Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Published: March 6, 2020 doi: 10.3791/60654

Summary

Hier presenteren we een tool die kan worden gebruikt om de posttranscriptional modulatie van een transcript in primaire alveolar epitheelcellen te bestuderen met behulp van een induceerbaar expressiesysteem gekoppeld aan een pipet elektroporatietechniek.

Abstract

Het bestuderen van posttranscriptional regulatie is fundamenteel voor het begrijpen van de modulatie van een bepaalde boodschapper RNA (mRNA) en de impact ervan op cel homeostase en metabolisme. Inderdaad, schommelingen in transcript expressie zou kunnen wijzigen van de vertaling efficiëntie en uiteindelijk de cellulaire activiteit van een transcript. Verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om de half-life van mRNA te onderzoeken, hoewel sommige van deze methoden beperkingen hebben die de juiste studie van posttranscriptional modulatie voorkomen. Een promotor inductiesysteem kan een gen van belang uitdrukken onder de controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Deze methode maakt de half-life schatting van een bepaalde mRNA onder een experimentele aandoening zonder storende cel homeostase. Een groot nadeel van deze methode is de noodzaak om cellen transfect, die het gebruik van deze techniek in geïsoleerde primaire cellen die zeer resistent zijn tegen conventionele transfection technieken beperkt. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur zijn uitgebreid gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. De unieke kenmerken en fenotype van primaire alveolarcellen maken het essentieel om de posttranscriptionalmodulaties van genen van belang in deze cellen te bestuderen. Daarom was ons doel om een nieuw instrument te ontwikkelen om de posttranscriptional modulaties van mRNAs van belang in alveolar epitheelcellen in primaire cultuur te onderzoeken. We ontwierpen een snel en efficiënt transieel transfection protocol om een transcriptiegestuurd plasmidexpressiesysteem in primaire alveolar epitheelcellen te plaatsen. Deze kloonstrategie, met behulp van een virale epitope om de constructie te taggen, zorgt voor de gemakkelijke discriminatie van constructexpressie uit die van endogene mRNAs. Met behulp van een gewijzigde ΔΔ kwantificeringscyclus (Cq) methode, kan de expressie van het transcript vervolgens worden gekwantificeerd op verschillende tijdstippen om de halfwaardetijd te meten. Onze gegevens tonen de efficiëntie van deze nieuwe aanpak bij het bestuderen van posttranscriptional regulatie in verschillende pathofysiologische omstandigheden in primaire alveolar epitheelcellen.

Introduction

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om de halflevensduur van mRNAs te bepalen. De pulse-chase verval techniek, die gebruik maakt van gelabelde mRNAs, zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van een grote pool van mRNAs met minimale cellulaire verstoring. Deze benadering staat echter geen directe schatting toe van de halfringstijd van één enkel gentranscript en kan niet worden uitgevoerd om de posttranscriptional modulatie van een mRNA te bestuderen na stimulatie met groeifactoren, ROS, alarminen ofontsteking1.

Het gebruik van transcriptieremmers, zoals actinomycine D en α-amanitine, is een relatief eenvoudige methode voor het meten van mRNA afbraakkinetiek in de tijd. Een belangrijk voordeel van deze aanpak ten opzichte van die van eerdere technieken(d.w.z. pulse-chase) is afhankelijk van de mogelijkheid om de halfduur van een bepaald transcript direct in te schatten en te vergelijken hoe verschillende behandelingen de afbraakkinetiek kunnen beïnvloeden. De aanzienlijke schadelijke impact van transcriptieremmers op de celfysiologie vormt echter een groot nadeel van de aanpak2. Inderdaad, de remming van de hele cel transcriptome met deze geneesmiddelen heeft de negatieve bijwerking van verstoren de synthese van belangrijke elementen die betrokken zijn bij mRNA stabiliteit, zoals microRNAs (miRNAs), evenals de expressie en synthese van RNA-bindende eiwitten, die belangrijk zijn voor mRNA afbraak en stabiliteit. De ernstige verstoring van gentranscriptie door deze geneesmiddelen zou daarom de degradatiekrommen van transcripties artefactually kunnen wijzigen.

Het promotorinductiesysteem vertegenwoordigt een derde benadering om de halfduur van een specifiek mRNA te meten. Deze methode meet de afbraak van een specifiek mRNA op een vergelijkbare manier als methoden die transcriptieremmers gebruiken. Er worden vaak twee soorten inductiesystemen gebruikt: de door serum geïnduceerde c-fos promotor3 en het Tet-Off onducible systeem4. Met het c-fos-systeem is het gebruik van transcriptieremmers die giftig kunnen zijn voor de cel niet nodig. Deze methode vereist echter synchronisatie van de celcyclus, waardoor de evaluatie van de werkelijke stabiliteit van een transcript tijdens interfase5wordt voorkomen. Het Tet-Off-systeem maakt daarentegen de sterke expressie van het gen of interest (GoI) mogelijk onder controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Dit systeem vereist de aanwezigheid van twee elementen die moeten worden gecotransfected in de cel functioneel te zijn. De eerste plasmid (pTet-Off) drukt het regelgevende eiwit tTA-Adv uit, een hybride synthetische transcriptiefactor bestaande uit de prokaryotische repressor TetR (van Escherichia coli) versmolten tot drie transcriptietransactivatiedomeinen van het virale eiwit HSV VP16. De Ingoi wordt gekloond in de pTRE-Tight plasmid onder controle van een synthetische promotor (PTight),bestaande uit de minimale volgorde van het cytomegalovirus (CMV) promotor gesmolten tot zeven herhalingen van de tetO operator sequentie. De transcriptie van het gen stroomafwaarts van PTight is afhankelijk van de interactie van TetR met tetO. In aanwezigheid van tetracycline of zijn afgeleide, doxycycline, verliest de TetR-onderdrukker zijn affiniteit met de tetO-operator, wat leidt tot een stopzetting van de transcriptie4. De kenmerken van het Tet-Off-systeem maken het een ideaal model voor de studie van specifieke mRNA-expressie in eukaryotische cellen, terwijl potentiële pleiotropische effecten worden vermeden die ondergeschikt zijn aan de afwezigheid van prokaryotische regulerende sequenties in eukaryotische cel6. Meestal worden dubbel stabiele Tet-Off-cellijnen (HEK 293, HeLa en PC12) met dit systeem gebruikt om kopieën van de regulator en responsplasmids te integreren voor gemakkelijke toegang tot controleerbare genexpressie7,8,9.

Verschillende modellen van alveolar epitheelcellen in de cultuur zijn gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. Jarenlang hebben onderzoekers op grote schaal gebruik gemaakt van menselijke of knaagdier primaire cellen10,11 evenals vereeuwigde cellijnen zoals de menselijke A549 of rat RLE-6TN cellen12,13. Hoewel ze over het algemeen minder proliferative en moeilijker te kweken en transfect, alveolar epitheel cellen in de primaire cultuur blijven de gouden standaard voor de studie van de functie en disfunctie van de alveolar epitheel in fysiologische en pathologische omstandigheden. Inderdaad, vereeuwigde cellijnen zoals A549 cellen vertonen niet de complexe kenmerken en fenotypen van primaire cellen, terwijl alveolar epitheliale cellen in de primaire cultuur de belangrijkste eigenschappen van het alveolaire epitheel samenvatten, met name het vermogen om een gepolariseerde en strakke barrière te vormen14,15. Helaas zijn deze cellen zeer resistent tegen conventionele transfection technieken, zoals die gebruik te maken van liposomen, waardoor het gebruik van een promotor-geïnduceerde systeem zoals Tet-Off zeer moeilijk.

De posttranscriptional modulatie van mRNAs is een van de meest effectieve methoden voor het snel moduleren van de genexpressie van een transcript16. De onvertaalde regio mRNA 3 (3' UTR) speelt een belangrijke rol in dit mechanisme. Het is aangetoond dat, in tegenstelling tot de 5' UTR, er een exponentiële correlatie is tussen de lengte van de 3' UTR en de cellulaire en morfologische complexiteitvan een organisme. Deze correlatie suggereert dat de 3' UTR, net als de mRNA-coderingsgebieden, is onderworpen aan natuurlijke selectie om in evolutie17steeds complexere posttranscriptiemogelijk te maken. De 3' UTR bevat verschillende bindende sites voor eiwitten en miRNAs die de stabiliteit en vertaling van het transcript beïnvloeden.

In het huidige werk ontwikkelden we een tool om de rol van sterk bewaarde domeinen in de 3' UTR van een InI voor de controle van de stabiliteit van het transcript te onderzoeken. We richtten ons op het epitheliale natriumkanaal, alfa subunit (αENaC), die een belangrijke rol speelt in alveolar epitheelfysiologie18. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur werden met succes tijdelijk transfected met de twee componenten van het Tet-Off-systeem, dat het mogelijk maakt voor de studie van de rol van de 3' UTR in mRNA stabiliteit met een systeem dat minimaal van invloed op de celfysiologie en metabolisme in vergelijking met het gebruik van transcriptieremmers met andere protocollen. Een kloonstrategie werd ontwikkeld om de expressie van de Ini te onderscheiden van die van het endogene gen met behulp van een nonendogene uitgedrukte epitope (V5). De respons en regelgevende plasmiden werden vervolgens overgebracht naar alveolar epitheel cellen met behulp van een pipet elektroporatie techniek. Vervolgens werd de expressie van het transcript gemeten door de cellen met doxycycline op verschillende tijdstippen uit te broeden. De halfwaardetijd van het transcript werd geëvalueerd door RT-qPCR met een aangepaste Cq-methode met behulp van het transfected tTA-Ad mRNA product voor normalisatie. Door middel van ons protocol bieden we een handige manier om de posttranscriptional modulatie van een transcript onder verschillende voorwaarden te bestuderen en de betrokkenheid van de onvertaalde regio's in meer detail te definiëren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging van het Onderzoekscentrum van Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).

1. Ontwerp en generatie van de respons plasmid uitdrukken van het gen van belang (IGoI)

  1. Gebruik een inducible tetracycline-off vector, zoals pTRE-Tight.
  2. Analyseer de volgorde van de GoI en de meervoudige kloonsite (MCS) van de vector om de beperkingssites in de MCS te identificeren die intern niet in de GoI aanwezig zijn.
  3. Isoleer primaire alveolar epitheelcellen uit mannelijke Sprague-Dawley rattenlongen zoals eerder beschreven19,20.
  4. Zuiver het totale RNA uit de alveolar epitheelcellen door RNA-extractie met behulp van een standaardmethode, zoals fenol/chloroformextractie of het gebruik van op silica gebaseerde RNA-spinkolommen.
  5. Reverse-transcriberen van de mRNA in complementaire DNA (cDNA) met behulp van oligo (dT) en high-fidelity reverse transcriptase.
  6. Gebruik high-fidelity Taq polymerase en standaard overlappende PCR-technieken om de GoI te flankeren met twee geselecteerde restrictieenzymherkenningssites met behulp van ontworpen primers.
    1. Laat de voorwaartse primer een Kozak consensus riosome binding site21 bevatten om expressieniveaus te verbeteren om eiwitexpressie parallel met mRNA-stabiliteit te bestuderen. Een sequentie die het V5-epitoop stroomopwaarts van de Ing codeert, moet worden opgenomen om de expressie van de transfected Ing i.g. te onderscheiden van endogene expressie(tabel 1).
    2. Laat de omgekeerde primer een polyadenylation signaal bevatten na de stop codon.
  7. Mutanten kunnen worden gegenereerd door sequentiële verwijdering om de effecten van verschillende 3' UTR-regio's op de stabiliteit van het mRNA van de Ini te bestuderen met behulp van omgekeerde primers die een polyadenylationsite coderen die geleidelijk het einde van de 3' 3' UTR(figuur 6)verwijdert. Als alternatief kan pcr-gerichte mutagenese worden gebruikt om zich te richten op een specifieke interesseregio in de 3' UTR22.
  8. Verwerk de induceerbare vector en de wisselplaat met de eerder gekozen beperkingsenzymen bij de juiste incubatietemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door behandeling met fosphatase tijdens de vectorreactie gedurende 30 min om zelfligatie te voorkomen.
  9. Scheid de verteerde vector en voeg segmenten door elektroforese in een 1-1,5% agarosegel (concentratie afhankelijk van de grootte van de wisselplaat).
  10. Verzamel met behulp van een mes en een UV-licht de DNA-fragmenten met de gewenste wisselplaat en vector die moeten worden vastgestomeerd.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
  11. Zuiver de verzamelde segmenten van de agarosegel met behulp van een op silica gebaseerde PCR-zuiveringskit en meet de concentratie door spectrofotometrie op 260 nm.
  12. Ligate de Ini en de onducible vector met T4 DNA ligase met behulp van een vector: voeg molaire verhouding van 1:3 om de kans op ligatie te verhogen. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 uur.
  13. Zet de ligatiereactie om in competente E. coli (DH5α).
    1. Voeg 1-10 ng vector en gen toe aan een buis met 100 μL competente cellen. Incubeer de cellen 30 min op ijs en verwarm vervolgens de cellen bij 42 °C voor 45 s. Plaats de buis gedurende 2 min op ijs en voeg 900 μL RT LB-medium toe. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C met schudden bij 225 tpm.
    2. Verspreid 100 μL van de reactie op een LB agar plaat met een geschikt antibioticum (bijvoorbeeld 100 μg/mL ampicillin voor de pTRE-Tight vector) om de getransformeerde bacteriën te selecteren. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
    3. Selecteer individuele kolonies met behulp van een inentingslus of een 20 μL-tip en incubeer 's nachts in 5 mL LB-medium met het geschikte antibioticum bij 37 °C met schudden. De getransformeerde bacteriën kunnen worden opgeslagen in glycerolvoorraden bij -80 °C bij een verhouding van 400:600 LB-medium tot glycerol.
  14. Haal het plasmide-DNA eruit met behulp van plasmakolommen op basis van silica en meet de concentratie per spectrofotometrie op 260 nm. Bevestig de invoeging van de Ingoi door beperkingsanalyse en de oriëntatie ervan en de afwezigheid van mutaties die mogelijk tijdens RT-PCR worden geïntroduceerd door sequencing.

2. Transfection van de respons plasmid die het gen van belang (Initi) uitdrukt in primaire alveolar epitheelcellen

  1. Isoleer type II alveolar epitheelcellen van rattenlongen.
  2. Zaai de cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen/cm2 in 100 mm petrischaaltjes met een volledig minimaal essentieel medium (volledige MEM). Complete MEM is MEM aangevuld met 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycine, Septra (3 μg/mL trimethoprim en 17 μg/mL sulfamethoxazool), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7.3) en 2 mM L-glutamine. Kweek de cellen 24 uur bij 37 °C in 5% CO2 in een bevochtigde couveuse.
  3. Plaats de volgende dag 500 μL volledige MEM zonder antibioticum in elke put van een nieuwe 12-putplaat en verwarm de plaat 30 minuten lang bij 37 °C. Tijdens deze stap is het belangrijk om foetale runderserum te gebruiken dat vrij is van contaminatie tetracyclines of met een te laag niveau om de inducibiliteit te verstoren.
  4. Bereid 1,5 mL buizen met de plasmid met de inducible GoI (Goi plasmid) en de regelgevende vector (bijvoorbeeld pTet-Off) door toevoeging van 1 μg Ini plasmid en 1 μg van regelgevende vector per goed bij RT. Voor coexpressieexperimenten met RNA-bindende eiwitten (RBP) wordt 1 μg van een constitutieve vector (bijvoorbeeld pcDNA3) die de RPB van belang uitdrukt, toegevoegd aan de DNA-mix (figuur 7).
  5. Aanzuigen van het medium en voorzichtig spoelen de cellen met PBS (zonder calcium en magnesium) voorverwarmd op 37 °C.
  6. Voeg 5 mL van 0,05% trypsine voorverwarmd bij 37 °C en uitbroed de cellen tot de cellen zijn losgemaakt (2-4 min). Neutraliseer de trypsine door 10 mL volledig MEM toe te voegen zonder antibioticum.
  7. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 mL, was de petrischaal met 4 mL medium om zoveel mogelijk resterende cellen te verzamelen en centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.
  8. Trek de supernatant voorzichtig aan en gooi de pellet opnieuw op in 1 mL PBS. Tel en bereken het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
  9. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant voorzichtig aan en breg de pellet opnieuw op in resuspensiebuffer bij een concentratie van 4 x 107 cellen/mL. Voeg de cellen van de 1,5 mL buis bereid in stap 2.4 bij een concentratie van 400.000 cellen per put en meng ze voorzichtig door op en neer te stampen.
  10. Plaats de buis in de elektroporatie-inrichting en vul deze met 3,5 mL elektrolytische buffer.
  11. Steek een vergulde elektrodetip in een pipet door de zuiger volledig te drukken. Meng voorzichtig de inhoud van de 1,5 mL buis en trek de cellen voorzichtig aan met de pipet. Wees voorzichtig om te voorkomen dat luchtbellen de tip binnendringen, omdat dit elektrische arcing zal veroorzaken tijdens elektroporatie en zal leiden tot verminderde transfection-efficiëntie.
  12. Steek de pipet in het elektroporatiestation totdat er een klikkend geluid is.
  13. Selecteer het juiste elektroporatieprotocol voor alveolar epitheelcellen, overeenkomend met een pulsspanning van 1.450 V en 2 pulsen met een breedte van 20 ms, en druk op Start op het touchscreen.
  14. Onmiddellijk na het transfection, verwijder de pipet en breng de cellen naar een goed eerder gevuld met volledige MEM zonder antibioticum dat is voorverwarmd tot 37 °C.
  15. Herhaal stap 2.11-2.14 voor de overige monsters.
  16. Schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig over het putoppervlak te verspreiden. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2 in een bevochtigde couveuse. Vervang na 2 dagen het medium door volledige MEM door antibiotica.
  17. Bevestig het succes van de transfection door de expressie van eGFP onder een fluorescentiemicroscoop of door stroomcytometrie te observeren met behulp van een controlevector (figuur 1).
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en vereist een extra transfection stap met behulp van een andere plasmid uitdrukken eGFP, zoals pcDNA3-EGFP.

3. Inductie van de transcriptieremming van de Indez

OPMERKING: De cellen kunnen worden voorbehandeld met de gewenste behandelingen vóór doxycycline inductie om hun impact op mRNA stabiliteit te beoordelen (figuur 5).

  1. Bereid een doxycycline stock oplossing van 1 mg/mL in gedeïoniseerd water. Bewaar de voorraadoplossing op -20 °C beschermd tegen licht. Doxycycline, een tetracycline derivaat, wordt gebruikt in plaats van tetracycline omdat het een langere half-life (2x) dan tetracycline heeft. Bovendien is een lagere concentratie van doxycycline vereist voor de volledige inactivering van de tet operon23.
    OPMERKING: Doxycycline kan de mRNA-expressie van de endogene IG beïnvloeden. Om dit te verifiëren, moet het effect van een behandeling van 24 uur met doxycycline op alveolarcellen worden getest om de afwezigheid van veranderingen in de Init-expressie te bevestigen (figuur 2).
  2. Bereid een verse 1 μg/mL doxycycline oplossing in volledige MEM 72 h posttransfection en verwarm deze tot 37 °C.
  3. Vervang het medium door 1 mL volledig MEM met 1 μg/mL doxycycline per put om de transcriptie van de Ini te remmen.
  4. Incubeer meerdere putten bij 37 °C in 5% CO2 voor verschillende hoeveelheden tijd van 15 min-6 uur om de mRNA halfwaardetijd van de Ini te beoordelen.
  5. Aan het einde van de behandeling, was de cellen met ijskoude PBS en lyse ze met een commercieel beschikbare fenol-chloroform RNA extractie kit door het toevoegen van 500 μL buffer per put en schudden van de plaat om de cellen te homogeniseren.
  6. Isoleer het RNA volgens het protocol van de fabrikant. Bepaal de RNA-opbrengst en -zuiverheid door spectrofotometrie op 230, 260 en 280 nm. RNA-monsters met respectievelijk 260:230 en 260:280-ratio's van respectievelijk 1,8 en 2,0 worden als zuiver beschouwd.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

4. Het bepalen van de mRNA stabiliteit van de Indev.

  1. Behandel 1 μg totaal RNA met RNAse-vrije DNAse I (versterkingsgraad) om elk spoor van plasmidDNA te verwijderen dat de daaropvolgende DNA-versterking zou kunnen verstoren.
    1. Combineer in een 0,2 mL PCR-buis 1 μg totaal RNA, 1 μL van 10x DNase I-reactiebuffer, 1 μL DNAse I (1 U/μL) en RNAse-vrij water om een totaal volume van 10 μL te verkrijgen.
    2. Incubeer de reactie bij RT gedurende 20 min.
    3. Deactiveer DNAse I door 1 μL van 25 mM EDTA toe te voegen aan de 10 μL-reactiemix en de reactie gedurende 10 min bij 70 °C uit te broeden.
  2. Reverse-transcriberen van de DNA-uitgeput totale RNA in cDNA met behulp van een commercieel beschikbare cDNA synthese kit met een mix van oligo (dT) en willekeurige hexamer primers om de omgekeerde transcriptie efficiëntie te verbeteren.
    1. Voeg kort 4 μL 5x reactiemix, 1 μL omgekeerde transcriptase en 4 μL RNAse-vrij water toe aan 11 μL van de DNA-uitgeputte totale RNA-mix om een totaal reactievolume van 20 μL te verkrijgen. Meng de reactie goed door het op en neer te beten.
    2. Incubeer de reactie gedurende 5 min bij 25 °C, gevolgd door 20 min bij 46 °C, en activeer vervolgens de reactie door deze gedurende 1 min bij 95 °C uit te broeden. Elke reactie levert 50 ng/μL cDNA-product op.
    3. Verdun de cDNA-reactie tot een concentratie van 5 ng/μL door 180 μL moleculair biologisch waardig water toe te voegen aan de 20 μL-reactiemix. Bewaar de cDNA-producten op -80 °C of ga onmiddellijk over tot het uitvoeren van real-time kwantitatieve PCR (qPCR).
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
  3. Ontwerp vooruit en draai qPCR primers specifiek voor de GoI.
    1. Vanwege de endogene expressie van de Ini in de cellen, moeten de primers zijn ontworpen om een 100-150 bp amplicon van de V5-epitoop gekoppeld aan de Ini (tabel 1) te versterken.
    2. Interne referentiegenprimers moeten ook worden gebruikt als normalisatiecontrole. Meestal worden huishoudelijke genen, zoals de bèta-actine en hypoxanthine fosforibosyltransferase 1 genen, gebruikt als referentiegenen. Deze kunnen echter niet worden gebruikt met dit inductiesysteem vanwege de variatie van de transfection-efficiëntie. In plaats daarvan wordt de expressie van het tTA-Ad transcript beoordeeld met het oog op normalisatie, omdat de expressie ervan constitutief is in cellen als gevolg van de activiteit van de cytomegaloviruspromotor. Elke variatie in de expressie gemeten door qPCR zal representatief zijn voor de transfection-efficiëntie (primers: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' en reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) en zal de normalisatie van de expressie van de transfected klonen mogelijk maken (figuur 3).
  4. Bereid elke qPCR reactie in drievoud met behulp van een SYBR Green kleurstof master mix.
    1. Verdun het 5 ng/μL cDNA-mengsel tot een concentratie van 1,25 ng/μL met behulp van water van moleculaire biologiekwaliteit.
    2. Combineer 5 μL SYBR Green dye master mix (2x), 0,1 μL moleculair biologisch waardig water, 0,45 μL van 7,5 μM voorwaartse primer, 0,45 μL van 7,5 μM omgekeerde primer, en 4 μL van 1,25 ng/μL cDNA om een totaal reactievolume van 10 μL te verkrijgen. Meng goed door op en neer te stampen in een 96 goed PCR-plaat. Gebruik optische kleeffolie om ervoor te zorgen dat de plaathoes wordt verzegeld en om verontreiniging en verdamping te voorkomen.
    3. Draai de reactiemix kort naar beneden door centrifugeren en plaats de plaat in een qPCR thermocycler.
  5. Versterk de V5-gelabelde GoI- en tTA-Ad-amplicons met behulp van de volgende qPCR-omstandigheden: 95 °C voor 10 min als denaturatiestap, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 10 s, 58 °C voor 15 s en 72 °C voor 20 s. Na de versterkingscycli moet een smeltcurve met hoge resolutie worden gegenereerd om de specifieke smelttemperaturen van de gewenste ampliconen te beoordelen en de afwezigheid van geluidsversterkingspieken te garanderen.
    1. Neem negatieve controles voor de qRT-PCR door het uitvoeren van qPCR met RNA als een sjabloon zonder omgekeerde transcriptase om te dienen als een controle voor mogelijke plasmid DNA-besmetting en qPCR zonder cDNA toegevoegd aan de qPCR mix om het gebrek aan primer dimers of Verontreinigingen.
    2. De optimale cDNA-concentratie, primer-efficiëntie en concentratie moeten volgens de GoI worden geoptimaliseerd door een standaard curvetest. Voer hiervoor een seriële verdunning uit met behulp van cDNA uit onbehandelde cellen (gekweekt zonder doxycycline). De standaardcurve wordt gegenereerd door de Cq-waarden af te plotten tegen het logboek van de cDNA-verdunningsfactor en de versterkingsefficiëntie (E) wordt berekend op basis van de helling van de standaardcurve met behulp van de volgende formule:
      E = 10-1/helling
      OPMERKING: De versterkingsefficiëntie moet ongeveer 0,9 tot 1,05 bedragen. Anders moeten de primers opnieuw worden ontworpen.
  6. Analyseer de qPCR-gegevens met behulp van de vergelijkende Cq-methode door de expressiewaarden van de Ini te normaliseren tot de expressie van tTA-Ad om de relatieve expressieniveaus van de Ini te verkrijgen en de expressie ervan te rapporteren als een percentage van de mRNA-expressie van de Ini in cellen van hetzelfde dier bij het beginpunt (t = 0) (figuur 4).
  7. De half-life wordt bepaald aan de hand van de koersconstante (K) van de GoI mRNA degradatiecurve aan de hand van de volgende vergelijking:
    t1/2 = ln 2/K.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol werd met succes gebruikt om een Tet-Off transcriptiesysteem te genereren dat plasmaleexpressiesysteem bevat om het belang van verschillende delen van de αENaC 3' UTR in de modulatie van transcriptiestabiliteit in primaire alveolar epitheelcellen te evalueren.

De eerste stap in de implementatie van dit systeem was het vaststellen van een snelle, eenvoudige en efficiënte transfection techniek voor alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur, die moeilijk te transfect. Zoals blijkt uit figuur 1, maakte de pipetelektroporatietechniek een transfection-efficiëntiesnelheid van 25-30% mogelijk, zoals blijkt uit de verhoudingen van eGFP-cellen die worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie en stroomcytometrie.

Alvorens dit inductiesysteem toe te passen, dat wordt gecontroleerd door tetracycline en zijn derivaten, werd de impact van dit medicijn op de expressie van onze Ini geverifieerd. De alveolar epitheelcellen werden behandeld met 1,0 μg/mL doxycycline om de impact ervan op endogene αENaC mRNA-expressie te beoordelen. Behandelingen die in een periode van 1-24 uur werden uitgevoerd, hadden geen significante invloed op de expressie van het endogene transcript , zoals blijkt uit figuur 2.

Onze transcriptie gecontroleerde plasmid expressie systeem maakt gebruik van een qPCR normalisatie techniek die verschilt van de standaard techniek die huishoudelijke genen gebruikt. In het geval van de expressie van V5-αENaC werd het signaal genormaliseerd volgens het tTA-Adv-signaal om de efficiëntie van transfection te bepalen met behulp van de Cq-methode. Figuur 3 toont het gebruik van het tTA-Adv transcript om mRNA-expressie te normaliseren.

Eerder gepubliceerde resultaten suggereren dat het gebruik van actinomycine D niet geschikt is voor de schatting van αENaC transcript stabiliteit, omdat het een abnormaal hoge mRNA half-life (ongeveer 12 uur)24aangaf . De halfwaardetijd van αENaC mRNA in aanwezigheid van het Tet-Off-systeem (99 min) was tot 7x korter dan die in aanwezigheid van actinomycine D, zoals blijkt uit figuur 4. Dit bevestigt dat actinomycine D leidt tot een artefactuele αENaC mRNA stabilisatie.

Dit Tet-Off-systeem werd ook met succes gebruikt om te testen of verschillende celstressoren waarvan bekend is dat ze invloed hebben op αENaC-genexpressie, de stabiliteit van αENaC mRNA konden moduleren. Zoals blijkt uit figuur 5,verminderde de cycloheximidebehandeling de stabiliteit (36 min) van het transcript aanzienlijk, terwijl lipopolysachariden (LPS, gebruikt om een infectieuze stimuli na te bootsen) dat niet deden. Ten slotte veroorzaakte de ontstekingsremmende cytokine TNF-α een drastische daling van de V5-αENaC mRNA-stabiliteit (met een halveringstijd van 16 min).

In het huidige werk was de kloonstrategie bedoeld om de bijdrage van de 3' UTR aan de modulatie van αENaC transcript te verduidelijken. Verschillende sequentiële verwijdering mutanten werden gegenereerd en getest om de bijdrage van verschillende domeinen van de αENaC 3 ' UTR in kaart te brengen aan transcript stabiliteit. Figuur 6 toont de significante veranderingen in de modulatie van de stabiliteit van V5-αENaC mRNA, afhankelijk van de verwijderde en opgenomen regio's van de 3' UTR.

Ten slotte werd de modulatie van de stabiliteit van αENaC mRNA door RNA-bindende eiwitten (RBP) met dit model bestudeerd. De transcriptie van αENaC mRNA met de V5 epitope van de pTRE-Tight vector staat onder de exclusieve controle van tTA-Adv. Dhx36, Tial1 en hnRNPK zijn drie RBC's die zijn gekoppeld aan de 3' UTR van αENaC24. Daarom zou elke modulatie van de expressie van V5-αENaC na cotransfection met Dhx36, Tial1 of hnRNPK het gevolg zijn van de modulatie van de mRNA-stabiliteit en niet van transcriptiemodulatie. Figuur 7 toont aan dat de overexpressie van Dhx36 of Tial1, in tegenstelling tot die van hnRNPK, de stabiliteit van V5-αENaC mRNA verminderde in vergelijking met transfection met de lege pcDNA3 plasmid, die de specifieke modulatie van sommige RBC's toont.

Gezamenlijk bevestigden deze resultaten dat het door ons ontwikkelde Tet-Off transcriptie-analysesysteem een geschikt instrument is voor de evaluatie van de werkelijke halfringstijd van een transcript en de mechanismen die betrokken zijn bij de modulatie ervan. Deze tool zal nuttig zijn bij het verkrijgen van nieuwe inzichten in de posttranscriptional regulatie van belangrijke GOI's die betrokken zijn bij de functie van het alveolar epitheel in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Figure 1
Figuur 1: Efficiëntie van de transfection van alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur door pipetteelektropolatie. Primaire alveolar epitheelcellen werden van voorbijgaande aard transfected met 2 μg van een pcDNA3 plasmid (leeg, klonen #1 en #2) die uitgedrukt of niet uitdrukken GFP eiwit. Transfection efficiency werd beoordeeld 48 uur na transfection door (A) fluorescentie microscopie of (B) flow cytometrie. One-way ANOVA en Bonferroni post hoc test; *p < 0,001 vs. leeg. Cellen van ten minste vier verschillende ratten (n ≥ 4) werden gebruikt voor elke experimentele aandoening. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Modulatie van endogene αENaC mRNA door doxycycline in alveolar epitheelcellen. Alveolar epitheelcellen werden behandeld met 1,0 μg/mL doxycycline voor een periode van 1-24 uur. De expressie van αENaC mRNA werd gekwantificeerd door kwantitatieve RT-PCR en gepresenteerd als de uitdrukking van αENaC mRNA ± SEM in vergelijking met die in onbehandelde cellen (Ctrl; t = 0) na normalisatie volgens β-actineexpressie (one-way ANOVA, n = 4). Doxycycline moduleerde in de loop der tijd geen endogene αENaC mRNA. Eerder gepubliceerd als figuur S4 in Migneault et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Normalisatie van goi mRNA-expressie met een gewijzigde Cq-methode volgens de expressie van de regelgevende mRNA tTA-Ad. Alveolar epitheelcellen werden van voorbijgaande aard cotransfected met de pTet-Off plasmid en de pTRE-Tight plasmid codering αENaC cDNA met een V5 epitope stroomopwaarts van zijn open leesframe en een complete 3' UTR sequentie. De expressie van V5-αENaC en tTA-Ad mRNAs werd gemeten door kwantitatieve RT-PCR in onbehandelde cellen. (A) De delta-genormaliseerde SYBR Green tl-signalen (ΔRn) van V5-αENaC en tTA-Ad uit twee afzonderlijke transfections (R1 en R2) zijn afgebeeld. (B) Linkergrafiek: mRNA-expressie van V5-αENaC en tTA-Ad in elk experiment (R1 en R2) worden uitgedrukt als de cycluskwantificeringswaarde (Cq). Het verschil tussen V5-αENaC en tTA-Ad mRNA expressie (ΔCq) wordt gepresenteerd. Rechtergrafiek: Met behulp van tTA-Ad mRNA in plaats van het huishoudingsgen kan de expressie van de Ini efficiënte normalisering worden, die een relatieve expressie van 0,98 in R1 vertoonde in vergelijking met die in R2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Afbraakkinetiek van V5-αENaC mRNA bij gebruik van het transcriptiegestuurd gecontroleerde plasmidexpressiesysteem in aanwezigheid en afwezigheid van actinomycine D. Primaire alveolar epitheelcellen werden van voorbijgaande aard cotransfected met de pTet-Off plasmid en de pTRE-tight plasmid codering αENaC cDNA met een V5 epitope stroomopwaarts van zijn open leesframe en complete 3' UTR sequenties. Cellen die voorbehandeld of onbehandeld waren met actinomycine D (5,0 μg/mL) voor 30 min werden daarna geïncubeerd met doxycycline (1,0 μg/mL) gedurende 15 min-6 h. Expressie van V5-αENaC mRNA werd gemeten door kwantitatieve RT-PCR en gepresenteerd als het percentage ± SEM van V5-αENaC mRNA expressie in onbehandelde cellen (t = 0) na normalisatie volgens de uitdrukking van tTA-Ad. De V5-αENaC mRNA half-life werd geschat door een-fase verval niet-lineaire regressie voor elke cel voorbereiding. Meerdere regressieanalyse toonde een statistisch significant verschil in V5-αENaC mRNA stabiliteit in cellen behandeld met actinomycine D in vergelijking met die in onbehandelde cellen (p < 0,0001). Cellen van ten minste vier verschillende ratten (n ≥ 4) werden gebruikt voor elke experimentele aandoening. Eerder gepubliceerd als figuur 1 in Migneault et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Modulatie van V5-αENaC mRNA stabiliteit door verschillende cellulaire en ontstekingsspanningen. Primaire alveolar epitheelcellen werden van voorbijgaande aard cotransfected met de pTet-Off plasmid en de pTRE-tight plasmid codering αENaC cDNA met een V5 epitope stroomopwaarts van zijn open leesframe en complete 3' UTR sequenties. De cellen werden voorbehandeld voor 30 min met 1,0 μM cycloheximide (CHX) (A) of 15 μg/mL LPS (B) of voor 5 uur met 100 ng/mL TNF-α (C), gevolgd door behandeling met 1,0 μg/mL doxycycline gedurende een periode van 15-120 min. Expressie van V5-αENaC mRNA werd gemeten door kwantitatieve RT-PCR en gepresenteerd als het percentage ± SEM van V5-αENaC mRNA expressie in onbehandelde cellen (t = 0) na normalisatie volgens de uitdrukking van tTA-Ad. Cellen van ten minste drie verschillende ratten (n ≥ 3) werden gebruikt voor elke experimentele aandoening. (D) De halfringstijd (t1/2) van V5-αENaC mRNA in behandelde cellen werd vergeleken met de halfringstijd van mRNA in cellen (Ctrl). De halflevens werden gemeten aan de hand van de constante (K) van de V5-αENaC mRNA degradatiecurve met behulp van de vergelijking t1/2 = ln 2/K en vervolgens uitgedrukt als min ± SEM (one-way ANOVA-test en Bonferroni post hoc test; *p < 0,01 vs. control; n ≥ 3). Aangepast van figuur 36 dat eerder in Migneault, F.25,werd gepubliceerd . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Gebruik van de sequentiële kloonstrategie om de rol van verschillende regio's van de αENaC 3' UTR in de modulatie van mRNA-stabiliteit aan het licht te brengen. (A) Schematische kaart van het V5-αENaC transcript met de volledige 3' UTR ingevoegd in de pTRE-strakke expressie vector. Het open leesframe wordt afgeschilderd als een grijs vak, terwijl de 3' UTR wordt weergegeven als een witte doos. Het 3' UTR gedeelte van αENaC mRNA is afgebeeld voor de kloon met een complete 3' UTR en voor de verschillende deletiemutanten (Del 1 tot Del 4). (B) Primaire alveolar epitheelcellen werden van voorbijgaande aard gecotransfected met pTRE-strakke plasmiden coderen verschillende αENaC 3' UTR schrapping mutanten samen met de pTet-Off plasmid, die tTA-Ad uitdrukt, om de specifieke expressie van de constructie en de remming ervan door doxycycline mogelijk te maken. Tweeënzeventig uur na transfection werden cellen behandeld met doxycycline (1,0 μg/mL) gedurende 15 min tot 6 uur. Expressie van V5-αENaC mRNA werd gemeten door kwantitatief RT-PCR en gepresenteerd als het percentage ± SEM van V5-αENaC mRNA-expressie in onbehandelde cellen (t = 0) na normalisatie volgens de uitdrukking van tTA-Ad. De V5-αENaC mRNA half-life voor elke constructie werd geschat op basis van de constante snelheid (K) van de V5-αENaC mRNA degradatiecurve met behulp van de volgende vergelijking: t1/2 = ln 2/K. De V5-αENaC mRNA verval wordt getoond voor de kloon met de volledige 3' UTR (Comp) en voor de Del 1 tot Del 4 3' UTR schrapping mutanten. De half-life (t1/2) van mRNA verval wordt gegeven voor elke kloon. In het kwadrant rechtsonder toont de grafiek een vergelijking van de verschillende t1/2 ± SEM-waarden die voor elke kloon worden geschat. p < 0,05 tussen de verschillende groepen volgens de Kruskal-Wallis test. *p < 0,05 volgens dunn's post hoc test in vergelijking met de complete 3' UTR. Φp < 0,05 volgens Dunn's post hoc test in vergelijking met Del 3. Voor elke experimentele aandoening werden cellen van ten minste vijf verschillende dieren (n ≥ 5) gebruikt. Aangepast uit de figuren 2 en 3 die eerder in Migneault et al.24zijn gepubliceerd . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Posttranscriptional modulatie van V5-αENaC mRNA door de RNA-bindende eiwitten hnRNPK, Dhx36 en Tial1. (A) Primaire alveolar epitheelcellen werden gecotransfected met de pTRE-strakke plasmid codering V5-αENaC mRNA, samen met een expressie vector voor de Dhx36, hnRNPK, of Tial1 RBC's en de pTet-Off plasmid. V5-αENaC mRNA expressie werd gekwantificeerd door RT-qPCR 72 h posttransfection en uitgedrukt als het percentage ± SEM van V5-αENaC mRNA expressie in vergelijking met die in cellen getransfected met een lege vector (pcDNA3) na normalisatie volgens de uitdrukking tTA-Ad. Overexpressie van Dhx36 en Tial1 aanzienlijk geremd V5-αENaC mRNA expressie, terwijl overexpressie van hnRNPK had geen effect. *p < 0,05 volgens de Kruskal-Wallis-test en Dunn's post hoc test in vergelijking met lege vector; n ≥ 3 monsters van verschillende dieren werden in tweevoud getest voor elke experimentele toestand. (B) Het proximale gedeelte van de αENaC 3' UTR werd verwijderd door het distale gebied van de 3' UTR naast de αENaC stop codon te klonen in de pTRE-tight plasmid (V5-αENaC-Del5). (C) Primaire alveolar epitheelcellen werden cotransfected met V5-αENaC of V5-αENaC-Del5 in de pTRE-strakke vector samen met de pTet-Off plasmid en de expressievector voor Dhx36 of Tial1 RBP overexpressie. V5-αENaC mRNA expressie werd gekwantificeerd door RT-qPCR 72 h posttransfection en uitgedrukt als het percentage ± SEM van V5-αENaC mRNA expressie in vergelijking met die in cellen getransfecteerd met een lege vector (pcDNA3) na normalisatie volgens de uitdrukking van tTA-Ad. Overexpressie van Dhx36 en Tial1 had geen effect op v5-αENaC-Del5 mRNA expressie. *p < 0,05 volgens de Kruskal-Wallis-test en Dunn's post hoc tests bij vergelijking van de experimentele vectoren met de lege vector; #p < 0,05 volgens de Mann-Whitney U-test bij vergelijking van de experimentele vectoren met de complete 3' UTR mutant; n ≥ 6 voor elke experimentele aandoening. Aangepast uit de figuren 5 en 7 die eerder in Migneault et al.24zijn gepubliceerd . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

A
Sjabloon 3' UTR Zin Volgorde
αENaC cDNA Volledige F 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG
GTAAGCCTATCCCTAACCCT
CTC-3'
R 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC
CTGCCTACCCGTC-3'
Del 1 R 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT
GAGGGACAGTGAAAG-3'
Del 2 R 5'- GCACTAATCGATTTTATTATTAAA
CAAGGGGGCTTTTTGGG-3'
Del 3 R 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTGTCC
CTGAAGGCAGTGAGGC-3'
Del 4 R 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG
CGCCGCCAGGGCACAG-3'
Del 5 R 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC
GCCAGGGCACAG-3'
F 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTCTGCT
CCTCTCCTTG-3'
B
Doel Zin Volgorde
V5-αENaC F 5'-CCTAACCCTCTCCTCGGTCT-3'
R 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3'
tTA-Adv F 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3'
R 5'-AGTGGGTATGATGCCTGTCC-3'

Tabel 1: Primers gebruikt in deze studie. (A) Primers die worden gebruikt voor het klonen en genereren van de V5-αENaC mutanten in de inducible pTRE-tight vector. (B) Primers die worden gebruikt voor het meten van mRNA-expressie door kwantitatieve RT-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De lage transfection rate van alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur is een ernstige beperking voor het gebruik van het Tet-Off systeem om de mRNA stabiliteit in deze cellen te beoordelen. Deze beperking werd echter overwonnen door pipetelektroporatie, waardoor een transfection-efficiëntie van 25-30% mogelijk was (figuur 1 en figuur 3)26.

De meting van transcript stabiliteit is fundamenteel voor het begrijpen van de modulatie van een bepaald mRNA en de impact ervan op cel homeostase en metabolisme. Variatie in de biologische beschikbaarheid van een Ingoi kan de vertaalefficiëntie veranderen en een directe invloed hebben op de expressie van de Ini in de cel. Om deze redenen zijn verschillende technieken ontwikkeld om de halfduur van mRNAs te bepalen. Zoals hierboven besproken, elk van deze technieken heeft beperkingen en beperkingen die de juiste studie van een transcript van belang te voorkomen. In vergelijking met andere technieken heeft het hier ontwikkelde TET-off model het voordeel dat de half-life schatting van een bepaald mRNA onder een experimentele voorwaarde mogelijk wordt. Het staat ons echter niet toe om de stabiliteit van een endogeen transcript direct te bestuderen. Om deze beperking zoveel mogelijk te overwinnen, wordt voorgesteld om de 5' UTR en 3' UTR sequenties van het transcript in de plasmid op te nemen, zodat de constructie zo veel mogelijk lijkt op de endogene transcripties. De toevoeging van de V5 epitope maakt de specifieke versterking van het doel mRNA door RT-qPCR ten opzichte van die van het endogene transcript mogelijk. Wat de kloonstrategie betreft, is de keuze van de sequentie die stroomopwaarts van het rentegen wordt ingevoegd, van cruciaal belang om de versterking van niet-specifieke signalen te voorkomen. De toevoeging van de V5 epitoop sequentie 5' van de ORF is noodzakelijk voor de specifieke qPCR versterking van de constructie vanwege de korte lengte en het ontbreken van de expressie in alveolaire epitheelcellen. Deze strategie biedt ook de mogelijkheid om de modulatie van eiwitvertaling te bestuderen met behulp van hetzelfde inducible systeem. Ondanks de kleine omvang van de V5 epitope (42 nt), is het nog steeds mogelijk dat dit de stabiliteit van transcriptie kan beïnvloeden. Om deze reden wordt voorgesteld om ook andere epitopen te testen, zoals menselijke influenzahemagglutinine (HA) of een andere sequentie die niet wordt aangetroffen in het transcriptome van alveolar epitheelcellen.

Een beperking van het systeem is het gebruik van doxycycline om de transcriptie van een Indeg te remmen. Verschillende rapporten tonen aan dat doxycycline een aanzienlijke impact kan hebben op het celmetabolisme. Het gebruik van dit antibioticum in 16HBE14 bronchiale cellen vermindert de proliferatie en verhoogt de sterfte als gevolg van apoptose27. Bovendien is al aangetoond dat doxycycline betrokken is bij de modulatie van de LPS ontstekingsreactie28. Daarom kan dit antibioticum off-target effecten hebben die de mRNA-stabiliteit van een bepaalde Ini kunnen beïnvloeden. Om deze redenen hebben we de impact van 1 μg/mL doxycycline over een periode van 24 uur op niet-transfected cellen beoordeeld en vastgesteld dat het geen verandering in endogene αENaC mRNA-expressie (figuur 2) heeft veroorzaakt. Deze concentratie werd gekozen omdat het op grote schaal wordt gebruikt om de transcriptie van het Tet-Off-systeem volledig te remmen en wordt aanbevolen om cytotoxische effecten te minimaliseren29. We raden aan deze concentratie in alveolar epitheelcellen te gebruiken en raden aan om de optimale concentratie te valideren voor de studie van andere genen of het gebruik van andere celtypen met het Tet-Off-systeem.

Ons systeem maakt gebruik van de constitutieve expressie van de GoI totdat de transcriptie ervan wordt geremd door doxycycline. Er is gesuggereerd dat overmatige mRNA concentraties giftig kunnen zijn voor de cel en het metabolisme ervan kunnen beïnvloeden. Dit kan leiden tot een verandering in de stabiliteit van het Ingoi-transcript, waardoor de snelle degradatie als gevolg van niet-fysiologische overexpressie30. In het geval van ons Tet-Off-model werd een dergelijke toxiciteit niet waargenomen, omdat de getransfecteerde cellen een morfologie vertoonden die vergelijkbaar is met die van gezonde niet-transfected cellen (niet-getoonde gegevens). In overeenstemming met Tani et al.31, die de geldigheid van het Tet-Off-systeem aantoonde bij het bepalen van de halfwaardetijd van een mRNA, toonden onze resultaten aan dat het Tet-Off-systeem niet giftig is in alveolar epitheelcellen en een halfwaardetijd voor αENaC mRNA oplevert dat niet de overstabilisatie weerspiegelt die werd gemeld in aanwezigheid van transcriptieremmers zoals actinomycin D (Figuur 4).

De ontwikkeling van dit systeem om de halfwaardetijd van mRNA te meten daagt de resultaten uit die werden waargenomen toen de stabiliteit van transcripties werd gemeten in aanwezigheid van transcriptieremmers zoals actinomycine D. Deze methode toont aan dat een transcript half-life kan veel korter zijn dan eerder gemeten.

Ons model is zeer geschikt voor het bestuderen van de posttranscriptional modulatie van een specifiek transcript onder verschillende omstandigheden, waaronder pro-inflammatoire aandoeningen of RBP overexpressie, evenals na behandeling met het uitschakelen van RNA. Bovendien maakt het de karakterisering van onvertaalde regio's die essentieel zijn voor de posttranscriptional modulatie van mRNAs in pathofysiologische omstandigheden die alveolar epitheelcellen beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

Francis Migneault werd ondersteund door een beurs die werd verstrekt door het Quebec Respiratory Health Network en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) longtraining, een studentenschip van FRSQ en een studentenschip van de Faculté des Études Supérieures et Postdoctoraal, Université de Montréal. Dit werk werd ondersteund door de Gosselin-Lamarre Leerstoel klinisch onderzoek en de Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A9415
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593
Bright-LineHemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Chloroform - Molecular biology grade Sigma-Aldrich C2432
ClaI New England Biolabs R0197S
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast Leica -
DNase I, Amplification Grade Invitrogen 18068015
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium Wisent Bioproducts 311-425-CL
Ethanol - Molecular biology grade Fisher Scientific BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker Eppendorf 1220G76
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
HEPES pH 7.3 Sigma-Aldrich H3784
Heracell 240i ThermoFisher Scientific 51026420
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad Laboratories 1708890
Isopropanol - Molecular biology grade Sigma-Aldrich I9516
LB Broth (Lennox) Sigma-Aldrich L3022
LB Broth with agar (Lennox) Sigma-Aldrich L2897
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 Sigma-Aldrich L9143
MEM, powder Gibco 61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets ThermoFisher Scientific 51025413
Mupid-exU electrophoresis system Takara Bio AD140
NanoDrop 2000c ThermoFisher Scientific ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit Invitrogen MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack Invitrogen MPK5000S
NheI New England Biolabs R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli Invitrogen C854003
pcDNA3 vector ThermoFisher Scientific V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid Addgene 13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
pTet-Off Advanced vector Takara Bio 631070
pTRE-Tight vector Takara Bio 631059
Purified alveolar epithelial cells n.a. n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit QIAGEN 20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software Applied Biosystems n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast Applied Biosystems 4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein R&D Systems 510-RT-010
Septra Sigma-Aldrich A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England Biolabs M0371S
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase Invitrogen 18090010
T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific EL0011
Tet System Approved FBS Takara Bio 631367
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
Water, Molecular biology Grade Wisent Bioproducts 809-115-EL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  2. Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
  3. Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
  6. Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
  7. Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
  8. Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
  9. Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
  10. Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
  11. Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
  12. Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
  13. Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
  14. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
  15. Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
  16. Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
  17. Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
  18. Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
  19. Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
  20. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  21. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
  22. Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
  23. Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
  24. Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
  25. Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
  26. Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
  27. Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
  28. Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
  29. Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
  30. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  31. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).

Tags

Genetica Kwestie 157 voorbijgaande transfection primaire cultuur alveolar epitheelcellen mRNA stabiliteit 3' UTR doxycycline Tet-Off onducible uitdrukking
Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Migneault, F., Gagnon, F.,More

Migneault, F., Gagnon, F., Brochiero, E., Berthiaume, Y., Dagenais, A. Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (157), e60654, doi:10.3791/60654 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter