Summary
여기서, 우리는 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호작용을 억제하는 항-B형 간염 바이러스 성 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호 작용의 쉬운 검출을 허용하고 그 같은 상호 작용의 억제제를 확인하기 위해 적당합니다.
Abstract
B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 새로운 치료제에 대한 긴급한 필요성이 있다. 현재 유효한 핵 (t)ide 유사체는 바이러스 복제를 강력하게 억제하지만, 그들은 바이러스 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA)에서 전사 된 바이러스 성 단백질의 발현에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 높은 바이러스 항원 부하가 이 만성 및 HBV 관련 발암에 역할을 할 수 있기 때문에, HBV 처리의 목표는 바이러스 성 단백질을 근절하는 것입니다. HBV 조절 단백질 X (HBx)는 cccDNA에서 바이러스 전사의 활성화의 결과로 염색체 5/6 (Smc5/6)의 구조적 유지 보수를 저하시키기 위해 숙주 DNA 손상 결합 단백질 1 (DDB1) 단백질에 결합합니다. 여기서, 분할 루시퍼라제 보완 분석 시스템을 사용하여, 우리는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하기 위한 포괄적인 화합물 스크리닝 시스템을 제시한다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 내에서 실시간으로 상호 작용 역학의 쉬운 검출을 가능하게합니다. 이 기술은 HBV 감염의 처리를 위한 새로운 치료제를 발견하는 중요한 분석사가 될 수 있습니다.
Introduction
B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제이며, 연간 2억 4천만 명이 HBV에 만성 감염되고 간경변및 간세포암(HCC)을 포함한 감염합병증으로인한 90,000명의 사망자가 발생한다. 현재 항-HBV 치료제인 뉴클레오스(t)ide 유사체는 바이러스 역 전사를 충분히 억제하지만, 장기적인 임상 목표인 바이러스 성 단백질의 제거를 거의 달성하지 못한다. 바이러스 성 단백질 제거에 대한 그들의 나쁜 효과는 간세포핵2에서에피솜 바이러스 성 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA) 미니 염색체에서 바이러스 전사에 대한 직접적인 영향의 부족으로 인한 것입니다.
HBV 전사는 HBV 조절 X (HBx) 단백질3에의해 활성화됩니다. 최근 연구에 따르면 HBx는 DDB1-CUL4-ROC1 E3 유비퀴틴 리가제 복합체4,5,6을납치하여 cccDNA에서 HBV 전사를 차단하는 숙주 제한 인자인 염색체 5/6(Smc5/6)의 구조적 유지를 저하시키는 것으로 나타났습니다. 따라서, cccDNA로부터의 바이러스 전사를 촉진하는 중요한 단계는 HBx-DDB1 상호작용으로 생각된다. HBx와 DDB1 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물은 바이러스 전사를 차단할 수 있으며, 실제로 니타옥산화물은 실험실에서 개발된 스크리닝 시스템을 통해 HBx-DDB1 상호작용의 억제제로 확인되었다7.
여기서, 우리는 분할 루시퍼라제 상보적분석7,8을활용하는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하는 데 사용되는 편리한 스크리닝 시스템을 제시한다. 분할 루시퍼라제 서브유닛은 HBx 및 DDB1에 융합되고, HBx-DDB1 상호작용은 소단위를 근접하게 하여 밝은 발광 신호를 생성하는 기능성 효소를 형성합니다. 소단위 간의 상호작용이 가역적이기 때문에, 이 시스템은 HBx-DDB1 단백질을 빠르게 해리시키는 것을 검출할 수있다(도 1). 이 시스템을 사용하여, 큰 화합물 라이브러리는 쉽게 스크리닝될 수 있으며, 이는 HBx-DDB1 상호작용을 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 화합물의 발견을 초래할 수 있다.
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Protocol
참고: 분할 루시퍼라아제 분석법의 개략적 표현은 도 1A에나와 있으며, 분석 과정은 도 1B에설명되어 있습니다. 상호작용 역학은 세포 라해없이 실시간으로 측정될 수 있다.
1. 세포 준비
- 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 배양된 HEK293T 세포를 10% v/v 태아 소 혈청(FBS),37°C에서 1x 페니실린/스트렙토마이신을 20%O2 및 5%CO2로유지한다.
- 시드 5 x 106 세포를 100 mm 접시에 DMEM 10 mL로 넣고 밤새 37°C에서 배양합니다.
- 다음 방법에 따라 HBx 및 DDB1의 1 μg를 분할 된 루시퍼라제를 세포내로 일시적으로 트랜스펙트합니다.
참고: 플라스미드 DNA가 형질감염된 양은 사용되는 형질감염 섭정에 따라 달라질 수 있다. 표적 단백질에 융합된 분할 루시퍼라제의 최적 위치는 사전에 결정되어야 한다. 이 경우 HBx는 DDB1(SmBit-DDB1)의 N-종점에서 HBx(HBx-LgBit)와 DDB1의 C-종단에서 LgBit에 융합되어 최상의 결과(즉, 가장 밝은 루시퍼라아제 신호)를 제공했습니다. 이 프로세스는 이전에 자세히보고된 7.- DNA 응축 완충액(물자표)에서DNA 플라스미드(SmBit-DDB1)의 DNA 플라스미드 및 1 μg를 발현하는 HBx-LgBit의 1 μg를 총 부피 300 μL로 희석한다.
- 인핸서 용액 16μL(재료 표)을넣고 1초 동안 와르싱하여 섞습니다.
- 샘플을 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 60 μL의 형질감염 시약(재료 표)을샘플에 넣고 10 초 동안 소용돌이치면서 섞습니다.
- 샘플을 실온에서 8분 동안 배양합니다.
- 배양 동안, 접시로부터 배양 배지를 흡인(단계 1.2에서 제조됨)하고, 인산완충식염수(PBS)의 5 mL로 세포를 세척한다. 흡인으로 PBS를 제거하고 DMEM 7mL를 추가합니다.
- 형질감염 복합체를 포함하는 튜브에 3 mL의 DMEM을 추가합니다. 파이펫팅으로 혼합하고 10cm 접시에 세포에 형질 감염 복합체를 추가합니다.
- 세포를 37°C에서 10시간 동안 5%CO2 이하의 인큐베이터에서 배양한다.
- 다음 방법에 따라 5 x 104 세포 / 50 μL의 흰색 96 웰 플레이트로 세포를 다시 시드하십시오.
- 소비된 세포 배양 배지를 제거하고 5 mL의 PBS로 세포를 세척하였다.
- 흡인에 의해 PBS를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL를 추가하고, 세포를 분리하기 위해 5분 동안 37°C에서 배양합니다.
- DMEM 4 mL를 추가하고 셀 층의 표면에 여러 번 파이펫팅하여 매체를 분산시고. 셀 현탁액을 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮
- 실온에서 5 분 동안 500 x g의 원심 분리전 세포.
- 상급을 버리고 PBS의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 실온에서 5분 동안 500 x g의 세포 현탁액을 원심분리하고 상급을 폐기합니다.
- 완충된 세포 배양배지(재료 표)로세포 펠릿을 희석하고 10% FBS를 1.0 x 106 세포/mL의 파종 밀도로 보충하였다.
- 피펫 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰 내로 넣고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓는다.
- 37°C에서 5%CO2 하에서 10시간 동안 세포를 배양한다.
2. 복합 스크리닝
- 배양 동안, 스크리닝화합물(재료 표)과용매(디메틸 설폭사이드[DMSO])를 13.5배 농도로 희석시켰다. 예를 들어, 스톡이 10 mM이고 스크리닝 농도가 10 μM인 경우, 완충된 세포 배양 배지의 73.1 μL에 1 μL의 스톡 용액을 추가한다.
- 12.5 μL의 발광 기판(재료표)을각 웰에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
참고: 네거티브 컨트롤로, 플레이트의 양쪽 끝에있는 우물 (즉, 열 1 및 12)에는 발광 기판이 포함되어서는 안됩니다. - 발광계(재료표)를사용하여 기준선 발광을 측정합니다.
- 초기 측정 직후, 5 μL의 화합물을 추가하고 각 우물에 2.1 단계에서 희석된 DMSO를 제어합니다.
참고: 최종 농도는 10 μM입니다. - 발광 값을 30분마다 2시간 동안 측정합니다.
참고: 접시는 실온에서 어둠 속에서 배양해야합니다. - 기준선 신호에 대한 정규화 후 제어 DMSO 처리와 비교하여 억제 효과를 계산합니다.
참고: 중복 또는 삼중으로 각 화합물을 선별하면 변동을 줄일 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용한 다음의 대표적인 결과는 그림 2A, B에나와 있습니다. 신호 대 배경 비율이 80보다 크고 Z'factor9 (고처리량 스크리닝을위한 금 표준 품질 지수)가 0.5보다 높았으며,이 분석 시스템은 높은 처리량 스크리닝에 허용되었음을 나타냅니다. 대조군(DMSO 만)에 비해 >40% 억제로 설정된 임계값으로, 우리는 니타옥사니드를 후보약물7로확인하였다. 이 시스템을 사용하여, 더 나은 후보 약물은 다른, 더 큰 화합물 라이브러리를 선별하여 찾을 수 있습니다.
그림 1: HBx-DDB1 상호작용의 분할 루시퍼라제 해석의 개략적 표현. (a)분할 루시퍼라제 상보분석시스템을 이용한 HBx-DDB1 결합의 원리기압검출. 분리된 루시퍼라제 서브유닛인 LgBit와 SmBit는 각각 HBx와 DDB1에 융합되어 있습니다. HBx-DDB1 상호 작용은 발광 신호를 생성하는 기능성 효소를 형성하기 위해 소단위를 근접시로 가져옵니다. 하위 단위 간의 상호 작용은 되돌릴 수 있습니다. (B)분할 루시퍼라아제 분석. Lg비트와 DDB1에 융합된 HBx의 발현을 위한 플라스미드의 병속 후, 세포를 96웰 플레이트로 재시드하였다. 발광 기판의 첨가는 세포 용해 단계없이 루시퍼라제 활성을 측정할 수 있게 합니다. 루시퍼라제 활동은 스크리닝 화합물을 첨가한 후 측정될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 분할 루시퍼라아제 분석의 성공적인 결과. (A)96 웰 플레이트로부터 대표적인 베이스라인 발광 신호. 루시퍼라아제 강도는 숫자와 색상으로 표시됩니다. 컬럼 1 및 도 12는 발광 기판이 첨가되지 않은 제어입니다. Z의 계수는 0.5보다 컸다. (B)96 웰 플레이트에 스크리닝 화합물을 첨가한 후 상대적인 루시퍼라아활성 수준의 대표적인 타임시리즈 결과. x축은 기준선 루시퍼라아제 활성에 대한 표준화 후 대조군(DMSO)에 비해 계산된 억제 효과를 나타낸다. 가장 효과적인 화합물은 니타옥사니드였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 HBx-DDB1 결합 억제제를 찾기 위해 분할 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 편리한 스크리닝 방법을 개발했습니다. 상호작용 역학은 세포 용해없이 살아있는 세포에서 실시간으로 검출될 수 있다. HBx-DDB1 상호 작용의 억제는 Smc5/6의 복원으로 이어지며, 이는 바이러스 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래한다7. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HBV 치료의 부족을 극복할 수 있습니다.
살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기 위하여 많은 방법이 유효하더라도, 이 상호 작용을 검토하는 것은 어려운10남아 있습니다. 우리의 절차는 간단하고 하나의 96 웰 플레이트를 스크리플 짧은 시간이 필요합니다. 더욱이, 높은 Z'점수, 높은 처리량 스크리닝을 위한 금 표준 품질 지수9로스크리닝 품질이 만족하였다. 우리의 분석은 로봇 자동화11에 적합할 수 있고 약 발견을 위한 능률적인 분석입니다.
여기서 설명된 프로토콜은 HEK293T 세포주를 사용하였지만 그 높은 형질전환 효능 및 높은 증식 능력은 높은 처리량 스크리닝에 적합하기 때문에, 이러한 스크리닝 방법은 수정 없이 다른 세포주(예를 들어, HepG2)를 사용하여 수행될 수 있다7. 스크리닝 화합물에 대한 현실적인 전략으로서, HEK293T 세포는 제2 검증 스크리닝에서 HepG2 세포에 이어 제1 스크리닝에 사용될 수 있다. 일부 화합물 효과 간접 메커니즘에 의존 하는 경우 다른 세포 주에서 중요 한 결과 표시 하지 않을 수 있습니다.
우리의 의도는 높은 처리량 스크리닝 방법을 개발하기 위한 것이었듯이, 확인된 화합물이 상호 작용 억제제로서 기능하는지 여부를 확인하기 위해 후속 검증 연구가 필요하다. 이 분석에서 발광 신호의 감소 수준은 항상 HBx-DDB1 상호작용의 억제에 대응하는 것은 아니다. 세포독성 시험, 공동 면역 침전 연구 및 추가항-HBV 실험은 효과를 확인하는 데 중요하다7.
우리는 이전에 상대적으로 작은 규모의 화합물 라이브러리7을스크리닝하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제로서 nitazoxanide를 확인했지만, 훨씬 더 큰 화합물 라이브러리의 스크리닝을 수반하는 추가 연구는 단백질-단백질 상호 작용을 보다 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 화합물을 식별하기 위해 쉽게 수행될 수 있다. 이러한 추가 스크리닝을 수행할 때, 니타옥사니드는 분석에 대한 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 더욱이, 여기에 기술된 시스템은 다른 단백질-단백질 상호작용에 적용될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 약물 표적12의중요한 부류이다. 실제로, 많은 다른 바이러스는 그들의 병원성을 복제하거나 표현하기 위하여 호스트 요인과 상호작용합니다 13,14. 여기에서 기술된 분할 luciferase 기지를 둔 분석은 바이러스성 과 호스트 단백질 사이 상호 작용을 표적으로 하고, HBV및 그밖 전염하는 질병을 위한 치료를 개발하기 위하여 새로운 전략을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 문부과학성의 보조금 지원으로 지원되었으며, 일본 스포츠, 과학 기술, 일본 (#19H03430 및 #17K09405 M.O., 그리고 K.S.에 #19J11829), 혁신적인 분야에 대한 과학 연구를위한 보조금에 의해 (#18H05024 M.O.), 일본 의학 연구 개발 기관에서 간염에 대한 연구 프로그램에 의해, AMED (M.O., #JP19fk021005), 혁신적인 개발 및 B에 대한 신약의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), 암 간염에 대한 새로운 약물의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), AB에 의해 #JP19fk0310102 일본 응용지질학재단과 고바야시 암연구재단(M.O.), GSK 재팬 연구보조금 2018(K.S.) 및 미야카와 기념연구재단(K.S.)의 보조금으로 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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