Summary
Aqui, apresentamos um método para triagem de agentes virais anti-hepatite B que inibem a interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio lúciferase dividido. Este sistema permite a fácil detecção de interações proteína-proteína e é adequado para identificar inibidores de tais interações.
Abstract
Há uma necessidade urgente de novos agentes terapêuticos para a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Embora os análogos de nucleos (t)ide atualmente disponíveis inibem potentemente a replicação viral, eles não têm efeito direto na expressão de proteínas virais transcritas de um DNA circular covalmente fechado viral (cccDNA). Como a alta carga de antígenos virais pode desempenhar um papel nessa carcinogênese crônica e relacionada ao HBV, o objetivo do tratamento com HBV é erradicar as proteínas virais. A proteína reguladora X (HBx) do HBV liga-se à proteína de ligação ao dano ao DNA do hospedeiro 1 (DDB1) proteína para degradar a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), resultando na ativação da transcrição viral do cccDNA. Aqui, usando um sistema de ensaio de complementação lúciferase dividido, apresentamos um sistema abrangente de triagem composta para identificar inibidores da interação HBx-DDB1. Nosso protocolo permite a fácil detecção da dinâmica de interação em tempo real dentro das células vivas. Esta técnica pode tornar-se um ensaio fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para o tratamento da infecção por HBV.
Introduction
A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma grande preocupação de saúde pública em todo o mundo, com estimativas anuais de 240 milhões de pessoas cronicamente infectadas com HBV e 90.000 mortes devido a complicações da infecção, incluindo cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC)1. Embora os atuais agentes terapêuticos anti-HBV, análogos nucleos (t)ide, inibem suficientemente a transcrição reversa viral, eles raramente conseguem a eliminação de proteínas virais, que é o objetivo clínico de longo prazo. Seu efeito pobre na eliminação viral da proteína é devido a sua falta do efeito direto na transcrição viral dos minicromossomos circulares covalently fechados do ADN (cccDNA) do episóros no núcleo do hepatocyte2.
A transcrição do HBV é ativada pela proteína X (HBx) reguladora do HBV3. Estudos recentes revelaram que o HBx degrada a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), um fator de restrição de hospedeiro que bloqueia a transcrição do HBV do cccDNA, através do sequestro de um complexo de onipresença DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Portanto, um passo crucial na promoção da transcrição viral do cccDNA é pensado para ser a interação HBx-DDB1. Compostos capazes de inibir a ligação entre HBx e DDB1 podem bloquear a transcrição viral, e de fato o nitazoxanida foi identificado como um inibidor da interação HBx-DDB1 através de um sistema de triagem desenvolvido em nosso laboratório7.
Aqui, apresentamos nosso conveniente sistema de triagem usado para identificar inibidores da interação HBx-DDB1, que utiliza um ensaio complementar lúciferase dividido7,8. As subunidades luciferase divididas são fundidas ao HBx e ao DDB1, e a interação HBx-DDB1 traz as subunidades para perto para formar uma enzima funcional que gera um sinal luminescente brilhante. Como a interação entre as subunidades é reversível, este sistema pode detectar proteínas HBx-DDB1 ràpida dissociando (Figura 1). Usando este sistema, uma grande biblioteca composta pode ser facilmente rastreada, o que pode resultar na descoberta de novos compostos capazes de inibir eficientemente a interação HBx-DDB1.
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Protocol
NOTA:Uma representação esquemática do ensaio luciferase dividido é mostrada na Figura 1A,e o processo de ensaio é descrito na Figura 1B. A dinâmica de interação pode ser medida em tempo real sem lyse celular.
1. Preparação celular
- Mantenha as células HEK293T cultivadas no meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementadas com 10% v/v soro bovino fetal (FBS), 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C em 20% O2 e 5% CO2.
- Sementes 5 x 106 células em um prato de 100 mm com 10 mL de DMEM e incubar a 37 °C durante a noite.
- Transitoriamente transfect 1 μg de HBx e DDB1 com lúciferases divididos nas células de acordo com o seguinte método.
NOTA:A quantidade do DNA plasmídeo transfecído pode depender do regente transfecção usado. A posição ideal da luciferase dividida fundida à proteína alvo deve ser determinada de antemão. Neste caso, a HBx fundida à LgBit no C-terminus de HBx (HBx-LgBit) e DDB1 fundida ao SmBit no N-terminus do DDB1 (SmBit-DDB1) forneceu os melhores resultados (ou seja, os sinais luciferase mais brilhantes). Este processo foi relatado anteriormente em detalhes7.- Diluir 1 μg de HBx-LgBit expressando plasmid de DNA e 1 μg de SmBit-DDB1 expressando plasmid de DNA(Tabela de Materiais)em buffer de condensação de DNA(Tabela de Materiais)para um volume total de 300 μL.
- Adicione 16 μL de solução potenciador(Tabela de Materiais)e misture vórtice por 1 s.
- Incubar a amostra à temperatura ambiente por 3 min.
- Adicione 60 μL de reagente de transfecção(Tabela de Materiais)à amostra e misture vórtice por 10 s.
- Incubar a amostra à temperatura ambiente por 8 min.
- Durante a incubação, aspirar o meio de cultura do prato (preparado no passo 1.2), e lavar as células com 5 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS). Remover PBS por aspiração e adicionar 7 mL de DMEM.
- Adicione 3 mL de DMEM ao tubo contendo os complexos de transfecção. Misture por pipetting e adicione os complexos de transfecção para a célula no prato de 10 cm.
- Incubar as células a 37 °C em uma incubadora abaixo de 5% CO2 para 10 h.
- Reseed as pilhas em uma placa branca de 96 poços em 5 x 104 pilhas/bem em 50 μL do meio/poço de acordo com o seguinte método.
- Remova o meio gastado da cultura da pilha e lave pilhas com 5 mL de PBS.
- Remover PBS por aspiração, adicionar 1 mL de 0,25% trypsin-EDTA, e incubar a 37 ° C para 5 min para separar as células.
- Adicione 4 mL de DMEM e disperse o meio tubulação sobre a superfície da camada celular várias vezes. Transfira a suspensão celular para um tubo.
- Células centrífugas a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Descarte supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 1 mL de PBS.
- Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar supernatant.
- Diluir a pelota celular com meio de cultura de células tamponadas(Tabela de Materiais)complementada com 10% FBS a uma densidade de semeadura de 1,0 x 106 células/mL.
- Pipete 50 μL de suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços e devolver as células para a incubadora.
- Incubate células a 37 °C abaixo de 5% CO2 para 10 h.
2. Triagem composta
- Durante a incubação, diluir os compostos de triagem(Tabela de Materiais)e solvente (dimetil sulfoxide [DMSO]) em 13,5 x concentração. Por exemplo, se o estoque for de 10 mM e a concentração de triagem for de 10 μM, adicione 1 μL de solução de estoque a 73,1 μL de meio de cultura de células tamponadas.
- Adicione 12,5 μL de substrato luminescente(Mesa de Materiais)a cada poço e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
NOTA:Como controles negativos, os poços em ambas as extremidades da placa (ou seja, colunas 1 e 12) não devem conter nenhum substrato luminescente. - Medir a luminescência de base usando um luminometer(Tabela de Materiais).
- Imediatamente após a medida inicial, adicione 5 μL de compostos e controle DMSO diluído na etapa 2.1 para cada poço.
NOTA:A concentração final será de 10 μM. - Medir os valores de luminescência a cada 30 min por 2 h.
NOTA:A placa deve ser incubada no escuro à temperatura ambiente. - Calcule os efeitos inibitórios em comparação com o tratamento de DMSO de controle após a normalização dos sinais de base.
NOTA:Triagem de cada composto em duplicado ou triplicado pode reduzir a variação.
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Representative Results
Os resultados representativos após o uso deste protocolo são mostrados na Figura 2A,B. A relação sinal/fundo foi superior a 80 e o fatorZ 9 (o índice de qualidade padrão-ouro para triagem de alta taxa de produção) foi superior a 0,5, indicando que esse sistema de ensaio era aceitável para triagem de alta taxa de produção. Com o limiar definido para >40% inibição em comparação com o controle (DMSO apenas), identificamos nitazoxanida como um candidato droga7. Usando este sistema, melhores medicamentos candidatos podem ser encontrados rastreando outras bibliotecas compostas maiores.
Figura 1: Representação esquemática da análise luciferase dividida da interação HBx-DDB1. (A)O princípio subjacente à detecção da ligação HBx-DDB1 usando o sistema de ensaio complementar lúciferase dividido. As subunidades luciferase separadas, LgBit e SmBit, são fundidas ao HBx e ao DDB1, respectivamente. A interação HBx-DDB1 traz as subunidades em estreita proximidade para formar uma enzima funcional que gera um sinal luminescente. A interação entre as subunidades é reversível. (B)Ensaio lúciferase dividido. Após a co-transfecção de plasmídeos para expressão de HBx fundido ao LgBit e DDB1 fundidos ao SmBit, as células foram re-semeadas em uma placa de 96 poços. A adição de substrato luminescente permite a medição da atividade de luciferase sem um passo de lise celular. As atividades de lúciferase podem ser medidas após a adição dos compostos de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Resultados bem sucedidos do ensaio luciferase dividido. (A)Sinais luminescentes representativos da linha de base de uma placa de 96 poços. A intensidade lúciferase é representada por números e cores. As colunas 1 e 12 são controles nos quais o substrato luminescente não foi adicionado. O fator Z foi superior a 0,5. (B) Resultado representativo da série temporal de níveis relativos de atividade luciferase após a adição de compostos de triagem a uma placa de 96 poços. O eixo x representa os efeitos inibitórios calculados em comparação com o controle (DMSO) após a padronização da atividade luciferase de base. O composto mais eficaz foi nitazoxanida. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Desenvolvemos um método de triagem conveniente usando um ensaio lúciferase dividido para encontrar inibidores de ligação HBx-DDB1. A dinâmica de interação pode ser detectada em tempo real em células vivas sem a necessidade de lyse celular. A inibição da interação HBx-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, o que resulta na supressão da transcrição viral, expressão proteica e produção de cccDNA7. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atuais de HBV.
Embora uma série de métodos estão disponíveis para investigar as interações proteína-proteína em células vivas, examinar essas interações permanecem difíceis10. Nosso procedimento é simples e requer apenas um curto período de tempo para selecionar uma placa de 96 poços. Além disso, a qualidade de triagem foi satisfatória com uma pontuação alta de Z, o índice de qualidade padrão-ouro para triagem de alta taxa de produção9. Nosso ensaio pode ser adequado para automação robótica11 e é um ensaio eficiente para a descoberta de medicamentos.
Enquanto o protocolo descrito aqui usou a linha de células HEK293T porque sua alta eficácia de transfecção e alta capacidade de proliferação são adequadas para triagem de alta produtividade, este método de triagem pode ser realizado usando outras linhas celulares (por exemplo, HepG2) sem modificações7. Como uma estratégia realista para compostos de triagem, as células HEK293T podem ser usadas no primeiro rastreamento seguido por células HepG2 em um segundo rastreamento de validação. Alguns compostos podem não mostrar resultados significativos em diferentes linhas celulares quando os efeitos dependem de mecanismos indiretos.
Como nossa intenção era desenvolver um método de triagem de alta vesperção, estudos de validação subsequentes são necessários para confirmar se os compostos identificados funcionam como inibidores de interação. A diminuição dos níveis de sinais luminescentes neste ensaio nem sempre corresponde à inibição da interação HBx-DDB1. Testes de citotoxicidade, estudos de co-imunoprecipitação e outros experimentos anti-HBV são importantes para confirmar os efeitos7.
Embora tenhamos identificado anteriormente o nitazoxanida como um inibidor da interação HBx-DDB1 ao selecionar uma biblioteca composta de escala relativamente pequena7,mais estudos envolvendo o rastreamento de bibliotecas compostas muito maiores podem ser facilmente realizados para identificar novos compostos capazes de inibir as interações proteína-proteína de forma mais eficiente. Ao realizar tal seleção mais adicional, o nitazoxanide pode ser usado como um controle positivo para o ensaio. Além disso, o sistema descrito aqui pode ser aplicado a outras interações proteína-proteína. As interações proteína-proteína são uma classe importante de alvos da droga12. Na verdade, muitos outros vírus interagem com fatores hospedeiros para replicar ou expressar sua patogenicidade13,14. O ensaio dividido baseado em luciferase descrito aqui, que tem como alvo as interações entre proteínas virais e hospedeiras, pode fornecer uma nova estratégia para desenvolver curas para o HBV e outras doenças infecciosas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Subvenções em Ajuda do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão (#19H03430 e #17K09405 para M.O., e #19J11829 para a K.S.), por um Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#18H05024 a M.O.), pelo Programa de Pesquisa sobre Hepatite da Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, AMED (para M.O., #JP19fk021005), por programa sobre o Desenvolvimento Inovador e a Aplicação de Novos Medicamentos para hepatite B #JP19fk0310102 (a K.K.) da AMED, por subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de a Fundação Japonesa para Enzimologia Aplicada e da Kobayashi Foundation for Cancer Research (para M.O.), da GSK Japan Research Grant 2018 (para a K.S.), e por uma doação da Miyakawa Memorial Research Foundation (para a K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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