Summary
Her præsenterer vi en metode til screening anti-hepatitis B viral agenter, der hæmmer HBX-DDB1 interaktion ved hjælp af en split der assay system. Dette system giver mulighed for nem påvisning af protein-protein interaktioner og er egnet til at identificere hæmmere af sådanne interaktioner.
Abstract
Der er et presserende behov for nye terapeutiske midler til hepatitis B virus (HBV) infektion. Selv om de aktuelt tilgængelige nucleos (t) ide-analogere hæmmer viral replikation, har de ingen direkte virkning på ekspression af virale proteiner, der er transkriberet fra et viral, kovalent lukket cirkulært DNA (cccDNA). Da høj viral antigen belastning kan spille en rolle i denne kroniske og HBV-relaterede carcinogenese, er målet med HBV behandling at udrydde virale proteiner. HBV Regulatory protein X (HBx) binder til Host DNA Damage-bindende protein 1 (DDB1) protein til at forringe strukturel vedligeholdelse af kromosomer 5/6 (Smc5/6), hvilket resulterer i aktivering af viral transkription fra cccDNA. Her, ved hjælp af en split der komplementering assay system, præsenterer vi en omfattende sammensatte screening system til at identificere hæmmere af HBX-DDB1 interaktion. Vores protokol gør det nemt at opdage interaktions dynamik i realtid i levende celler. Denne teknik kan blive en vigtig analyse for at opdage nye terapeutiske midler til behandling af HBV-infektion.
Introduction
Hepatitis B-virus (HBV) infektion er et stort folkesundhedsproblem på verdensplan, med årlige estimater af 240.000.000 mennesker kronisk inficeret med HBV og 90.000 dødsfald på grund af komplikationer fra infektionen, herunder cirrose og hepatocellulære karcinom (HCC)1. Selv om de nuværende anti-HBV terapeutiske midler, nucleos (t) ide analoger, tilstrækkeligt hæmmer viral reverse transkription, de sjældent opnå eliminering af virale proteiner, som er det langsigtede kliniske mål. Deres ringe virkning på udskillelsen af virus protein skyldes deres manglende direkte virkning på viral transskription fra episomal viral kovalent lukket cirkulært DNA (cccdna) minichromosomes i hepatocyt Nucleus2.
HBV transskription aktiveres af HBV Regulatory X (HBx) protein3. Nylige undersøgelser afslørede, at HBX nedbryder strukturel vedligeholdelse af kromosomer 5/6 (Smc5/6), en værts begrænsnings faktor, der blokerer HBV-transkriptionen fra cccdna, via kapring af et DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ubiquitinligase-kompleks4,5,6. Derfor menes et afgørende skridt i at fremme viral transskription fra cccDNA at være HBx-DDB1 interaktion. Forbindelser, der kan hæmme bindingen mellem HBx og DDB1, blokerer viral transkriptionen, og nitazoxid blev faktisk identificeret som en hæmmer af HBx-DDB1-interaktionen via et screeningssystem, der er udviklet i vores laboratorium7.
Her præsenterer vi vores bekvemme screening system, der anvendes til at identificere hæmmere af HBX-DDB1 interaktion, som udnytter en split der komplementær assay7,8. Split der-under enheder er smeltet til HBX og DDB1, og HBX-DDB1-interaktionen bringer underenhederne i umiddelbar nærhed til at danne et funktionelt enzym, der genererer et klart luminescerende signal. Da interaktionen mellem underenhederne er reversibel, kan dette system detektere hurtigt dissocierende HBx-DDB1 proteiner (figur 1). Ved hjælp af dette system, kan en stor sammensatte bibliotek let screenes, hvilket kan resultere i opdagelsen af nye forbindelser, der er i stand til effektivt at hæmme HBx-DDB1 interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: en skematisk gengivelse af den opdelte der-analyse er vist i figur 1A, og analyseprocessen er skitseret i figur 1B. Interaktions dynamikken kan måles i realtid uden cellelyse.
1. klargøring af celler
- Vedligehold dyrkede HEK293T celler i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% v/v føtal bovin serum (FBS), 1x penicillin/streptomycin ved 37 °C i 20% O2 og 5% Co2.
- Frø 5 x 106 celler i en 100 mm skål med 10 ml DMEM og Inkuber ved 37 °c natten over.
- Transitivt transficere 1 μg HBX og DDB1 med split luciferaser ind i cellerne efterfølgende metode.
Bemærk: mængden af plasmid-DNA transficeret kan afhænge af transfektering Regent anvendes. Den optimale placering af den opdelte der, der er smeltet til målproteinet, skal bestemmes på forhånd. I dette tilfælde, HBX fvant til lgbit på C-terminalen af HBX (HBX-lgbit) og DDB1 fvant til smbit ved N-endestation af DDB1 (smbit-DDB1) gav de bedste resultater (dvs. de lyseste der signaler). Denne proces er tidligere blevet rapporteret i detaljer7.- 1 μg HBx-LgBit, der udtrykker DNA-plasmid, og 1 μg SmBit-DDB1 udtrykker DNA-plasmid (tabel over materialer) i DNA-kondensations buffer (tabel over materialer) fortyndes til et samlet volumen på 300 μl.
- Tilsæt 16 μl forstærker-opløsning (tabel over materialer), og bland med vortexning i 1 s.
- Prøven inkubates ved stuetemperatur i 3 minutter.
- Tilsæt 60 μl transfektering reagens (tabel over materialer) til prøven og bland med vortexning for 10 s.
- Prøven inkubates ved stuetemperatur i 8 minutter.
- Under inkubationen aspirerer du kulturmediet fra skålen (forberedt i trin 1,2) og vasker celler med 5 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS). Fjern PBS ved aspiration, og tilsæt 7 mL DMEM.
- Der tilsættes 3 ml DMEM til røret, som indeholder transfektering komplekser. Bland ved pipettering og tilsæt transfektering komplekser på cellen i 10 cm skålen.
- Cellerne inkubates ved 37 °C i en inkubator under 5% CO2 i 10 timer.
- Reseed cellerne i en hvid 96 brønd plade ved 5 x 104 celler/godt i 50 μl medium/godt efterfølgende metode.
- Fjern det brugte cellekulturmedium, og vask cellerne med 5 mL PBS.
- Fjern PBS ved aspiration, tilsæt 1 mL 0,25% trypsin-EDTA, og Inkuber ved 37 °C i 5 minutter for at frigøre celler.
- Tilsæt 4 mL DMEM, og dispersserer mediet ved at pipettere over overfladen af cellelaget flere gange. Overfør cellesuspensionen til et rør.
- Centrifuge cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og celle pellet opslæmmes i 1 mL PBS.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
- Fortynd celle pellet med bufferet cellekulturmedium (tabel over materialer) suppleret med 10% FBS til en såning tæthed på 1,0 x 106 celler/ml.
- Der afpipetteres 50 μL cellesuspension i hver brønd af en 96 brønd plade, og cellerne returneres til inkubator.
- Inkubatceller ved 37 °C under 5% CO2 i 10 timer.
2. sammensatte screening
- Under inkubationen fortyndes Screenings forbindelserne (tabel over materialer) og opløsningsmiddel (dimethylsulfoxid [DMSO]) ved 13,5 x koncentration. For eksempel, hvis bestanden er 10 mM og Screenings koncentrationen er 10 μM, tilsættes 1 μL stamopløsning til 73,1 μL bufferet cellekulturmedium.
- Tilsæt 12,5 μL luminescerende substrat (tabel over materialer) til hver brønd og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: som negativ kontrol bør brøndene i begge ender af pladen (dvs. kolonne 1 og 12) ikke indeholde noget luminescerende substrat. - Mål den grundlæggende luminescens ved hjælp af et luminometer (tabel over materialer).
- Umiddelbart efter den første måling tilsættes 5 μL forbindelser og kontrol DMSO fortyndet i trin 2,1 til hver brønd.
Bemærk: den endelige koncentration vil være 10 μM. - Mål luminescens værdier hver 30 min for 2 h.
Bemærk: pladen skal inkuberet i mørke ved stuetemperatur. - De hæmmende virkninger beregnes ved sammenligning med kontrol DMSO-behandling efter normalisering til de oprindelige signaler.
Bemærk: screening af hver forbindelse i duplikat eller triplicat kan reducere variation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater efter anvendelsen af denne protokol er vist i figur 2A, B. Forholdet mellem signal og baggrund var større end 80, og Z ' faktor9 (det gyldne standard kvalitetsindeks for screening med høj gennemløb) var større end 0,5, hvilket indikerer, at dette analyse system var acceptabelt for screening med høj gennemløb. Med tærsklen sat til > 40% hæmning sammenlignet med kontrol (DMSO kun), identificerede vi nitazoxid som et kandidatstof7. Ved hjælp af dette system, bedre kandidat medicin kan findes ved screening andre, større sammensatte biblioteker.
Figur 1: skematisk gengivelse af Split der-analyse af HBX-DDB1-interaktionen. A) det princip, der ligger til grund for påvisning af HBX-DDB1 binding ved hjælp af det komplementære analyse system split der. De adskilte der under enheder, lgbit og smbit, er smeltet til henholdsvis HBX og DDB1. HBx-DDB1-interaktionen bringer underenhederne i umiddelbar nærhed til at danne et funktionelt enzym, der genererer et lysende signal. Interaktionen mellem underenhederne er reversibel. B) opdeling af der-analysen. Efter Co-transfection af plasmider til ekspression af HBx smeltet til LgBit og DDB1 smeltet til SmBit, celler blev re-seedet i en 96 brønd plade. Tilføjelsen af luminescerende substrat muliggør måling af luciferaseaktivitet uden et cellelyse trin. Luciferaseaktiviteter kan måles efter tilsætning af screenings forbindelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vellykkede resultater af Split der assay. A) repræsentative baseline-luminescerende signaler fra en 96 brønd plade. Luciferase intensitet repræsenteres af tal og farver. Kolonne 1 og 12 er kontrolelementer, hvor det lysende substrat ikke blev tilføjet. Z ' faktoren var større end 0,5. (B) repræsentative tidsserie resultat af relativ luciferaseaktivitet niveauer efter tilsætning af screening forbindelser til en 96 brønd plade. X-aksen repræsenterer de hæmmende virkninger beregnet sammenlignet med kontrol (DMSO) efter standardisering til den grundlæggende luciferaseaktivitet. Den mest effektive forbindelse var nitazoxid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi udviklede en bekvem screeningmetode ved hjælp af en split der assay til at finde HBX-DDB1 binding hæmmere. Interaktions dynamikken kan påvises i realtid i levende celler uden behov for cellelyse. Hæmning af HBx-DDB1-interaktionen fører til genoprettelse af Smc5/6, hvilket resulterer i undertrykkelse af viral transkriptionen, protein ekspression og cccDNA-produktion7. Denne nye mekanisme for antiviral handling kan overvinde utilstrækkeligheden af nuværende HBV-terapier.
Selv om en række metoder er tilgængelige til at undersøge protein-protein interaktioner i levende celler, undersøge disse interaktioner fortsat vanskeligt10. Vores procedure er enkel og kræver kun en kort tid til at screene 1 96 godt plade. Desuden var screeningen kvalitet tilfredsstillende med en høj Z ' score, guld standard kvalitetsindeks for high-gennemløb screening9. Vores analyse kan være egnet til robot Automation11 og er en effektiv analyse for Drug Discovery.
Mens den protokol, der er beskrevet her, brugte HEK293T-celle linjen, fordi dens høje transfektering effektivitet og høj spredningsevne er egnet til høj gennemløbs screening, kan denne screeningsmetode udføres ved hjælp af andre cellelinjer (f. eks. HepG2) uden modifikationer7. Som en realistisk strategi for screening forbindelser, HEK293T celler kan anvendes i den første screening efterfulgt af HepG2 celler i en anden validering screening. Nogle forbindelser kan ikke vise signifikante resultater i forskellige cellelinjer, når virkningerne er afhængige af indirekte mekanismer.
Da det var vores hensigt at udvikle en screeningsmetode med høj gennemløb, er det nødvendigt med efterfølgende valideringsundersøgelser for at bekræfte, om de identificerede forbindelser fungerer som interaktions inhibitorer. Nedsatte niveauer af lysende signaler i denne analyse svarer ikke altid til hæmning af HBx-DDB1-interaktionen. Cytotoksiske tests, co-immunoprecipitation undersøgelser, og yderligere anti-HBV eksperimenter er vigtige for at bekræfte virkningerne7.
Selv om vi tidligere identificerede nitazoxid som en hæmmer af HBx-DDB1 interaktion ved at screene et relativt lille sammensatte bibliotek7, kan yderligere undersøgelser med screening af meget større sammensatte biblioteker let udføres for at identificere nye forbindelser, der er i stand til at hæmme protein-protein interaktioner mere effektivt. Når der udføres en sådan yderligere screening, kan nitazoxid anvendes som en positiv kontrol for analysen. Desuden kan det system, der er beskrevet her, anvendes på andre protein-protein interaktioner. Protein-protein interaktioner er en vigtig klasse af narkotika mål12. Faktisk, mange andre vira interagerer med Host faktorer til at replikere eller udtrykke deres patogenicitet13,14. Den opdelte luciferase-baserede assay, der er beskrevet her, som er rettet mod samspillet mellem virale og Host proteiner, kan give en ny strategi for udvikling af helbredelsesmetoder for HBV og andre smitsomme sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af støtte fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi, Japan (#19H03430 og #17K09405 til M.O., og #19J11829 til K.S.), ved hjælp af støtte til videnskabelig forskning i innovative områder (#18H05024 til M.O.), af forskningsprogrammet om hepatitis fra Japan agentur for medicinsk forskning og udvikling, AMED (til M.O., #JP19fk021005), ved program om innovativ udvikling og anvendelse af nye lægemidler til hepatitis B (#JP19fk0310102 til K.K.) fra AMED, ved tilskud fra Japan Foundation for Applied Enzymology og fra Kobayashi Foundation for Cancer Research (til M.O.), af GSK Japan Research Grant 2018 (til K.S.), og af et stipendium fra Miyakawa Memorial Research Foundation (til K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
