Feature-Barcode-Matrix, die Genexpressionszahlen zusammen mit Feature-Barcode-Zahlen für jeden Zell-Barcode enthält, auf eine R-basierte Plattform für die nachgelagerte Analyse.
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Analyse der Daten aus der lipidbasierten Barcode-Strategie
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Representative Results
In dieser Studie verwendeten wir mausembryonales Herz als Beispiel, um zu zeigen, wie multiplexierte einzelzellige mRNA-Sequenzierung durchgeführt wurde, um die verschiedenen Proben aus separaten Teilen eines Organs gleichzeitig zu verarbeiten. E18.5 CD1 Mausherzen wurden isoliert und in linkes Atrium (LA), rechtes Atrium (RA), linke Herzkammer (LV) und rechte Herzkammer (RV) seziert. Die vorgerichtlichen und ventrikulären Zellen wurden dann unabhängig mit einem lipidbasierten Barcoding-Verfahren barcoded und vor der GENERIERUNG und Reverse-Transkription von GEMs vermischt. Die schematische Übersicht ist in Abbildung 1dargestellt. Wir quantifizierten die cDNA-Konzentration vor dem Bibliotheksbau (Abbildung 2A). Einer der Unterschiede bei der Durchführung von Multiplex-ScRNA-Seq aus dem Standard scRNA-Seq ist, dass die endogene cDNA-Bibliothek und die Sample-Barcode-cDNA-Bibliothek nach cDNA-Verstärkung und -Reinigung separat erworben wurden (Schritt 4.2.1 und 4.2.2.2). Die beiden Bibliotheken waren auch in unserem Experiment qualifiziert (Abbildung 2B,C). Die Sequenzierung und Datenanalyse der nächsten Generation wurde durchgeführt, gefolgt vom Bibliotheksaufbau und QC.
Wir haben die HiSeqX-Plattform verwendet, um beide Bibliotheken in derselben Sequenzierungsspur zu sequenzieren. Mit den Sequenzierungsdaten trennten wir zunächst die endogenen Transkript- und Barcodedaten mit dem BaseSpace-Programm. Dann analysierten wir Barcode-Expression in jeder einzelnen Zelle und fanden 8 Gruppen von einzelnen Zellen, die eindeutig einen Typ von Barcode ausdrücken, die Zellen aus 8 verschiedenen Proben darstellen (Abbildung 3A). Darüber hinaus fanden wir auch heraus, dass einige Zellen keinen Barcode ausdrücken, den wir als negative Zellen definiert haben, und einige Zellen zwei verschiedene Barcodes ausdrücken, die Doublets darstellen (Abbildung 3B). Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass etwa 70 % der Zellen Singlets sind, 25 % der Zellen negativ sind und 5 % der Zellen Doublets sind.
Mit den Singletzellen können wir weitere nachgelagerte Analysen durchführen, um die zelluläre Heterogenität und molekulare Regulationen zu verstehen. Die Potentialanalysen können Zelltypanmerkungen sein (Abbildung 4A), romanische/seltene Zelltypidentifikation (Abbildung 4B), vergleichende anatomische Zonenanalyse (Abbildung 4C) und Genontologie-Signalweganalyse wie Zellzyklusphasentrennungen (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Multiplex-Einzelzell-mRNA-Sequenzierungsworkflow. Embryonale Tag 18,5-Stufenherzen wurden mit einem multiplexed Droplet-basierten Einzelzell-Sequenzierungsverfahren analysiert. RT = umgekehrte Transkription. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative QC-Ergebnisse in verschiedenen Schritten. (A) QC-Analyse von cDNA ab Schritt 4.1.7. Die Zielfragmentgröße beträgt 200 bis 9000 bp. (B) Endogene Bibliothek und (C) Barcode-Bibliothek wurden mit einem automatisierten Elektrophorese-Instrument analysiert. Die Zielfragmentgröße für die endogene Bibliothek beträgt 300-600 bp, und die DNA-Größe der Barcode-Bibliothek beträgt etwa 172 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Demultiplexing der Sequenzierungsdaten aus der lipidbasierten Barcodestrategie. (A) Unbeaufsichtigte Analyse des Barcodeausdrucks. X-Achse stellt einzelne Zellen dar, und y-Achse stellt Barcodes dar. Jede der 8 Einzelzellpopulationen wurde identifiziert, um einen der 8 Barcodes eindeutig auszudrücken. Beachten Sie, dass einige Zellen mehr als einen Barcode ausdrücken und einige Zellen keine Barcodes ausdrücken. (B) t-SNE-Diagramm der Einzelzellen, Doublet-Zellen und negativen Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erweiterte Analyse von einzelzelligen Transkriptionsdaten. (A-D) Einzelzelldaten können auf unterschiedliche Weise analysiert werden, um die zelluläre Heterogenität und molekulare Bahnen zu verstehen. Wir haben hier mehrere Anwendungen als Beispiele aufgeführt. Einzelne Zellen wurden in ein R-Paket geladen, um Zelltypen (A), seltene Zellpopulationen (B), Zellanatomzonen (C) und Zellzyklusphasen (D) zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Mischungsname | Zusammensetzung |
| Kollagenase-Mischung | 10 mg/ml Kollagenase A und 10 mg/ml Kollagenase B, gelöst in HBSS++ mit 40% FBS. |
| 2 M Anker/Barcode-Lagerlösung | Mischen Sie 50 M Anker und 10 M Barcodestrang im 1:1-Molarenverhältnis in PBS (ohne FBS oder BSA) für ein Gesamtvolumen von 25 l. |
| 2 M Co-Anchor Stofflösung | Verdünnen Sie 1 L 50 M Co-Anchor mit 24 L PBS (ohne FBS oder BSA). |
| Färbepuffer | PBS mit 2% BSA, 0,01% Tween 20 |
| Master-Mischung | 20 l RT Reagenz, 3,1 l Oligo, 2 l Reduktionsmittel B, 8,3 l RT Enzym C. |
| Perlen Cleanup Mischung | 182 l Cleanup Buffer, 8 l Selection Reagenz, 5 l Reduktionsmittel B, 5 l Nukleasefreies Wasser. |
| Amplifikationsreaktionsmischung | 1 l mit 10 -M Lipid-tagged Additive Primer, 15 l cDNA Primer, 50 l Amp Mix |
| Elution Solution | 98 L Puffer EB, 1 l 10% Tween 20, 1 l Reduktionsmittel B. |
| Fragmentierungsmischung | Fragmentierungspuffer, 10 L Fragmentierungsenzym. |
| Adaptor Ligation Mischung | 20 L Ligationspuffer, 10 L DNA Ligase, 20 L Adapter Oligos. |
| Beispielindex PCR-Mischung | 50 L Amp Mix, 10 l SI Primer |
| Lipid Barcode Bibliothek Mischung | 26,25 l mit 2 X Hot Start Master-Mix, 2,5 l von 10 M RPIX-Primer, 2,5 l von 10 'M TruSeq Universal Adapter Primer (siehe Materialtabelle) |
| Antikörper-Barcode-Bibliotheksmischung | 50 L des 2-Mal-Hot-Start-Master-Mix, 2,5 l von 10 M RPIX-Primer, 2,5 l von 10 X M P5-Smart-Pcr-Hybrid-Oligo |
Tabelle 1: Die im Protokoll verwendeten Reagenzmischungen.
| Inkubationsverfahren | Temperatur(1) | Zeit |
| GEM-RT Inkubation | Deckeltemperatur 53 °C | |
| Schritt 1 | 53 °C | 45 Min. |
| Schritt 2 | 85 °C | 5 Min. |
| Schritt 3 | 4 °C | Halten |
| 10x Genomik cDNA Amplifikation | Deckeltemperatur 105 °C | |
| Schritt 1 | 98 °C | 3 Min. |
| Schritt 2 | 98 °C | 15 s |
| Schritt 3 | 63 °C | 20 s |
| Schritt 4 | 72 °C | 1 Min. |
| Schritt 5 | Wiederholen Sie die Schritte 2 bis 4 für insgesamt 12 Zyklen (2) | |
| Schritt 6 | 72 °C | 1 Min. |
| Schritt 7 | 4 °C | Halten |
| Bibliotheksbau | Deckeltemperatur 65 °C | |
| Vorkühlblock | 4 °C | Halten |
| Fragmentierung | 32 °C | 5 Min. |
| End-Reparatur und A-Tailing | 65 °C | 30 Min. |
| Halten | 4 °C | Halten |
| Adaptor-Ligation | Deckeltemperatur 30 °C | |
| Schritt 1 | 20 °C | 15 Min. |
| Schritt 2 | 4 °C | Halten |
| Beispielindex PCR | Deckeltemperatur 105 °C | |
| Schritt 1 | 98 °C | 45 s |
| Schritt 2 | 98 °C | 20 s |
| Schritt 3 | 54 °C | 30 s |
| Schritt 4 | 72 °C | 20 s |
| Schritt 5 | Wiederholen Sie die Schritte 2 bis 4 für insgesamt 12 Zyklen (3) | |
| Schritt 6 | 72 °C | 1 Min. |
| Schritt 7 | 4 °C | Halten |
| Lipid Barcode Bibliothek PCR | ||
| Schritt 1 | 95 °C | 5 Min. |
| Schritt 2 | 98 °C | 15 s |
| Schritt 3 | 60 °C | 30 s |
| Schritt 4 | 72 °C | 30 s |
| Schritt 5 | Wiederholen Sie die Schritte 2 bis 4 für insgesamt 10 Zyklen (4) | |
| Schritt 6 | 72 °C | 1 Min. |
| Schritt 7 | 4 °C | Halten |
| Antikörper-Barcode-Bibliothek PCR | ||
| Schritt 1 | 95 °C | 3 Min. |
| Schritt 2 | 95 °C | 20 s |
| Schritt 3 | 60 °C | 30 s |
| Schritt 4 | 72 °C | 20 s |
| Schritt 5 | Wiederholen Sie die Schritte 2 bis 4 für insgesamt 8 Zyklen (5) | |
| Schritt 6 | 72 °C | 5 Min. |
| Schritt 7 | 4 °C | Halten |
Tabelle 2: Das im Protokoll verwendete Inkubationsverfahren. (1) Achten Sie auf die unterschiedliche Deckeltemperatur, die in jedem Verfahren verwendet wird. (2) Legen Sie die Gesamtzykluszahlen entsprechend der Zelllast fest: 13 Zyklen für <500 Zelllast; 12 Zyklen für 500-6.000 Zelllast; 11 Zyklen für >6.000 Zelllast. (3) Legen Sie die Gesamtzykluszahlen nach dem cDNA-Eingang fest: 14-16 Zyklen für 1-25 ng cDNA; 12-14 Zyklen für 25-150 ng cDNA; 10-12 Zyklen für 150-500 ng cDNA; 8-10 Zyklen für 500-1.000 ng cDNA; 6-8 Zyklen für 1000-1500 ng cDNA. (4) Legen Sie die Gesamtzykluszahlen nach dem cDNA-Eingang fest: 8-12 Zyklen. (5) Legen Sie die Gesamtzykluszahlen nach dem cDNA-Eingang fest: 6-10 Zyklen.
| Lipidbasierte Barkodierung Oligonukleotide | |
| Anker LMO | 5'-TGGAATCGGGTGCCAAGGGTAACGATCCAGCTGTCACT-Lipid-3' |
| Co-Anchor LMO | 5'-Lipid-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-3' |
| Barcode Oligo | 5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNNA30-3' |
| Lipid-Barcoding Additive Primer | 5'-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3' |
| RPIX Primer | 5'-CAAGCAGAAGACGGACACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCC TTGGCACCCGAGAATTCCA-3' |
| Universal Adapter Primer | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTCTCTCTTACACGAC GCTCTTCCGATCT-3' |
| Antikörperbasierte Barkodierung Oligonukleotide | |
| Antikörper-Barcoding-Oligo | 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA*A*A-3' |
| HTO-Additiv Primer | 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC-3' |
| ADT-Additiv Primer | 5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCC-3' |
| P5-Smart-pcr Hybrid-Oligo | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTCTGCGGAA GCAGTGGTATCAACGCAGAGT*A*C-3' |
Tabelle 3: Oligonukleotidsequenzen, die in diesem Protokoll verwendet werden. N = Barcode oder Indexsequenz; * = Phosphorothioat-Bindung
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Discussion
In dieser Studie haben wir ein Protokoll zur Analyse von einzelzelligen Transkriptionsprofilen demonstriert. Wir haben auch zwei optionale Methoden für Multiplex-Proben im scRNA-Seq-Workflow bereitgestellt. Beide Methoden haben sich in verschiedenen Labors als machbar erwiesen und Lösungen für ein kostengünstiges und batcheffektfreies Einzelzellexperiment18,26geliefert.
Es gibt ein paar Schritte, die sorgfältig befolgt werden sollten, wenn Sie das Protokoll durchlaufen. Eine ideale Einzelzellsuspension sollte >90% der lebensfähigen Zellen haben und die Zelldichte sollte auch innerhalb eines bestimmten Bereichs27liegen. Es ist wichtig, eine gute Qualität der Zellen zu erhalten, um das Vorhandensein von zellulären Aggregaten, Schmutz und Fasern zu minimieren. Zelluläre Aggregate haben negative Auswirkungen auf das Probenmultiplexing und haben ein potenzielles Risiko, die Tröpfchenerzeugungsmaschine17zu verstopfen. Im Allgemeinen eignet sich ein 30-40-m-Zellsieb ideal zum Entfernen großer Klumpen und Schmutz unter Beibehaltung der Zellproben, da die meisten Zellen nach der Dissoziation unter 30 m schrumpfen. Es wird empfohlen, stattdessen Einzelzellkerne zu verwenden, wenn der Zelldurchmesser größer als 30 m ist. In frühen embryonalen Stadien sollte die Zellgröße für alle Arten von Mauszellen kleiner als 30 m sein. In späteren Stadien können jedoch die Kardiomyozyten im Herzen, Neuronen im Gehirn, Muskelzellen in den Gliedmaßen und einige Fettzellen eine Zellgröße größer als 30 m haben. Zellgröße sollte für diese Arten von Zellen gemessen werden, bevor die Einzelzellexperimente beginnen.
Die Multiplexing-Strategien bieten eine Möglichkeit, eine große Anzahl von Proben gleichzeitig kostengünstig zu analysieren. Darüber hinaus können wir durch die gemeinsame Profilierung mehrerer Stichproben die Batcheffekte deutlich vermeiden und Zelldoublets identifizieren. Diese Vorteile werden für das Einzelzellfeld sehr attraktiv sein. Es gibt jedoch einige Faktoren, die ihre Verwendung einschränken können. Da in einem einzigen Experiment mehr Zellen multiplexiert werden, erhöht sich auch das Zellverdoppelungsverhältnis. Obwohl diese Doublets durch die Analyse der Multiplexing-Barcodedaten identifiziert und entfernt werden können, führt dies zu einer großen Verschwendung von Sequenzierungslesevorgängen. Darüber hinaus sind die Zellen leichter zu brechen und verursachen eine Erhöhung der Umgebungs-mRNA, die in Tröpfchen mit Zellen eingefangen wird und die Erkennungsempfindlichkeit beeinträchtigt. Wir gehen davon aus, dass eine weitere Optimierung des experimentellen Workflows oder der Bioinformatik-Analyse-Pipeline diese beiden Probleme in naher Zukunft lösen wird.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken David M. Patterson und Christopher S. McGinnis vom Labor Dr. Zev J. Gartner für ihre Art und Weise der Bereitstellung der lipidbasierten Barcoding-Reagenzien und Vorschläge zu den experimentellen Schritten und der Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (HL13347202) gegründet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
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