Summary
Hier worden twee murine wondgenezingsmodellen beschreven, een ontworpen om cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties te beoordelen en de andere om de snelheid van wondsluiting te kwantificeren. Deze methoden kunnen worden gebruikt met complexe ziektemodellen zoals diabetes om mechanismen van verschillende aspecten van slechte wondgenezing te bepalen.
Abstract
Wondgenezing is een complex proces dat de ordelijke progressie van ontsteking, granulatieweefselvorming, fibrose en resolutie vereist. Murinemodellen bieden waardevol mechanistisch inzicht in deze processen; echter, geen enkel model volledig adressen alle aspecten van de wondgenezing reactie. In plaats daarvan is het ideaal om meerdere modellen te gebruiken om de verschillende aspecten van wondgenezing aan te pakken. Hier worden twee verschillende methoden beschreven die betrekking hebben op diverse aspecten van de wondgenezingsrespons. In het eerste model worden polyvinyl alcoholsponzen onderhuids geïmplanteerd langs de muisdorsum. Na het ophalen van spons, cellen kunnen worden geïsoleerd door mechanische verstoring, en vloeistoffen kunnen worden geëxtraheerd door centrifugering, waardoor een gedetailleerde karakterisering van cellulaire en cytokine reacties in de acute wond omgeving. Een beperking van dit model is het onvermogen om de snelheid van wondsluiting te beoordelen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een staarthuidexcisiemodel. In dit model wordt een rechthoekig stuk staarthuid van 10 mm x 3 mm uitgesneden langs het rugoppervlak, in de buurt van de basis van de staart. Dit model kan gemakkelijk worden gefotografeerd voor planimetrische analyse om genezingtarieven te bepalen en kan worden weggesneden voor histologische analyse. Beide beschreven methoden kunnen worden gebruikt in genetisch veranderde muizenstammen, of in combinatie met modellen van comorbide aandoeningen, zoals diabetes, veroudering of secundaire infectie, om wondgenezingsmechanismen op te helderen.
Introduction
Er zijn veel murine model systemen beschikbaar om wondgenezing processen te onderzoeken, elk met specifieke voordelen en beperkingen1,2. De volgende methoden presenteren twee murinewondmodellen, die elk een bepaald aspect van de wondgenezingsrespons aandeorde, en die kunnen worden gebruikt om de oorzaak en het effect van verstoringen in de reactie op letsel te identificeren. Het proces van wondgenezing vindt plaats in verschillende fasen. De eerste fase is inflammatoir, gekenmerkt door de snelle instroom van bloedplaatjes, neutrofielen en monocyten/macrofagen, evenals de productie van ontstekingscytokines en chemokines. Na de oplossing van ontsteking, de omgeving overgangen naar een meer herstellende toestand met de inductie van profibrotische en proangiogene cytokines en groeifactoren. Granulatieweefsel wordt afgezet en neovessels vormen zich met de migratie van myofibroblasten, fibroblasten, epitheelcellen en endotheelcellen. In de laatste fase wordt de voorlopige extracellulaire matrix gerenoveerd en verloopt littekenvorming en wondsluiting2,3,4,5,6,7,8.
Geen enkel murinemodel biedt een systeem om alle stadia van wondgenezing te bestuderen2. Hier worden twee chirurgische wondmodellen beschreven: de ene verduidelijkt acute cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties, en de andere maakt de beoordeling van wondsluiting en histologische analyses mogelijk. Deze twee methoden kunnen op complementaire wijze worden gebruikt om de effecten van een verstoring of comorbiditeit op verschillende aspecten van de wondgenezingsrespons te beoordelen. De dorsale onderhuidse implantatie van polyvinyl alcohol (PVA) sponzen is een systeem dat is gebruikt in knaagdiermodellen voor decennia tot tal van aspecten van cellulaire en granulatie weefsel reacties9,,10,11,12,14,,15,16,17,18,19,20,1420 ,21,22,23,24. Deze aanpak maakt het ophalen van cytokine-rijke wondvloeistoffen en cellulaire infiltreert. In dit model worden 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stukken PVA-spons in onderhuidse zakken geplaatst door middel van een incisie van 2 cm gemaakt aan de achterste ruglijn. De incisie wordt gesloten met chirurgische clips, en de sponzen kunnen worden opgehaald op latere tijd punten voor cel-en vloeistofisolatie. Het cellulaire en cytokine-milieu van geïsoleerde sponzen weerspiegelt de normale stadia van acute wondgenezing tot ongeveer 14 dagen na implantatie. Op latere tijdpunten is het model voordeliger voor het bestuderen van granulatieweefselvorming en de vreemde lichaamsrespons1. Met dit systeem is het mogelijk om >106 cellen te isoleren, wat een duidelijk voordeel biedt voor fenotypische en functionele testen en RNA-isolatie, over het isoleren van cellen van andere biopsie-gebaseerde methoden1,22,23,25,26.
De snelheid van wondsluiting wordt bepaald met behulp van het staarthuidexcisiemodel. In dit model, zoals in eerste instantie beschreven door Falanga et al. en gemeld door anderen27,28,29,30, een 1 cm x 0,3 cm volledige dikte sectie van de staart huid wordt verwijderd in de buurt van de basis van de staart. Het wondgebied wordt gemakkelijk gevisualiseerd en kan na verloop van tijd worden gemeten. Als alternatief kan staartweefsel worden geïsoleerd voor histologische analyse. Deze aanpak kan worden gebruikt als een alternatief voor of in combinatie met de gevestigde dorsale punch biopsie methode. Het primaire onderscheid tussen deze twee modellen zijn de snelheid van wondsluiting, de aan- of afwezigheid van bont en de huidstructuur2,31,32. Staarthuidwonden bieden een langer tijdsbestek om de wondsluiting te beoordelen, omdat het ongeveer 21 dagen duurt voordat de volledige sluiting optreedt. Dit is in tegenstelling tot ongespkal dorsale punch biopten, die veel sneller genezen (~ 7-10 dagen), voornamelijk door contractie als gevolg van de werking van de panniculus carnosus. Spalkd rugstompbiopten genezen langzamer en verminderen de effecten van contractiele genezing, maar vertrouwen op de aanwezigheid van een vreemd lichaam om contractiele mechanismen te beperken1,2,27,30,31,33.
De beschreven wondmodellen zijn informatief voor het begrijpen van normale wondgenezingsprocessen bij afwezigheid van verstoring. Terwijl de genezing van knaagdierhuid op zeer significante manieren verschilt van de menselijke huid, waaronder losse structuur, afhankelijkheid van contractiele genezing en andere anatomische verschillen, biedt het murinesysteem bepaalde voordelen voor mechanistische en screeningsstudies. Belangrijkste onder deze is de beschikbaarheid van inteelt stammen en genetische mutanten, genetische traktaat, en lagere kosten. Mechanistisch inzicht dat is opgedaan met murinestudies kan worden vertaald naar complexe diermodellen die de genezing van de menselijke huid, zoals het varkenssysteem2,,31,beter nabootsen.
Naast het onderzoeken van wondgenezingsreacties in de steady state, kunnen deze modellen worden gecombineerd met comorbide aandoeningen om de basis van wondgenezingsdefecten op cellulair, cytokine en brutoweefselniveau te begrijpen. Het is in deze specifieke setting dat de twee modellen in overleg kunnen worden gebruikt om de effecten van een bepaalde comorbide aandoening, zoals postoperatieve longontsteking, te beoordelen op zowel de acute cellulaire wondgenezingsrespons als de snelheid van wondsluiting30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven dierstudies zijn goedgekeurd door het Institute Of The Brown University Institutional Animal Care and Use Committee en uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van dieren van de National Institutes of Health. LET OP: in de video is het chirurgische gordijn weggelaten voor demonstratiedoeleinden.
1. Onderhuidse implantatie van PVA-sponzen
- Gebruik een schaar om vellen PVA-spons in stukken van 8 mm x 8 mm x 4 mm te snijden. Rehydrateer de stukjes PVA spons door ze onder te dompelen in steriele 1x PBS in een beker.
- Autoclave de sponzen in 1x PBS te steriliseren, en volledig afkoelen. Bewaar autoclaved sponzen in steriele 1x PBS bij 4 °C.
- Voorafgaand aan het uitvoeren van chirurgische implantatie, aliquot het nodige aantal sponzen in een steriele cultuur schotel onder steriele omstandigheden in een laminaire stroom kap. Bewaar de extra sponzen in steriele 1x PBS bij 4 °C voor toekomstig gebruik. Zorg ervoor dat de sponzen na rehydratie tot 1 cm x 1 cm x 0,5 cm zwellen. Een afbeelding van uitgedroogde PVA sponzen wordt weergegeven in figuur 1A.
OPMERKING: Om de steriliteit van de chirurgische locatie te behouden, vereist de PVA-sponsimplantatieprocedure één persoon om de muis te behandelen en de chirurgische plaats voor te bereiden, en een tweede persoon om de implantatie uit te voeren. - Verdoven van een 8-12 weken oude mannelijke C57BL/6J muis door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine. Toedienen 40 mg/kg xylazine intraperitoneally voor analgesie. Bevestig de diepte van anesthesie door het verlies van een pedaalreflex. Bereid de chirurgische plaats door het verwijderen van het haar langs de dorsum met tondeuse. Breng met behulp van steriel gaas povidone-jodium oplossing op het scheergebied 2x, gevolgd door 70% ethanol.
- Plaats de muis op steriele chirurgische gordijnen. Plaats een verwarmde pad onder de chirurgische gordijnen om de kerntemperatuur van de muis te behouden.
- Draag steriele chirurgische handschoenen voor het uitvoeren van de operatie. Trek de rughuid weg van het onderliggende weefsel met tangen, en met behulp van steriele chirurgische schaar, maak een 2 cm incisie langs de ruglijn middellijn ongeveer 2 cm voorste aan de basis van de staart. Terwijl u de incisie openhoudt met steriele tangen, gebruikt u steriele gebogen, stompe chirurgische schaar om een onderhuidse zak langs de dorsum te vormen in een van de posities die in figuur 1Bzijn aangegeven.
- Blijf tangen gebruiken om de huid weg te tillen van het onderliggende weefsel. Met behulp van steriele chirurgische schaar, voorzichtig knijp een PVA spons in de kweekschaal om overtollige PBS te verwijderen. Pak de PVA spons door een hoek met behulp van steriele chirurgische schaar en, leidt met de hoek gehouden door de schaar, plaats de spons in de onderhuidse zak gevormd in stap 1.4.
- Herhaal dit proces 5x, het plaatsen van een totaal van zes sponzen in onderhuidse zakken zoals afgebeeld in figuur 1B.
- Knijp de ingesneden rughuid samen met steriele tangen en sluit de incisie met twee roestvrijstalen wondclips.
- Gebruik een nieuwe set steriele chirurgische instrumenten voor elke muis. U ook een kraalsterilisator gebruiken om instrumenten tussen muizen te steriliseren.
2. Isolatie van vloeistoffen uit PVA sponzen
- Om de acute wond cytokine milieu te beoordelen, isoleren sponzen tussen 1-14 dagen na implantatie.
- Bereid een vloeistofopvangbuis voor door het vat van een 5 mL-spuit in een kweekbuis van 16 mL te nestelen.
- Euthanaseer een muis met geïmplanteerde PVA-sponzen door CO 2-verstikking, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Verwijder de chirurgische nietjes en open de incisie met getande tangen. Gebruik een schaar om de incisie langs de ruglijn uit te breiden.
- Met behulp van tangen, haal een spons uit zijn onderhuidse zak en breng het naar de voorbereide spuit vat, voorzichtig om de druk op de spons te minimaliseren. Los van elk bindweefsel dat aan het oppervlak van de spons blijft hangen. Gebruik een schaar om de spons ontleden van het omliggende weefsel indien nodig. Herhaal het sponsverwijderingsproces met de resterende sponzen. Plaats de buis met de sponzen op ijs.
- Om de wondvloeistof te isoleren, centrifugeer t.w.v. de kweekbuis met de 5 mL-spuit met de sponzen op 700 x g gedurende 10 min.
- Gooi na de centrifugering de spuit en de sponzen weg. De wondvloeistof zal verzameld zijn in de 16 mL kweekbuis. Een representatief beeld van vloeistof verzameld van een dag 7 wond wordt weergegeven in figuur 1D. Breng de wondvloeistof over op een schone buis voor langdurige opslag bij -80 °C.
3. Isolatie van cellen uit PVA sponzen
- Om de acute wondgenezing cellulaire milieu te beoordelen, verzamelen sponzen tussen 1-14-dagen na de spons implantatie. Sponzen verkregen uit een wond 7 dagen na implantatie worden weergegeven in figuur 1E.
- Bereid het opvangmedium met 1x HBSS (+calcium/+magnesium/–fenolrood) voor, aangevuld met 1% FBS, 1% HEPES en 1% penicilline-streptomycine.
- Aliquot 5 mL hbss collectie medium in een 15 mL conische buis.
- Haal de PVA-sponzen uit geëeuthaniseerde muizen zoals beschreven in 2.2–2.4. Plaats de sponzen in de conische buis met 5 mL HBSS-opvangmedium.
- Breng de sponzen en het HBSS-opvangmedium door door te gieten naar een blenderzak van 80 mL. Hang de blender zak uit het luik van de peddel blender, geplaatst, zodat de peddels staking de sponzen en media. Pas de instellingen van de peddelblender aan om op hoog te draaien voor 60 s. Druk op start.
- Breng de media van de blenderzak terug naar de conische buis van 15 mL met een pipet, waardoor de sponzen in de zak achterblijven. Knijp in de sponzen om de media grondig los te laten. Pas de instellingen van de peddelblender aan om 30 s hoog te draaien. Voeg 5 mL media toe aan de blenderzak en herhaal het maagproces 2x voor een totaal van drie sponswassingen.
- Centrifugeer de conische buis op 250 x g gedurende 5 min. Een rode pellet van cellen en rode bloedcellen zal zichtbaar zijn aan de onderkant van de conische buis na centrifugatie.
- Gooi de supernatant weg en voer een rode bloedcellyse uit: voeg 900 μL dH2O toe aan de celpellet en pipet om te mengen. Neutraliseer met 100 μL van 10x PBS. Voeg 4 mL van 1x PBS toe aan de buis om de lysis volledig te neutraliseren en centrifugeer vervolgens op 250 x g gedurende 5 min.
OPMERKING: De lysisstap moet kort zijn; het water meer dan 3-5 s in contact laten met de cellen kan leiden tot lyse van niet-rode bloedcellen. - Na centrifugatie zal een witte celpellet met wondcellen zonder rode bloedcellen aanwezig zijn op de bodem van de kegelbuis. Gooi de supernatant weg en stoom de celpellet opnieuw op in het gewenste medium voor downstream-analyses.
4. Facultatieve stroomcytometrieanalyse van aangeboren leukocyten geïsoleerd van PVA sponswonden
- Resuspend0.5-1 x 106 wondcellen in 25 μL van een 2x oplossing voor het blokkeren van antilichamen met 10 μg/mL anti-CD16/CD32 FcRγII/III antilichaam verdund in 1x PBS + 1% BSA.
OPMERKING: Alle antilichamen moeten worden getitreerd om optimale concentraties voor stroomcytometrieanalyse te bepalen. - Incubeer de cellen met blokkerend antilichaam gedurende 10 min op ijs.
- Maak een 2x master mix van antilichamen die 2,5 mg/mL van PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL fitc-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, en 10 mg/mL van eFluor660-F4-80 verdund in 1x PBS + 1% BSA. Voeg direct 25 μL van de antilichaamcocktail toe aan de cellen die in het blokkeren van antilichaam uitbroeden.
- Incubeer de cellen gedurende 20 min op ijs, beschermd tegen licht.
- Was de cellen 2x met 1x PBS.
- Maak een master mix van amine-reactieve fixable levensvatbaarheid kleurstof-eFluor506 verdund 1:1,000 in 1x PBS. De celpellet opnieuw opschorten in 50 μL van de levensvatbaarheidskleurstofoplossing.
OPMERKING: Serum moet worden uitgesloten van de herstelbare levensvatbaarheidsstap, omdat het binding van de kleurstof aan endogene eiwitten zal voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 20 min op ijs, beschermd tegen licht. - Was de cellen 2x met 1x PBS. De celpellet opnieuw opschorten in 50 μL van 1% paraformaldehyde.
- Incubeer de cellen met 1% paraformaldehyde gedurende 15 min op ijs, beschermd tegen licht.
- Was de cellen 1x met 1x PBS en stouw de pellet opnieuw in 1x PBS voor flow cytometrische analyse.
5. Uitlaathuidexcisie
- Verdoven van een 8-12 weken oude mannelijke C57BL/6J muis door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine. Toedienen 40 mg/kg xylazine intraperitoneally voor analgesie. Bevestig de diepte van anesthesie door het verlies van een pedaalreflex.
- Bereid de chirurgische plaats op de staart van de verdoofde muis met behulp van steriele gaas om povidone-jodium oplossing toe te passen 2x, gevolgd door een toepassing van 70% ethanol.
- Definieer een sectie van 10 mm x 3 mm op het rugoppervlak van de staart, 10 mm van de basis van de staart (figuur 1C) met behulp van een permanente markering om te traceren van een vooraf gemaakte sjabloon.
- Plaats de verdoofde muis op steriele chirurgische gordijnen.
- Draag steriele chirurgische handschoenen om de chirurgische ingrepen uit te voeren. Maak met een steriel scalpelblad een volledige dikteincisie langs de rechter-, onder- en linkerranden van het wondgebied.
- Met behulp van steriele tangen, schil de uitgesneden huid uit de buurt van de staart, en gebruik steriele chirurgische schaar weg te snijden de bovenste rand van de wond gebied.
- Druk uitoefenen met steriel gaas om het bloeden te stoppen.
- Breng een spuitbarrièrefolie aan op het wondbed.
- Fotografeer de wonden van een vaste afstand op regelmatige tijdstippen. Analyseer foto's op planimetrische analyse om de metingen van wondgebieden te bepalen. U ook remklauwen gebruiken om wondlengte en breedtemetingen te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemische ontstekingsreactie na PVA sponsimplantatie
De PVA spons implantatie operatie genereerde een systemische ontstekingsreactie, zoals blijkt uit de inductie van IL-6 in het plasma 1 dag na het verwonden (Figuur 2A). Andere ontstekingscytokinen, waaronder TNF-α en IL-1β, evenals een reeks chemokines, waaronder CCL2 en CXCL1, werden systemisch geïnduceerd in de eerste 7 dagen na de sponsimplantatie na PVA, en zijn elders beschreven26,30.
Isolatie van cellen en vloeistoffen uit PVA sponswonden
Het belangrijkste voordeel van het PVA sponswondmodel is de mogelijkheid om voldoende cellen te herstellen voor fenotypische en functionele analyses van de acute cellulaire wondgenezingsrespons. Het aantal cellen dat kan worden teruggewonnen uit PVA sponswonden neemt na verloop van tijd toe, van ongeveer 2 x 106 cellen per zes sponzen op wonddag 1 x 106 tot 8 x 106 cellen op wonddag 7 (Figuur 2B). Het celnummer blijft stijgen na dag 7. Het wordt niet aanbevolen om dit model verder te zetten dan ~ 14 dagen, omdat de sponzen volledig worden ingekapseld door collageen en het systeem overgangen van het modelleren van een acute wondgenezing reactie op het modelleren van een vreemd lichaam granuloma1,22,23,25,26. Neutrofielen, monocyten en macrofagen waren de primaire cellulaire infiltreren in PVA spons wonden. Neutrofielen domineerden de wond cellulaire milieu een dag na de wond, zoals beoordeeld door flow cytometrische analyse (Figuur 2C). Monocyten en monocyten afgeleide macrofagen verzameld binnen 3 dagen na de spons implantatie, en de drie celpopulaties steeg in aantal na verloop van tijd (Figuur 2C). Een representatieve flow cytometrie gating strategie om neutrofiele, monocyten en macrofaag populaties te identificeren wordt weergegeven in figuur 2D. Na het uitsluiten van celdoublets met fsc-H- en SSC-H-parameters(figuur 2D, i en ii),werden niet-levensvatbare cellen uitgesloten met behulp van een amine-reactieve fixable viability dye (hier afgebeeld) of een nucleïnezuurkleurstof (bijvoorbeeld sytox of propidiumjodide) (Figuur 2D, iii). Resterend cellulair puin dat niet door de voorafgaande gatingstappen werd verwijderd, werd vervolgens uitgesloten met fsc-A- en SSC-A-parameters(figuur 2D, iv). Hematopoietische cellen bestonden uit de meerderheid van pva sponswondcellen en werden geïdentificeerd door CD45-expressie (Figuur 2D, v). Neutrofielen werden geïdentificeerd als Ly6G+Siglec-F– (Figuur 2D, vi). Siglec-F+ cellen waren voornamelijk eosinofielen (Figuur 2D, vii). Gating op Ly6G–Siglec-F– cellen, monocyten / macrofagen werden geïdentificeerd als F4/80+ cellen (Figuur 2D, viii). F4/80+ cellen kunnen verder worden gefractioneerd door Ly6C expressie om Ly6Chi inflammatoire monocyten (Figuur 2D, ix) en Ly6Clage monocyte-afgeleide macrofagen (Figuur 2D, x)26te onderscheiden .
Het vermogen om cytokinen en andere wondoplosbare factoren te meten is een ander voordeel voor het PVA sponswondmodel. Het is mogelijk om tot 100 μL vloeistof per spons te extraheren. Geëxtraheerde vloeistoffen zijn geschikt voor een verscheidenheid van downstream testen. De detectie van cytokines en chemokines in vroege en late wondvloeistoffen door ELISA of op kralen gebaseerde multiplex immunoassays zijn elders gemeld26,30. Het is mogelijk om zowel cellen als vloeistoffen uit dezelfde wond te verkrijgen. Om dit te doen, wordt het aanbevolen om drie sponzen te isoleren van de ene kant van de ruglijn voor celisolatie en 3 sponzen van de andere kant van de ruglijn voor vloeistofextractie.
Beoordeling van wondsluiting met behulp van het staarthuidexcisiemodel
De excisional staart huid model biedt een alternatief voor de rugschil biopsie methode om langzame wondsluiting te bestuderen in stevige huid ontbreekt dichte vacht. Voorbeeldbeelden van rughuidwonden op 1, 7 en 15 dagen na excisie worden getoond in figuur 3A. Wondsluiting kan worden gekwantificeerd door na verloop van tijd het gebied van het wondbed te meten. De dag 7 en dag 15 wondbed gebieden waren ongeveer 70% en 35%, respectievelijk, van de dag 1 wondgebied (Figuur 3B). Volledige wondsluiting vereiste ongeveer 28 dagen. De staart huidwond kan ook worden waargenomen in dwarsdoorsnede door histologische analyse. Figuur 3C en figuur 3D tonen representatieve afbeeldingen van respectievelijk H&E en Masson's Trichrome-gekleurde staartdoorsneden. De zijmarges van de uitgesneden huid worden aangegeven met pijlpunten op het rugoppervlak van de staart.
Figuur 1: Schematisch van murine wondgenezingsmodellen. (A) Zij (links) en boven (rechts) zicht van uitgedroogde PVA sponzen van 8 mm x 8 mm x 0,4 mm. (B) Illustratie van een muis die de plaatsing van de ruglijnincisie (centrale rode lijn) en zes 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA-sponzen in onderhuidse zakken aantoont. c) Schematisch waaruit de grootte en plaatsing van een excisionale huidwond (10 mm x 3 mm rode rechthoek) op het rugoppervlak van de staart aantoont. (D) Wondvloeistof geïsoleerd uit drie sponzen die werden opgehaald uit de onderhuidse ruimte 7 dagen na implantatie. (E) Het verschijnen van sponzen die 7 dagen na de implantatie uit de wond zijn gehaald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De systemische en cellulaire reactie op PVA spons implantatie. (A) Een tijdsverloop van IL-6 niveaus in het plasma toont aan dat PVA spons implantatie een systemische ontstekingsreactie veroorzaakte. De concentratie van IL-6 werd gemeten met behulp van een multiplex kraal-gebaseerde immunoassay. (B) Het aantal cellen geïsoleerd van PVA sponzen wond steeg na verloop van tijd. (C) Een tijdcursus toont de accumulatie van neutrofielen, monocyten en monocyten afgeleide macrofagen in PVA spons wonden na verloop van tijd. (D) Een representatieve gating strategie van cellen geïsoleerd van PVA spons wonden laat zien hoe leukocyte subsets te identificeren door middel van flow cytometrische analyse. Poorten worden als volgt gedefinieerd:i en ii) doublet uitsluiting,iii) dode cel uitsluiting met behulp van een amine-reactieve fixable levensvatbaarheid kleurstof,iv) uitsluiting van vuil door FSC-A en SSC-A,v) CD45+ hematopoietische cellen,vi) Ly6G+ neutrofielen,vii) Siglec-F+ eosinofielen,( viii) Ly6G–Siglec-F– F4/80+ monocyten/macrofagen,ix) F4/80+ Ly6Chi monocyten, en (x) F4/80+Ly6Clage macrofagen. Poorten werden geplaatst volgens fluorescentie-minus een (FMO) controles. De gegevens in A–C zijn het gemiddelde ± SEM, n = 6-10 muizen per groep in (A), n = 8-9 muizen in (B) en n = 6-8 muizen in (C). Alle gegevens worden gecombineerd van 2-3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van de genezing van de excisionalstaarthuidwond. (A) Representatieve foto's van excisional staart huidwonden genomen 1, 7, en 15 dagen na de wond. (B) De snelheid van sluiting van excisional staart huidwonden. Wonden werden om de andere dag gefotografeerd. Beeldverwerkingssoftware werd gebruikt om de marges van het wondbed te traceren en het wondgebied op aangegeven tijdspunten te berekenen. Het wondgebied wordt gepresenteerd als een fractie van het wondgebied gemeten op dag 1. Representatieve afbeeldingen van staartdoorsneden die paraffine-ingebed, doorgesneden en bevlekt met (C) H&E of (D) Masson's Trichrome. De wond bevond zich op het rugoppervlak van de staartdoorsnede; laterale wondmarges worden aangegeven met pijlpunten. De gegevens in (B) zijn het gemiddelde ± SEM, n = 8 muizen per groep. Gegevens worden gecombineerd uit twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft twee hardnekkige murine wond modellen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de acute wondgenezing reactie. De eerste methode omvat de chirurgische implantatie van PVA sponzen in de dorsale onderhuidse ruimte. Deze aanpak biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van biopsie-gebaseerde wondmodellen voor het bestuderen van de cellulaire wondgenezingsrespons vanwege het grote aantal cellen en de hoeveelheid wondvloeistoffen verkregen uit de geïsoleerde sponzen. Voor de succesvolle uitvoering van deze procedure is het handhaven van een steriel chirurgisch veld door de huid rond de incisie grondig te reinigen noodzakelijk, omdat translocatie van bacteriën in de wond het verloop van genezing aanzienlijk zal veranderen. Met behulp van de celisolatiemethode die hier wordt beschreven, is het mogelijk om ten minste 1-10 x 106 cellen te isoleren van de PVA-sponzen, afhankelijk van het tijdstip van sponsextractie. De meerderheid van de cellen geïsoleerd van PVA spons wonden zijn levensvatbaar (Figuur 2D). Echter, omdat het mogelijk is voor dode cellen te vormen tot ~ 20% van geïsoleerde wondcellen na mechanische verstoring, is het sterk aanbevolen om een levensvatbaarheid vlek te gebruiken bij de procedure met flow cytometrie op basis van analyses. Cellen geïsoleerd van PVA spons wonden zijn voornamelijk van hematopoietische oorsprong zoals bepaald door CD45 positiviteit (Figuur 2D). De snelle accumulatie van neutrofielen gevolgd door monocyten en macrofagen komt overeen met de acute stadia van wondherstel3,4,34,35,36,37,38. Geïsoleerde cellen zijn geschikt voor downstream analyses, waaronder immunofenomtypering, celsortering, culturing, RNA-extractie en een verscheidenheid aan functionele testen.
Het PVA sponswondmodel maakt ook de isolatie van vloeistoffen mogelijk, wat ideaal is voor het beoordelen van cytokine- en groeifactorreacties in de acute wondomgeving. PVA sponsvloeistoffen zijn geschikt voor het testen door ELISA, op de kraal gebaseerde multiplex immunoassay, en eiwitkwantitatie, onder anderen. Eerdere studies hebben aangetoond door middel van cytokine en groeifactor meting dat de vroege wond omgeving is inflammatoire van aard, met snelle inductie van IL-6, TNF-α, en IL-1β van dagen 1-3. De wondomgeving schakelt vervolgens over naar een herstellende toestand met de latere inductie van pro-angiogene en pro-fibrotische groeifactoren, waaronder VEGF en TGF-β22,23,25,26,30.
Terwijl de PVA spons implantatie model is voordelig voor het bestuderen van acute wond cellulaire en cytokine reacties, een van de beperkingen is het onvermogen om de snelheid of de mate van genezing te meten. Meting van dit aspect van wondgenezing kan nodig zijn bij de beoordeling van de effecten van een comorbide aandoening op verschillende aspecten van de wondgenezingsrespons30. Voor deze statistiek hebben biopsiegebaseerde methoden de voorkeur. Hier wordt het staarthuidexcisiemodel gepresenteerd. In dit model wordt een volledige dikte sectie van de staarthuid uit het rugoppervlak van de staart verwijderd. Nogmaals, het handhaven van een steriel chirurgisch veld is belangrijk om te voorkomen dat inenting van de wond bed. Het gebruik van een spray barrière film of andere wondbekleding wordt ook aanbevolen om latere wondinfectie te voorkomen. Oudere mannelijke muizen of agressieve stammen vereisen solo behuizing om verstoring van de wond te voorkomen. Een bijzonder voordeel van de staart als een site voor het bestuderen van wondgenezing is dat het meer afhankelijk is van re-epithelialisatie voor sluiting, zoals beschreven door anderen27,32,33. Naast het meten van het wondbedgebied en het uitvoeren van histologische analyses, hebben anderen gemeld dat het gebruik ervan wordt gebruikt bij de beoordeling van de werkzaamheid van actuele interventies bij het moduleren van de genezingsprocessen33.
Elk van de wondmodellen die in deze methoden worden beschreven, biedt duidelijke voordelen voor het begrijpen van wondherstelprocessen in de stabiele toestand en in aanwezigheid van comorbiditeiten. Vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch veranderde stammen van inteeltmuizen, is het ook mogelijk om de wondgenezingsreacties te manipuleren om mechanistische vragen over het proces te beantwoorden. Bovendien kunnen deze systemen worden geïmplementeerd in murine-modellen van aandoeningen die verband houden met slechte wondgenezing, waaronder diabetes, veroudering, secundaire infectie, en anderen30,36,39,40. De mechanistische inzichten uit murinestudies kunnen dan de basis vormen voor het bestuderen van wondgenezing in diermodellen met een hogere orde. Samen bieden de PVA sponsimplantatie en excisional tail skin wound modellen hardnekkige en veelzijdige systemen om wondgenezingsprocessen onder stabiele toestand en pathologische omstandigheden op te helderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Kevin Carlson van de Brown University Flow Cytometrie en Sorteerfaciliteit bedanken voor overleg en hulp bij stroomcytometrieexperimenten. Afbeeldingen in figuur 1B en C zijn gemaakt met BioRender. Kayla Lee en Gregory Serpa worden bedankt voor hun fotografische hulp. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de volgende: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) en de Brown University Research Seed Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17x100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum - Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge - large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
References
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
