Summary
这里描述了两个鼠伤愈合模型，一个旨在评估细胞和细胞因子伤口愈合反应，另一个用于量化伤口愈合率。这些方法可用于复杂的疾病模型，如糖尿病，以确定伤口愈合不良的各个方面的机制。
Abstract
伤口愈合是一个复杂的过程，需要炎症、造粒组织形成、纤维化和解决的有序进展。毛林模型为这些过程提供了宝贵的机械洞察力;然而，没有一个模型完全解决伤口愈合反应的所有方面。相反，最好使用多个模型来解决伤口愈合的不同方面。在这里，描述了两种不同的方法来处理伤口愈合反应的不同方面。在第一个模型中，聚乙烯醇海绵被皮下植入鼠标多糖。在海绵回收后，细胞可以通过机械中断进行分离，流体可以通过离心提取，从而能够详细描述急性伤口环境中的细胞和细胞因子反应。此模型的一个局限性是无法评估伤口闭合率。为此，使用了尾皮肤切除模型。在此模型中，沿着尾部底部附近的背表面切除了 10 mm x 3 mm 矩形尾皮。该模型可以很容易地拍摄平面分析，以确定愈合率，并可以切除组织学分析。这两种描述的方法可用于基因改变的小鼠菌株，或与合并条件模型（如糖尿病、衰老或继发感染）结合使用，以阐明伤口愈合机制。
Introduction
有许多鼠模型系统可用于检查伤口愈合过程，每个系统具有特定的优点和限制1，,2。以下方法提出了两种鼠伤模型，每个模型都涉及伤口愈合反应的特定方面，可用于识别损伤反应中扰动的因因和效果。伤口愈合的过程发生在不同的阶段。第一阶段是炎症，其特点是血小板、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的迅速涌入，以及产生亲炎细胞因子和化学因子。炎症的解决后，环境过渡到一种更具弹性的状态，引入亲纤维和血管生成细胞因子和生长因子。造血组织沉积，新血管形成与肌纤维细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的迁移。在最后阶段，临时细胞外基质进行改造，疤痕形成和伤口封闭进行232、3、4、5、6、7、8。6,7,84,5,,,
没有一个鼠模型提供一个系统来研究伤口愈合的所有阶段2。在这里，描述了两个手术伤口模型：一个阐明急性细胞和细胞因子伤口愈合反应，另一个允许评估伤口闭合以及组织分析。这两种方法可以以补充的方式用于评估扰动或合并症对伤口愈合反应不同方面的影响。聚苯乙烯醇（PVA）海绵的背皮下植入是一个系统，几十年来一直用于啮齿动物模型，阐明细胞和造粒组织反应的诸多方面9,109、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ，21，,22，,23，,24.这种方法允许检索富含细胞因子的伤口液体和细胞渗透。在此模型中，1 厘米 x 1 厘米 x 0.5 厘米的 PVA 海绵通过后背背中线做出的 2 厘米切口放入皮下口袋。切口用手术夹闭合，以后可以取回海绵，用于细胞和流体隔离。分离海绵的细胞和细胞因子环境反映了急性伤口愈合的正常阶段，在植入后长达14天左右。在以后的时间点，该模型更有利于研究造粒组织的形成和异物反应1。有了这个系统，可以分离>106细胞，这为球形和功能测定和RNA分离提供了明显的优势，而不是从其他活检方法11，22，23，25，2622,23,25分离26细胞。
使用尾皮切除模型确定伤口闭合率。在这个模型中，如Falanga等人最初描述，并由其他人报告27，28，29，30，28,29一个1厘米x0.3厘米全厚的尾皮部分被去除附近的尾巴底部。,3027伤口区域易于可视化，并可随时间测量。或者，尾组织可以分离进行组织分析。这种方法可以用作替代或结合成熟的背孔活检方法。这两种型号的主要区别是伤口闭合率、毛皮的存在或缺失以及皮肤结构2,2、31、32。,32尾皮伤口提供了一个较长的时间框架来评估伤口关闭，因为它大约需要21天，完全关闭发生。这与未溅的背孔活检相反，这种活检愈合得更快（+7~10天），主要通过收缩引起的泛素性腺作用。溅条背孔活检愈合较慢，减少收缩愈合的影响，但依靠一个外国机构的存在来限制基于收缩的机制11，2，27，30，31，33。,2,27,30,31,33
所述伤口模型对于了解在无扰动的情况下正常伤口愈合过程的信息量很大。虽然啮齿动物皮肤的愈合与人类皮肤有非常显著的差异，包括结构松散、依赖收缩愈合和其他解剖学差异，但鼠系为机械和筛选研究提供了某些优势。其中最重要的是近亲繁殖菌株和遗传突变体的可用性、遗传可得性和更低的成本。从鼠学研究中获得的机械学见解可以转化为更复杂的动物模型，更密切地模仿人类皮肤愈合，如猪系统2,2，31。
除了检查伤口愈合反应在稳定状态，这些模型可以结合合并条件，以了解伤口愈合缺陷在细胞，细胞因子和毛组织水平的基础。正是在这个特殊环境中，两种模型可以协同评估特定合并症（如术后肺炎）对急性细胞伤口愈合反应和伤口闭合率的影响。
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Protocol
这里描述的所有动物研究都得到布朗大学机构动物护理和使用委员会的批准，并根据《国家卫生研究院动物护理和使用指南》进行。 注：在视频中，手术窗帘被省略用于演示目的。
1. PVA海绵的皮下植入
- 使用剪刀将 PVA 海绵片切割成 8 毫米 x 8 毫米 x 4 毫米件。通过将 PVA 海绵碎片浸入无菌的 1x PBS 中，将其浸入烧杯中，使这些海绵重新补充水分。
- 在 1x PBS 中高压海绵进行消毒，并完全冷却。在 4 °C 下将自灭海绵存放在无菌的 1x PBS 中。
- 在进行手术植入之前，在层压流量罩无菌条件下，将必要数量的海绵分入无菌培养皿中。将多余的海绵存放在无菌的 1x PBS 中，温度为 4°C，供将来使用。补水后，确保海绵膨胀至 1 厘米 x 1 厘米 x 0.5 厘米。如图1A所示有脱水PVA海绵的图像。
注：为了保持手术部位的无菌性，PVA海绵植入程序要求一个人处理小鼠并准备手术部位，第二人进行植入。 - 麻醉8-12周大的男性C57BL/6J小鼠通过腹内注射80毫克/千克氯胺酮。为肛门口服40毫克/千克的木拉辛。 通过失去踏板反射确认麻醉深度。准备手术部位，通过去除头发沿多德姆与剪子。使用无菌纱布，将波维酮碘溶液涂在2倍的沙液中，然后施以70%乙醇。
- 将鼠标放在无菌手术窗帘上。将加热垫放在手术窗帘下方，以保持鼠标的核心温度。
- 戴上无菌手术手套进行手术。用钳子将背皮从底层组织拉开，并使用无菌手术剪刀，沿着背底中线向尾部底部约2厘米前约2厘米的切口进行切口。当用无菌钳子保持切口打开时，使用无菌弯曲的钝尖手术剪刀，在图1B所示的位置之一沿多香形成皮下口袋。
- 继续使用钳子将皮肤从底层组织抬走。使用无菌手术剪刀，轻轻挤压培养盘中的一块 PVA 海绵，以去除多余的 PBS。用无菌手术剪刀从一个角落捡起PVA海绵，然后用剪刀的角，将海绵放入步骤1.4中形成的皮下口袋中。
- 重复此过程 5 倍，将总共六块海绵放入皮下口袋，如图1B所示。
- 用无菌钳子将切口背皮捏在一起，用两个不锈钢伤口夹关闭切口。
- 每只老鼠使用一套新的无菌手术器械。或者，使用珠子消毒器对小鼠之间的仪器进行消毒。
2. 从 PVA 海绵中分离液体
- 为了评估急性伤口细胞因子环境，在植入后1-14天之间分离海绵。
- 通过将 5 mL 注射器的桶嵌套到 16 mL 培养管中，准备流体收集管。
- 通过 CO2窒息后使用植入 PVA 海绵对小鼠进行安乐死，然后进行宫颈脱位。
- 取出手术钉，用齿性钳子打开切口。使用剪刀沿背道中线延伸切口。
- 使用钳子，从皮下口袋中提取一块海绵，并将其转移到准备好的注射器桶中，小心尽量减少对海绵的压力。分离任何仍附着在海绵表面的结缔组织。如有必要，使用剪刀从周围组织解剖海绵。用剩余的海绵重复海绵去除过程。将装有海绵的管子放在冰上。
- 要分离伤口液，请将含有 5 mL 注射器的培养管与海绵在 700 x g上离心 10 分钟。
- 离心后，丢弃注射器和海绵。伤口液将收集到16 mL培养管中。图1D显示了从第7天伤口中收集的具有代表性的液体图像。将伤口液转移到干净的管中，在-80°C长期储存。
3. 从PVA海绵中分离细胞
- 为了评估急性伤口愈合细胞环境，在海绵植入后1-14天之间收集海绵。植入后7天从伤口获得的海绵如图1E所示。
- 制备含有 1x HBSS（+钙/=镁/+酚红色）的收集介质，辅以 1% FBS、1% HEPES 和 1% 青霉素链霉素。
- 将 5 mL HBSS 收集介质的阿利quot5输入 15 mL 锥形管。
- 从安乐死小鼠中提取PVA海绵，如2.2~2.4所述。将海绵放入含有 5 mL HBSS 收集介质的锥形管中。
- 通过浇注将海绵和 HBSS 收集介质转移到 80 mL 搅拌机袋中。悬挂搅拌器从桨搅拌机的舱口，定位，使桨击中海绵和媒体。调整桨搅拌机的设置，在 60 s 高空运行。
- 将介质从搅拌袋转移到15 mL锥形管与移液器，留下海绵在袋子。挤压海绵以彻底释放介质。调整桨搅拌机的设置，在高高时运行 30 s。将 5 mL 的介质添加到搅拌袋中，重复胃部过程 2 倍，总共进行三次海绵处理。
- 将锥形管在 250 x g下离心 5 分钟。离心后，在圆锥管底部可以看到细胞和红血球的红色颗粒。
- 丢弃上清液并进行红血球压网：将900μL的dH2O添加到细胞颗粒和移液器中混合。用 100 μL 的 10x PBS 中和。将 4 mL 的 1x PBS 添加到管中，以完全中和套结塞，然后在 250 x g下离心 5 分钟。
注：lysis 步骤应简短;让水与细胞接触超过3~5s，可能导致非红血球的收缩。 - 离心后，圆锥管底部将存在一个含有无红血细胞的伤口细胞的白细胞颗粒。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在所需的介质中，以便进行下游分析。
4. 从PVA海绵伤口分离的先天白细胞的可选流动细胞学分析
- 在含有10 μg/mL抗CD16/CD16/CD32 FCR®II/III抗体的2倍溶液中重新悬浮0.5×1 x106个伤口细胞，在1倍PBS+ 1%BSA中稀释。
注：所有抗体都应进行定化，以确定流细胞学分析的最佳浓度。 - 用阻塞抗体在冰上孵育细胞10分钟。
- 制作含有 2.5 mg/mL PerCP-eFluor710-Ly6G 的抗体 2x 主混合物，5 mg/mL 的 FITC-Ly6C、APC-Fire750-CD45.2、APC-R700-Siglec-F 和 10 mg/mL 的 eFluor660-F4-80 稀释 1 倍 = 1% BSA。直接加入25μL的抗体鸡尾酒的细胞孵化阻断抗体。
- 在冰上孵育细胞20分钟，免受光的影响。
- 用 1x PBS 清洗 2 倍的细胞。
- 在 1x PBS 中，将胺反应性可修复的可活性染料-eFluor506 稀释 1：1，000 进行主组合。将细胞颗粒重新悬浮在50μL的可生存染料溶液中。
注：血清必须排除在可修复的生存能力步骤之外，因为它可以防止染料与内源性蛋白质结合。在冰上孵育细胞20分钟，免受光的影响。 - 用 1x PBS 清洗 2 倍的细胞。将细胞颗粒重新悬浮在50μL的1%甲醛中。
- 用1%的副甲醛在冰上孵育15分钟，防止光。
- 用 1x PBS 清洗细胞 1x，并在 1x PBS 中重新悬浮颗粒，以便进行流式细胞测量分析。
5. 尾皮切除
- 麻醉8-12周大的男性C57BL/6J小鼠通过腹内注射80毫克/千克氯胺酮。为肛门口服40毫克/千克的木拉辛。通过失去踏板反射确认麻醉深度。
- 使用无菌纱布将波维酮碘溶液2倍，然后一次应用70%乙醇，在麻醉小鼠尾部准备手术部位。
- 在尾部的背面上定义一个 10 mm x 3 mm 的截面，从尾部底部（图 1C）处定义 10 mm x 3 mm 截面，使用永久标记从预制模板进行跟踪。
- 将麻醉小鼠放在无菌手术窗帘上。
- 戴上无菌手术手套进行外科手术。使用无菌手术刀刀片，沿伤口区域的右边缘、底部和左边缘进行全厚切口。
- 使用无菌钳子，剥去被切除的皮肤从尾巴，并使用无菌手术剪刀切开伤口区域的顶部边缘。
- 用无菌纱布施加压力以止血。
- 在伤口床上涂上喷雾阻隔膜。
- 定期拍摄固定距离的伤口。通过平面分析分析照片以确定伤口区域测量值。或者，使用卡钳获取伤口长度和宽度测量。
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Representative Results
PVA海绵植入后的全身炎症反应
PVA海绵植入手术产生了全身炎症反应，如伤伤1天后血浆中IL-6的诱导（图2A）。其他亲炎细胞因子，包括TNF-α和IL-1+，以及包括CCL2和CXCL1在内的一系列化学因子在PVA海绵植入后的前7天被系统诱导，并在其他地方描述了26，30。26,
从PVA海绵伤口分离细胞和液体
PVA海绵伤口模型的主要优点是能够恢复足够的细胞，用于对急性细胞伤口愈合反应的皮象和功能分析。从PVA海绵伤口中恢复的细胞数量随着时间的推移而增加，从伤口第7天1 x 106至8 x 106细胞的伤口日每6个海绵大约2 x 106个细胞增加（图2B）。单元格数在第 7 天以后继续增加。不建议继续这个模型超过€14天，因为海绵变得完全封装胶原蛋白和系统过渡从建模急性伤口愈合反应，以建模一个异物颗粒瘤1,221，22，23，25，26。,23,25,26嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞是PVA海绵伤口中渗透的主要细胞。根据流动细胞测量分析的评估，嗜中性粒细胞在伤伤一天后占据伤口细胞环境（图2C）。单核细胞和单细胞衍生巨噬细胞在海绵植入后3天内积累，三个细胞群随时间而增加（图2C）。图2D显示了识别嗜中性粒细胞、单细胞和巨噬细胞群的代表性流细胞测量门控策略。使用FSC-H和SSC-H参数（图2D，i和ii）排除细胞双i精度值后，使用胺反应性可修复的可活性染料（如下所示）或核酸染料（例如，sytox或异丙二）（图2D，iii）排除非活细胞。 iii然后，使用 FSC-A 和 SSC-A 参数（图 2D，iv），排除了先前浇注步骤iv未清除的残余细胞碎屑。造血细胞由大多数PVA海绵伤口细胞组成，由CD45表达（图2D，v）识别。 v嗜中性粒细胞被确定为Ly6G+Siglec-F=（图2D，vi）。 viSiglec-F=细胞主要是嗜酸性细胞（图2D，vii）。 vii在Ly6G+Siglec-F+细胞上，单核细胞/巨噬细胞被确定为F4/80+细胞（图2D，VIII）。 viiiF4/80+细胞可以通过Ly6C表达式进一步分馏，以区分Ly6Chi炎症单核细胞（图2D，ix）和Ly6C低单细胞衍生巨噬细胞（ix图2D，x）26。 x26
测量细胞因子和其他伤口可溶性因子的能力是PVA海绵伤口模型的另一个优势。每海绵可提取高达 100 μL 的液体。萃取的流体适用于各种下游检测。ELISA或珠子多路免疫测定在早期和晚期伤口液体中检测到细胞因子和化学因子，已报告在其他地方26、30。,30可以从同一伤口获得细胞和液体。为此，建议从背底中线的一侧分离三块海绵，以便细胞隔离，并从背底中线的对面分离 3 块海绵，以便进行流体提取。
使用尾皮切除模型对伤口闭合的评估
外皮尾皮肤模型提供了一种替代背皮冲孔活检方法，以研究缺乏密集毛皮的牢固皮肤的缓慢伤口闭合。图3A显示了切除后1天、7天和15天尾皮伤口的示例图像。随着时间的推移，可以通过测量伤口床的面积来量化伤口闭合。第7天和第15天伤口床区分别约为70%和35%，为第1天伤口区域（图3B）。完全伤口关闭大约需要28天。尾皮伤口也可以通过组织分析在横截面中观察到。图 3C和图 3D分别显示了 H&E 和 Masson 的三铬染色尾部横截面的代表性图像。切除皮肤的横向边距由尾部背面上的箭头表示。
图1：鼠伤愈合模型的原理图。（A） 脱水 PVA 海绵的侧面（左）和顶部（右）视图，尺寸为 8 mm x 8 mm x 0.4 mm. （B） 显示小鼠在皮下口袋中放置背侧中切口（中央红线）和六块 1 厘米 x 1 厘米 x 0.5 厘米 PVA 海绵的位置。（C） 示意图，显示外皮伤口（10 毫米 x 3 毫米红色矩形）在尾部的背表面的大小和位置。（D） 从植入后7天从皮下空间取回的三块海绵分离的伤口液体。（E） 植入后7天从伤口中取回的海绵的外观。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：对PVA海绵植入的系统和细胞反应。（A） 血浆中IL-6水平的时间过程表明，PVA海绵植入引起全身炎症反应。IL-6的浓度是使用多工珠免疫测定测量的。（B） 从PVA海绵伤口分离的细胞数量随着时间的推移而增加。（C） 时间过程演示了随着时间的推移，PVA海绵伤口中嗜中性粒细胞、单核细胞和单细胞衍生巨噬细胞的积累。（D） 从PVA海绵伤口分离的细胞的代表性浇注策略演示如何通过流细胞学分析识别白细胞子集。盖茨的定义如下： （i和ii） 双排除， （iii） 使用胺反应性可修复的可活性染料， （iv） FSC-A 和 SSC-A 排除碎片， （v） CD45+造血细胞， （vi） Ly6G=嗜中性粒细胞， （vii） Siglec-F=嗜酸性粒细胞， （八） Ly6G=Siglec-F= F4/80=单核细胞/巨噬细胞， （ix） F4/80|Ly6Chi单核细胞， 和 （x） F4/80=Ly6C低巨噬细胞。盖茨是按照荧光减一 （FMO） 控制放置的。A+C中显示的数据是平均值 = SEM，n = 每组 6×10 小鼠（A），n= 8+9 小鼠（B），n= 6+8 小鼠（C）。所有数据均来自 2+3 独立实验的组合。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：评估切除尾皮伤口愈合。（A） 伤后1天、7天和15天，有代表性的尾皮肤伤口照片。（B） 切除尾皮肤伤口的封闭率。伤口每隔一天被拍照。使用图像处理软件跟踪伤口床边缘，并在指定的时间点计算伤口区域。伤口区域作为第 1 天测量的伤口区域的一小部分显示。具有代表性的尾横截面图像，这些截面由石蜡嵌入、分割和染色（C） H&E 或 （D）Masson 的三铬。伤口位于尾部横截面的背面表面;侧绕边缘由箭头指示。（B） 中显示的数据是每组均值 = SEM，n = 8 个小鼠。数据来自两个独立的实验。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
本文介绍了两种可处理的鼠伤模型，可用于评估急性伤口愈合反应。第一种方法涉及在背皮皮空间中植入PVA海绵。这种方法比基于活检的伤口模型具有明显的优势，用于研究细胞伤口愈合反应，因为从分离海绵中获得的细胞数量和伤口液体数量众多。为了成功实施这一程序，通过彻底清洁切口周围的皮肤来维持无菌手术场势在必行，因为细菌在伤口中的易位将大大改变愈合过程。使用此处描述的细胞隔离方法，根据海绵提取的时间，可以从 PVA 海绵中分离至少 1-10 x 106 个细胞。从PVA海绵伤口分离出的大多数细胞是可行的（图2D）。然而，由于死细胞在机械中断后可能构成高达约20%的隔离伤口细胞，因此强烈建议在进行基于流细胞的分析时使用可行性染色。从PVA海绵伤口分离的细胞主要是由CD45正性决定的造血源（图2D）。中性粒细胞的快速积累，其次是单核细胞和巨噬细胞，与伤口修复的急性阶段3,43、4、34、35、36、37、38一致。,34,35,36,37,38分离细胞适用于下游分析，包括免疫排皮、细胞分拣、培养、RNA提取和各种功能测定。
PVA 海绵伤口模型还允许分离液体，这是评估急性伤口环境中的细胞因子和生长因子反应的理想选择。PVA海绵液适用于ELISA、珠基多路复用免疫测定和蛋白质定量等测试。先前的研究通过细胞因子和生长因子测量证明，早期伤口环境在性质上具有炎症性，从第1-3天开始，IL-6、TNF-+和IL-1+的快速诱导。伤口环境随后过渡到恢复性状态，随后引入亲血管生成和亲纤维生长因子，包括VEGF和TGF-+22、23、25、26、30。22,23,25,26,30
虽然PVA海绵植入模型有利于研究急性伤口细胞和细胞因子反应，但其局限性之一是无法测量愈合的速度或程度。在评估合并条件对伤口愈合反应反应的各个方面的影响时，可能需要测量伤口愈合的这一方面。对于此指标，首选基于活检的方法。这里介绍了尾皮肤切除模型。在此模型中，尾部皮肤的全厚部分从尾部的背面表面被切除。同样，保持无菌手术场对于避免给伤口床接种疫苗非常重要。还建议使用喷雾阻隔膜或其他伤口覆盖物，以避免以后的伤口感染。年龄较大的雄性小鼠或腐蚀性菌株需要单独壳体，以避免伤口中断。尾巴作为研究伤口愈合的场所的一个特别优点是，它更依赖于重新上皮的闭合，正如其他人描述的27，32，33。32,3327除了测量伤口床面积和执行组织学分析外，其他人还报告了它在评估局部干预在调节愈合过程方面的有效性。
这些方法中描述的每个伤口模型都为在稳定状态下和存在合并体的情况下了解伤口修复过程提供了明显的优势。由于近亲繁殖小鼠的遗传改变菌株的广泛可用，也可以操纵伤口愈合反应，以回答有关这一过程的机械问题。此外，这些系统可以在与伤口愈合不良相关的条件（包括糖尿病、衰老、继发性感染等30、36、39、40）36,39,40的鼠模型中实施。30从鼠学研究中获得的机械学见解可能为研究高阶动物模型中的伤口愈合提供基础。PVA 海绵植入和切除尾皮肤伤口模型共同提供可处理且多功能的系统，以阐明稳定状态和病理条件下的伤口愈合过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢布朗大学流动细胞测量和分拣基金的凯文·卡尔森在流细胞学实验方面的咨询和帮助。图 1B 和 C 中的图像是使用 BioRender 创建的。凯拉·李和格雷戈里·塞尔帕感谢他们的摄影帮助。这项工作得到了以下资助：国防高级研究计划局（DARPA）YFAA15 D15AP00100、院长新兴科学奖（布朗大学）、国家心肺血液研究所（NHLBI）1R01HL126887-01A1，国家环境科学研究所（NIES）T32-ES7272（环境病理学培训）和布朗大学研究种子奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17x100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum - Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge - large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
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