Summary
Vi presenterar kyckling chorioallantoic membran modell som en alternativ, transplanterbar, in vivo modell för engraftment av gynekologiska och urologiska cancer cellinjer och patient-härledda tumörer.
Abstract
Musmodeller är riktmärkestesterna för in vivo cancerstudier. Men kostnader, tid och etiska överväganden har lett till krav på alternativa in vivo cancermodeller. Kycklingchorioallantoic membranet (CAM) modellen ger ett billigt, snabbt alternativ som möjliggör direkt visualisering av tumör utveckling och är lämplig för in vivo imaging. Som sådan försökte vi utveckla ett optimerat protokoll för engrafting gynekologiska och urologiska tumörer i denna modell, som vi presenterar här. Cirka 7 dagar postfertilization, luftcellen flyttas till vascularized sidan av ägget, där en öppning skapas i skalet. Tumörer från murin och mänskliga cellinjer och primära vävnader kan sedan engrafted. Dessa är vanligtvis sådd i en blandning av extracellulär matris och medium för att undvika cellulär spridning och ge näringsstöd tills cellerna rekrytera ren kärlförsörjning. Tumörer kan sedan växa i upp till ytterligare 14 dagar före äggen kläckning. Genom att implantera celler som genomsärgas särbehandling med firefly luciferase kan bioluminescensavbildning användas för känslig detektion av tumörtillväxt på membranet och cancercellen sprids över hela embryot. Denna modell kan potentiellt användas för att studera tumorigenicity, invasion, metastasering och terapeutisk effektivitet. KycklingEN CAM-modellen kräver betydligt mindre tid och ekonomiska resurser jämfört med traditionella murinmodeller. Eftersom äggen är immunkomprometterade och immuntoleranta kan vävnader från alla organismer potentiellt implanteras utan kostsamma transgena djur (t.ex. möss) som krävs för implantation av mänskliga vävnader. Men många av fördelarna med denna modell kan potentiellt också vara begränsningar, inklusive den korta tumör generationentid och immunkomprometterade / immun tolerant status. Dessutom, även om alla tumörtyper presenteras här engraft i kyckling chorioallantoic membran modell, de gör det med varierande grad av tumörtillväxt.
Introduction
Möss har fungerat som den klassiska modellorganismen för studier av mänskliga sjukdomar, inklusive malignitet. Som däggdjur delar de många likheter med människor. Deras höga grad av genetisk likhet har tillåtit transgen manipulation av musgenomet för att ge enorm insikt i den genetiska kontrollen av mänskliga sjukdomar1. Lång erfarenhet av hantering av och experiment med möss har resulterat i att de är den modell som väljs för biomedicinsk forskning. Men förutom de etiska och vetenskapliga oro när det gäller murin modeller, kan de också vara ganska kostsamt och tidskrävande2,3. Utvecklingen av tumörer kan ta veckor eller månader. Bostäder på en typisk institution ensam kan köras i hundratals till tusentals dollar medan tumörer utvecklas. Äggstockscancer är ett exempel på denna nackdel eftersom dess tillväxt i murin modeller lätt kan ta månader. Förseningar i forskningsutvecklingen kan påverka äggstockscancer patienternas ihållande låga 5-års överlevnad på endast 47% (dvs. en ökning av överlevnaden på endast 10% under 30 år)4. På samma sätt utgör urologiska cancerformer (njur-, prostata- och blåscancer) 19% av alla cancerfall i USA och 11% av cancerrelaterade dödsfall4. Således kan en ny in vivo strategi för att studera gynekologiska och urologiska cancerer spara ett laboratorium betydande tid, arbete och pengar, även om denna modell endast tillämpas på inledande screening experiment. Dessutom kan den resulterande accelerationen av forskningsresultat avsevärt påverka de 177.000 individer som diagnostiserats med dessa cancerformer årligen.
KycklingEN CAM modellen erbjuder många fördelar som tar itu med ovannämnda frågor. En populär modell för att studera angiogenes5,6, tumörcell invasion7,8och metastasering7,9, chick embryo CAM modell har redan använts för att studera många former av cancer, inklusive glioma10,11,12, huvud och hals skivepitelcancer carcinom13,14, leukemi15,16, pankreascancer17, och kolorektal cancer18. Dessutom har CAM modeller genererats för neuroblastom19, Burkitt lymfom20, melanom21och katt fibrosarkom22. Tidigare studier har också presenterat engraftment av blåscancer23 och prostatacancer cellinjer24, men med begränsade protokoll detaljer. Inte bara är ägg mycket billigare än möss, men de ger också mycket reproducerbara resultat25,26. De visar snabb vaskulatur utveckling, och tumör engraftment kan uppstå i så snabbt som ett par dagar och visualiseras längsgående genom det öppna fönstret. Med 21 dagars tidsram mellan äggbefruktning och kläckning kan experiment slutföras inom några veckor. Dessutom tillåter de låga kostnaderna, begränsade bostadsbehov och små storlekar lätt storskaliga experiment som skulle vara oöverkomliga för musstudier.
Därför försökte vi optimera CAM-modellen för engraftment av gynekologiska och urologiska cancerformer. På grund av den immunkomprometterade status en tidig kyckling embryo27, både mus och mänskliga celler kan lätt implanteras. Som sådan har vi framgångsrikt engrafted äggstockscancer, njure, prostata och cancer i urinblåsan. För var och en av dessa tumörtyper accepterar CAM lätt etablerade murina och/eller mänskliga tumörcellinjer. Viktigt, nyskördade primära mänskliga tumörvävnader kan också engraft från antingen smälta celler eller bitar av fast vävnad med hög framgång. Var och en av dessa cancertyper och cellkällor kräver optimering, som vi delar här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som presenteras häri granskades och godkändes av lämpliga etiska kommittéer vid University of California, Los Angeles (UCLA). Användningen av deidentifierade, primära mänskliga tumörer har godkänts av UCLA Institutional Review Board (protokoll nummer 17-000037, 17-001169 och 11-001363). Vid UCLA krävs inte granskning av animalresearchkommittén för experiment med kycklingembryon. godkännande av protokoll krävs endast när äggen kläcks. Bästa praxis, såsom AVMA:s riktlinjer för djurens dödshjälp, användes dock för att hantera kycklingembryon etiskt och för att undvika smärta så mycket som möjligt. Forskare uppmanas att kontrollera tillsynskraven vid sin institution innan de inleder studier med CAM-modeller.
1. Förbereda äggen
- Innan äggen tas ut, montera och ekvilibrera ägginkubatorn till 37,8 °C (100 °F) med 60–70 % luftfuktighet enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: För att minimera föroreningsrisker kan automatiskt vatten användas för att kontrollera luftfuktigheten. - När de fick befruktat, Rhode Island Red hönsägg från en certifierad laboratoriekvalitet ägg leverantör, torka torka ytan av skalen med pappershanddukar. En lätt dämpad pappershandduk kan användas för att avlägsna efterhäftat material. Torka omedelbart.
OBS: Vätning av skalet med vätska under 43,3 °C kan föra in bakterier i ägget. Om man väljer att tvätta eller desinficera äggen måste vätskans temperatur vara mellan 43,3-48,9 °C. Högre temperaturer kan koka äggen. Valet av desinfektionsmedel bör göras på grundval av de mikroorganismer som orsakar oro. - Använd en penna eller markör för att märka datumet på ägget. Detta anses utvecklingsdag 0.
- Placera äggen i ägginkubatorn och inkubera i minst 7 dagar med rotation för att tillåta CAM utveckling. En automatisk rotator kan användas, eller äggen kan roteras 180° 2-3x per dag.
2. Öppna äggen
OBS: Öppning av äggen bör göras när CAM har utvecklats fullt ut. Detta är vanligtvis på utvecklingsdag 7 eller 8.
- Desinficera ett biosäkerhetsskåp med 70% etanol. På samma sätt desinficera och placera i biosäkerhetsskåpet ett äggställ, äggljusband, markör, sladdfritt roterande verktyg med kiselhårdmetallslipsten och cirkulärt skärhjul, 18 G nål, rörregulator med kvartstum vakuumslang, förpackningstejp, kontors- sax, böjd sax, Semken (eller liknande) pincett, bomullsbollar och 6 x 7 cm transparent filmdressing. Använd sterila, disponibla eller autoklavade verktyg när det är möjligt.
- Stäng av äggrotatorn. Placera cirka 1-3 ägg i biosäkerhetsskåpet på äggräcket. Medan i mörkret, placera äggljuset mot äggskalet för att identifiera luftcellen. Markera placeringen av luftcellen.
OBS: Intensiteten i belysningen från äggljuset är avgörande för att visualisera det inre av ägget. Om luftcellen eller vaskulaturen är konsekvent svår att se, prova att byta ut äggljusbatterierna. - Flytta äggljuset över skalet för att hitta ett stort blodkärlsnätverk. Rotera ägget om det behövs. En idealisk vaskulatur kommer att förgrena sig nära mitten av ägget. Använd en markör för att dra över vaskulatur som ska användas för implantation.
- Slå på lampan i huven. Borra ett litet hål i skalet direkt över mitten av luftcellen med hjälp av ett sladdlöst roterande verktyg med en metallhårdmetallslipsten. Borra tills det mesta av skalet har tagits bort, men det vita, inre membranet är intakt.
OBS: Borrning över luftcellen innan den riktar vaskulatur tillåter bestämning av tjockleken på just det äggskalet över luftcellen snarare än över CAM och vaskulatur. Om CAM eller vaskulatur störs, kan ägget inte användas för implantation. - Borra och öppna ett annat litet hål där kärlfönstret öppnas som gjordes för luftcellen (steg 2.4).
- Med hjälp av en 18 G-nål, försiktigt genomborra genom det vita, inre membranet över luftcellen och vaskulatur. Om det inte går att tränga in i skalet, borra försiktigt lite mer. Se till att det vita, inre membranet (men inte CAM) störs i hela det borrade området. Avlägsnande av membranstycket är inte nödvändigt.
OBS: Om CAM eller vaskulatur störs under detta steg, kassera ägget. Skador är uppenbart om det finns blod eller albumin läcker från ett borrat hål. - Stäng av huvens lampa. Kontrollera att luftcellen överfördes från slutet av ägget till området över vaskulaturen. Om det behövs, placera vakuumslangen inifrån i en rörregulator runt hålet över den ursprungliga luftcellen och applicera försiktigt sug i korta skurar för att flytta luftcellen.
- Använd en markör för att beskriva den nya platsen för luftcellen cirka 0,5 cm innanför luft-CAM gränsen. Fäst en bit förpackningstejp strax över den nya luftcellen. Använd vid behov standardkontorssax för att trimma tejpen till en lämplig storlek.
OBS: Tejp kan störa luftflödet genom skalet och bör inte vara större än nödvändigt för att helt täcka luftcellen. - Returnera äggen till inkubatorn för att värma utan rotation med den nya luftcellen vänd uppåt. Upprepa steg 2.2-2.9 för de återstående äggen som ska öppnas.
Protokollet kan pausas här. Om det är osäkert att CAM:s utveckling är osäker på kvaliteten på CAM:s utveckling bör ett litet antal ägg gå igenom steg 2.16 innan de återstående äggen öppnas. - Placera cirka 1-3 ägg med omplacerade luftceller på äggstället i biosäkerhetsskåpet.
OBS: Försiktighet bör iakttas för att undvika att införa kontaminering i det öppnade ägget. Därför alltid öppna ägg i ett biosäkerhetsskåp och använd sterila verktyg och utrustning när det är möjligt. - Med hjälp av ett sladdlöst roterande verktyg utrustat med ett cirkulärt skärhjul, skär en liten linje över luftcellsgränsen som ritades i steg 2.8. Se till att detta är cirka 0,5 cm innanför den faktiska luft-CAM-gränsen för att undvika att störa CAM eller vaskulatur. Skär helt genom skalet men var noga med att inte tränga djupt nog för att störa CAM eller vaskulatur.
- Med böjd sax skär du runt den återstående luftcellen för att skapa ett fönster i skalet.
OBS: Om blod eller membran finns på det borttagna skalet är ägget inte lämpligt för implantation. Om en stor andel av äggen inte öppnas rent, överväga att vänta minst 1 ytterligare dag för att öppna de återstående äggen för att möjliggöra bättre CAM-bildning. Om skalen på de återstående äggen inte har genomborrats, bör äggens rotation inom inkubatorn återupptas. - Kontrollera embryots livskraft. Livskraftiga embryon kommer att visa omfattande vaskulatur, tydlig albumin, embryorörelse eller ett synligt hjärtslag.
- Med Semken pincett, dra små bitar av bomull från en steril bomullstuss. Torka försiktigt CAM-ytan för att ta bort skalets damm och skräp.
OBS: Avlägsnandet av skräp måste utföras samma dag som äggen öppnas. - Täck skalet öppning med en en fjärdedel bit av 6 x 7 cm transparent film dressing.
- Lämna äggen till inkubatorn. Se till att ägget sitter säkert med det öppna fönstret uppåt och att CAM inte vidrör den genomskinliga filmdressingen. Använd en bit äggställ, kanten på äggrotatorn eller något annat lämpligt objekt för att prop alla ägg som fortsätter att rulla.
- Upprepa steg 2.10-2.16 för alla återstående ägg som ska öppnas.
OBS: Öppningen av äggen behöver inte fyllas i samma dag som implantation. Väntar minst 1 dag kan bidra till att eliminera ägg vars lönsamhet äventyrades genom att öppna skalet.
3. Förbereda cancercellsuspensionen för transplantation (alternativ 1)
Obs! Se anteckningar i början av steg 5 eller 6 för ytterligare information om implantationsdatumet. Detta tillvägagångssätt användes för alla cellinjer och odlade njurcancer tumör sammandrag.
- Tina den extracellulära matrislösningen på is.
- Med mekanisk och/eller enzymatisk matsmältning erhåller du en enda cellsuspension med en metod som är lämplig för celltypen som implanteras.
- Omblandas det totala antalet celler som ska implanteras i lämpligt medium för implantation. Implantat av 1-2 x 106 celler per ägg är typiska.
OBS: Det medium som används för implantation av cellinjerna är vanligtvis det kompletta mediet som används för att odla cellerna, som innehåller FBS eller serumersättning. Implantationen av tumörsammandrag använder vanligtvis det kompletta mediet som används för att odla cellinjer av samma cancertyp. Justeringar av mediumformuleringen kan dock göras vid behov experimentellt. Effekterna på tumörutveckling och tillväxt skulle behöva empiriskt bestämmas. - Pellet cellerna med hjälp av en centrifughastighet och tid som är lämplig för de celler som används. Typiska hastigheter är 250-300 x g, och tiderna är 5-10 min.
- Ta bort supernatanten från de pelletade cellerna genom att pipetta. Mekaniskt omblandas cellerna i det kvarvarande mediet via snärtning eller rörledningar. Placera på isen för att svalna. Mät volymen celler och medium med hjälp av en lämplig storlek rört.
- Beräkna implantationsvolymer så att 1-2 x 106 celler implanteras i en volym av 20-100 μL per ägg med en slutlig extracellulär matriskoncentration på 2,7-4 mg/ml protein. Tillsätt medium, önskade tillväxtfaktorer eller tillsatser, och extracellulär matrislösning enligt denna beräkning. Håll på istills redo att implantera.
ANMÄRKNING: För beräkningarna i steg 3.3 och 3.6 bör en extra volym på minst ett halvt äggimplantat införas för att säkerställa en tillräcklig volym för alla ägg i gruppen. För implantation av äggstockscancer cellinjer (dvs. SKOV3 och ID8), 106 celler per ägg implanterades. För implantation av njurcellscancer carcinom cellinje RENCA, odlade celler som härrör från smält primära mänskliga njurlymfknutor cell carcinom, prostatacancer cellinjer (dvs CWR, C4-2 och MyC-CaP), och urinblåsan cancer cellinjer (dvs. HT-1376 och T24), 2 x 106 celler implanterades.
4. Förbereda tumörbitar för implantation (alternativ 2)
Obs! Se anteckningar i början av steg 5 eller 6 för ytterligare information om implantationsdatumet. Primära äggstocks- och urinblåsan cancer implanterades som tumörbitar.
- Tina extracellulär matrislösning på is. Späd till en slutlig proteinkoncentration på 2,7-4 mg/ml i lämpligt medium som innehåller önskade tillväxtfaktorer eller tillsatser. Håll på isen.
OBS: Implantation av tumörbitar använder vanligtvis det kompletta medium som används för att odla cellinjer av samma cancertyp. Justeringar av mediumformuleringen kan dock göras om det behövs experimentellt. Effekterna på tumör engraftment och tillväxt skulle behöva empiriskt bestäms. - Med hjälp av en skalpell eller sax, punktskatter bitar från den färska tumören. Idealiska storlekar varierar från 2-5 mm på varje sida. Håll vävnaderna nedsänkta i mediet tills de är redo att implantera.
5. Implantation med hjälp av en nonstick ring (alternativ 1)
Obs! Implantation kan uppstå när som helst före kläckning som ger tillräcklig tid för tumörutveckling och önskat experiment, men observera att embryots immunceller börjar vara närvarande runt dag 10 postfertilization27. Tumör tillväxttakt varierar avsevärt efter celltyp och måste empiriskt bestämmas för celltypen av intresse. Äggstockscancer och prostatacancerceller implanterades med hjälp av nonstick ring metoden. Observera att när en nonstick ring inte är tillgänglig, kan en pipet spets skäras till en liknande storlek och användas.
- Använd 70% etanol för att desinficera ett biosäkerhetsskåp och alla nödvändiga verktyg: ett äggställ, böjda irispincen, nonstick ringar (1/4 tums innerdiameter), glasrörstång, lämpliga volymrör rör och spetsar, 6 x 7 cm transparent filmdressing, kontorssax och markör eller penna. Sterila, engångsverktyg eller autoklaveriga verktyg bör användas när så är möjligt.
- Placera ägg som ska implanteras på ett äggställ i ett biosäkerhetsskåp. Välj ett hanterbart antal ägg. Upp till sex är typiskt. Undvik att låta äggen svalna avsevärt medan du arbetar med dem.
- Ta bort genomskinlig filmdressing från skalet genom att rulla kanterna mot det öppna fönstret för att undvika att dra bort skalbitar. Kontrollera att äggen är livskraftiga och friska. Idealiska ägg kommer att ha ett stort fartyg i mitten av det öppnade området med mindre fartyg som förgrenar sig från den.
- Använd böjda irispincen, placera en steril, nonstick ring på CAM över fartyget, helst över en gren punkt. Använd en steril rörstång av glas för att försiktigt slipa CAM.
- Rör cellsuspensionen från steg 3.6 in i mitten av nonstickringen. Alternativt, använd pincett för att placera en tumör bit från steg 4.2 i mitten av nonstick ringen och täcka med 20-50 μL av extracellulärmatrislösning som genereras i steg 4.1.
- Försegla öppningen med en en fjärdedel bit av 6 x 7 cm transparent filmdressing. Märk äggen med en lämplig implantatbeteckning.
OBS: Numrering av äggen inom en grupp underlättar längsgående observationer. - Lämna tillbaka ägget till inkubatorn. Se till att öppningen av skalet sitter upprätt och att ägget är säkert.
ÄGG kan returneras till en ägginkubator utan rotation. Alternativt kan hög postimplantatlivbarhet erhållas med hjälp av en 37-38 °C-cellinkubator med CO2 avaktiverad och en hygrometer för att övervaka luftfuktigheten, som bör vara 50%-80%.
6. Implantation utan nonstickring (alternativ 2)
Obs! Implantation kan uppstå när som helst före kläckning som ger tillräcklig tid för tumörutveckling och önskat experiment, men observera att embryots immunceller börjar vara närvarande runt dag 10 postfertilization27. Denna metod användes för att implantera njurcellscancerceller och cancerceller i urinblåsan.
- Använd 70% etanol för att desinficera ett biosäkerhetsskåp och alla nödvändiga verktyg: lämpliga volymrör och spetsar, sterila 10-cm vävnadsodlingsrätter, äggställ, 6 x 7 cm transparent filmdressing, kontorssax och markör.
- Aspirera en inympningsvolym av cellsuspensionen som genereras i steg 3.6 i en lämplig pipetspets (200 μL är typisk). Medan du håller den övre delen av spetsen, försiktigt mata ut pipet spetsen och placera horisontellt i en steril, 10-cm vävnad kultur skålen.
- Upprepa steg 6.2 för alla prover i en grupp med en maträtt för varje grupp.
- Placera spetsarna i en inkubator på 37 °C i 15-30 min så att den extracellulära matrisen delvis kan polymerisera.
- Efter 15 min inkubation, börja kontrollera polymerisation. En liten mängd vätska läcker vanligtvis ur spetsen när den placeras på skålen. Polymerisering av denna vätska kan användas för att uppskatta omfattningen av polymerisation av vätskan i spetsen.
- Placera äggen som ska implanteras på ett äggställ i ett biosäkerhetsskåp. Välj ett hanterbart antal ägg. Upp till sex är typiskt. Undvik att låta äggen svalna avsevärt medan du arbetar med dem.
- Ta bort den genomskinliga filmdressingen från skalet genom att rulla kanterna mot det öppna fönstret. Detta undviker att dra bort bitar av skal.
- Kontrollera att äggen är livskraftiga och friska. Idealiska ägg kommer att ha ett stort fartyg i mitten av det öppnade området med mindre fartyg som förgrenar sig från den.
- Placera en rörspets på en lämplig storlek rört. Tryck kolven för att tvinga den delvis polymeriserade cellsuspensionen på CAM över ett stort, välutvecklat kärl, helst över en grenpunkt.
- Försegla öppningen med en en fjärdedel bit av 6 x 7 cm transparent filmdressing.
- Märk ägget med en lämplig implantatbeteckning.
OBS: Numrering av äggen inom en grupp underlättar längsgående observationer. - Lämna tillbaka ägget till inkubatorn. Se till att öppningen av skalet sitter upprätt och att ägget är säkert.
ÄGG kan returneras till en dedikerad ägginkubator utan rotation. Alternativt kan hög postimplantatlivbarhet erhållas med hjälp av en 37-38 °C-cellinkubator med CO2 avaktiverad och en hygrometer för att övervaka luftfuktigheten, som bör vara 50%-80%.
7. Bioluminescens avbildning av firefly luciferase markerade tumörer
OBS: Om de implanterade cellerna var stabilt transduced med genen kodning firefly luciferase eller andra bildfaktorer, då de resulterande tumörer kan visualiseras med hjälp av bioluminescens imaging. Fluorescensavbildning rekommenderas inte på intakta ägg på grund av hög bakgrund från äggskalet. Detta är endpointanalys, eftersom öppnandet av skalet drastiskt minskar överlevnaden. Tumörer kan avbildas när som helst som är lämpligt för experimentella behov och hastigheten på tumörtillväxt. Men i genomsnitt kläcks ägg 21 dagar efterbefruktning. Därför är utvecklingsdag 18 ett lämpligt slutpunkt för att undvika oönskade kläckning.
- Vid behov transportera ägg till bildhanteringsanläggningen. Tejpa ägg på 10 cm vävnadsodlingrätter. Återför dem till en ägginkubator på 37,8 °C (100 °F) med rotationsmekanismen borttagen eller avaktiverad. Fukt är inte avgörande för transport och bildbehandling.
- Använd böjda irispincen, tryck försiktigt bort KAM:et från skalet tills CAM är i linje med albumin och embryo. Använda bredspetsad provpintat, bryta bort bitar av skalet för att expandera skalet öppning tillräckligt för tumör visualisering.
- Injicera minst 50 μl 30 mg/ml D-luciferin i äggalbuminen. En liknande volym D-luciferin kan också ledas in i nonstick ringen eller på ytan av CAM i området som innehåller de implanterade cellerna. Detta säkerställer optimal bioluminescens i avsaknad av en idealisk vaskulär tillförsel. Inkubera i 8 min.
- Injicera 20-50 μL isoflurane i äggets albumin för att söcera ägget. Inkubera i ytterligare 2 min. Alternativt kan ägget placeras i en induktionskammare som innehåller 2-2,5% förångad isoflurane. Adekvat anestesidjup erhålls när embryonal rörelse upphör.
OBS: Större volymer av isoflurane (100 μL) kan användas för att avliva ägget. - Placera ägg i en bioluminescensbildenhet och bild med lämpliga inställningar enligt tillverkarens anvisningar. För denna studie användes en exponeringstid på 1 min.
- För att avbilda den återstående CAM och embryo, öppna ägget i en 10-cm vävnad kultur skålen.
- Ta tag i ägget med fingrarna på båda händerna på undersidan av ägget nära mitten av ägget och tummarna på vardera sidan av skalet öppning.
- Dra försiktigt isär äggets två halvor med tummarna samtidigt som du försiktigt trycker in i ägget med fingrarna.
- När skalet är ungefär halvseparerat från CAM och embryo, vänd ägget upp och ner över en 10-cm vävnadskultur skålen.
- Fortsätt att separera skalhalvorna. Om CAM fastnar på skalets insida, använd försiktigt fingrarna för att trycka bort KAM:et från skalet.
- Embryot kan vändas in i en annan maträtt om så önskas.
- Vid behov kan ytterligare isofluran administreras som i steg 7.4.
8. Tumör skörd
OBS: Tumörer kan skördas när som helst som är lämpligt för de experimentella behoven och hastigheten på tumörtillväxt. Men i genomsnitt kläcks ägg 21 dagar efterbefruktning. Därför är utvecklingsdag 18 ett lämpligt slutpunkt för att undvika oönskade kläckning.
- Förstå tumör med pincett. Använda sax (våren iris sax fungerar bra) eller en skalpell, försiktigt punktskatt tumör från CAM.
- Om tumören har transduced med firefly luciferase genen, reimaging kan utföras för att verifiera framgångsrikt avlägsnande av svåra att visualisera tumörer.
OBS: Punktskattepliktiga tumörer kan analyseras med någon metod som är lämplig för ett visst experiment. Tumörer kan också återimplanteras till CAM eller möss. För att bekräfta tumöridentitet, tumörer kan fastställas, paraffin inbäddad, och undersökas med hematoxylin och eosin eller immunohistochemical färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hittills har vi funnit denna metod för implantation vara framgångsrik för äggstockscancer, njure, prostata och cancer i urinblåsan. Var och en optimerades för att identifiera specifika villkor för implantation, även om det kan finnas flexibilitet. Av de testade tumörtyperna var äggstockscancertillväxten mycket mindre uttalad och syns vanligtvis inte utan hjälp av bioluminescensavbildning (figur 1). En förstyvning av CAM kunde dock kännas med pincett i implantationsområdet. Detta kan bidra till att identifiera eventuell tumörtillväxt i avsaknad av bioluminescensavbildning, även om ytterligare validering skulle krävas via histologi eller annan lämplig metod. Vi uppnådde framgångsrik agraftment av både mänskliga och murina cellinjer som visar morfologiska ämnen överensstämmer med dem som ses i andra in vivo modeller(figur 1A och 1B). Dessutom var implantation av tumörbitar möjligt (Figur 1C, blå pil indikerar tumör). Den implanterade tumören i detta fall kom från en patient med höggradig, ögonbevarande, äggstockscancer serös carcinom. De resulterande tumörermorfologiskt liknade deras tumörer ursprung och uttryckte mänskliga specifika proteiner, såsom cytokeratin 8 / 18, som lätt tillåter deras differentiering från CAM och kyckling embryonala vävnader.
Vid optimering av tumörenympning och tillväxt kan lämpliga tillväxtfaktorer eller hormoner läggas till vid tidpunkten för implantationen. Till exempel observerades en subtil, icke-signifikant ökning av tumörstorlek (mätt med total lysterflöde) i ID8-celler när de kompletterades med tre enheter (U) av humant follikelstimulerande hormon (FSH) vid tidpunkten för implantation (figur 1D). Valet av FSH för äggstockscancer tillväxt härrörde från uttrycket av FSH-receptorn i ID8 celler och de höga nivåerna av FSH vanligtvis finns i postmenopausala kvinnor, som utgör majoriteten av äggstockscancer fall. Liknande metoder kan antas för andra svåra att växa cancertyper för att förbättra nyttan av CAM-modellen. Dessutom lades FSH endast till vid tidpunkten för cellimplantation. Fylla på tillväxtfaktorn eller hormonet kan åstadkommas genom att leda en lämplig mängd av tillsatsen i mediet i nonstick ringen med lämpliga intervaller, vilket kan förbättra effekten.
För njurcancer, implantation av 2 x 106 klarcelliga njurcellscancer carcinom celler från etablerade cellinjer, såsom RENCA, produceras snabb, robust tumörbildning, även om lägre cell doser kan också användas (Figur 2A, 10 dagar postimplantation). Resulterande tumörer morfologiskt liknade dem som erhållits genom standard mus in vivo modeller28. Implantation av RENCA-celler markerade med firefly luciferase tillåten bioluminescensavbildning. Primära mänskliga tumörer kan också implanteras. Bitarna av tumör kvarstod och rekryterade vaskulatur utan att visa betydande tillväxt. Implantation av smälta celler med ursprung i en primär, klar cell njurcellscancer carcinom som expanderades in vitro, dock växte på samma sätt som de etablerade cellinjer (Figur 2B). Njurcellscancer karcinomceller kan sås med antingen nonstick ring metod eller metoden utan nonstick ring.
Flera celllinjer för prostatacancer och murinprostatacancer testades för CAM-engraftment (figur 3). Varje växte bra när 2 x 106 celler implanterades med hjälp av nonstick ringen. Histologisk utvärdering av de resulterande tumörerna överensstämde med förväntningarna för varje celllinje. Dessutom, implantation av celler stabilt märkta med firefly luciferase tillåten tumör identifiering med bioluminescens imaging(Figur 3A).
Blåscancer fastställdes i CAM-modellen från etablerade cellinjer och delar av primär mänsklig vävnad (figur 4). Cellinjer växte väl när implanteras med 2 x 106 celler utan nonstick ring (Figur 4A och 4B), även om implantation med ringen var framgångsrik. Primär human tumör kan implanteras från bitar av vävnad(figur 4C). Det presenterade fallet härstammar från en patient med hög kvalitet, icke-muskel-invasiva, urothelial carcinom. Implantation av smälta celler har ännu inte försökt på grund av pågående tumör matsmältningoptimering. Cancerceller i de resulterande CAM tumörer behöll morfologi av den ursprungliga tumören, men med en förändrad stromal komponent. Tumörtillväxt var mindre än för njurcellscancer carcinom och prostatacancer, men fortfarande lätt synlig.
För att säkerställa ett stort antal livskraftiga, analysbara ägg vid endpointen måste försiktighet iakttas när äggen inkuberas och öppnas. Om inkubatorns tillstånd är suboptimala antingen före eller efter implantation, kan embryolivskraften äventyras. Om betydande embryonal död inträffar, felsöka inkubatorförhållandena enligt tillverkarens anvisningar. Enligt vår erfarenhet verkar temperatur- och luftfuktighetsstabilitet vara viktigare än deras exakta värden. Därför fann vi att inkubera inokuleraägg i en modifierad, cell-kultur, CO2 inkubator uppnått överlägsen livskraft över att behålla äggen i små, dedikerade ägg kuvöser som kräver oftare öppning för att fylla på vattnet som styr luftfuktigheten. Minimera frekvensen med vilka de inokuleraäggen avlägsnas för tumörundersökning kan också förbättra embryots livskraft.
En ytterligare oro för CAM implantation är integriteten hos CAM vid inympning. Om CAM inte är intakt efter att ha öppnat skalet sjunker nonstickringen och implanterade cellerna in i embryots albumin (se anteckningen efter steg 2.12). Detta orsakar cancercell spridning. Vissa tumörer kan fortfarande bildas, men cancer som får betydande tillväxt och överlevnad signalering från angränsande cancerceller, såsom äggstockscancer, kommer inte tillförlitligt att bilda tumörer under sådana förhållanden. Om nonstick ringar används för implantation, kan felet i CAM identifieras genom förlisningen av ringen i albumin. Detta måste skiljas från fall där ringen och implanterade celler flyttades till botten av ägget genom embryonal rörelse. I dessa fall kommer ringen att hittas mellan CAM och undersidan av skalet. Embryonal rörelse kan inte kontrolleras. Ringplacering kan dock göra det svårare för embryot att störa de implanterade cellerna. Ringar placeras vid kanterna av luftfickan genereras i steg 2,7 är mer benägna att flyttas av embryot än de som placeras i mitten av fältet.
Figur 1: Representativ tumörutveckling från äggstockscancer. Äggstockscancer celler framgångsrikt implanteras inkluderar: (A) den mänskliga SKOV3 cellinjen, (B)den murin ID8 celllinjen, och (C) primära tumörer. Representativ hematoxylin och eosinfärgning presenteras tillsammans med bioluminescensavbildning, beroende på vad som är lämpligt. För CAM tumör som härrör från implantation av en primär tumör bit (C)hematoxylin och eosin färgning av både CAM tumör och primära tumör ingår, tillsammans med cytokeratin 8/18 (CK 8/18) färgning av den resulterande CAM tumör. Den blå pilen i den första panelen indikerar tumören. (D)Tumörstorlek för ID8-implantat med och utan 3U FSH, beräknat som det totala flödet till följd av bioluminescensavbildning (n = 3 för obehandlade och n = 4 för FSH-kompletterad). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ tumörutveckling från högcellig njurcellscancer. Tumörer till följd av implantation av (A) den murina njurlymfknutor cell carcinom cellinjen, RENCA, eller (B) odlade celler som härrör från en smält mänskliga primära tumör. Mätskalan intill den strukna tumören i (B) visar 1 mm markeringar. Motsvarande histologi i (A) och (B) visar hematoxylin och eosinfärgning. I (A) visas även den representativa bioluminescensavbildningen av firefly-luciferase-märkta RENCA-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ tumörutveckling från prostatacancercellinjer. Representativa tumörer och hematoxylin och eosinfärgning till följd av implantation av mänskliga prostatacancer cellinjer (A) CWR och (B) C4-2 tillsammans med murincell linje (C) MyC-CaP. Bioluminescens avbildning av de resulterande tumörerna från firefly luciferase markerade CWR celler visas i (A). Mätskalan intill de strukna tumörerna visar 1 mm markeringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ tumörutveckling från cancer i urinblåsan. Representativa tumörer till följd av implantation av de etablerade mänskliga blåscancercellinjer (A) HT-1376, (B) T24 och (C) primära mänskliga urinblåsan tumör. I (C) visas hematoxylin och eosinfärgning av den resulterande CAM-tumören och den primära tumören. Mätskalan intill de strukna tumörerna visar 1 mm markeringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumör expansion och engraftment med hjälp av CAM-modellen möjliggör snabbare och direkt observerbar tumörtillväxt än befintliga in vivo djurmodeller. Dessutom är kostnaderna betydligt lägre när det första köpet av utrustningen är klart, särskilt jämfört med kostnaden för immunkomprometterade möss. Det ursprungliga, immunkomprometterade tillståndet för kycklingembryon tillåter lätt engraftment av mänsklig och murinvävnad. Även med dessa styrkor har CAM-modellen begränsningar. Den korta tid som kan vara en fördel kan också vara en nackdel om långsiktiga behandlingsstudier är motiverade. Den immunkomprometterade / immun tolerant status CAM modellen kan komplicera studier av tumör-immun interaktioner. För dessa studier kan coimplantation av immunceller av intresse vara nödvändigt, möjligen med påfyllning av immunförsvaret. Dessutom, även om alla tumörtyper vi presenterade engraft i CAM-modellen, de gör det med varierande grad av tillväxt. Till exempel, njurlymfknutor cell carcinom bildar snabbt stora tumörer, men äggstockscancer tumörer är svåra att visualisera utan hjälp av bioluminescens imaging. Tumör tillväxt och hastighet skulle behöva bedömas för en viss tumör typ för att avgöra om CAM skulle vara en lämplig experimentell modell.
Framgångsrik tumör engraftment kräver noggrann slutförande av specifika steg i protokollet. För det första måste ägg inkuberas under idealiska förhållanden för att ha optimal embryoöverlevnad och CAM-bildning före engraftment. På grund av den naturliga variationen i omgångar föreslår vi att du får överflödiga ägg från den specifika äggleverantören. Vi har också funnit att svalare, regnigare väder kan leda till svamptillväxt i äggen. Under blötare väder kan fler ägg behöva ympas för att få tillräcklig avkastning vid effektmåttet. Denna säsongsvariation kommer sannolikt att vara regionspecifik. Adekvat CAM-formation är viktigt för framgångsrik tumörengraftment. Alla indikationer på att CAM är kvar fäst vid skalet när du öppnar bör inte ignoreras. Om flera ägg inte har intakt CAM när du öppnar den första satsen, rekommenderar vi att öppna de återstående äggen i minst 1 till dag.
Om dålig lönsamhet eller engraftment erhålls, kan flera steg vara fel. För det första kan embryots livskraft från leverantören vara dålig. Avsaknad av en luftcell och synlig vaskulatur indikerar ett icke lönsamt ägg. Ibland kan embryorörelse visualiseras för att bekräfta livskraften. Först, dock se till att nya batterier är i äggljuset, eftersom ett starkt ljus behövs för visualisering. Flottörtestet kan också göras för att bedöma lönsamheten (en mängd instruktioner och videor finns tillgängliga online). En annan möjlig förklaring till dålig livskraft är inkubatorn. Använd en oberoende hygrometer och termometer, se till att inställningarna är korrekta och stabila. Tillverkarens instruktioner för inkubatorn bör innehålla detaljerade felsökningsinstruktioner för att bedöma korrekta inställningar. Felaktiga inkubatorinställningar kan också äventyra CAM-utvecklingen. Med tejp och/eller markör, avgöra om äggrotatorn faktiskt snurrar äggen. Om nonstick ringar sjunka in i albumin i en hög andel av engrafted ägg, då CAM inte tillräckligt utveckla. Slutligen har vi funnit att frekvent kontroll av det engrafted ägg, vilket leder till temperatur och luftfuktighet fluktuationer, kan minska postimplant lönsamhet. Om implanterade ägg är initialt bärkraftiga, men lönsamheten minskar under hela engraftperioden, bör äggen kontrolleras mindre ofta. Denna minskning av lönsamheten kan också bero på felaktiga eller olämpliga inkubatorinställningar efter implantation.
När du optimerar den här metoden för en ny celltyp kan flera faktorer styras. Den första är cellnummer. Vi implanterar vanligtvis 5 x 105-2 x 106 celler från cellinjer. Implanterade tumörbitar är vanligtvis 2-5 mm på varje sida. Dessa belopp kan justeras för att förbättra engraftment eller storlek. Vi har dock funnit att tumörtillväxt minskar över en viss tröskel, vilket är celltypberoende. Ytterligare engraftment parametrar inkluderar närvaro eller frånvaro av en nonstick ring. Det här valet görs vanligtvis baserat på om ringen kommer att hindra endpointanalysen, även om det också kan påverka engraftment. Förekomsten av nonstick ringen kan också tillåta att täcka begynnande moderplantor med medium med önskade intervaller för att förbättra överlevnaden före vaskulär rekrytering, om så önskas. Valet av extracellulär matristyp, koncentration och medium där matrisen späds ut kan också påverka engraftment. Tillägg av tillväxtfaktorer eller hormoner kan ytterligare förbättra tumör ta hastighet eller storlek. Valet av tillsatser och koncentrationer måste göras på grundval av vad som skulle vara lämpligt för den specifika celltypen och inte störa experimentet. Dessa skulle också ha potential att fyllas på med jämna mellanrum om en nonstick ring används.
Framtida tillämpningar av detta modellsystem beror på hypotesen som ska testas. Till exempel kan dessa tumörtransplantat användas för att testa nya terapeutiska metoder för att minska tumörstorlek eller utarmning en subpopulation av tumören. Co-implantation med celler från värdtumör mikromiljö kan tillåta studier av påverkan av dessa celler på en mängd olika parametrar, inklusive tumör tillväxt och behandlingsmotstånd. Denna modell kan också fungera som en möjlighet att stegvis expandera primära mänskliga tumörer innan xenografts i immunkomprometterade djurmodeller. Den första anpassningen till CAM engraftment kan kanske underlätta tumör ta hastighet i murin modeller. Dessa ansökningar har ännu inte testats, men motiverar ytterligare prospektering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Fuyuhiko Tamanoi och Binh Vu för den inledande utbildningen på denna metod. Diskussioner med Dr Eva Koziolek har bidragit till att optimera denna strategi och har varit mycket uppskattat. Detta arbete skulle inte ha varit möjligt utan finansiering från följande källor: tobaksrelaterade sjukdomforskningsprogrammet Postdoctoral Fellowship (27FT-0023, till ACS), Department of Defense (DoD) Äggstockscancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), tobaksrelaterade sjukdomar Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016), och UCLA institutionellt stöd, inklusive ett JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) och ett 3R-bidrag från office of the Vice Chancellor for Research till LW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
