Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка острого исцеления ран с использованием dorsal подкожный поливинил алкоголь Губка Имплантация и иссционные хвост овешки раны модели.

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60653
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

Summary

Здесь описаны две модели заживления ран, одна из которой предназначена для оценки клеточных и цитокинов реакций заживления ран, а другая - для количественной оценки скорости замыкания ран. Эти методы могут быть использованы со сложными моделями заболеваний, таких как диабет для определения механизмов различных аспектов плохого заживления ран.

Abstract

Заживление ран является сложным процессом, который требует упорядоченного прогрессирования воспаления, формирования гранулированной ткани, фиброза и разрешения. Модели Murine обеспечивают ценное механистическое понимание этих процессов; однако, ни одна модель полностью не рассматривает все аспекты реакции заживления ран. Вместо этого, идеально использовать несколько моделей для решения различных аспектов заживления ран. Здесь описаны два различных метода, которые затрагивают различные аспекты реакции заживления ран. В первой модели поливиниловые спиртовые губки подкожно имплантируются вдоль мышечной сум. После поиска губки, клетки могут быть изолированы механические нарушения, и жидкости могут быть извлечены путем центрифугации, что позволяет подробную характеристику клеточных и цитокинов реакции в острой среде раны. Ограничением этой модели является неспособность оценить скорость закрытия ран. Для этого используется модель иссечения хвостовой кожи. В этой модели, 10 мм х 3 мм прямоугольный кусок хвостовой кожи иссесывается вдоль поверхности доза, вблизи основания хвоста. Эту модель можно легко сфотографировать для планиметрического анализа для определения показателей заживления и можно усвоить для гистологического анализа. Оба описанных метода могут быть использованы в генетически измененных штаммов мыши, или в сочетании с моделями сопутствующих заболеваний, таких как диабет, старение или вторичная инфекция, для того, чтобы выяснить механизмы заживления ран.

Introduction

Есть много систем модели мурин доступны для изучения процессов заживления ран, каждый из которых обладает конкретными преимуществами и ограничениями1,2. Следующие методы представляют две модели мурин раны, каждая из которых рассматривает конкретный аспект реакции заживления ран, и которые могут быть использованы для определения причины и следствия возмущений в ответ на травму. Процесс заживления ран происходит в различных фазах. Первая фаза является воспалительной, характеризующейся быстрым притоком тромбоцитов, нейтрофилов и моноцитов/макрофагов, а также производством провоспалительных цитокинов и хемокин. После разрешения воспаления, окружающая среда переходит в более репаративное состояние с индукцией профибротических и проангиогенных цитокинов и факторов роста. Гранулированная ткань откладывается и неососы образуются с миграцией миофибробластов, фибробластов, эпителиальных клеток и эндотелиальных клеток. На заключительных стадиях перестраивается предварительная внеклеточная матрица, а образование рубцов и замыкание раны происходит2,,33,44,5,66,7,,8.

Ни одна модель мурина не обеспечивает систему для изучения всех стадий заживления ран2. Здесь описаны две хирургические модели ран: одна проясняет острые клеточные и цитокины заживление ран, а другая позволяет оценить закрытие раны, а также гистологические анализы. Эти два метода могут быть использованы в дополнительной форме для оценки последствий возмущения или сопутствующих мер на различные аспекты реакции заживления ран. В розницу подкожной имплантации поливинилового спирта (PVA) губки представляет собой систему, которая была использована в моделях грызунов на протяжении десятилетий, чтобы прояснить многочисленные аспекты клеточной и гранулирующей ткани ответы9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Такой подход позволяет извлекать богатые цитокиновыми раневыми жидкостями и клеточные инфильтраты. В этой модели, 1 см х 1 см х 0,5 см куски pVA губки помещаются в подкожные карманы через 2 см разрез, сделанный на задней дорсальной средней линии. Разрез закрывается хирургическими зажимами, и губки могут быть извлечены в более поздние временные точки для изоляции клеток и жидкости. Клеточная и цитокинская среда изолированных губок отражает нормальные стадии заживления острых ран до 14 дней послеимплантации. В более поздние моменты указывает модель является более выгодным для изучения формирования гранулирования ткани и инородного тела ответ1. С помощью этой системы, можно изолировать йgt;106 клеток, который предлагает явное преимущество для фенотипических и функциональных анализов и ИЗОЛЯЦИи РНК, более изоляции клеток из других методов на основе биопсии1,22,23,25,26.

Скорость замыкания раны определяется с помощью модели иссечения хвостовой кожи. В этой модели, как первоначально описано Falanga et al. и сообщили другие27,28,29,30, 1 см х 0,3 см полная толщина секции хвостовой кожи удаляется вблизи основания хвоста. Область раны легко визуализирована и может быть измерена с течением времени. Кроме того, хвостовая ткань может быть выделена для гистологического анализа. Этот подход может быть использован в качестве альтернативы или в сочетании с устоявшимся методом биопсии пневматического пунша. Основными различиями между этими двумя моделями являются скорость закрытия ран, наличие или отсутствие меха, и структура кожи2,,31,32. Хвост овешки раны предлагают более длительные сроки, в которых для оценки закрытия раны, как это занимает около 21 дней для полного закрытия произойти. Это противопоставляется непорочным кисло-пунш биопсии, которые заживают гораздо быстрее (7-10 дней), в первую очередь за счет сокращения из-за действия panniculus карнос. Splinted dorsal пунша биопсии исцелить медленнее и уменьшить последствия сократительного исцеления, но полагаться на наличие инородного тела, чтобы ограничить сократительных механизмов1,2,27,30,31,33.

Описанные модели ран информативны для понимания нормальных процессов заживления ран при отсутствии возмущения. В то время как заживление кожи грызунов отличается очень значительными способами от кожи человека, включая рыхлую структуру, зависимость от сократительного заживления и другие анатомические различия, муринсистема предлагает определенные преимущества для механистических и скрининговых исследований. На первом месте среди них является наличие инбредных штаммов и генетических мутантов, генетическая усваиваемость и более низкая стоимость. Механистические понимание, полученное из мурин исследований могут быть переведены на сложные модели животных, которые более тесно имитировать заживление кожи человека, таких как свиная система2,31.

В дополнение к изучению реакции заживления ран в устойчивом состоянии, эти модели могут быть объединены с сопутствующими условиями, чтобы понять основу дефектов заживления ран на клеточной, цитокинов, и валового уровня ткани. Именно в этой конкретной обстановке, что две модели могут быть использованы в согласии для оценки последствий конкретного сопутствующих состояний, таких как послеоперационная пневмония, как на острой клеточной реакции заживления рании и скорость закрытияраны 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на животных, описанные здесь, были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Брауна и проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию животных Национальных институтов здравоохранения.  ПРИМЕЧАНИЕ: в видео, хирургическая драпировка была опущена для демонстрационных целей.

1. Подкожная имплантация губок ПВА

  1. Используйте ножницы, чтобы разрезать листы губки PVA на 8 мм х 8 мм х 4 мм штук. Rehydrate куски губки ПВА, погрузив их в стерильные 1x PBS в стакан.
  2. Автоклав губки в 1x PBS стерилизовать, и охладить полностью. Храните автоматически ватированные губки в стерильных 1x PBS при 4 градусах Цельсия.
  3. Перед выполнением хирургической имплантации, aliquot необходимое количество губок в стерильной культуры блюдо в стерильных условиях в ламинарной капоты потока. Храните дополнительные губки в стерильных 1x PBS при 4 градусах по Цельсию для использования в будущем. Убедитесь, что губки набухают до 1 см х 1 см х 0,5 см после регидратации. Изображение обезвоженных губок ПВА показано на рисунке 1A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильности хирургического участка, процедура имплантации губки PVA требует, чтобы один человек обработал мышь и подготовил хирургическое место, и второй человек для выполнения имплантации.
  4. Анестезия 8-12 недельный мужчина C57BL/6J мыши интраперитонеальной инъекции 80 мг/кг кетамина. Администрирование 40 мг/кг ксилазина интраперитонена для обезболивания.  Подтвердите глубину анестезии потерей педали рефлекса. Подготовка хирургического сайта, удалив волосы вдоль стропы с клиперами. Используя стерильную марлю, нанесите повидон-йодный раствор на область бритья 2x, а затем 70% этанола.
  5. Поместите мышь на стерильные хирургические шторы. Поместите подогрев под хирургические шторы для поддержания температуры ядра мыши.
  6. Носите стерильные хирургические перчатки для выполнения операции. Вытяните сонную кожу от основной ткани с помощью щипц, и с помощью стерильных хирургических ножниц, сделать 2 см разрез вдоль дорсальной средней линии примерно 2 см передней к основанию хвоста. При проведении разреза открытым и стерильных щипцы, использовать стерильные изогнутые, тупой наконечником хирургические ножницы, чтобы сформировать подкожный карман вдоль сницы в одном из позиций, указанных в Рисунке 1B.
  7. Продолжайте использовать щипки, чтобы поднять кожу от основной ткани. Используя стерильные хирургические ножницы, аккуратно сжать одну губку ПВА в культуре блюдо, чтобы удалить избыток PBS. Возьмите губку PVA на один угол, используя стерильные хирургические ножницы и, ведя с углу, удерживаемым ножницами, поместите губку в подкожный карман, сформированный в шаге 1.4.
  8. Повторите этот процесс 5x, поместив в общей сложности шесть губок в подкожные карманы, как показано на рисунке 1B.
  9. Pinch incised сонной кожи вместе с стерильными щипками и закрыть разрез с двумя зажимами из нержавеющей стали раны.
  10. Используйте новый набор стерильных хирургических инструментов для каждой мыши. Кроме того, используйте стерилизатор из биса для стерилизации инструментов между мышами.

2. Изоляция жидкостей от губок ПВА

  1. Для оценки острой раны цитокинов среды, изолировать губки между 1-14 дней послеимплантации.
  2. Подготовьте трубку для сбора жидкости, прививая ствол шприца 5 мл в культурную трубку длиной 16 мл.
  3. Эвтанизировать мышь с имплантированными губками PVA с помощью CO2 асфиксии с последующим вывихом шейки матки.
  4. Удалить хирургические скобы и открыть разрез с зубчатыми щипками. Используйте ножницы, чтобы продлить разрез вдоль дорсала средней линии.
  5. Используя щипцы, извлеките одну губку из подкожного кармана и перенесите ее в подготовленный шприц-бочку, стараясь свести к минимуму давление на губку. Отсоедините любую соединительную ткань, которая остается прилипаемым к поверхности губки. Используйте ножницы, чтобы вскрыть губку из окружающих тканей, если это необходимо. Повторите процесс удаления губки с оставшимися губками. Поместите трубку, содержащую губки, на лед.
  6. Чтобы изолировать рану жидкости, центрифугия культуры трубки, содержащей 5 мл шприц с губками на 700 х г в течение 10 минут.
  7. После центрифугации отбросьте шприц и губки. Раневая жидкость будет собрана в 16 мл культуры трубки. Репрезентативное изображение жидкости, собранной с 7-го дня раны, показано на рисунке 1D. Перенесите раную жидкость в чистую трубку для длительного хранения при -80 градусах Цельсия.

3. Изоляция клеток от губок ПВА

  1. Для оценки острой раны заживления клеточной среды, собирать губки между 1-14 дней после губчатой имплантации. Губки, полученные из раны через 7 дней после имплантации, показаны на рисунке 1E.
  2. Подготовьте среду сбора, содержащую 1x HBSS (кальций/магний/-фенол красный), дополненный 1% FBS, 1% HEPES и 1% пенициллина-стрептомицина.
  3. Aliquot 5 мл коллекции HBSS среднего в 15 мл конической трубки.
  4. Извлеките губки PVA из эвтанированных мышей, как описано в 2.2-2.4. Поместите губки в коническую трубку, содержащую 5 мл среды коллекции HBSS.
  5. Перенесите губки и среду коллекции HBSS в мешок блендера 80 мл путем заливки. Повесьте мешок блендера из люка весло блендер, расположенный так, что весла удар губки и средства массовой информации. Отрегулируйте настройки весла блендер для запуска на высоком для 60 s. Нажмите начала.
  6. Перенесите средства массовой информации из блендера мешок обратно в 15 мл конической трубки с пипеткой, оставляя губки позади в сумке. Сожмите губки, чтобы тщательно освободить средства массовой информации. Отрегулируйте настройки весла блендер для запуска в течение 30 с на высоком. Добавьте 5 мл носителей в пакет блендера и повторите процесс желудка 2x в общей сложности три губки моет.
  7. Центрифуги коническая трубка на 250 х г в течение 5 мин. Красные гранулы клеток и красных кровяных телец будут видны в нижней части конической трубки после центрифугации.
  8. Откажитесь от супернатанта и выполните лисис красных кровяных телец: добавьте 900 кЛ дГ2О в клеточные гранулы и пипетку для смешивания. Нейтрализуйте с помощью 100 л 10x PBS. Добавьте 4 мл 1x PBS в трубку, чтобы полностью нейтрализовать лизис, затем центрифугу на уровне 250 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: шаг lysis должен быть кратким; оставляя воду в контакте с клетками для более чем 3-5 с может привести к лиза некрасных кровяных телец.
  9. После центрифугации, белые клетки гранулы, содержащие раны, лишенные красных кровяных телец будет присутствовать в нижней части конической трубки. Откажитесь от супернатанта и resuspend клеточной гранулы в желаемой среде для анализа вниз по течению.

4. Дополнительный анализ цитометрии потока врожденных лейкоцитов, изолированных от ран пвиса ПВА

  1. Resuspend 0,5-1 х 106 раневых клеток в 25 л 2x раствор блокирующих антител, содержащих 10 мкг /мл анти-CD16/CD32 FcR'II/III антитела разбавленного в 1x PBS и 1% BSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела должны быть тистрированы, чтобы определить оптимальные концентрации для анализа цитометрии потока.
  2. Инкубировать клетки с блокирующими антителами в течение 10 минут на льду.
  3. Сделать 2x мастер смесь антител, содержащих 2,5 мг/мл PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 мг/мл FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, и 10 мг/мл eFluor60-F4-80 разбавленный 1. Непосредственно добавьте 25 зл антитела коктейль в клетки инкубации в блокирующих антител.
  4. Инкубировать клетки в течение 20 минут на льду, защищенном от света.
  5. Вымойте клетки 2x с 1x PBS.
  6. Сделать мастер сочетание амина-реактивной фиксации жизнеспособности красителя-eFluor506 разбавленной 1:1,000 в 1x PBS. Приостановите действие клеточных гранул в 50 злиц раствора красителя жизнеспособности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка должна быть исключена из поправимой жизнеспособности шаг, так как это позволит предотвратить связывание красителя для эндогенных белков. Инкубировать клетки в течение 20 минут на льду, защищенном от света.
  7. Вымойте клетки 2x с 1x PBS. Приостановите действие клеточных гранул в 50 л параформальдегида.
  8. Инкубировать клетки с 1% параформальдегида в течение 15 минут на льду, защищены от света.
  9. Вымойте клетки 1x с 1x PBS и resuspend гранулы в 1x PBS для потока цитометрического анализа.

5. Иссечение кожи хвоста

  1. Анестезия 8-12 недельный мужчина C57BL/6J мыши путем интраперитонеальной инъекции 80 мг/кг кетамина. Администрирование 40 мг/кг ксилазина интраперитонена для обезболивания. Подтвердите глубину анестезии потерей педали рефлекса.
  2. Подготовьте хирургическое место на хвосте обезболиваеной мыши с помощью стерильной марли для нанесения повидон-йодного раствора 2x, за которым следует одно применение 70% этанола.
  3. Определите 10 мм х 3 мм раздел на царской поверхности хвоста, 10 мм от основания хвоста(рисунок 1C) с помощью постоянного маркера для отслеживания от готовых шаблонов.
  4. Поместите анестезирующую мышь на стерильные хирургические шторы.
  5. Носите стерильные хирургические перчатки для выполнения хирургических процедур. С помощью стерильного скальпеля лезвие сделайте полный разрез толщины вдоль правого, нижнего и левого краев раны.
  6. Используя стерильные щипцы, очистить вырезанную кожу от хвоста, и использовать стерильные хирургические ножницы, чтобы отрезать верхний край области раны.
  7. Нанесите давление стерильной марлей, чтобы остановить кровотечение.
  8. Нанесите спрей барьерной пленкой на рану кровати.
  9. Фотографируй раны с фиксированного расстояния через регулярные промежутки времени. Анализ фотографий с помощью планиметрического анализа для определения измерений раневой области. Кроме того, используйте калиперы для измерения длины раны и ширины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Системная воспалительная реакция после имплантации губки ПВА
Операция по имплантации губки ПВА вызвала системную воспалительную реакцию, о чем свидетельствует индукция ИЛ-6 в плазме через 1 день после ранения(рисунок 2A). Другие провоспалительные цитокины, включая TNF-я и IL-1, а также массив хемокины, включая CCL2 и CXCL1 были индуцированы системно в первые 7 дней после PVA губки имплантации, и были описаны в другом месте26,30.

Изоляция клеток и жидкостей от ран ПВА губки
Основным преимуществом модели РАНы губки PVA является способность восстанавливать достаточное количество клеток для фенотипического и функционального анализа острой клеточной реакции заживления ран. Количество клеток, которые могут быть извлечены из ран pVA губки увеличивается с течением времени, примерно с 2 х 106 клеток на шесть губок на рану день 1 х 106 до 106 6 6 клеток на рану день 7 (Рисунок 2B). Номер ячейки продолжает увеличиваться после 7-го дня. Не рекомендуется продолжать эту модель за 14дней,потому что губки становятся полностью инкапсулированы коллагена и системы переходов от моделирования острой реакции заживления раны на моделирование чужеродных грануломы тела1,22,23,25,26. Нейтрофилы, моноциты и макрофаги были основным клеточным инфильтратом в ранах губки ПВА. Нейтрофилы преобладали раны клеточной среде один день после ранения, как оценивается поток цитометрического анализа(рисунок 2C). Моноциты и моноцитные макрофаги, накопленные в течение 3 дней после имплантации губки, и три популяции клеток увеличились в количестве с течением времени(рисунок 2C). Репрезентативная стратегия цитометрии потока для выявления популяций нейтрофилов, моноцитов и макрофагов показана на рисунке 2D. После исключения клеточных дублетов с использованием параметров FSC-H и SSC-H(Рисунок 2D, i и ii),нежизнеспособные клетки были исключены с помощью амин-реактивного фиксируемого чичабельного красителя (показано здесь) или красителя нуклеиновой кислоты (например, sytox или propidium iodide) (Рисунок 2D, iii). Остаточный клеточный мусор, не удаленный предыдущими шагами gating, был затем исключен с использованием параметров FSC-A и SSC-A(рисунок 2D, iv). Гематопоиэтитические клетки состояли из большинства pVA губки раны клетки и были определены CD45 выражение(Рисунок 2D, V). Нейтрофилы были идентифицированы как Ly6GиSiglec-F- (рисунок 2D, vi). Siglec-F- клетки были в основном эозинофилами(рисунок 2D, vii). Gating на Ly6G-Siglec-F- клетки,моноциты / макрофаги были определены как F4/80- клетки(Рисунок 2D, viii ). F4/80- клетки могут быть дополнительно фракционированы выражением Ly6C, чтобы различать ли6Спривет воспалительных моноцитов(Рисунок 2D, ix) и Ly6Cс низким моноцитом полученных макрофагов (Рисунок 2D, x)26.

Способность измерять цитокины и другие ранерастворимые факторы является еще одним преимуществом для модели раны губки PVA. На губку можно добывать до 100 л жидкости. Извлеченные жидкости подходят для различных анализов вниз по течению. Обнаружение цитокинов и хемокинов в ранних и поздних рановых жидкостях eLISA или бисины на основе мультиплекс иммуноанализа были зарегистрированы в другом месте26,30. Можно получить как клетки, так и жидкости из одной и той же раны. Для этого рекомендуется изолировать три губки с одной стороны нижней средней линии для изоляции клеток и 3 губки с противоположной стороны донной средней линии для извлечения жидкости.

Оценка замыкания раны с помощью модели иссечения хвостовой кожи
Иссисионная модель кожи хвоста обеспечивает альтернативу методу биопсии пунша снащающей кожи для изучения медленного закрытия раны в твердой коже, не которой не хватает плотного меха. Примеры ран хвостовой кожи на 1, 7 и 15 дней после иссечения показаны на рисунке 3A. Закрытие раны может быть количественно путем измерения площади раневого дна с течением времени. Днем 7 и днем 15 раны области были примерно 70% и 35%, соответственно, в день 1 раны области(рисунок 3B). Полное закрытие раны потребовало примерно 28 дней. Раны хвостовой кожи также можно было наблюдать в поперечном сечении гистологическим анализом. Рисунок 3C и Рисунок 3D показать репрезентативные изображения Н И Е и Массон в Трихром-окрашенные хвост анавидной поперечности, соответственно. Боковые поля вырезанной кожи указаны наконечниками стрел на псовой поверхности хвоста.

Figure 1
Рисунок 1: Схема моделя заживления ран мурин. (A) Боковой (слева) и верхний (справа) вид обезвоженных губок ПВА размером 8 мм х 8 мм х 0,4 мм. (B) Иллюстрация мыши, демонстрирующая размещение разреза нижней линии (центральная красная линия) и 6 1 см х 1 см х 0,5 см Губки PVA в подкожных карманах. (C) Схема, демонстрирующая размер и размещение иссеченной рана кожи (10 мм х 3 мм красного прямоугольника) на царской поверхности хвоста. (D) Раневая жидкость изолирована из трех губок, которые были извлечены из подкожного пространства 7 дней после имплантации. (E) Появление губок, извлеченных из раны через 7 дней после имплантации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Системная и клеточная реакция на имплантацию губки ПВА. (A) Временной курс уровней IL-6 в плазме показывает, что имплантация губки ПВА индуцировала системную воспалительную реакцию. Концентрация ИЛ-6 измерялась с помощью иммуноанализов на основе мультиплекса. (B) Количество клеток, изолированных от раны PVA губки увеличилось с течением времени. (C) Временный курс демонстрирует накопление нейтрофилов, моноцитов и моноцитов, полученных макрофагов в ранах губки ПВА с течением времени. (D) Представитель gating стратегия клеток, изолированных от ран пВА губки демонстрирует, как определить подмножества лейкоцитов по потоку цитометрического анализа. Ворота определяются следующимixобразом: (i и ii) doublet исключение, (iii) исключение мертвых клеток с использованием амин-реактивного фиксируемого красителя жизнеспособности, (iv) исключение мусора FSC-A и SSC-A, (v) CD45- гематоподетические клетки, (vi) Ly6Gи нейтрофилы,(vii) Siglec-F- эозинофилы, (+ viii) Ly6G-Siglec-F- F4/80 Ly6Cпривет моноцитов, и (( x) F4/80иLy6Cнизких макрофагов. Ворота были размещены в соответствии с флуоресценцией-минус один (FMO) контроля. Данные, показанные в A-C являются средними SEM, n 6-10 мышей на группу в (A), n 8-9 мышей в (B), и n 6-8 мышей в (C). Все данные объединены из 2-3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка иссеченного заживления хвостовой части кожи. (A) Представитель фотографии иссецисционных ран хвост кожи, принятых 1, 7, и 15 дней после ранения. (B) Скорость закрытия иссечения хвоста раны кожи. Раны фотографировались через день. Программное обеспечение для обработки изображений использовалось для отслеживания краев раны и расчета области раны в указанные временные точки. Область раны представлена как доля раневой области, измеренной на 1-й день. Представитель изображения хвоста поперечные секции, которые были парафина встроенных, секционированных, и окрашенных с (C) Н И Е или (D) Массон в Трихром. Рана была расположена на подошвальной поверхности хвостовой секции; боковые поля раны указаны наконечниками стрел. Данные, показанные в (B) являются средними SEM, n и 8 мышей на группу. Данные объединяются из двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта статья описывает две уступчивые модели раны мурин, которые позволяют оценить острой реакции заживления ран. Первый метод включает в себя хирургическую имплантацию губок ПВА в подкожном пространстве. Этот подход предлагает явное преимущество по сравнению с биопсией на основе раны моделей для изучения клеточной реакции заживления ран ы из-за большого количества клеток и количества раневых жидкостей, полученных из изолированных губок. Для успешного выполнения этой процедуры, поддержание стерильной хирургического поля путем тщательной очистки кожи вокруг разреза является обязательным, как транслокации бактерий в рану значительно изменит ход заживления. Используя описанный здесь метод изоляции клеток, можно изолировать по крайней мере 1-10 х 106 ячеек от губок ПВА, в зависимости от времени извлечения губки. Большинство клеток, изолированных от ран пВА губки являются жизнеспособными(Рисунок 2D). Однако, поскольку мертвые клетки могут составлять до 20% изолированных раневых клеток после механических нарушений, настоятельно рекомендуется использовать пятно жизнеспособности при продолжении анализа цитометрии на основе потока. Клетки, изолированные от ран pVA губки в первую очередь гематопогетического происхождения, как это определено CD45 положительность(Рисунок 2D). Быстрое накопление нейтрофилов с последующим моноцитами и макрофагами согласуется с острыми стадиями восстановления ран3,,4,,34,,35,,36,37,38. Изолированные клетки подходят для анализа ниже по течению, включая иммунофенотипирование, сортировку клеток, культивирование, экстракцию РНК и различные функциональные анализы.

Модель РАНы губки PVA также позволяет для изоляции жидкостей, которая идеально подходит для оценки цитокинов и реакции фактора роста в острой ране в среде. PVA губки жидкости подходят для тестирования ELISA, бисины основе мультиплекс иммуноанализа, и белка количественно, среди других. Предыдущие исследования показали, с помощью цитокинов и измерения фактора роста, что ранняя среда раны является воспалительным по своему характеру, с быстрой индукцией IL-6, TNF-я, и IL-1 'с 1-3 дней. Раны окружающей среды затем переходит в репаративное состояние с более поздней индукции про-ангиогенных и профиброзных факторов роста, в том числе VEGF и TGF-2222,23,25,26,30.

В то время как модель имплантации губки PVA выгодна для изучения острой раневой клеточной и цитокиновой реакции, одним из ее ограничений является неспособность измерить скорость или степень заживления. Измерение этого аспекта заживления ран может потребоваться при оценке последствий сопутствующих состояний на различные аспекты реакции заживления раны 30. Для этой метрики предпочтительнее методы, основанные на биопсии. Здесь представлена модель иссечения хвостовой кожи. В этой модели, полный раздел толщины хвостовой кожи иссечен из торцевой поверхности хвоста. Опять же, поддержание стерильного хирургического поля важно, чтобы избежать прививки раны. Использование спрей барьерной пленки или другого раневого покрытия также рекомендуется, чтобы избежать поздней раневой инфекции. Более старые мышей мышей или завоевательных напряжения требуют сольный корпус для того чтобы во избежание нарушение раны. Особое преимущество хвоста в качестве места для изучения заживления ран является то, что он больше полагается на реэпилиализации для закрытия, как описано другими27,32,33. В дополнение к измерению области раны и выполнения гистологических анализов, другие сообщили о его использовании в оценке эффективности актуальных мероприятий в модуляции процессов заживления33.

Каждая из моделей ран, описанных в этих методах, предлагает явные преимущества для понимания процессов восстановления ран в стабильном состоянии и при наличии сопутствующих состояний. Из-за широкого наличия генетически измененных штаммов инбредных мышей, это также можно манипулировать раны исцеления ответы ответить на механистические вопросы о процессе. Кроме того, эти системы могут быть реализованы в murine модели условий, связанных с плохим заживление ран, включая диабет, старение, вторичная инфекция, и другие30,36,39,40. Механистические идеи, полученные из мурин исследований может служить основой для изучения заживления ран в высших моделей животных порядка. Вместе, PVA губки имплантации и иссецисционные модели раны хвостовой кожи обеспечивают tractable и универсальные системы для выяснения процессов заживления ран при стабильном состоянии и патологических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Кевина Карлсона из Брауновского университета потока цитометрии и сортировки фонда для консультаций и помощи с потоком цитометрии экспериментов. Изображения на рисунке 1B и C были созданы с помощью BioRender. Кайла Ли и Грегори Серпа поблагодарили за их фотографической помощи. Эта работа была поддержана гранты от следующих: Оборона Расширенные исследовательские проекты агентства (DARPA) YFAA15 D15AP00100, декан области новых новых наук премии (Браун университета), Национальный институт сердца легких и крови (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Национальный институт экологических наук (NIES) T32-ES7272 (обучение в области экологической патологии), и Браун университета научно-исследовательских семян премии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 157 рана модель заживления ран фиброз хирургия травма мышь воспаление врожденный иммунный ответ
Оценка острого исцеления ран с использованием dorsal подкожный поливинил алкоголь Губка Имплантация и иссционные хвост овешки раны модели.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, … More

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter