Summary
Здесь мы представили мультиплексированный метод секвенирования одноклеточного мРНК для профилирования экспрессии генов в эмбриональных тканях мыши. Метод секвенирования одноклеточной мРНК на основе капельных одноклеточных мРНК (scRNA-Seq) в сочетании со стратегиями мультиплексирования может профилировать отдельные ячейки из нескольких образцов одновременно, что значительно снижает затраты на реагенты и сводит к минимуму экспериментальные пакетные эффекты.
Abstract
Одноклеточная мРНК секвенирование добилась значительного прогресса за последние несколько лет и стала важным инструментом в области биологии развития. Он был успешно использован для выявления редких популяций клеток, обнаружить новые гены маркера, и расшифровать пространственную и височную информацию о развитии. Метод одноклеточных также эволюционировал от микрофлюидной основанной технологии Fluidigm C1 к растворам на основе капель в последних 2 до 3 летах. Здесь мы использовали сердце в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как профиль мыши эмбриональных клеток ткани с помощью капли на основе метода scRNA-Seq. Кроме того, мы интегрировали две стратегии в рабочий процесс для профилирование нескольких образцов в одном эксперименте. Используя один из интегрированных методов, мы одновременно профилировали более 9000 клеток из восьми образцов сердца. Эти методы будут полезны для области биологии развития, предоставляя экономически эффективный способ одновременного профиля одиночных клеток из различных генетических слоев, стадий развития, или анатомических местах.
Introduction
Транскрипционный профиль каждой одной клетки варьируется среди клеточных популяций во время эмбрионального развития. Хотя одномолекулярная гибридизация на месте может быть использована для визуализации экспрессии небольшого числа генов1,секвенирование мРНК одной клетки (scRNA-Seq) обеспечивает беспристрастный подход к иллюстрации геномных экспрессионных моделей генов в одиночных клетках. После того, как он был впервые опубликован в 2009 году2, scRNA-Seq был применен для изучения нескольких тканей на нескольких стадиях развития в последние годы3,4,5. Кроме того, в связи с тем, что в последнее время атлас клеток человека приступил к осуществлению своих проектов, ориентированных на развитие, ожидается, что в ближайшем будущем будет получено больше данных о одиночных клетках из эмбриональных тканей человека.
Сердце как первый орган, развиваемый, играет решающую роль в эмбриональном развитии. Сердце состоит из нескольких типов клеток и развитие каждого типа клеток жестко регулируется временно и пространственно. За последние несколько лет, происхождение и клеточная линия сердечных клеток на ранних стадиях развития были охарактеризованы6, которые обеспечивают огромный полезный инструмент навигации для понимания врожденного патогенеза порока сердца, а также для разработки более технологически передовых методов для стимулирования кардиомиоцитов регенерации7.
scRNA-Seq претерпел быстрое расширение в последние годы8,9,10. С недавно разработанными методами, проектирование и анализ экспериментов с одноклеточными стали более достижимыми11,12,13,14. Представленный здесь метод представляет собой коммерческую процедуру, основанную на растворах капель (см. Таблицу Материалов)15,16. Этот метод имеет захват клеток и наборы уникально штрих-кодированных бусин в масляной воде эмульсии капли под контролем микрофлюидной системы контроллера. Скорость загрузки клеток в капли крайне низка, так что большинство эмульсий капель содержат только одну ячейку17. Гениальный дизайн процедуры происходит от разделения одной клетки на эмульсии капель, происходящих одновременно с баркодированием, что позволяет параллельный анализ отдельных клеток с помощью РНК-Сек на неоднородной популяции.
Включение мультиплексирования стратегии является одним из важных дополнений к традиционной одноклеточной рабочего процесса13,14. Это дополнение очень полезно в отбрасывая дублеты клеток, снижение экспериментальных затрат, и устранение пакетных эффектов18,19. Липидная стратегия баркодирования и стратегия баркодирования на основе антител (см. Таблица материалов)являются двумя в основном используемыми методами мультиплексирования. Специфические штрих-коды используются для обозначения каждого образца в обоих методах, а маркированные образцы затем смешиваются для захвата одной ячейки, подготовки библиотеки и секвенирования. После этого объединенные данные секвенирования могут быть разделены путем анализа последовательностей штрих-кодов(рисунок 1)19. Однако между этими двумя методами существуют значительные различия. Стратегия баркодирования на основе липидов основана на липидных модифицированных олигонуклеотидах, которые не имеют каких-либо предпочтений типа клеток. В то время как антитела на основе штрихкодирования стратегия может обнаружить только клетки, выражающие антигенов белков19,20. Кроме того, это занимает около 10 минут, чтобы испачкать липиды, но 40 минут, чтобы испачкать антитела(Рисунок 1). Кроме того, липидно-модифицированные олигонуклеотиды дешевле, чем антитела-конъюгированные олигонуклеотиды, но не коммерчески доступны на момент написания этой статьи. Наконец, на основе липидов стратегия может мультиплекс 96 образцов в одном эксперименте, но антитела на основе стратегии в настоящее время может только мультиплекс 12 образцов.
Рекомендуемый номер ячейки в мультиплекс в одном эксперименте должен быть ниже, чем 2,5 х 104, в противном случае, это приведет к высокому проценту клеточных дублетов и потенциального загрязнения окружающей среды мРНК. Благодаря стратегиям мультиплексирования стоимость захвата одной ячейки, генерации кДНК и подготовки библиотеки для нескольких образцов будет снижена до стоимости одного образца, но стоимость секвенирования останется прежней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура использования животных проводится в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга (IACUC).
1. Мышь эмбрионального сердца Рассечение и одноклеточной подвески Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять несколько часов в зависимости от количества эмбрионов для вскрытия.
- Чтобы приобрести E18.5 эмбриональных сердец, эвтаназии беременной мыши CD1 со стороны CO2 администрации. Используйте бритву, чтобы удалить нежелательные волосы в области живота и дезинфицировать кожу с 70% этанола.
- Вырежьте кожу живота стерилизованные ножницы и тщательно вскрыть эмбрионы и быстро положить их в холодный фосфат-буферный солей (PBS) на льду.
- Изолировать сердца от каждого отдельного эмбриона тщательно в 10 см блюдо заполнено холодной PBS под стереоскопическим микроскопом с помощью щипцы и ножницы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите четыре камеры нетронутыми, вскрывая легких с сердцем вместе и не поймать непосредственно / тянуть сердце с хирургическими инструментами. - Перенесите 10 сердец в новую 10-сантиметровую тарелку, наполненную холодным PBS, и микро-вскрыть сердца в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек и правый желудочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагается дать более 1 х 106 клеток из каждого образца. Мы рекомендуем начать с по крайней мере 1 х 105 клеток на образец. - Перенесите каждую из 4 камерных тканей в трубку 1,5 мл и нарежьте их на куски ножницами. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин, чтобы собрать ткани.
- После аспирации супернатанта, добавить 1 мл 0,25% трипсин / EDTA к каждой трубке и инкубировать в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 мин. Pipet вверх и вниз мягко 7-8 раз с помощью пипетки P1000.
- Если эмбриональная стадия старше E11.5, добавьте 1 мл коллагенеза A/B смеси 10 мг/мл и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10-20 мин. Мягко пайпетик вверх и вниз, пока большинство клеток не будут разобщены.
- Перенесите клетки в трубку 15 мл и добавьте сбалансированный солевой раствор Хэнка 8 мл (HBSS), чтобы разбавить ферменты. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин. Приостановить клетки в 1 мл PBS и передать их в 1,5 мл трубки. Фильтр клетки через 40 мкм ячейки ситечко.
- Возьмите 15 qL объема из каждого образца и смешать с тем же количеством 0,04% trypan синий. Загрузите это на камеру подсчета клеток и посчитайте клетки в клеточном счетчике.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высококачественных результатов, жизнеспособность клеток рекомендуется быть выше, чем 95%.
2. Баркодирование одноклеточного мультиплексирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает не менее 40 минут, которая варьируется в зависимости от количества обработанных образцов. Для предусилительных шагов (шаг 2,11 - 3,11) требуется чистая скамейка, обработанная раствором RNase (шаг 2.11 - 3.11), а для постусилительных ступеней (шаги после 3.11) требуется отдельная чистая скамейка.
-
Процедура баркодирования на основе липидов (необязательная процедура 1)
- Основываясь на концентрации клеток, держите менее 5 х 105 клеток на образец. Убедитесь, что подвеска ячейки свободна от мусора и клеточных агрегатов.
- Подготовьте 2 мкм якорь / штрих-код фондового раствора и 2 ММ совместно якорный стокрешение решение для каждого образца(Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Якорь и со-якорь были любезно одаренных д-р Зев J. Gartner лаборатории. Для синтеза этих липидо-модифицированных олигонуклеотидов, последовательности ДНК были спряжены с жирными кислотами на твердой поддержке и очищены обратной фазы высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC)18,19. - Вымойте клетки дважды с PBS и собирать клетки на 300 х г в течение 5 мин. Приостановить клетки в 180 Л Л PBS.
- Добавить 20 злящих якорных /штрих-кодового стокового раствора и пипетки вверх и вниз осторожно перемешать. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
- Добавьте 20 кЛ со-якорного стокового раствора и пипетку вверх и вниз осторожно перемешать, затем инкубировать на льду еще 5 минут.
- Добавьте 1 мл холодного PBS с 1% BSA и центрифугу на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах По Цельсия. Вымойте по крайней мере еще 2 раза с холодным 1% BSA в PBS.
- Объедините все образцы вместе и фильтрчерез через 40 мкм ячейки ситечко. Подсчитайте клетки и держите суспензию клетки на льду для использования в разделе 3.
-
Процедура баркодирования на основе антител (необязательная процедура 2)
- Centrifuge 1 х 10-2х 106 ячеек для каждого образца (от шага 1.8) на 300 х г в течение 5 мин и приостановить их в 100 зл иокра буфера (Таблица 1) в 1,5 мл низких связывания труб.
- Добавьте 10 qL Fc блокирующий реагент и инкубировать в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
- Приготовьте антитела (см. Таблицу Материалов) путем центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин при 2-8 градусах Цельсия.
- Добавьте 1 мкг каждого олиго-конъюгированного антитела до 50 злител ковчеге клеточного окрашивающего буфера, чтобы сделать антитело окрашивающимраствором 20. Добавьте один антитело окрашивая раствор к каждому образцу трубки. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки 3 раза с 1 мл PBS, спина в течение 5 минут при 350 х г при 4 C.
- Объедините все образцы в желаемых пропорциях в 1 мл окрашивающего буфера, вращайте 5 мин при 350 х г при 4 градусах Цельсия.
- Повторное перетаскивание клеток в PbS в соответствующей концентрации (до 1500 ячеек/Зл) и фильтрация клеток через 40 мкм-ситеч. Немедленно переходите к следующему шагу.
3. Поколение капель и мРНК Обратная транскрипция
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 90 минут для одной реакции мультиплексированной.
- Уравновесите гелевой шарик (см. Таблицу Материалов)до комнатной температуры в течение 30 мин. Выняйте реагенты из комплекта геля-в-эмульсии (GEMs) (см. Таблица материалов)и держите их при указанной температуре.
- Соберите чип B в держатель чипа (см. Таблица материалов).
- Распределить 75 л 50% глицерола раствора в неиспользованные скважины в строке 1; 40 зл в строке 2; 280 л в строке 3. Не добавляйте глицерол в любые восстановительные скважины в верхнем ряду чипа.
- Подготовка мастер смесь на льду в соответствии с таблицей 1. Добавить соответствующий объем клеточной подвески и безнучей воды, чтобы освоить смесь в соответствии с таблицей калькулятора объема суспензии ячейки17 и мягко пипетка смесь. Распределите 75 л клеточной смеси в нижний центр образца хорошо в строке 1 без введения пузырьков.
- Vortex гель бусы для 30 s с помощью адаптера вихря и медленно распределять 40 л гелевого шарика в нижний центр геля шарик хорошо в строке 2 без введения пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно ждать 30 s между добавлением клеток и гелевых бусин, чтобы избежать смачивания отказа. - Для разделительной скважины в ряду 3, распределять 280 л раздела нефти через боковую стенку скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка менее 270 л раздельного масла приведет к аномальной генерации ГЭМ. - Прикрепите прокладку на чип, не нажимать на прокладку и держать его горизонтальным, чтобы избежать смачивания прокладки.
- Загрузите собранный чип прокладкой в контроллерх хрома и запустите хромовую одноклеточную программу B (см. Таблица Материалов),немедленно переходите к следующему шагу, когда программа завершится.
- Выньте чип и отбросьте прокладку. Сложите крышку назад, чтобы выставить скважины на 45 ", проверьте уровень жидкости, чтобы убедиться, что нет забивает присутствуют.
- Медленно аспирируйте 100 л ГЭС из самых низких точек восстановления скважины и проверяйте единообразие ГЭМ. Распределите ГЭМ в новую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) трубку на льду с наконечниками пипетки против боковины трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается избыток вавного слоя, предлагается повторно подготовить образцы. Важно, сфотографировать смесь, когда GEMs все еще находятся в пипетки советы. Эта картина может сказать, если есть смачивания отказа, частично эмульгированных GEMs, и реагент забивает. Фотография также может быть использована в качестве доказательства для получения возмещения от компании реагентов с заменой реагентов и чипов. - Положите трубку в тепловой цикл и выполнить обратную процедуру транскрипции(таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь или перейдите к следующему шагу. Продукт ПЦР может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение недели.
4. усиление кДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 150 минут.
- Опубликовать одноэлементную реверсивную очистку транскрипции
- Выняйте реагенты усиления кДНК из комплекта ГЭМ (см. Таблица материалов)и держите их при указанной температуре.
- Добавьте 125 л восстановительного агента в образец при комнатной температуре, чтобы приобрести двухфазатической смеси. Нет непрозрачной жидкости следует соблюдать и избегать трубача или вихря смеси.
- После ожидания 60 с, медленно удалить 125 Л рекуперации агента из нижней части трубки.
- Vortex магнитные бусы (см. Таблица материалов) тщательно в течение 30 с и сразу же использовать его для подготовки смеси очистки бисера (Таблица 1). Реагенты должны быть добавлены последовательно, как указано в списке.
- Vortex смесь очистки бисера и добавить 200 зл. Пипетка смесь 10 раз, затем инкубировать его в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Добавить реагенты последовательно, как указано в таблице 1, чтобы подготовить раствор elution и elute кДНК следующим образом.
- Поместите образцы на магнит (высокое положение) (см. Таблица материалов)до тех пор, пока раствор не расчистит, а затем удалите супернатант.
- Добавьте 200 л 80% этанола в гранулы. Подождите 30 с, затем удалите этанол.
- Повторите шаг 4.1.6.2 еще 2 раза. Центрифуга кратко и место на магнит (низкое положение). Аккуратно удалите оставшийся этанол и воздух сухим менее чем на 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ превышать сушки воздуха прошлом 2 мин, в противном случае эффективность elution будет снижаться. - Удалите образец из магнита. Добавьте 35,5 л раствора элютации и пипетку, чтобы перемешать 15 раз. Инкубировать 2 мин при комнатной температуре.
- Поместите образец на магнит (высокое положение) до тех пор, пока раствор не прояснит. Перенесите 35 зл и того, что образец перейдет на новую прокладку трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура очистки также используется в шагах 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 и 6.2.6. Обратите внимание на концентрацию магнитных бусин и объем буфера EB / ультрачистая вода, используемая для elute образцов на каждом шагу.
- Количественная оценка размера, концентрации и целостности элютированной кДНК с помощью автоматизированного электрофорасисного прибора21 (см. Таблица материалов)(рисунок 2).
- Усиление кДНК
-
cDNA усиление с использованием липидной стратегии баркодирования (необязательная процедура 1)
- Приготовьте усилительную реакционную смесь(Таблица 1) на льду.
- Добавьте смесь реакции усиления к 35 ql образцов кДНК (от шага 4.1.6.7). Пипетка смесь, и центрифуга кратко. Инкубировать смесь в термальных циклизаторпосленых после процедуры усиления кДНК(Таблица 2).
- После тщательного вихря добавьте 120 л избранного реагента и 100 л ультрачистой воды к 100 л образца, чтобы приобрести 0,6-ю концентрацию выбранного реагента (см. Таблица Материалов). Пипетка смесь в течение 15 раз.
- Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем поместить образец на магнит, пока растворы не станут ясными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндогенные кДНК в бисере фракции и мультиплексирования штрих-кодом cDNA находится в супернатанте. - Передача супернатанта в 1,5 мл низкой связывания трубки для мультиплексирования штрих-кодом кДНК библиотеки строительства на шаг 6.1.
- Очистите эндогенную кДНК, выдвинув за шагом в 4.1.6 и украсите их с помощью 40 qL буфера EB.
- Выполнить 1 Зл очищенного образца кДНК на автоматизированном инструменте электрофореза (см. Таблица материалов)для анализа / количественной оценки кДНК.
- Aliquot 10 qL кДНК в новую трубку ПЦР для эндогенного строительства библиотеки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь или перейдите к следующему шагу. Оставшаяся выборка может храниться в -20 градусов по Цельсию в течение 4 недель для создания дополнительных библиотек, если это необходимо.
-
cDNA усиление в антитела на основе штрихкодирования стратегии (необязательная процедура 2)
- Добавьте 2 мпмола HTO и ADT добавочные грунтовки и 15 Зл кЛ грунтовок к ДНК до 50 зл и реакции смеси(Таблица 1) и выполнить усиление кДНК с процедурой усиления кДНК(Таблица 2).
- Используйте 0.6x выберите реагент для отделения эндогенной кДНК (фракция бисера) и мультиплексирования штрих-кода cDNA (в супернатанте). Не забудьте сохранить супернатант для выполнения штрихкодирования строительство библиотеки в шаге 6.2.
- Очистите и украсьте эндогенную транскрипт cDNA, следуя шагам в 4.1.6, выполните контроль качества (КК) библиотек и aliquot 10 qL в новую трубку ПЦР для строительства эндогенной библиотеки.
-
cDNA усиление с использованием липидной стратегии баркодирования (необязательная процедура 1)
5. Подготовка эндогенной библиотеки стенограммы
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 120 минут.
- Храните реагенты строительства библиотеки экспрессии генов из библиотечного комплекта (см. Таблица Материалов)при указанной температуре, соответственно.
- Подготовка фрагментации смеси (Таблица 1) на льду, пипетка для смешивания и центрифуги кратко.
- Добавьте 25 буфера EB в 10 qL очищенную кДНК-образец (от шага 4.2.1.8 или 4.2.2.3), а затем добавьте недавно подготовленную смесь фрагментации 15 л в образец, пипетку смесь 15 раз на льду и центрифуге кратко.
- Передача образца в предварительно охлажденный тепловой циклик и инициировать программу ПЦР для фрагментации, конечный ремонт и A-хвост (Таблица 2).
- Vortex выбрать реагент приостановить магнитные бусы и последовательно использовать 0,6x и 0,8x выбрать реагенты, чтобы сделать двусторонний выбор размера в соответствии с руководством пользователя17,22. Используйте 50 зл буфера EB, чтобы увязать ДНК.
- Подготовка адаптер перевязки смеси (Таблица 1), затем пипетка смесь тщательно и центрифуги кратко.
- Добавьте 50 кЛ перевязочной смеси до 50 зл и плода образца, пипетку снова перемешать в течение 15 раз и ненадолго центрифугу. Выполните перевязку адаптера в рамках протокола в тепловом циклическом цикле(таблица 2).
- Используйте 0.8x выберите реагент для очистки ligation продукта и elute очищенный образец с 30 qL буфера EB (см. шаг 4.1.6).
- Подготовьте образец индекса ПЦР смеси(таблица 1) и добавьте 60 зл. Добавьте в образец 10 злицитов, пипетку перемешать и опустить в течение 5 раз и ненадолго центрифуги, инкубировать в тепловом циклическом цикле после протокола индекса выборки(таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь или перейдите к следующему шагу. Если используется несколько скважин, выберите один конкретный индекс выборки (см. Таблица материалов)для каждой скважины. Не забудьте записать идентификатор индекса, используемый для каждой скважины, и убедитесь, что в мультиплексном секвенировании не будет перекрытия. - Последовательно используйте 0,6x и 0.8x избранные реагенты, чтобы сделать двусторонний выбор размера, чтобы приобрести 35 зл и l очищенной эндогенной клеточной ДНК17.
- КК эндогенной клеточной библиотеки до секвенирования (Рисунок 2).
6. Подготовка мультиплексирования Образец штрих-кода кДНК библиотеки
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает не менее 120 минут.
-
Образец генерации библиотеки штрих-кодов для стратегии мультиплексирования на основе липидов (необязательная процедура 1)
- Добавьте 520 qL избранного реагента и 360 л изопропанола в образец штрих-кода cDNA от шага 4.2.1.5, чтобы получить 3,2x выбрать концентрацию реагента. Пипетка смесь 10 раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Поместите трубку на магнитную стойку и ждите, пока решение прояснит. Затем отбросьте супернатант.
- Используйте 500 л 80% этанола, чтобы дважды мыть бисер на магните и ждать 30 с после каждой стирки.
- Кратко центрифуга бисера и место на магните. Удалите оставшийся этанол с микропайпетом P10 и оставьте бисер на 2 мин.
- Снимите трубку с магнитной стойки и переприостановите шарики в 50 злику буфера EB. Pipet вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать при комнатной температуре 2 мин.
- Верните трубку к магниту и ждите, пока раствор прояснит. Передача супернатанта (образца штрих-кода cDNA) в новую трубку ПЦР. Будьте осторожны, чтобы не передавать любые бусы.
- Количественная концентрация образца штрих-кода cDNA23.
- Подготовка липидных штрих-кодов библиотечной смеси(таблица 1), добавить 3,5 нг очищенной штрих-кодом кДНК (от шага 6.1.6) и безнуса, воды для общего объема 50 л.
- Держите его в тепловой циклпосле после липидной основе бардид библиотеки ПЦР(Таблица 2).
- Используйте реагент 1.6x select для очистки продукта ПЦР и выяснения ДНК с 25 qL буфера EB (см. шаг 4.1.6).
- Количественная концентрация библиотеки с использованием метода анализа ДНК высокой чувствительности24 от первоначального разбавления 1:5(Рисунок 2).
-
Образец генерации библиотеки штрих-кодов для стратегии мультиплексирования на основе антител (необязательная процедура 2)
- Добавьте дополнительный 1,4-x объем реакции выбранного реагента в супернатант, содержащий пробные штрих-коды, приобретенные с шага 4.2.2.3, чтобы получить коэффициент реагента 2x select.
- Вымойте бисер с 80% этанола, следуя шагам в 4.1.6 и увядите штрих-кодированной кДНК с ультрачистой водой.
- Выполните протокол отбора с 2x выбрать реагент во второй раз и elute использованием ультрачистой воды.
- Подготовка антитела штрих-код библиотечной смеси (Таблица 1), и добавить 45 зл и l очищенной штрих-кодированной кДНК с последнего шага.
- Инкубировать в тепловой циклпосле после антитела баркод библиотеки ПЦР (Таблица 2)20.
- Используйте реагент 1.6x select для очистки продукта ПЦР и ущелья очищенного образца с 30 зл и пилите ультрачистую воду (см. шаг 4.1.6).
7. Секвенирование библиотеки
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько платформ секвенирования следующего поколения, такие как HiSeq 4000 и NovaSeq, могут быть использованы для секвенирования эндогенных библиотек транскриптов и мультиплексирующих библиотек штрих-кодов.
- Используйте платформу секвенирования следующего поколения для секвенирования эндогенных библиотек транскриптов и библиотек штрих-кодов мультиплексирования.
- Разбавить библиотеки в соответствии с рекомендациями эксперта в компании по секвенированию или объекте секвенирования. Минимум 20 000 считываний на ячейку рекомендуется для эндогенной библиотеки стенограммы и 3000 считываний для библиотек штрих-кодов.
8. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Де-мультиплексданные данные по секвенированию с помощью облачного ресурса BaseSpace или при запуске пакета bcl2fastq на сервере UNIX.
-
Анализ данных эндогенного транскриптома
- С данными fastq, генерируемыми из программного обеспечения demultiplexing, запустите "mkfastq" на коммерчески доступном конвейере анализа данных (см. Таблица материалов)для дальнейшего демультиплекса каждого штрих-кода GEMs.
- Выполнить "счет" для выполнения выравнивания, фильтрации, подсчета штрих-кодов и подсчета UMI.
- Дополнительно запустите "aggr" для агрегирования нескольких полос последовательности из одного эксперимента.
- Используйте "клеточный браузер" (см. Таблицу Материалов)для визуализации данных, кластерных клеток, выявления дифференциально выраженных генов и генерации графиков тепловой карты tSNE или экспрессии генов.
- Дополнительно, используйте ухоженные R-платформы25 (см. Таблица материалов) для нормализации и масштабирования данных, выявления дифференциально выраженных генов, а также генерации tSNE / UMAP участков и генной экспрессии тепловых карт (Рисунок 3).
-
Анализ данных штрих-кодов мультиплексирования
-
Анализ данных из стратегии баркодирования на основе липидов
- Используйте коммерчески доступный конвейер анализа данных или пакет deMULTIplex R(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)для преобразования образцовых штрих-кодов файлов FAST в матрицу подсчета проб штрих-кода.
- Загрузите матрицу подсчета штрих-кодов ВМЕСТЕ с эндогенными транскриптомными данными на платформу на основе R (см. Таблица материалов)для интеграционного анализа(рисунок 3).
-
Анализ данных, полученных в ходе стратегии баркодирования на основе антител
- Используйте "счет" из коммерчески доступного конвейера анализа данных для картирования штрих-кодов, предоставляя файл CSV библиотеки и функцию хэштега CSV file.
- Загрузите на платформу R-основанной платформы для анализа вниз по течению матрицу, содержащую количество экспрессии генов, рядом с штрих-кодом функции для каждого штрих-кода клетки.
-
Анализ данных из стратегии баркодирования на основе липидов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании мы использовали эмбриональное сердце мыши в качестве примера, чтобы показать, как мультиплексированное секвенирование одноклеточной мРНК было выполнено для обработки различных образцов из отдельных частей органа одновременно. Сердца мыши E18.5 CD1 были изолированы и расчленены в левое предсердие (LA), правое предсердие (РА), левый желудочек (LV) и правый желудочек (RV). Предсердий и желудочковых клеток затем штрих-код независимо с помощью липидной основе баркодирования процедуры и смешанные вместе до генерации GEMs и обратной транскрипции. Схематический обзор показан на рисунке 1. Мы количественно концентрации кДНК до строительства библиотеки(рисунок 2A). Одно из отличий в выполнении мультиплексного scRNA-Seq от стандартного scRNA-Seq заключается в том, что эндогенная библиотека кДНК и библиотека штрих-кода штрих-кода были приобретены отдельно после усиления и очистки кДНК (Шаг 4.2.1 и 4.2.2.2). Две библиотеки были также квалифицированы в нашем эксперименте(Рисунок 2B, C). Секвенирование и анализ данных нового поколения были выполнены с последующим строительством библиотеки и КК.
Мы использовали платформу HiSeqX для секвенирования обеих библиотек в одной полосе последовательности. С помощью данных о секвенировании мы сначала разделили эндогенные данные стенограммы и данные штрих-кодов с помощью программы BaseSpace. Затем мы проанализировали экспрессию штрих-кодов в каждой одной ячейке и обнаружили 8 групп одиночных ячеек, которые однозначно выражают один тип штрих-кода, представляющий клетки из 8 различных образцов(рисунок 3A). Кроме того, мы также обнаружили, что некоторые клетки не выражают никаких штрих-кодов, которые мы определили как отрицательные клетки, а некоторые клетки выражают два различных штрих-кода, которые представляют собой дублеты(Рисунок 3B). Таким образом, мы обнаружили, что около 70% клеток singlets, 25% клеток являются отрицательными и 5% клеток дублетов.
С одиночными клетками, мы можем выполнить более дополнительные ниже по течению анализы для того чтобы понять клеточное неоднородность и молекулярные регулировки. Потенциальные анализы могут быть аннотации типа клеток (Рисунок 4A), роман / редкий тип клеток идентификации (Рисунок 4B), анатомической зоны сравнительный анализ(Рисунок 4C), и ген онтологический анализ пути, такие как разделение фазы клеточного цикла (Рисунок 4D).
Рисунок 1: Мультиплексный одноклеточный процесс секвенирования мРНК. Эмбриональный день 18,5 стадии сердца были проанализированы с помощью мультиплексной капли на основе одноклеточного секвенирования процедуры. RT - обратная транскрипция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель КК результаты на разных этапах. (A)КК анализ кДН от шага 4.1.7. Размер целевого фрагмента составляет от 200 до 9000 bp. (B) Эндогенная библиотека и (C) библиотека штрих-кодов были проанализированы с помощью автоматизированного инструмента электрофореза. Размер целевого фрагмента для эндогенной библиотеки составляет 300-600 б.п., а размер ДНК библиотеки штрих-кодов составляет около 172 б.п. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Рисунок 3: Демультиплексирование данных секвенирования от стратегии баркодирования на основе липидов. (A) Неконтролируемый анализ выражения штрих-кода. X-оси представляет собой одиночные ячейки, а y-оси представляет штрих-коды. Каждая из 8 популяций одной ячейки была идентифицирована, чтобы однозначно выразить один из 8 штрих-кодов. Обратите внимание, что некоторые клетки выражают более одного штрих-кода, а некоторые клетки не выражают никаких штрих-кодов. (B) t-SNE участок одноклеточных клеток, двойных клеток, и отрицательных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Расширенный анализ данных одноклеточной транскрипции. (A-D) Данные одной клетки могут быть проанализированы различными способами, чтобы понять клеточной неоднородности и молекулярных путей. В качестве примеров мы перечислили несколько приложений. Одиночные клетки были загружены в пакет R для определения типов клеток(A),редких популяций клеток (B), анатомических зон клеток (C), и фазы цикла клеток (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Название смеси | Состав |
| Коллагенеза смесь | 10 мг/мл коллагеназы А и 10 мг/мл коллагеназы В, растворенные в HBSS с 40% FBS. |
| 2 мкм Якорь / Штрихкод фондовый раствор | Смешайте 50 мкм якорь и 10 мкм штрих-код пряди в 1:1 молярное соотношение в PBS (без FBS или BSA) для общего объема 25 мл. |
| 2 мкм Со-якорь фондовый раствор | Разбавить 1 л 50 мкм Ко-Якорь с 24 Л Л ПБС (без FBS или BSA). |
| Окрашивание буфера | PBS, содержащий 2% BSA, 0.01% Tween 20 |
| Мастер Смешение | 20 л РТ Реагент, 3,1 л олиго, 2 Л. Снижение агента B, 8,3 л RT Фермент C. |
| Смесь для очистки бисера | 182 зЛ Очистка Буфер, 8 л реагент выбора, 5 Л. Снижение агента B, 5 Л Л Nuclease-свободной воды. |
| Смесь реакции усиления | 1 зЛ из 10 мкм липид-тегами добавка грунтовка, 15 ЛЛ кДНК грунтовка, 50 ЛЛ Amp Mix |
| Решение для универсала | 98 Л. Буфер EB, 1 Л. 10% Tween 20, 1 Л. Редукционный агент B. |
| Фрагментация Mixture | 5 ЗЛ Фрагментация Буфер, 10 ЗЛ Фрагментация Фермент. |
| Смесь лигации адаптера | 20 л лигационный буфер, 10 Л ДНК Лигаза, 20 Л Адаптор Олигос. |
| Пример индекса PCR Mixture | 50 ЗЛ Amp Mix, 10 Л SI Primer |
| Липид ный штрих-код библиотечной смеси | 26.25 л из 2 "Горячий старт мастер-микс, 2,5 л из 10 мкм RPIX грунтовка, 2,5 л из 10 мкм TruSeq Универсальный адаптер грунтовка (см. таблицу материалов) |
| Смесь библиотеки штрих-кодов антител | 50 л из 2 "Горячий старт мастер-микс, 2,5 л из 10 мкм RPIX грунтовка, 2,5 л из 10 ММ P5-smart-pcr гибридный олиго |
Таблица 1: Реагентные смеси, используемые в протоколе.
| Процедура инкубации | Температура(1) | Время |
| Инкубация GEM-RT | Температура крышки 53 C | |
| Шаг 1 | 53 кк с | 45 мин. |
| Шаг 2 | 85 кк | 5 мин. |
| Шаг 3 | 4 кк с | Держать |
| 10x Геномика кДНК Усиление | Температура крышки 105 градусов по Цельсию | |
| Шаг 1 | 98 кв. c | 3 мин. |
| Шаг 2 | 98 кв. c | 15 с |
| Шаг 3 | 63 кк с | 20 с |
| Шаг 4 | 72 кк с | 1 мин. |
| Шаг 5 | Повторите шаги от 2 до 4 для 12 циклов в общей сложности (2) | |
| Шаг 6 | 72 кк с | 1 мин. |
| Шаг 7 | 4 кк с | Держать |
| Строительство библиотеки | Температура крышки 65 градусов по Цельсию | |
| Предварительно прохладный блок | 4 кк с | Держать |
| Фрагментации | 32 кк | 5 мин. |
| Конец ремонта и A-хвост | 65 кк | 30 мин. |
| Держать | 4 кк с | Держать |
| Перевязка адаптора | Температура крышки 30 градусов по Цельсию | |
| Шаг 1 | 20 кв. | 15 мин. |
| Шаг 2 | 4 кк с | Держать |
| Пример индекса PCR | Температура крышки 105 градусов по Цельсию | |
| Шаг 1 | 98 кв. c | 45 с |
| Шаг 2 | 98 кв. c | 20 с |
| Шаг 3 | 54 кк с | 30 с |
| Шаг 4 | 72 кк с | 20 с |
| Шаг 5 | Повторите шаги от 2 до 4 для 12 циклов в общей сложности (3) | |
| Шаг 6 | 72 кк с | 1 мин. |
| Шаг 7 | 4 кк с | Держать |
| Липид штрих-код библиотеки PCR | ||
| Шаг 1 | 95 кв. c | 5 мин. |
| Шаг 2 | 98 кв. c | 15 с |
| Шаг 3 | 60 кк | 30 с |
| Шаг 4 | 72 кк с | 30 с |
| Шаг 5 | Повторите шаги от 2 до 4 для 10 циклов в общей сложности (4) | |
| Шаг 6 | 72 кк с | 1 мин. |
| Шаг 7 | 4 кк с | Держать |
| Антитела штрих-код библиотеки PCR | ||
| Шаг 1 | 95 кв. c | 3 мин. |
| Шаг 2 | 95 кв. c | 20 с |
| Шаг 3 | 60 кк | 30 с |
| Шаг 4 | 72 кк с | 20 с |
| Шаг 5 | Повторите шаги от 2 до 4 для 8 циклов в общей сложности (5) | |
| Шаг 6 | 72 кк с | 5 мин. |
| Шаг 7 | 4 кк с | Держать |
Таблица 2: Процедура инкубации, используемая в протоколе. (1) Обратите внимание на различные температуры крышки, используемые в каждой процедуре. (2) Установить общие числа циклов в зависимости от нагрузки ячейки: 13 циклов для нагрузки ячейки qlt;500; 12 циклов на 500-6000 клеточных нагрузки; 11 циклов для нагрузки ячейки. (3) Установить общие числа циклов в соответствии с вводом кДНК: 14-16 циклов для 1-25 нг кДНК; 12-14 циклов для 25-150 нг кДНК; 10-12 циклов для 150-500 нг кДНК; 8-10 циклов на 500-1000 нг кДНК; 6-8 циклов на 1000-1500 нг кДНК. (4) Установите общие числа циклов в соответствии с вводом кДНК: 8-12 циклов. (5) Установить общие числа циклов в соответствии с вводом кДНК: 6-10 циклов.
| Липидная основе баркодирования олигонуклеотидов | |
| Якорь LMO | 5'-TGGAATCTCGGGTGCCAAGGGTAACAGCGCTGTCTCACT-Lipid-3' |
| Со-якорь LMO | 5'-Липид-АГТГАКАКТГГГГГГГЦТТАКС-3' |
| Баркод Олиго | 5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNNNNNA30-3' |
| Липидный штрихкодирование аддитивная праймер | 5'-CTTGGCACCCGAGAATCC-3' |
| Праймер RPIX | 5'-CAAGCAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCC TTGGCACCCGAGAATCCA-3' |
| Универсальный адаптер Праймер | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAATTTACACTCTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCT-3' |
| Антитела на основе баркодирования олигонуклеотидов | |
| Антитела баркодирования олиго | 5'-GTGACTGGAGTCACGTGTGTGTCTGATCTCTCTCTCTCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNBAAAAAAAAAAAAAaaaaaaaaAAAA-A-3' |
| HTO добавка Праймер | 5'-GTGACTGGAGTCACGTGTGTGTTC-3' |
| Аддитивная притязание ADT Primer | 5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCC-3' |
| P5-smart-pcr гибридный олиго | 5'-AATGATACGGCGACCACCGACTACACGCCTGTGCGGGGAA GCAGTGGTATCAACGCAGAGT |
Таблица 3: Последовательности олигонуклеотидов, используемые в этом протоколе. N - штрих-код или последовательность индексов; Фосфоротиоатная связь
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали протокол для анализа одноклеточных транскрипционных профилей. Мы также предоставили два дополнительных метода для мультиплексных образцов в рабочем процессе scRNA-Seq. Оба метода оказались осуществимыми в различных лабораториях и предоставили решения для запуска экономически эффективного и безсерийного эффекта эксперимент с одноклеточными18,26.
Есть несколько шагов, которые следует тщательно следить при прохождении протокола. Идеальная одноклеточная подвеска должна иметь 90% жизнеспособных клеток, а плотность клеток также должна находиться в определенном диапазоне27. Очень важно получить хорошее качество клеток, чтобы свести к минимуму наличие клеточных агрегатов, мусора и волокон. Сотовые агрегаты оказывают негативное влияние на мультиплексирование образцов и потенциально рискуют засорить капельную генерирующую машину17. Вообще говоря, 30-40 мкм ячейки ситечко идеально подходит для удаления больших сгустков и мусора при сохранении образцов клеток, потому что большинство клеток будет сокращаться ниже 30 мкм после диссоциации. Одноклеточные ядра рекомендуется использовать вместо этого, если диаметр ячейки больше 30 мкм. На ранних эмбриональных стадиях размер клетки для всех типов клеток мыши должен быть меньше 30 мкм. Однако, на более поздних стадиях, кардиомиоциты в сердце, нейроны в головном мозге, мышечные клетки в конечностях, и некоторые жировые клетки могут иметь размер клетки больше, чем 30 мкм. Размер клетки должны быть измерены для этих типов клеток, прежде чем начать эксперименты с одной клеткой.
Стратегии мультиплексирования обеспечивают способ одновременного анализа большого количества образцов экономически эффективным способом. Кроме того, профилирование нескольких образцов вместе, мы можем значительно избежать пакетных эффектов и определить дублеты клеток. Эти преимущества будут очень привлекательными для одноклеточного поля. Однако есть некоторые факторы, которые могут ограничить их использование. По мере того как больше клеток мультиплексированы в одиночном эксперименте, коэффициент двойника клетки также увеличит. Хотя эти дублеты могут быть идентифицированы и удалены путем анализа данных штрих-кода мультиплексирования, это приведет к большой трате последовательности читает. Кроме того, по мере объединения большего количества клеток клетки легче разрушаются и вызывают увеличение окружающей мРНК, которая будет улавлена в капли клеток и будет мешать чувствительности обнаружения. Мы ожидаем, что дальнейшая оптимизация экспериментального конвейера анализа рабочего процесса или биоинформатики позволит решить эти два вопроса в ближайшем будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарим Дэвида М. Паттерсона и Кристофера С. Макгинниса из лаборатории доктора Зев Дж. Гартнера за их добрые поставки липидных баркодирующих реагентов и предложения по экспериментальным шагам и анализу данных. Эта работа была основана Национальными институтами здравоохранения (HL13347202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
- SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
- Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
- Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).
