Summary
Ici, nous présentons une méthode pour le dépistage des agents viraux anti-hépatite B qui inhibent l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'évaluation de la luciferase fractionnée. Ce système permet une détection facile des interactions protéines-protéines et convient à l'identification des inhibiteurs de ces interactions.
Abstract
Il y a un besoin urgent de nouveaux agents thérapeutiques pour l'infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Bien que les analogues nucléos(t)ide actuellement disponibles inhibent puissamment la réplication virale, ils n'ont aucun effet direct sur l'expression des protéines virales transcrites à partir d'un ADN circulaire viril covalently fermé (cccDNA). Comme une charge élevée d'antigène viral peut jouer un rôle dans cette carcinogenèse chronique et liée au VHB, l'objectif du traitement du VHB est d'éradiquer les protéines virales. La protéine régulatrice du VHB X (HBx) se lie à la protéine 1 (DDB1) qui lie les dommages à l'ADN de l'hôte pour dégrader le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), ce qui entraîne l'activation de la transcription virale de l'ADN-ccc. Ici, à l'aide d'un système d'analyse de complémentarité de la luciférase fractionnée, nous présentons un système complet de dépistage composé pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1. Notre protocole permet une détection facile de la dynamique d'interaction en temps réel au sein des cellules vivantes. Cette technique peut devenir un essai clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour le traitement de l'infection par le VHB.
Introduction
L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, avec des estimations annuelles de 240 millions de personnes infectées de façon chronique par le VHB et de 90 000 décès dus à des complications de l'infection, y compris la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (HCC)1. Bien que les agents thérapeutiques anti-HBV actuels, analogues nucléos(t)ide, inhibent suffisamment la transcription inverse virale, ils atteignent rarement l'élimination des protéines virales, qui est l'objectif clinique à long terme. Leur mauvais effet sur l'élimination des protéines virales est dû à leur manque d'effet direct sur la transcription virale des minichromosomes d'ADN circulaires épisomiques covalentement fermés (cccDNA) dans le noyau d'hépatocyte2.
La transcription du VHB est activée par la protéine HBV regulatory X (HBx)3. Des études récentes ont révélé que HBx dégrade le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), un facteur de restriction de l'hôte qui bloque la transcription du VHB de cccDNA, par le détournement d'un DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complexe4,5,6. Par conséquent, une étape cruciale dans la promotion de la transcription virale de cccDNA est pensé pour être l'interaction HBx-DDB1. Les composés capables d'inhiber la liaison entre HBx et DDB1 peuvent bloquer la transcription virale, et en effet le nitazoxanide a été identifié comme un inhibiteur de l'interaction HBx-DDB1 via un système de criblage développé dans notre laboratoire7.
Ici, nous présentons notre système de criblage commode utilisé pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1, qui utilise un test complémentaire de luciferase fractionnée7,8. Les sous-unités de luciferase fendues sont fusionnées à HBx et DDB1, et l'interaction HBx-DDB1 amène les sous-unités à proximité pour former une enzyme fonctionnelle qui génère un signal luminescent lumineux. Comme l'interaction entre les sous-unités est réversible, ce système peut détecter des protéines HBx-DDB1 dissociantes rapidement dissociantes (figure 1). À l'aide de ce système, une grande bibliothèque de composés peut être facilement examinée, ce qui peut entraîner la découverte de nouveaux composés capables d'inhiber efficacement l'interaction HBx-DDB1.
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Protocol
REMARQUE: Une représentation schématique de l'analyse de la luciferase fendue est indiquée à la figure 1A, et le processus d'analyse est décrit à la figure 1B. La dynamique d'interaction peut être mesurée en temps réel sans lyse cellulaire.
1. Préparation cellulaire
- Maintenir les cellules HEK293T cultivées dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% v/v sérum bovin foetal (FBS), 1x pénicilline/streptomycine à 37 oC dans 20% O2 et 5% CO2.
- Ensemencer 5 x 106 cellules dans un plat de 100 mm avec 10 ml de DMEM et incuber à 37 oC pendant la nuit.
- Transfect transitoirement 1 g de HBx et DDB1 avec des luciferases fendues dans les cellules selon la méthode suivante.
REMARQUE: La quantité d'ADN plasmide transfectépeut peut dépendre du régent de transfection utilisé. La position optimale de la luciferase fendue fusionnée à la protéine cible doit être déterminée à l'avance. Dans ce cas, HBx fusionné à LgBit au c-terminus de HBx (HBx-LgBit) et DDB1 fusionné à SmBit au n-terminus de DDB1 (SmBit-DDB1) a fourni les meilleurs résultats (c.-à-d., les signaux de luciférase les plus brillants). Ce processus a été rapporté précédemment dans le détail7.- Diluer 1 g de HBx-LgBit exprimant le plasmide d'ADN et 1 g de SmBit-DDB1 exprimant le plasmide d'ADN (Tableau des matériaux) dans le tampon de condensation d'ADN (tableau des matériaux) à un volume total de 300 L.
- Ajouter 16 l de solution d'améliorateur (Table of Materials) et mélanger par vortexing pour 1 s.
- Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 3 min.
- Ajouter 60 l de réactif de transfection(tableau des matériaux)à l'échantillon et mélanger par vortexing pendant 10 s.
- Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 8 min.
- Pendant l'incubation, aspirer le milieu de culture du plat (préparé à l'étape 1.2), et laver les cellules avec 5 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS). Supprimer PBS par aspiration et ajouter 7 mL de DMEM.
- Ajouter 3 ml de DMEM au tube contenant les complexes de transfection. Mélanger par pipetting et ajouter les complexes de transfection sur la cellule dans le plat de 10 cm.
- Incuber les cellules à 37 oC dans un incubateur de moins de 5 % de CO2 pendant 10 h.
- Réensemencer les cellules dans une plaque blanche de 96 puits à 5 x 104 cellules/puits dans 50 L de moyenne /puits selon la méthode suivante.
- Enlever le milieu de culture cellulaire usé et laver les cellules avec 5 ml de PBS.
- Retirez le PBS par aspiration, ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA de 0,25 % et incubez à 37 oC pendant 5 min pour détacher les cellules.
- Ajouter 4 ml de DMEM et disperser le milieu en tapissant plusieurs fois la surface de la couche cellulaire. Transférer la suspension de la cellule dans un tube.
- Cellules centrifugeuses à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de PBS.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le supernatant.
- Diluer le granule cellulaire avec le milieu de culture cellulaire tamponné (Tableau des matériaux) complété par 10% FBS à une densité d'ensemencement de 1,0 x 106 cellules/mL.
- Pipette 50 l de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de puits de 96 et retourner les cellules à l'incubateur.
- Incuber les cellules à 37 oC sous 5 % de CO2 pendant 10 h.
2. Dépistage composé
- Pendant l'incubation, diluer les composés de criblage(Tableau des matériaux) et le solvant (sulfoxide de diméthyle [DMSO]) à une concentration de 13,5x. Par exemple, si le stock est de 10 mm et que la concentration de criblage est de 10 M, ajoutez 1 l de solution de stock à 73,1 l de milieu de culture cellulaire tamponné.
- Ajouter 12,5 l de substrat luminescent(tableau des matériaux)à chaque puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.
REMARQUE: En tant que contrôles négatifs, les puits aux deux extrémités de la plaque (c.-à-d. les colonnes 1 et 12) ne doivent pas contenir de substrat luminescent. - Mesurer la luminescence de base à l'aide d'un luminomètre (Tableau des matériaux).
- Immédiatement après la mesure initiale, ajouter 5 l de composés et contrôler le DMSO dilué à l'étape 2.1 à chaque puits.
REMARQUE: La concentration finale sera de 10 M. - Mesurer les valeurs de luminescence toutes les 30 min pendant 2 h.
REMARQUE: La plaque doit être incubée dans l'obscurité à température ambiante. - Calculer les effets inhibiteurs en comparant le traitement de contrôle DMSO après la normalisation aux signaux de base.
REMARQUE: Le dépistage de chaque composé en double ou en triplepeut peut réduire les variations.
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Representative Results
Les résultats représentatifs à la suite de l'utilisation de ce protocole sont indiqués à la figure 2A,B. Le rapport signal-arrière était supérieur à 80 et le facteurZ 9 (l'indice de qualité de l'étalon-or pour le dépistage à haut débit) était supérieur à 0,5, ce qui indique que ce système d'analyse était acceptable pour le dépistage à haut débit. Avec le seuil fixé à l'inhibition de 40% par rapport au contrôle (DMSO seulement), nous avons identifié le nitazoxanide comme un médicament candidat7. Grâce à ce système, de meilleurs médicaments candidats peuvent être trouvés en examinant d'autres bibliothèques composées plus grandes.
Figure 1 : Représentation schématique de l'analyse de la luciferase fractionnée de l'interaction HBx-DDB1. (A) Le principe sous-jacent à la détection de la liaison HBx-DDB1 à l'aide du système d'analyse complémentaire à la luciferase fendue. Les sous-unités de luciferase séparées, LgBit et SmBit, sont fusionnées à HBx et DDB1, respectivement. L'interaction HBx-DDB1 rapproche les sous-unités pour former une enzyme fonctionnelle qui génère un signal luminescent. L'interaction entre les sous-unités est réversible. (B) Split luciferase assay. Après la co-transfection des plasmides pour l'expression de HBx fusionné à LgBit et DDB1 fusionné à SmBit, les cellules ont été re-enseçant esclavagées dans une plaque de puits 96. L'ajout de substrat luminescent permet de mesurer l'activité de la luciferase sans une étape de lyse cellulaire. Les activités de Luciferase peuvent être mesurées après l'ajout des composés de criblage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats réussis de l'analyse de la luciferase fractionnée. (A) Signaux luminescents de base représentatifs d'une plaque de puits de 96. L'intensité de Luciferase est représentée par des nombres et des couleurs. Les colonnes 1 et 12 sont des commandes dans lesquelles le substrat luminescent n'a pas été ajouté. Le facteur Z était supérieur à 0,5. (B) Résultat représentatif de la série chronologique des niveaux relatifs d'activité de luciferase après l'ajout des composés de criblage à une plaque de puits 96. L'axe X représente les effets inhibiteurs calculés par rapport au contrôle (DMSO) après normalisation à l'activité de luciferase de base. Le composé le plus efficace était le nitazoxanide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons développé une méthode de criblage pratique utilisant un test de luciferase split pour trouver des inhibiteurs de liaison HBx-DDB1. La dynamique d'interaction peut être détectée en temps réel dans les cellules vivantes sans avoir besoin de lyse cellulaire. L'inhibition de l'interaction HBx-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription virale, l'expression des protéines, et la production cccDNA7. Ce nouveau mécanisme d'action antivirale peut surmonter les insuffisances des thérapies actuelles de HBV.
Bien qu'un certain nombre de méthodes soient disponibles pour étudier les interactions protéines-protéines dans les cellules vivantes, l'examen de ces interactions reste difficile10. Notre procédure est simple et ne nécessite que peu de temps pour filtrer une plaque de puits 96. En outre, la qualité de dépistage était satisfaisante avec un score élevé de Z', l'indice de qualité de l'étalon-or pour le dépistage à haut débit9. Notre analyse peut être adaptée à l'automatisation robotique11 et est un test efficace pour la découverte de médicaments.
Bien que le protocole décrit ici ait utilisé la lignée cellulaire HEK293T parce que son efficacité de transfection élevée et sa capacité de prolifération élevée conviennent au dépistage à haut débit, cette méthode de dépistage peut être effectuée à l'aide d'autres lignées cellulaires (p. ex. HepG2) sans modifications7. Comme stratégie réaliste pour le dépistage des composés, les cellules HEK293T peuvent être utilisées dans le premier dépistage suivi par les cellules HepG2 dans un deuxième criblage de validation. Certains composés peuvent ne pas montrer de résultats significatifs dans différentes lignées cellulaires lorsque les effets dépendent de mécanismes indirects.
Comme notre intention était de mettre au point une méthode de dépistage à haut débit, des études de validation ultérieures sont nécessaires pour confirmer si les composés identifiés fonctionnent comme des inhibiteurs de l'interaction. Les niveaux réduits de signaux luminescents dans cet exemple ne correspondent pas toujours à l'inhibition de l'interaction HBx-DDB1. Les tests de cytotoxicité, les études de co-immunoprécipitation et d'autres expériences anti-HBV sont importants pour confirmer les effets7.
Bien que nous ayons précédemment identifié le nitazoxanide comme un inhibiteur de l'interaction HBx-DDB1 en examinant une bibliothèque composée relativement petite7, d'autres études impliquant le dépistage de bibliothèques composées beaucoup plus grandes peuvent être facilement effectuées pour identifier de nouveaux composés qui sont capables d'inhiber les interactions protéines-protéines plus efficacement. Lors de l'exécution d'un tel dépistage supplémentaire, le nitazoxanide peut être utilisé comme un contrôle positif pour l'analyse. En outre, le système décrit ici peut être appliqué à d'autres interactions protéines-protéines. Les interactions protéines-protéines sont une classe importante de cibles médicamenteuses12. En effet, de nombreux autres virus interagissent avec les facteurs de l'hôte pour reproduire ou exprimer leur pathogénie13,14. L'analyse à base de luciférase fractionnée décrite ici, qui cible les interactions entre les protéines virales et les protéines hôtes, peut fournir une nouvelle stratégie pour développer des remèdes contre le VHB et d'autres maladies infectieuses.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Des subventions en aide du Ministère de l'éducation, Culture, Sports, Science et Technologie, Japon (#19H03430 et #17K09405 à M.O., et #19J11829 à K.S.), par une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (#18H05024 à M.O.), par le Programme de recherche sur l'hépatite du Japon Agency for Medical Research and Development, AMED (à M.O., #JP19fk021005), par programme sur le développement innovant et l'application de nouveaux médicaments pour l'hépatite B.( #JP19fk0310102 à K.K.) la Japan Foundation for Applied Enzymology et de la Kobayashi Foundation for Cancer Research (à M.O.), par GSK Japan Research Grant 2018 (à K.S.), et par une subvention de la Miyakawa Memorial Research Foundation (à K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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