Summary
Her præsenterer vi et værktøj, der kan bruges til at studere den posttransskriptionelle graduering af en udskrift i primære alveolær epitelceller ved hjælp af et uiukbelt ekspressionssystem koblet til en pipetteelektroporationsteknik.
Abstract
At studere posttransskriptionel regulering er afgørende for at forstå gradueringen af en given messenger RNA (mRNA) og dens indvirkning på cellehomøostase og stofskifte. Faktisk kan udsving i udskriftsudtryk ændre oversættelseseffektiviteten og i sidste ende den cellulære aktivitet af en udskrift. Flere eksperimentelle tilgange er blevet udviklet for at undersøge halveringstiden af mRNA selv om nogle af disse metoder har begrænsninger, der forhindrer en korrekt undersøgelse af posttransskriptionel graduering. Et promotorinduktionssystem kan udtrykke et gen af interesse under kontrol af en syntetisk tetracyklinreguleret promotor. Denne metode gør det muligt at foretage halveringstiden for et givet mRNA under enhver eksperimentel tilstand uden at forstyrre cellehomøostase. En væsentlig ulempe ved denne metode er nødvendigheden af at transfect celler, som begrænser brugen af denne teknik i isolerede primære celler, der er meget resistente over for konventionelle transfektionsteknikker. Alveolær epitelceller i primærkulturen er blevet brugt i udstrakt grad til at studere den cellulære og molekylære biologi i alveolær epitel. De unikke egenskaber og fænotype af primære alveolær celler gør det vigtigt at studere de posttransskriptionelle modulationer af gener af interesse i disse celler. Derfor var vores mål at udvikle et nyt værktøj til at undersøge de posttranstransonielle modulationer af mRNAs af interesse i alveolære epitelceller i primærkulturen. Vi designede en hurtig og effektiv forbigående transfection protokol til at indsætte en transskriptionsstyret plasmid udtryk ssystem i primære alveolær epitelceller. Denne kloning strategi, ved hjælp af en viral epitop til at mærke konstruktionen, giver mulighed for let diskrimination af konstruere udtryk fra endogene mRNAs. Ved hjælp af en modificeret ΔΔ-kvantificeringscyklus (Cq) kan udskriftens udtryk kvantificeres med forskellige tidsintervaller for at måle dens halveringstid. Vores data viser effektiviteten af denne nye tilgang til at studere posttransskriptionel regulering i forskellige patofysiologiske tilstande i primære alveolær epitelceller.
Introduction
Flere teknikker er blevet udviklet til at bestemme halveringstiden af mRNAs. Den puls-chase henfald teknik, som udnytter mærket mRNAs, giver mulighed for samtidig evaluering af en stor pulje af mRNAs med minimal cellulære forstyrrelser. Denne fremgangsmåde giver imidlertid ikke mulighed for en direkte vurdering af halveringstiden for en enkelt genudskrift og kan ikke gennemføres for at undersøge den posttransskriptionelle graduering af et mRNA efter stimulation med vækstfaktorer, ROS, alarminer eller inflammation1.
Brugen af transskriptionshæmmere, såsom actinomycin D og α-amanitin, er en forholdsvis enkel metode til måling af mRNA nedbrydningskinetik over tid. En væsentlig fordel ved denne tilgang i forhold til tidligere teknikker(dvs. puls-chase) er afhængig af evnen til direkte at vurdere halveringstiden for en given udskrift og sammenligne, hvordan forskellige behandlinger kan påvirke dens nedbrydning kinetik. Den betydelige skadelige virkning af transskriptionshæmmere på cellefysiologien udgør imidlertid en væsentlig ulempe ved metoden2. Faktisk har hæmningen af hele celletranstranskomet med disse lægemidler den negative bivirkning, der forstyrrer syntesen af nøgleelementer, der er involveret i mRNA-stabilitet, såsom microRNAs (miRNAs), samt ekspressionen og syntesen af RNA-bindende proteiner, som er vigtige for mRNA-nedbrydning og stabilitet. Den alvorlige forstyrrelser af gentransskription af disse stoffer kan derfor kunstrent faktisk ændre nedbrydningskurverne af udskrifter.
Promotorinduktionssystemet repræsenterer en tredje tilgang til måling af halveringstiden for et bestemt mRNA. Denne metode måler nedbrydningen af et bestemt mRNA på samme måde som metoder, der anvender transskriptionshæmmere. Der anvendes hyppigt to typer induktionssystemer: den seruminducerede c-fos promotor3 og Tet-Off-det inducerede system4. Med c-fos-systemet er det ikke nødvendigt at anvende transskriptionshæmmere, der kan være giftige for cellen. Denne metode kræver dog synkronisering af cellecyklus, hvilket forhindrer evaluering af den faktiske stabilitet af en udskrift under mellemfase5. I modsætning hertil giver Tet-Off-systemet mulighed for et stærkt udtryk for det interessegen, der kontrolleres af en syntetisk tetracyklinreguleret promotor. Dette system kræver tilstedeværelsen af to elementer, der skal cotransfected i cellen for at være funktionel. Den første plasmid (pTet-Off) udtrykker det lovgivningsmæssige protein tTA-Adv, en hybrid syntetisk transskriptionsfaktor bestående af prokaryote repressor TetR (fra Escherichia coli) smeltet til tre transaktiveringsdomæner fra det virale protein HSV VP16. Den indiske regering klones ind i pTRE-Tight plasmid under kontrol af en syntetisk promotor (PTight),bestående af den minimale sekvens af cytomegalovirus (CMV) promotor smeltet til syv gentagelser af tetO operatør sekvens. Transskriptionen af genet nedstrøms for PTight afhænger af samspillet mellem TetR og tetO. Ved tilstedeværelse af tetracyclin eller dets derivat, doxycyclin, tetr repressor mister sin affinitet for tetO operatør, hvilket fører til et ophør af transskription4. Tet-Off-systemets karakteristika gør det til en ideel model til undersøgelse af specifikke mRNA-udtryk i eukaryote celler, samtidig med at potentielle pleiotropiske virkninger, der er sekundære i forhold til fraværet af prokaryotiske regulatoriske sekvenser i eukaryote celle6, undgås. Normalt anvendes dobbelt stabile Tet-Off-cellelinjer (HEK 293, HeLa og PC12) med dette system til at integrere kopier af regulatoren og responsplasmider for nem adgang til kontrollerbar genekspression7,8,9.
Flere modeller af alveolær epitelceller i kulturen er blevet brugt til at studere den cellulære og molekylære biologi alveolær epitel. I årevis har forskere i udstrakt grad udnyttet menneskelige eller gnavere primære celler10,11 samt udødeliggjortcellelinjer såsom menneskelige A549 eller rotte RLE-6TN celler12,13. Selv om de generelt er mindre spredning og vanskeligere at kultur og transfect, alveolær epitelceller i primærkultur forbliver guld standard for studiet af funktion og dysfunktion af alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold. Faktisk udødeliggjortcellelinjer såsom A549 celler ikke udviser de komplekse egenskaber og fænotyper af primære celler, mens alveolær epitelceller i primærkultur opsummere de vigtigste egenskaber af alveolær epitel, især evnen til at danne en polariseret og stram barriere14,15. Desværre, disse celler er meget resistente over for konventionelle transfektion steknikker, såsom dem, der udnytter liposomer, gør brugen af en promotor-induceret system såsom Tet-Off meget vanskeligt.
Den posttransskriptionelle graduering af mRNAs er en af de mest effektive metoder til hurtigt at modulere genekspressionen af en udskrift16. MRNA 3' uoversat region (3' UTR) spiller en vigtig rolle i denne mekanisme. Det er blevet påvist, at der i modsætning til 5' UTR er en eksponentiel sammenhæng mellem længden af 3' UTR og en organismes cellulære og morfologiske kompleksitet. Denne sammenhæng tyder på, at 3 'UTR, ligesom mRNA kodning regioner, har været udsat for naturlig udvælgelse for at give mulighed for stadig mere komplekse posttransskriptionelle graduering i hele evolution17. De 3 'UTR indeholder flere bindende steder for proteiner og miRNAs, der påvirker stabiliteten og oversættelsen af udskriften.
I dette arbejde udviklede vi et værktøj til at undersøge den rolle, som højt bevarede domæner i 3 'UTR af en indiske regering til kontrol af udskrift stabilitet. Vi fokuserede på epitelnatriumkanalen, alfaunderenheden (αENaC), som spiller en central rolle i alveolær epitelfysiologi18. Alveolær epitelceller i primærkulturen blev med succes transiently transfected med de to komponenter i Tet-Off-systemet, som giver mulighed for undersøgelse af den rolle, som 3' UTR i mRNA stabilitet med et system, der minimalt påvirker celle fysiologi og stofskifte i forhold til brugen af transskriptionshæmmere med andre protokoller. Der blev udviklet en kloningsstrategi for at skelne fra den indiske borgers udtryk fra det endogene gen ved hjælp af en ikke-endogent udtrykt epitop (V5). Responsen og regulerende plasmider blev derefter overført til alveolær epitelceller ved hjælp af en pipetteelektroporationsteknik. Efterfølgende blev udskriftenmålt ved at inkubere cellerne med doxycyklin med forskellige tidsintervaller. Udskriftens halveringstid blev evalueret af RT-qPCR med en modificeret Cq-metode ved hjælp af det transfected tTA-Ad mRNA-produkt til normalisering. Gennem vores protokol tilbyder vi en bekvem måde til at studere den posttranstransonelle graduering af en udskrift under forskellige forhold og definere inddragelsen af de uoversatte regioner mere detaljeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra canadian Council on Animal Care og blev godkendt af Institutional Animal Care Committee of the Research Center of Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Design og generering af respons plasmid udtrykke genet af interesse (INI)
- Brug en uanvendelig tetracyklin-off vektor, såsom pTRE-Tight.
- Analysér sekvensen af den indiske regering og vektorens mcs (multiple kloningssted) for at identificere de begrænsningssteder i MCS,der ikke findes internt i den indiske regering.
- Isoler primære alveolær epitelceller fra mandlige Sprague-Dawley rottelunger som beskrevet tidligere19,20.
- Rens det samlede RNA fra de alveolær epitelceller ved RNA-ekstraktion ved hjælp af en standardmetode, såsom fenol/chloroformekstraktion eller anvendelse af silicabaserede RNA-spinkolonner.
- Omvendt transskriberet mRNA i komplementær DNA (cDNA) ved hjælp af oligo (dT) og high-fidelity omvendt transkriptase.
- Brug hi-fi Taq polymerase og standard overlap PCR teknikker til at flankere den indiske regering med to udvalgte begrænsning enzym anerkendelse steder ved hjælp af designede primere.
- Har den forreste primer indeholder en Kozak konsensus ribosom bindende site21 at forbedre ekspressionsniveauer at studere protein udtryk parallelt med mRNA stabilitet. Der skal medtages en sekvens, der koder for den indiske indholdsfortegnelse ser ud til at være foretog en sekvens, der koder for den indiske regerings V5-epitop for at skelne mellem den transfected indiske regering og endogene udtryk (tabel 1).
- Har den omvendte primer indeholder en polyadenylation signal efter stop codon.
- Mutanter kan genereres ved sekventiel sletning for at undersøge virkningerne af forskellige 3' UTR-regioner på stabiliteten af den indiske regerings mRNA ved hjælp af omvendte primere, der koder et polyadenylationssted, der gradvist sletter 3' enden af den indiske regering 3' UTR (figur 6). Alternativt kan PCR-rettet mutagenese anvendes til at målrette mod en bestemt interesseregion i 3' UTR22.
- Den uibilible vektor og indsatsen sammenmed de tidligere valgte restriktionsenzymer fordøjes ved den relevante inkubationstemperatur i 1 time efterfulgt af behandling med fosfatase under vektorreaktionen i 30 minutter for at undgå selvligation.
- Adskil den fordøjede vektor og skær segmenter ved elektroforese i en 1-1,5% agarose gel (koncentration afhængigt af størrelsen af indsatsen).
- Ved hjælp af en klinge og et UV-lys opsamles dna-fragmenterne, der indeholder det ønskede skær og den vektor, der skal ligegøres.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - Rens de indsamlede segmenter fra agarosegelen ved hjælp af et silicabaseret PCR-rensningssæt, og mål koncentrationen ved spektrofotometri ved 260 nm.
- Ligate den indiske regering og den uibilible vektor med T4 DNA ligase ved hjælp af en vektor:indsæt molære forhold på 1:3 for at øge sandsynligheden for ligation. Reaktionen inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 3 timer.
- Ligationreaktionen omsættes til kompetent E. coli (DH5α).
- Der tilsættes 1-10 ng vektor og gen til et rør, der indeholder 100 μL kompetente celler. Cellerne inkuberes på is i 30 min. og varmechokcellerne derefter ved 42 °C i 45 s. Anbring røret på is i 2 min. og tilsæt 900 μL RT LB-medium. Cellerne inkuberes i 1 time ved 37 °C ved omrystning ved 225 omdrejninger i minuttet.
- Spred 100 μL af reaktionen på en LB agarplade med et egnet antibiotikum (f.eks. 100 μg/ml ampicillin til pTRE-tight vektor) for at vælge de transformerede bakterier. Pladen inkuberes natten over ved 37 °C.
- Individuelle kolonier udvælges ved hjælp af en inokuleringssssløjfe eller en 20 μL spids og inkuberer natten over i et 5 ml LB-medium, der indeholder det egnede antibiotikum ved 37 °C ved omrystning. De transformerede bakterier kan opbevares i glycerol lagre på -80 °C i et forhold på 400:600 af LB medium til glycerol.
- Plasmid-DNA'et udvindes ved hjælp af silicabaserede plasmidsøjler, og koncentrationen måles ved spektrofotometri ved 260 nm. Bekræft indsættelsen af den indiske regering ved begrænsningsanalyse og dens orientering og fraværet af mutationer, der potentielt kan indføres under RT-PCR ved sekvensering.
2. Transfection af respons plasmid udtrykke genet af interesse (GOI) i primære alveolær epitelceller
- Isoler type II alveolær epitelceller fra rottelunger.
- Cellerne frøs med en massefylde på 1 x 106 celler/cm2 i 100 mm Petriskåle med et fuldstændigt minimum vigtigt medium (komplet MEM). Komplet MEM er MEM suppleret med 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycin, Septra (3 μg/mL trimethoprim og 17 μg/mL sulfamethoxazol), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) og 2 mM L-glutamin. Cellerne dyrkes i 24 timer ved 37 °C i 5% CO2 i en befugtet inkubator.
- Den næste dag anbringes 500 μL komplet MEM uden antibiotikum i hver brønd af en ny 12 brøndplade, og pladen forvarmes ved 37 °C i 30 min. I dette trin er det vigtigt at bruge føtal kvægserum fri for forurenende tetracykliner eller med et niveau for lavt til at forstyrre inducbilitet.
- Der fremstilles 1,5 ml rør, der indeholder plasmid, med den inducible inducible goi (GOI plasmid) og reguleringsvektoren (f.eks. pTet-Off) ved at tilsætte 1 μg ingo plasmid og 1 μg regulerende vektor pr. brønd ved RT. Til sideekspressionsforsøg med RNA-bindende proteiner (RBP) tilsættes 1 μg af en konstituerende vektor (f.eks. pcDNA3), der udtrykker den rpb af interesse, til DNA-blandingen (figur 7).
- Sug mediet og skyl forsigtigt cellerne med PBS (uden calcium og magnesium) forvarmet ved 37 °C.
- Der tilsættes 5 ml 0,05% trypsin forvarmet ved 37 °C og inkubercellerne, indtil cellerne er løsrevet (2-4 min). Neutralisere trypsin ved at tilføje 10 ml komplet MEM uden antibiotika.
- Cellesuspensionen opsamles i et 50 ml rør, petriskålen vaskes med 4 ml medium for at samle så mange resterende celler som muligt, og centrifuger derefter cellesuspensionen ved 300 x g i 5 min.
- Sug forsigtigt og kassér supernatanten og resuspenderer pelleti 1 ml PBS. Tæl og beregn antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Overmank blidt supernatanten og resuspender pelleten i resuspensionsbufferen i en koncentration på 4 x 107 celler/ml. Cellerne fra 1,5 ml røret fremstillet i trin 2.4 til en koncentration på 400.000 celler pr. brønd og bland dem forsigtigt ved at pipettere op og ned.
- Anbring røret i elektroporationsanordningen og fyld det med 3,5 ml elektrolytisk buffer.
- Sæt en forgyldt elektrodespids i en pipette ved helt at trykke på stemplet. Bland forsigtigt indholdet af 1,5 ml røret og sug forsigtigt cellerne med pipetten. Vær omhyggelig med at forhindre luftbobler i at trænge ind i spidsen, da dette vil forårsage elektrisk lysbuedannelse under elektroporation og føre til nedsat transfektionseffektivitet.
- Sæt pipetten i elektroporationsstationen, indtil der er en klikkende lyd.
- Vælg den relevante elektroporationsprotokol for alveolær epitelceller, svarende til en pulsspænding på 1.450 V og 2 impulser med en bredde på 20 ms, og tryk på Start på berøringsskærmen.
- Umiddelbart efter transfection fjernes pipetten og cellerne overføres til et godt tidligere fyldt med komplet MEM uden antibiotikum, der er blevet forvarmet til 37 °C.
- 12.11-2.14 gentages for de resterende prøver.
- Ryst forsigtigt pladen for at fordele cellerne jævnt over brøndoverfladen. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 5% CO2 i en befugtet inkubator. Efter 2 dage, erstatte mediet med komplet MEM med antibiotika.
- Bekræfte, at transfektionen er vellykket, ved at observere ekspressionen af eGFP under et fluorescensmikroskop eller ved flowcytometri ved hjælp af en kontrolvektor (figur 1).
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit og kræver et ekstra transfektionstrin ved hjælp af en anden plasmid, der udtrykker eGFP, f.eks.
3. Induktion af transskriptionshæmningen af den indiske regering
BEMÆRK: Cellerne kan forbehandles med de ønskede behandlinger før induktion af doxycyklin for at vurdere deres indvirkning på mRNA-stabilitet (figur 5).
- Der fremstilles en doxycyklinbestandopløsning på 1 mg/ml i deioniseret vand. Stamopløsningen opbevares ved -20 °C beskyttet mod lys. Doxycyclin, et tetracyclinderivat, anvendes i stedet for tetracyclin, fordi det har en længere halveringstid (2x) end tetracyclin. Desuden kræves der en lavere koncentration af doxycyklin til fuldstændig inaktivering af tet operon23.
BEMÆRK: Doxycycline kan påvirke mRNA-ekspressionen af den endogene goi. For at verificere dette skal virkningen af en 24 timers behandling med doxycyklin på alveolærceller testes for at bekræfte, at der ikke sker ændringer i den indiske regering (figur 2). - Der fremstilles en frisk 1 μg/ml doxycyklinopløsning i komplet MEM 72 h eftertransfection, og den opvarmes til 37 °C.
- Mediet udskiftes med 1 ml komplet MEM indeholdende 1 μg/ml doxycycline pr. brønd for at hæmme transskriptionen af den indiske regering.
- Inkuber flere brønde ved 37 °C i 5% CO2 i forskellige mængder af tid fra 15 min-6 h for at vurdere mRNA's halveringstid.
- Ved afslutningen af behandlingen vaskes cellerne med iskold PBS og lyse dem med et kommercielt tilgængeligt fenol-chloroform RNA ekstraktionssæt ved at tilføje 500 μL buffer pr. brønd og ryste pladen for at homogenisere cellerne.
- Isoler RNA i henhold til producentens protokol. RNA-udbyttet og renheden bestemmes ved spektrofotometri ved 230, 260 og 280 nm. RNA-prøver med 260:230 og 260:280-forhold på henholdsvis 1,8 og 2,0 betragtes som rene.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
4. Bestemmelse af mRNA-stabiliteten i den indiske regering
- Behandl 1 μg total RNA med RNAse-fri DNAse I (forstærkningsgrad) for at fjerne ethvert spor af plasmid-DNA, der kan forstyrre efterfølgende DNA-forstærkning.
- I et 0,2 ml PCR-rør kombineres 1 μg total RNA, 1 μL 10x DNase I-reaktionsbuffer, 1 μL DNAse I (1 U/μL) og RNAse-frit vand for at opnå et samlet volumen på 10 μL.
- Reaktionen ved RT inkuberes i 20 min.
- Deaktiver DNAse I ved tilsætning af 1 μL på 25 mM EDTA til 10 μL-reaktionsblandingen og inkubering af reaktionen ved 70 °C i 10 min.
- Reverse-transskriberet DNA-forarmet total RNA i cDNA ved hjælp af en kommercielt tilgængelig cDNA syntese kit med en blanding af oligo (dT) og tilfældige hexamer primere til at forbedre den omvendte transskription effektivitet.
- Kort efter tilsættes 4 μL 5x-reaktionsblanding, 1 μL omvendt transkriptase og 4 μL RNAse-frit vand til 11 μL af den dna-forarmet samlede RNA-blanding for at opnå et samlet reaktionsvolumen på 20 μL. Bland reaktionen godt ved at pipettere den op og ned.
- Reaktionen inkuberes i 5 min ved 25 °C efterfulgt af 20 min ved 46 °C, og reaktionen inaktiveres derefter ved 95 °C i 1 min. Hver reaktion vil give 50 ng/μL cDNA-produkt.
- CDNA-reaktionen fortyndes til en koncentration på 5 ng/μL ved at tilsætte 180 μL molekylærbiologisk vand til 20 μL-reaktionsblandingen. CDNA-produkterne opbevares ved -80 °C, eller fortsæt straks med at udføre kvantitativ PCR (qPCR) i realtid.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
- Design fremad og omvendt qPCR primere, der er specifikke for den indiske regering.
- På grund af den enogene ekspression af den indiske regering i cellerne skal primerne være konstrueret til at forstærke en 100-150 bp amplicon af V5-epitopen koblet til denindiskeregering ( tabel 1 ).
- Interne referencegenprimere skal også anvendes som normaliseringskontrol. Normalt bruges rengøringsgener, såsom beta-actin og hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1 gener, som referencegener. Disse kan dog ikke anvendes sammen med dette induktionssystem på grund af variationen i transfektionseffektiviteten. I stedet vurderes udtrykket af tTA-Ad udskrift med henblik på normalisering, fordi dens udtryk er konstituerende i celler på grund af aktiviteten af cytomegalovirus promotor. Enhver variation i udtrykket målt ved qPCR vil være repræsentativ for transfektionseffektiviteten (primere: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' og omvendt 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) og vil gøre det muligt at normalisere udtrykket af de transfected kloner (figur 3).
- Forbered hver qPCR reaktion i tre eksemplarer ved hjælp af en SYBR Green farvestof master mix.
- 5 ng/μL cDNA-blandingen fortyndes til en koncentration på 1,25 ng/μL ved hjælp af molekylærbiologisk vand.
- Kombiner 5 μL SYBR Green dye master mix (2x), 0,1 μL molekylærbiologi-grade vand, 0,45 μL af 7,5 μM fremprimer, 0,45 μL af 7,5 μM omvendt primer, og 4 μL af 1,25 ng/μL cDNA for at opnå et samlet reaktionsvolumen på 10 μL. Bland godt ved pipettering op og ned i en 96 brønd PCR plade. Brug optisk klæbefilm for at sikre, at pladedækslet er forseglet, og for at forhindre kontaminering og fordampning.
- Drej kort ned i reaktionsblandingen ved centrifugering, og placer pladen i en qPCR-termocycler.
- Forstærke v5-mærkede goi- og tTA-ad-amplicons ved hjælp af følgende qPCR-betingelser: 95 °C i 10 minutter som denatureringstrin efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C for 10 s, 58 °C for 15 s og 72 °C for 20 s. Der skal dannes en smeltekurve med høj opløsning, efter at forstærkningscyklusserne er udført for at vurdere de ønskede ampelicons specifikke smeltetemperaturer og for at sikre, at der ikke er støjamplicontoppe.
- Medtag negative kontroller for qRT-PCR ved at udføre qPCR med RNA som skabelon uden omvendt transkriptase for at fungere som en kontrol for potentiel plasmid DNA-forurening og qPCR uden cDNA tilføjet til qPCR mix for at sikre manglen på primer dimers eller Forurenende stoffer.
- Den optimale cDNA-koncentration, primereffektivitet og koncentration skal optimeres i henhold til den indiske regering ved hjælp af en standardkurveanalyse. For at gøre dette, udføre en seriel fortynding ved hjælp af cDNA fra ubehandlede celler (dyrket uden doxycyklin). Standardkurven genereres ved at afbilde Cq-værdierne i forhold til stammen af cDNA-fortyndingsfaktoren, og forstærkningseffektiviteten (E) beregnes i henhold til standardkurvens hældning ved hjælp af følgende formel:
E = 10-1/hældning
BEMÆRK: Forstærkningseffektiviteten skal være ca. 0,9 til 1,05. Ellers skal primerne redesignes.
- Analysér qPCR-dataene ved hjælp af den sammenlignende Cq-metode ved at normalisere den indiske dimensions udtryksværdier til udtryk for tTA-Ad for at opnå den indiske dimensions udtryksniveauer og for at rapportere udtrykket som en procentdel af den indiske dimensions udtryk i celler fra det samme dyr ved udgangspunktet (t = 0) (Figur 4).
- Halveringstiden bestemmes ud fra hastighedskonstanten (K) for den koreanske mRNA-nedbrydningskurve ved hjælp af følgende ligning:
t1/2 = ln 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol blev med succes brugt til at generere et Tet-Off transskriptionsstyret plasmidekspressionssystem til at vurdere betydningen af forskellige dele af αENaC 3' UTR i moduleringen af transskriptionsstabilitet i primære alveolær epitelceller.
Det første skridt i gennemførelsen af dette system var at etablere en hurtig, nem og effektiv transfektionsteknik for alveolær epitelceller i primærkulturen, som er vanskelige at transfect. Som vist i figur 1tillod pipetteelektroporationsteknikken en 25-30% transfektionseffektivitetshastighed, som det fremgår af forholdet mellem eGFP-celler detekteret ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri.
Før anvendelsen af denne induktion system, som er kontrolleret af tetracyclin og dets derivater, virkningen af dette stof på udtrykket af vores indiske regering blev verificeret. Alveolær epitelcellerne blev behandlet med 1,0 μg/ml doxycyklin for at vurdere virkningen på endogent αENaC mRNA-udtryk. Behandlinger udført over en periode på 1-24 timer havde ingen væsentlig indvirkning på ekspressionen af den endogene udskrift, som vist i figur 2.
Vores transskriptionsstyrede plasmid ekspressionssystem bruger en qPCR normaliseringsteknik, der adskiller sig fra den standardteknik, der bruger rengøringsgener. I tilfælde af udtryk for V5-αENaC blev signalet normaliseret i henhold til tTA-Adv-signalet for at bestemme effektiviteten af transfektion ved hjælp af Cq-metoden. Figur 3 viser brugen af tTA-Adv udskrift til at normalisere mRNA udtryk.
Tidligere offentliggjorte resultater tyder på, at brugen af actinomycin D er uhensigtsmæssig til estimering af αENaC udskrift stabilitet, da det indikerede en unormalt høj mRNA halveringstid (ca. 12 h)24. Halveringstiden for αENaC mRNA ved tilstedeværelse af Tet-Off-systemet (99 min) var op til 7 x kortere end den, der blev fundet ved tilstedeværelse af actinomycin D, som vist i figur 4. Dette bekræfter, at actinomycin D fører til en artifaktuel αENaC mRNA stabilisering.
Dette Tet-Off-system blev også anvendt med succes til at teste, om forskellige cellestressorer, der vides at påvirke αENaC-genekspression, kunne modulere αENaC mRNA-stabilitet. Som vist i figur 5, cycloheximidbehandling betydeligt nedsat stabilitet (36 min) af udskriften, mens lipopolysaccharider (LPS, bruges til at efterligne en smitsom stimuli) ikke. Endelig forårsagede den proinflammatoriske cytokin TNF-α et drastisk fald i V5-αENaC mRNA-stabilitet (med en halveringstid på 16 min).
I dette arbejde havde kloningsstrategien til formål at belyse 3' UTR's bidrag til gradueringen af αENaC-udskriften. Flere sekventielle sletning mutanter blev genereret og testet for at kortlægge bidraget fra forskellige domæner af αENaC 3 'UTR til udskrift stabilitet. Figur 6 viser de betydelige ændringer i gradueringen af stabiliteten af V5-αENaC mRNA afhængigt af de slettede og inkluderede regioner i 3' UTR.
Endelig blev gradueringen af stabiliteten af αENaC mRNA ved RNA-bindende proteiner (RBP) undersøgt med denne model. Transskriptionen af αENaC mRNA med V5-epitop fra pTRE-tight vektoren er eksklusivt under kontrol af tTA-Adv. Dhx36, Tial1 og hnRNPK er tre RPM'er, der er forbundet med 3' UTR af αENaC24. Derfor vil enhver graduering af udtrykket v5-αENaC efter samtransfection med Dhx36, Tial1 eller hnRNPK være en konsekvens af gradueringen af mRNA-stabiliteten og ikke af transskriptionsmodulation. Figur 7 viser, at overekspressionen af Dhx36 eller Tial1 i modsætning til hnRNPK's reducerede stabiliteten af V5-αENaC mRNA sammenlignet med transfektion med den tomme pcDNA3 plasmid, hvilket viser den specifikke graduering af visse RPS.
Kollektivt bekræftede disse resultater, at det Tet-Off transskriptionsstyrede plasmidekspressionssystem, som vi udviklede, udgør et passende redskab til evaluering af den faktiske halveringstid for en udskrift og de mekanismer, der er involveret i dens graduering. Dette værktøj vil være nyttigt i at erhverve nye indsigter i posttransskriptionel regulering af centrale indiske involveret i funktionen af alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold.
Figur 1: Effektiviteten af transfektion af alveolær epitelceller i primærkultur ved pipetteelektroporation. Primære alveolær epitelceller blev transiently transfemeret med 2 μg af en pcDNA3 plasmid (tom, kloner #1 og #2), der udtrykte eller ikke udtrykker GFP-protein. Transfection effektivitet blev vurderet 48 h efter transfection ved (A) fluorescens mikroskopi eller (B) flow cytometri. Envejs ANOVA og Bonferroni post hoc-test; *p < 0,001 vs. tom. Celler fra mindst fire forskellige rotter (n ≥ 4) blev anvendt til hver forsøgstilstand. Skalabar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Graduering af endogen αENaC mRNA ved doxycyklin i alveolær epitelceller. Alveolær epitelceller blev behandlet med 1,0 μg/ml doxycycline i en periode på 1-24 timer. Udtrykket af αENaC mRNA blev kvantificeret ved kvantitativ RT-PCR og præsenteret som udtryk for αENaC mRNA ± SEM sammenlignet med i ubehandlede celler (Ctrl; t = 0) efter normalisering i henhold til β-actin udtryk (envejs ANOVA, n = 4). Doxycycline modulerede ikke endogenαENaC mRNA over tid. Tidligere udgivet som figur S4 i Migneault et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Normalisering af GOI mRNA-udtryk med en modificeret Cq-metode i overensstemmelse med udtrykket af det regulerende mRNA tTA-Ad. Alveolære epitelceller blev forbigående cotransfected med pTet-Off plasmid og pTRE-Tight plasmid-kodning αENaC cDNA med en V5 epitop opstrøms for sin åbne læseramme og en komplet 3' UTR sekvens. Udtrykket af V5-αENaC og tTA-Ad mRNA blev målt ved kvantitativ RT-PCR i ubehandlede celler. (A) De deltanormaliserede SYBR Green fluorescerende signaler (ΔRn) af V5-αENaC og tTA-Ad fra to separate transfections (R1 og R2) er afbildet. (B) Venstre graf: mRNA-udtryk for V5-αENaC og tTA-Ad i hvert forsøg (R1 og R2) udtrykkes som cykluskvantificeringsværdien (Cq). Forskellen mellem V5-αENaC og tTA-Ad mRNA-udtryk (ΔCq) præsenteres. Højre graf: Brug af tTA-Ad mRNA i stedet for husholdninggen giver mulighed for en effektiv normalisering af ekspressionen af den indiske regering, som viste et relativt udtryk på 0,98 i R1 sammenlignet med i R2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Nedbrydningskinetik af V5-αENaC mRNA ved brug af transskriptionsstyret plasmidekspressionssystem ved tilstedeværelse og fravær af actinomycin D. Primære alveolær epitelceller blev forbigående cotransfected med pTet-Off plasmid og pTRE-tight plasmid-kodning αENaC cDNA med en V5 epitop opstrøms for sin åbne læseramme og komplette 3' UTR-sekvenser. Celler, der er forbehandlet eller ubehandlet med actinomycin D (5,0 μg/ml) i 30 minutter, blev derefter inkuberet med doxycycin (1,0 μg/ml) i 15 min-6 timer. Udtrykket af V5-αENaC mRNA blev målt ved kvantitativ RT-PCR og præsenteret som procentdelen ± SEM af V5-αENaC mRNA-udtryk i ubehandlede celler (t = 0) efter normalisering i henhold til udtrykket tTA-Ad. V5-αENaC mRNA's halveringstid blev estimeret ved enfaset henfald ikke-lineær regression for hvert cellepræparat. Multipel regressionsanalyse afslørede en statistisk signifikant forskel i V5-αENaC mRNA-stabilitet i celler behandlet med actinomycin D sammenlignet med i ubehandlede celler (p < 0,0001). Celler fra mindst fire forskellige rotter (n ≥ 4) blev anvendt til hver forsøgstilstand. Tidligere udgivet som figur 1 i Migneault et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Graduering af V5-αENaC mRNA-stabilitet ved forskellige cellulære og inflammatoriske belastninger. Primære alveolær epitelceller blev forbigående cotransfected med pTet-Off plasmid og pTRE-tight plasmid-kodning αENaC cDNA med en V5 epitop opstrøms for sin åbne læseramme og komplette 3' UTR-sekvenser. Cellerne blev forbehandlet i 30 minutter med 1,0 μM cycloheximid (CHX) (A) eller 15 μg/ml LPS (B) eller i 5 timer med 100 ng/mL TNF-α (C), efterfulgt af behandling med 1,0 μg/ml doxycyklin i en periode på 15-120 min. Udtrykket af V5-αENaC mRNA blev målt ved kvantitativ RT-PCR og præsenteret som procentdelen ± SEM af V5-αENaC mRNA-udtryk i ubehandlede celler (t = 0) efter normalisering i henhold til udtrykket tTA-Ad. Celler fra mindst tre forskellige rotter (n ≥ 3) blev anvendt til hver forsøgstilstand. (D) Halveringstiden (t1/2) af V5-αENaC mRNA i behandlede celler blev sammenlignet med halveringstiden for mRNA i celler (Ctrl). Halveringstiden blev målt i henhold til hastighedskonstanten (K) for V5-αENaC mRNA-nedbrydningskurven ved hjælp af ligningen t1/2 = Ln 2/K og derefter udtrykt som min ± SEM (envejs ANOVA-test og Bonferroni post hoc-test; *p < 0,01 vs. kontrol; n ≥ 3). Tilpasset fra figur 36 tidligere offentliggjort i Migneault, F.25. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Anvendelse af den sekventielle udeladelseskloningsstrategi til at afsløre de forskellige regioners rolle i αENaC 3' UTR i gradueringen af mRNA-stabilitet. (A) Skematisk kort over V5-αENaC udskrift med den komplette 3 ' UTR indsat i pTRE-stramme udtryk vektor. Den åbne læseramme er afbildet som en grå boks, mens 3' UTR vises som en hvid boks. 3' UTR-delen af αENaC mRNA er afbildet for klonen med en komplet 3' UTR og for de forskellige sletningsmutanter (Del 1 til Del 4). (B) Primære alveolær epitelceller blev forbigående cotransfected med pTRE-stramme plasmider, der koder forskellige αENaC 3' UTR-sletningsmutanter sammen med pTet-Off plasmid, som udtrykker tTA-Ad, for at tillade konstruktionens specifikke udtryk og dens hæmning ved doxycyklin. 72 h efter transfektion blev cellerne behandlet med doxycyklin (1,0 μg/ml) i 15 minutter til 6 timer. Udtryk for V5-αENaC mRNA blev målt ved kvantitativ RT-PCR og præsenteret som procentdel ± SEM af V5-αENaC mRNA-udtryk i ubehandlede celler (t = 0) efter normalisering i henhold til udtrykket tTA-Ad. V5-αENaC mRNA-halveringstiden for hver konstruktion blev estimeret ud fra hastighedskonstanten (K) af V5-αENaC mRNA-nedbrydningskurven ved hjælp af følgende ligning: t1/2 = ln 2/K. V5-αENaC mRNA-henfaldet er vist for klonen med de komplette 3' UTR (Comp) og for Del 1 til Del 4 3' UTR-sletningsmutanter. Halveringstiden (t1/2) af mRNA-henfald gives for hver klon. I den nederste højre kvadrant viser grafen en sammenligning af de forskellige t1/2 ± SEM-værdier, der er estimeret for hver klon. p < 0,05 mellem de forskellige grupper ifølge Kruskal-Wallis testen. * p < 0,05 ifølge Dunn's post hoc-test i forhold til den komplette 3 'UTR. Φp < 0,05 ifølge Dunns post hoc-test sammenlignet med Del 3. Celler fra mindst fem forskellige dyr (n ≥ 5) blev anvendt til hver forsøgstilstand. Tilpasset fra figur 2 og 3, der tidligere er offentliggjort i Migneault et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Posttransskriptionel graduering af V5-αENaC mRNA ved de RNA-bindende proteiner hnRNPK, Dhx36 og Tial1. (A) Primære alveolær epitelceller blev cotransfected med pTRE-tight plasmid-kodningen V5-αENaC mRNA sammen med en ekspressionsvektor for Dhx36, hnRN eller Tial1 RPM'er og pTet-Off plasmid. V5-αENaC mRNA-udtrykket blev kvantificeret ved RT-qPCR 72 h posttransfection og udtrykt som procentdelen ± SEM af V5-αENaC mRNA-udtryk sammenlignet med i celler transfemeret med en tom vektor (pcDNA3) efter normalisering i henhold til udtrykket tTA-Ad. Overekspression af Dhx36 og Tial1 hæmmede signifikant V5-αENaC mRNA-udtryk, mens overekspression af hnRNPK ikke havde nogen effekt. * p < 0,05 ifølge Kruskal-Wallis test og Dunn's post hoc-test i forhold til tom vektor; n ≥ 3 prøver fra forskellige dyr blev testet i to eksemplarer for hver forsøgstilstand. (B) Den proksimale del af αENaC 3' UTR blev slettet ved kloning af det distale område af 3' UTR ved siden af αENaC stop codon i pTRE-tight plasmid (V5-αENaC-Del5). (C) Primære alveolær epitelceller blev cotransfected med V5-αENaC eller V5-αENaC-Del5 i pTRE-tight vektorsammen med pTet-Off plasmid og ekspressionsvektoren for Dhx36 eller Tial1 RBP overekspression. V5-αENaC mRNA-udtrykket blev kvantificeret ved RT-qPCR 72 h posttransfection og udtrykt som procentdelen ± SEM af V5-αENaC mRNA-udtryk sammenlignet med i celler transfemeret med en tom vektor (pcDNA3) efter normalisering i henhold til udtrykket af tTA-Ad. Overekspression af Dhx36 og Tial1 havde ingen effekt på V5-αENaC-Del5 mRNA-udtryk. * p < 0,05 ifølge Kruskal-Wallis test og Dunn's post hoc-test ved sammenligning af de eksperimentelle vektorer til den tomme vektor; #p < 0,05 ifølge Mann-Whitney U-testen ved sammenligning af de eksperimentelle vektorer med den komplette 3' UTR-mutant; n ≥ 6 for hver forsøgstilstand. Tilpasset fra figur 5 og 7, der tidligere er offentliggjort i Migneault et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.
| A | |||
| Skabelon | 3' UTR | Følelse | Sekvens |
| αENaC cDNA | Komplet | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3« |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGCTTTGGG-3« |
|
| Del 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| Del 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCGCACAG-3« |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Mål | Følelse | Sekvens | |
| V5-αENaC | F | 5'-CCTAACCCTCTCCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTGTCC-3' | ||
Tabel 1: Primere, der anvendes i denne undersøgelse. (A) Primere, der anvendes til kloning og generering af V5-αENaC-mutanter i den uibrugbare pTRE-stramme vektor. (B) Primere, der anvendes til måling af mRNA-udtryk ved kvantitativ RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den lave transfektionsrate for alveolær epitelceller i primærkulturen har været en alvorlig begrænsning for brugen af Tet-Off-systemet til at vurdere mRNA-stabiliteten i disse celler. Denne begrænsning blev imidlertid overvundet ved pipetteelektroporation, hvilket gav mulighed for en 25-30% transfektionseffektivitet (figur 1 og figur 3)26.
Målingen af udskriftsstabilitet er afgørende for at forstå gradueringen af et givet mRNA og dets indvirkning på cellehomøostase og stofskifte. Variation i biotilgængeligheden af en indiske regering kan ændre oversættelseseffektiviteten og have en direkte indvirkning på den indiske regerings udtryk i cellen. Af disse grunde er der udviklet flere teknikker til bestemmelse af halveringstiden for mRNA'er. Som nævnt ovenfor, hver af disse teknikker har begrænsninger og begrænsninger, der forhindrer en korrekt undersøgelse af en udskrift af interesse. Sammenlignet med andre teknikker har TET-off-modellen, der er udviklet her, den fordel, at half-life-vurderingen af et givet mRNA kan vurderes under enhver eksperimentel tilstand. Men det giver os ikke mulighed for direkte at undersøge stabiliteten af en endogen udskrift. For at overvinde denne begrænsning så meget som muligt foreslås det at medtage 5 ' UTR og 3 'UTR sekvenser af udskriften i plasmid, således at konstruktionen er så ens som muligt til de endogene udskrifter. Tilføjelsen af V5-epitopen gør det muligt at foretage en specifik forstærkning af målmRNA ved RT-qPCR i forhold til den endogene udskrift. Med hensyn til kloningsstrategien er valget af den sekvens, der er indsat opstrøms for det pågældende gen, afgørende for at forhindre forstærkning af uspecifikke signaler. Tilføjelsen af V5-epitopsekvensen 5' af ORF er nødvendig for den specifikke qPCR-forstærkning af konstruktionen på grund af dens korte længde og manglen på dens udtryk i alveolære epitelceller. Denne strategi giver også mulighed for at undersøge gradueringen af proteinoversættelse ved hjælp af det samme uibrugbare system. På trods af den lille størrelse af V5 epitop (42 nt), er det stadig muligt, at dette kan påvirke stabiliteten af transskription. Af denne grund foreslås det også at teste andre epitoper, såsom human influenza hemagglutinin (HA) eller enhver anden sekvens ikke findes i transcriptome af alveolær epitelceller.
En begrænsning af systemet er brugen af doxycyklin til at hæmme transskriptionen af en indiske regering. Flere rapporter viser, at doxycyklin kan have en betydelig indvirkning på cellestofskiftet. Brugen af dette antibiotikum i 16HBE14 bronkiale celler reducerer spredning og øger dødeligheden på grund af apoptose27. Desuden har doxycycline allerede vist sig at være involveret i moduleringen af LPS inflammatorisk respons28. Derfor kan dette antibiotikum have off-target-virkninger, der kan påvirke mRNA-stabiliteten af en given indiske regering. Af disse grunde vurderede vi virkningen af 1 μg/ml doxycyklin over en periode på 24 timer på ikke-transfected celler og konstaterede, at det ikke medførte nogen ændring i endogent αENaC mRNA-udtryk (figur 2). Denne koncentration blev valgt, fordi den er almindeligt anvendt til helt at hæmme transskriptionen af Tet-Off-systemet og anbefales for at minimere cytotoksiske virkninger29. Vi foreslår, at denne koncentration anvendes i alveolær epitelceller, og anbefaler, at den optimale koncentration valideres til undersøgelse af andre gener eller brug af andre celletyper med Tet-Off-systemet.
Vores system udnytter den konstituerende udtryk for den indiske regering, indtil dens transskription er hæmmet af doxycyklin. Det er blevet antydet, at for høje mRNA-koncentrationer kan være giftige for cellen og påvirke dens stofskifte. Dette kan føre til en ændring i stabiliteten af den indiske udskrift, hvilket kan forårsage hurtig nedbrydning på grund af ikkefysiologisk overekspression30. I forbindelse med vores Tet-Off-model blev en sådan toksicitet ikke observeret, fordi de transfected celler viste en morfologi svarende til dem af sunde ikke-transfected celler (data ikke vist). I overensstemmelse med Tani et al.31, som påviste gyldigheden af Tet-Off-systemet ved bestemmelse af halveringstiden for et mRNA, viste vores resultater, at Tet-Off-systemet ikke er giftigt i alveolær epitelceller og giver en halveringstid for αENaC mRNA, der ikke afspejler den overstabilisering, der blev rapporteret ved tilstedeværelse af transkriptionelle hæmmere såsom actinomycin D (Figur 4).
Udviklingen af dette system til måling af halveringstiden for mRNA udfordrer de observerede resultater, når stabiliteten af udskrifter blev målt i overværelse af transskriptionshæmmere såsom actinomycin D. Denne metode viser, at en udskrift halveringstid kan være meget kortere end tidligere målt.
Vores model er meget velegnet til at studere den posttransskriptionelle graduering af en specifik udskrift under forskellige forhold, herunder pro-inflammatoriske tilstande eller RBP overekspression, samt efter behandling med lyddæmpning RNA. Desuden giver det mulighed for karakterisering af uoversatte regioner afgørende for posttransskriptionelle graduering af mRNAs i patofysiologiske forhold, der påvirker alveolær epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Francis Migneault blev støttet af et stipendium fra Quebec Respiratory Health Network og canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungetræningsprogram, et studenterskab fra FRSQ og et studenterskab fra Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Dette arbejde blev støttet af Gosselin-Lamarre formand i klinisk forskning og den canadiske Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
