Summary
Ici, nous présentons un outil qui peut être employé pour étudier la modulation posttranscriptionale d’une transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires en utilisant un système inductible d’expression couplé à une technique d’électroporation de pipette.
Abstract
L’étude de la réglementation posttranscriptionnelle est fondamentale pour comprendre la modulation d’un ARN messager donné (ARNM) et son impact sur l’homéostasie cellulaire et le métabolisme. En effet, les fluctuations de l’expression de transcription pourraient modifier l’efficacité de la traduction et, en fin de compte, l’activité cellulaire d’une transcription. Plusieurs approches expérimentales ont été développées pour étudier la demi-vie de l’ARNm bien que certaines de ces méthodes aient des limites qui empêchent l’étude appropriée de la modulation posttranscriptionale. Un système d’induction promoteur peut exprimer un gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline.regulated. Cette méthode permet l’estimation de demi-vie d’un ARNm donné dans n’importe quelle condition expérimentale sans troubler l’homéostasie cellulaire. Un inconvénient majeur de cette méthode est la nécessité de transfecter les cellules, ce qui limite l’utilisation de cette technique dans les cellules primaires isolées qui sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Les caractéristiques uniques et le phénotype des cellules alvéolaires primaires font qu’il est essentiel d’étudier les modulations posttranscriptionnelles des gènes d’intérêt dans ces cellules. Par conséquent, notre objectif était de développer un nouvel outil pour étudier les modulations posttranscriptionnelles des ARNm d’intérêt pour les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire. Nous avons conçu un protocole transitoire rapide et efficace de transfection pour insérer un système d’expression plasmide contrôlé par transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires. Cette stratégie de clonage, utilisant une épitope virale pour marquer la construction, permet la discrimination facile de l’expression de construction de celle des ARNm endogènes. À l’aide d’une méthode modifiée du cycle de quantification (Cq), l’expression de la transcription peut ensuite être quantifiée à différents intervalles de temps pour mesurer sa demi-vie. Nos données démontrent l’efficacité de cette nouvelle approche en étudiant la régulation posttranscriptionnelle dans diverses conditions pathophysiologiques dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.
Introduction
Plusieurs techniques ont été développées pour déterminer la demi-vie des ARNm. La technique de désintégration de la chasse au pouls, qui utilise des ARNm étiquetés, permet l’évaluation simultanée d’un grand bassin d’ARNm avec une perturbation cellulaire minimale. Cependant, cette approche ne permet pas une estimation directe de la demi-vie d’une transcription génétique unique et ne peut pas être mise en œuvre pour étudier la modulation posttranscriptionnelle d’un ARNm suivant la stimulation avec des facteurs de croissance, ROS, alarmines, ou inflammation1.
L’utilisation d’inhibiteurs de transcription, tels que l’actinomycine D et l’amanitine, est une méthode relativement simple pour mesurer la cinétique de dégradation de l’ARNm au fil du temps. L’un des principaux avantages de cette approche par rapport à celui des techniques précédentes (c.-à-d. la chasse au pouls) repose sur la capacité d’estimer directement la demi-vie d’une transcription donnée et de comparer comment différents traitements pourraient affecter sa cinétique de dégradation. Cependant, l’impact délétère significatif des inhibiteurs de transcription sur la physiologie cellulaire représente un inconvénient majeur de l’approche2. En effet, l’inhibition de l’ensemble du transcriptome cellulaire avec ces médicaments a l’effet secondaire négatif de perturbing la synthèse des éléments clés impliqués dans la stabilité de l’ARNm, tels que les microARN (miRNAs), ainsi que l’expression et la synthèse des protéines liant l’ARN, qui sont importants pour la dégradation et la stabilité de l’ARNm. La perturbation sévère de la transcription de gène par ces drogues pourrait donc modifier artefactually les courbes de dégradation des transcriptions.
Le système d’induction du promoteur représente une troisième approche pour mesurer la demi-vie d’un ARNm spécifique. Cette méthode mesure la dégradation d’un ARNm spécifique de la même manière que les méthodes qui utilisent des inhibiteurs de transcription. Deux types de systèmes d’induction sont fréquemment utilisés : le promoteur c-fos induit par le sérum3 et le système inductible Tet-Off4. Avec le système c-fos, l’utilisation d’inhibiteurs de transcription qui peuvent être toxiques pour la cellule n’est pas nécessaire. Cependant, cette méthode nécessite la synchronisation du cycle cellulaire, ce qui empêche l’évaluation de la stabilité réelle d’une transcription pendant l’interphase5. En revanche, le système Tet-Off permet l’expression forte du gène d’intérêt (GOI) sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline réglementé. Ce système nécessite la présence de deux éléments qui doivent être cotransfectés dans la cellule pour être fonctionnel. Le premier plasmide (pTet-Off) exprime la protéine réglementaire tTA-Adv, un facteur hybride de transcription synthétique composé du répresseur procaryotique TetR (d’Escherichia coli) fusionné à trois domaines de transactivation de transcription de la protéine virale HSV VP16. Le GOI est cloné dans le plasmide pTRE-Tight sous le contrôle d’un promoteur synthétique (PTight), comprenant la séquence minimale du promoteur de cytomégalovirus (CMV) fusionné à sept répétitions de la séquence de l’opérateur tetO. La transcription du gène en aval de PTight dépend de l’interaction de TetR avec le tetO. En présence de tétracycline ou de son dérivé, doxycycline, le répresseur TetR perd son affinité pour l’opérateur tetO, conduisant à une cessation de la transcription4. Les caractéristiques du système Tet-Off en font un modèle idéal pour l’étude de l’expression spécifique de l’ARNm dans les cellules eucaryotes tout en évitant les effets pléiotropic potentiels qui sont secondaires à l’absence de séquences réglementaires procaryotes dans la cellule eucaryote6. Habituellement, les lignes cellulaires Tet-Off doublement stables (HEK 293, HeLa et PC12) sont utilisées avec ce système pour intégrer des copies des plasmides de régulateur et de réponse pour un accès pratique à l’expression génique contrôlable7,8,9.
Plusieurs modèles de cellules épithéliales alvéolaires en culture ont été utilisés pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Pendant des années, les chercheurs ont largement utilisé les cellules primaires humaines ou rongrices10,11 ainsi que des lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules humaines A549 ou rat RLE-6TN12,13. Bien qu’elles soient généralement moins prolifératives et plus difficiles à culture et à transfecter, les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire demeurent l’étalon-or pour l’étude de la fonction et du dysfonctionnement de l’épithélium alvéolaire dans des conditions physiologiques et pathologiques. En effet, les lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules A549 ne présentent pas les caractéristiques complexes et les phénotypes des cellules primaires, tandis que les cellules épithéliales alvéolaires de la culture primaire récapitulent les principales propriétés de l’épithélium alvéolaire, en particulier la capacité de former une barrière polarisée et serrée14,15. Malheureusement, ces cellules sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles, telles que celles utilisant des liposomes, ce qui rend très difficile l’utilisation d’un système induit par un promoteur comme le Tet-Off.
La modulation posttranscriptionnelle des ARNm est l’une des méthodes les plus efficaces pour moduler rapidement l’expression génique d’une transcription16. La région non traduite de l’ARNM 3 (3' UTR) joue un rôle important dans ce mécanisme. Il a été démontré que, contrairement à l’UTR de 5', il existe une corrélation exponentielle entre la longueur de l’UTR de 3' et les complexités cellulaires et morphologiques d’un organisme. Cette corrélation suggère que l’UTR 3', comme les régions de codage de l’ARNm, a été soumis à la sélection naturelle pour permettre une modulation posttranscriptionnelle de plus en plus complexe tout au long de l’évolution17. L’UTR 3' contient plusieurs sites de liaison pour les protéines et les miARN qui affectent la stabilité et la traduction de la transcription.
Dans le présent travail, nous avons développé un outil pour étudier le rôle des domaines hautement conservés dans les 3' UTR d’un GOI pour le contrôle de la stabilité des transcriptions. Nous nous sommes concentrés sur le canal épithélial de sodium, sous-unité alpha (ENaC), qui joue un rôle clé dans la physiologie épithéliale alvéolaire18. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été avec succès transitoirement transagères avec les deux composants du système Tet-Off, qui permet l’étude du rôle de l’UTR 3' dans la stabilité de l’ARNm avec un système qui affecte de façon minimale la physiologie cellulaire et le métabolisme par rapport à l’utilisation des inhibiteurs de transcription avec d’autres protocoles. Une stratégie de clonage a été développée pour différencier l’expression du GOI de celle du gène endogène à l’aide d’une épitope non endogènement exprimée (V5). La réponse et les plasmides régulateurs ont ensuite été transférés dans les cellules épithéliales alvéolaires utilisant une technique d’électroporation de pipette. Par la suite, l’expression de la transcription a été mesurée en incuber les cellules avec la doxycycline à différents intervalles de temps. La demi-vie de la transcription a été évaluée par RT-qPCR avec une méthode modifiée de Cq utilisant le produit transfected de tTA-Ad mRNA pour la normalisation. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique d’étudier plus en détail la modulation posttranscriptionnelle d’une transcription dans différentes conditions et de définir plus en détail l’implication des régions non traduites.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux du Centre de recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM).
1. Conception et génération du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI)
- Utilisez un vecteur inductible de tétracycline, comme pTRE-Tight.
- Analyser la séquence du GOI et le site de clonage multiple (MCS) du vecteur afin d’identifier les sites de restriction dans le MCS qui ne sont pas présents en interne dans le GOI.
- Isoler les cellules épithéliales alvéolaires primaires des poumons mâles de rat Sprague-Dawley comme décrit précédemment19,20.
- Purifier l’ARN total des cellules épithéliales alvéolaires par extraction d’ARN à l’aide d’une méthode standard, comme l’extraction du phénol/chloroforme ou l’utilisation de colonnes de spin à base de silice.
- Rétro-transcrire l’ARNm en ADN complémentaire (CDNA) à l’aide d’oligo(dT) et de transcriptase inversée haute fidélité.
- Utilisez la polymérase Taq haute fidélité et les techniques PCR de chevauchement standard pour accompagner le GOI avec deux sites sélectionnés de reconnaissance d’enzymes de restriction à l’aide d’amorces conçues.
- Demandez à l’apprêt avant de contenir un site de liaison ribosome de consensus Kozak21 pour améliorer les niveaux d’expression pour étudier l’expression des protéines en parallèle avec la stabilité de l’ARNm. Une séquence codant l’épitope V5 en amont du GOI doit être incluse pour distinguer l’expression du GOI transfected de l’expression endogène(tableau 1).
- Demandez à l’amorce inverse de contenir un signal de polyadenylation après le codon d’arrêt.
- Les mutants peuvent être générés par la suppression séquentielle pour étudier les effets de différentes régions UTR de 3' sur la stabilité de l’ARN de l’IERn à l’aide d’amorces inversées codant un site de polyadenylation qui supprime progressivement la fin 3' de l’UTR GOI 3 (figure 6). Alternativement, la mutanèse dirigée par PCR peut être utilisée pour cibler une région d’intérêt spécifique dans l’UTR22de 3' .
- Digest le vecteur inductible et l’insert avec les enzymes de restriction précédemment choisies à la température d’incubation appropriée pendant 1 h, suivie d’un traitement avec phosphatase pendant la réaction vectorielle pendant 30 min pour éviter l’auto-ligation.
- Séparez le vecteur digéré et insérez des segments par électrophoresis dans un gel agarose de 1 à 1,5 % (concentration selon la taille de l’insert).
- À l’aide d’une lame et d’une lumière UV, recueillir les fragments d’ADN contenant l’insert et le vecteur désiré pour être ligated.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. - Purifier les segments collectés à partir du gel agarose à l’aide d’un kit de purification PCR à base de silice et mesurer la concentration par spectrophotométrie à 260 nm.
- Ligate le GOI et le vecteur inductible avec la ligase d’ADN T4 utilisant un rapport vectoriel : insérer le rapport molaire de 1:3 pour augmenter la probabilité de ligature. Incuber la réaction à température ambiante (RT) pendant 3 h.
- Transformez la réaction de ligature en E. coli compétent (DH5).
- Ajouter 1-10 ng de vecteur et de gène à un tube contenant 100 ll de cellules compétentes. Incuber les cellules sur la glace pendant 30 min, puis les cellules à choc thermique à 42 oC pour 45 s. Placer le tube sur la glace pendant 2 min et ajouter 900 l 'L de RT LB moyen. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 oC avec secousses à 225 tr/min.
- Étendre 100 l de la réaction sur une plaque d’agar LB avec un antibiotique approprié (par exemple, 100 g/mL ampicilline pour le vecteur pTRE-Tight) pour sélectionner les bactéries transformées. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 oC.
- Sélectionnez les colonies individuelles à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’une pointe de 20 L et incuber toute la nuit dans un milieu de 5 ml de LB contenant l’antibiotique approprié à 37 oC avec secousses. Les bactéries transformées peuvent être stockées dans des stocks de glycérol à -80 oC à un rapport de 400:600 de LB moyen à glycérol.
- Extraire l’ADN plasmide à l’aide de colonnes plasmides à base de silice et mesurer la concentration par spectrophotométrie à 260 nm. Confirmer l’insertion du GOI par l’analyse de restriction et son orientation et l’absence de mutations potentiellement introduites pendant RT-PCR par séquençage.
2. Transfection du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI) dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires
- Isoler les cellules épithéliales alvéolaires de type II des poumons de rat.
- Ensemencer les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/cm2 en 100 mm Petri plats avec le milieu essentiel minimum complet (MEM complet). Le MEM complet est MEM complété par 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycin, Septra (3 g/mL trimethoprim et 17 g/mL sulfamethoxazole), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH - 7,3), et 2 m glutM-Lamine. Culture des cellules pendant 24 h à 37 oC en 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
- Le lendemain, placez 500 l de MEM complet sans antibiotique dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et avant la mise à l’avant-garde de la plaque à 37 oC pendant 30 min. Pendant cette étape, il est important d’utiliser du sérum bovin fœtal exempt de contamination des tétracyclines ou d’un niveau trop bas pour interférer avec l’inductibilité.
- Préparer des tubes de 1,5 mL contenant le plasmide avec le GOI inductible (GOI plasmide) et le vecteur réglementaire (p.pTet-Off) en ajoutant 1 g de plasmide GOI et 1 g de vecteur réglementaire par puits à RT. Pour les expériences de coexpression avec des protéines liant l’ARN (RBP), 1 g d’un vecteur constitutif (p. ex., pcDNA3) exprimant le RPB d’intérêt est ajouté au mélange d’ADN(figure 7).
- Aspirer le milieu et rincer doucement les cellules avec PBS (sans calcium et magnésium) pré-émaillée à 37 oC.
- Ajouter 5 ml de trypsine de 0,05 % préenchassa à 37 oC et incuber les cellules jusqu’à ce que les cellules soient détachées (2-4 min). Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 ml de MEM complet sans antibiotique.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, laver le plat Petri avec 4 ml de milieu pour recueillir autant de cellules restantes que possible, puis centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
- Aspirez et jetez doucement le supernatant et réutilisez la pastille dans 1 ml de PBS. Comptez et calculez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer doucement le supernatant et réanimer la granule dans un tampon de résuspension à une concentration de 4 x 107 cellules/mL. Ajouter les cellules du tube de 1,5 mL préparé à l’étape 2.4 à une concentration de 400 000 cellules par puits et les mélanger doucement en les canalisation de haut en bas.
- Placer le tube dans le dispositif d’électroporation et le remplir de 3,5 ml de tampon électrolytique.
- Insérer une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette en appuyant complètement sur le piston. Mélanger délicatement le contenu du tube de 1,5 mL et aspirer soigneusement les cellules avec la pipette. Veillez à empêcher les bulles d’air d’entrer dans la pointe, car cela provoquera l’arc électrique pendant l’électroporation et entraînera une diminution de l’efficacité de la transfection.
- Insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’il y ait un bruit de clic.
- Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires, correspondant à une tension d’impulsion de 1 450 V et 2 impulsions d’une largeur de 20 ms, et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.
- Immédiatement après la transfection, retirez la pipette et transférez les cellules à un puits préalablement rempli de MEM complet sans antibiotique qui a été préenchillé à 37 oC.
- Répéter les étapes 2.11-2.14 pour les échantillons restants.
- Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules sur la surface du puits. Incuber les cellules à 37 oC en 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. Après 2 jours, remplacer le milieu par meM complet avec des antibiotiques.
- Confirmer le succès de la transfection en observant l’expression de l’EGFP sous un microscope à fluorescence ou par cytométrie d’écoulement à l’aide d’un vecteur de contrôle(figure 1).
REMARQUE : Cette étape est facultative et nécessite une étape transfection supplémentaire à l’aide d’un plasmide différent exprimant eGFP, comme pcDNA3-EGFP.
3. Induction de l’inhibition de la transcription du GOI
REMARQUE : Les cellules peuvent être traitées à l’avance avec les traitements souhaités avant l’induction de doxycycline afin d’évaluer leur impact sur la stabilité de l’ARNm(figure 5).
- Préparer une solution de stock de doxycycline de 1 mg/mL dans de l’eau déionisée. Conservez la solution de stock à -20 oC protégée de la lumière. La doxycycline, un dérivé de la tétracycline, est utilisée au lieu de la tétracycline parce qu’elle a une demi-vie plus longue (2x) que la tétracycline. En outre, une concentration plus faible de doxycycline est nécessaire pour l’inactivation complète de l’opéon du tet 23.
REMARQUE : La doxycycline pourrait affecter l’expression d’ARNm du GOI endogène. Pour vérifier cela, l’effet d’un traitement de 24 h avec de la doxycycline sur les cellules alvéolaires devrait être testé pour confirmer l’absence de tout changement dans l’expression du goI(figure 2). - Préparer une solution de doxycycline fraîche de 1 g/mL en posttransfection COMPLÈTE MEM 72 h et la réchauffer à 37 oC.
- Remplacer le milieu par 1 ml de MEM complet contenant 1 g/mL doxycycline par puits pour inhiber la transcription du GOI.
- Incuber plusieurs puits à 37 oC en CO2 à 5% pour différentes quantités de temps de 15 min-6 h pour évaluer la demi-vie de l’ARNm.
- À la fin du traitement, laver les cellules avec PBS glacé et les lyse avec un kit d’extraction d’ARN phénol-chloroforme disponible dans le commerce en ajoutant 500 lil de tampon par puits et en secouant la plaque pour homogénéiser les cellules.
- Isolez l’ARN selon le protocole du fabricant. Déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nm. Les échantillons d’ARN avec des ratios d’ARN de 260:230 et 260:280 de 1,8 et 2,0, respectivement, sont considérés comme purs.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
4. Déterminer la stabilité de l’ARNm du GOI
- Traiter 1 g d’ARN total avec DNAse I (qualité d’amplification) sans ARN pour enlever toute trace d’ADN plasmide qui pourrait interférer avec l’amplification ultérieure de l’ADN.
- Dans un tube PCR de 0,2 mL, combinez 1 g d’ARN total, 1 ll de tampon de réaction DNase I de 10x, 1 L de DNAse I (1 U/L) et eau sans ARN pour obtenir un volume total de 10 L.
- Incuber la réaction à RT pendant 20 min.
- Désactiver DNAse I en ajoutant 1 lL de 25 mM EDTA au mélange de réaction de 10 L et en incuber la réaction à 70 oC pendant 10 min.
- Inverser-transcribe l’ARN total appauvri par l’ADN dans l’ADN cDNA à l’aide d’un kit de synthèse cDNA disponible dans le commerce avec un mélange d’amorces d’olig(dT) et d’héxamer aléatoire pour améliorer l’efficacité de la transcription inverse.
- En bref, ajoutez 4 L de mélange de réaction 5x, 1 l de transcriptase inverse et 4 L d’eau sans ARN à 11 lil du mélange total d’ARN appauvri par l’ADN pour obtenir un volume de réaction total de 20 L. Mélanger la réaction bien en la canalisation de haut en bas.
- Incuber la réaction pendant 5 min à 25 oC, suivie de 20 min à 46 oC, puis inactiver la réaction en l’incubant à 95 oC pendant 1 min. Chaque réaction produira 50 ng/L de produit d’ADN.
- Diluer la réaction de l’ADNC à une concentration de 5 ng/L en ajoutant 180 l 'L d’eau de biologie moléculaire-grade au mélange de réaction de 20 L. Entreposez les produits cDNA à -80 oC ou procédez immédiatement à l’exécution du PCR quantitatif en temps réel (QPCR).
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
- Concevez des amorces qPCR avant et inversées spécifiques au GOI.
- En raison de l’expression endogène du GOI dans les cellules, les amorces doivent être conçues pour amplifier un amplicon de 100-150 bp de l’épitope V5 couplé au GOI (tableau 1).
- Les amorceurs de gènes de référence interne doivent également être utilisées comme témoins de normalisation. Habituellement, les gènes d’entretien ménager, tels que les gènes bêta-actin et hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, sont utilisés comme gènes de référence. Cependant, ceux-ci ne peuvent pas être utilisés avec ce système d’induction en raison de la variation de l’efficacité transfection. Au lieu de cela, l’expression de la transcription tTA-Ad est évaluée aux fins de la normalisation, parce que son expression est constitutive dans les cellules en raison de l’activité du promoteur de cytomégalovirus. Toute variation de son expression mesurée par qPCR sera représentative de l’efficacité transfection (amorce : avant 5'-GCC TGA CGA CAGA GGA AAC TC-3' et inverser 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) et permettra la normalisation de l’expression des clones transfectés(figure 3).
- Préparer chaque réaction qPCR en triplicate à l’aide d’un mélange de maître de teinture SYBR Green.
- Diluer le mélange d’ADNC de 5 ng/L à une concentration de 1,25 ng/L à l’aide d’eau de qualité biologique moléculaire.
- Combinez 5 L de SYBR Green dye master mix (2x), 0.1 'L d’eau de biologie moléculaire de qualité, 0,45 L d’apprêt avant de 7,5 M, 0,45 ll de l’amorce inversée de 7,5 M et 4 L de 1,25 ng/L cDNA pour obtenir un volume de réaction total de 10 L. Mix bien par pipe de haut en bas dans une plaque de 96 puits PCR. Utilisez un film adhésif optique pour vous assurer que le couvercle de la plaque est scellé et pour prévenir la contamination et l’évaporation.
- Tournez brièvement le mélange de réaction par centrifugation et placez la plaque dans un thermocycler qPCR.
- Amplifier les amplicons GOI et tTA-Ad étiquetés V5 en utilisant les conditions qPCR suivantes : 95 oC pendant 10 min comme étape de dénaturation, suivie de 40 cycles de 95 oC pour 10 s, 58 oC pour 15 s et 72 oC pour 20 s. Une courbe de fonte haute résolution doit être générée après l’exécution des cycles d’amplification afin d’évaluer les températures de fonte spécifiques des amplicons désirés et d’assurer l’absence de pics d’amplicone sonore.
- Inclure des contrôles négatifs pour le QRT-PCR en effectuant qPCR avec l’ARN comme un modèle sans transcriptase inverse pour servir de contrôle pour la contamination potentielle de l’ADN plasmide et qPCR sans cDNA ajouté au mélange qPCR pour assurer le manque de dimers apprêt ou Contaminants.
- La concentration optimale d’ADNC, l’efficacité et la concentration d’apprêt doivent être optimisées selon le GOI par un essai standard de courbe. Pour ce faire, effectuer une dilution en série à l’aide de l’ADP à partir de cellules non traitées (cultivée sans doxycycline). La courbe standard est générée par tracer les valeurs Cq par rapport au journal du facteur de dilution de l’ADN, et l’efficacité d’amplification (E) est calculée en fonction de la pente de la courbe standard à l’aide de la formule suivante :
E 10-1/pente
REMARQUE : L’efficacité de l’amplification devrait être d’environ 0,9 à 1,05. Sinon, les amorces doivent être redessinées.
- Analyser les données qPCR à l’aide de la méthode comparative Cq en normalisant les valeurs d’expression du GOI à l’expression de tTA-Ad pour obtenir les niveaux d’expression relatifs de l’IER et pour signaler son expression en pourcentage de l’expression de l’ARN dans les cellules du même animal au point de départ (t - 0) (figure 4).
- La demi-vie est déterminée à partir de la constante de taux (K) de la courbe de dégradation de l’ARNm GOI en utilisant l’équation suivante :
t1/2 ln 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer un système d’expression plasmide transcriptionnellement contrôlé Tet-Off pour évaluer l’importance de différentes parties de l’UTR de l’ENaC 3 dans la modulation de la stabilité de transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.
La première étape de la mise en œuvre de ce système a été d’établir une technique de transfection rapide, facile et efficace pour les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire, qui sont difficiles à transfecter. Comme le montre la figure 1, la technique d’électroporation de pipette a permis un taux d’efficacité transfection de 25 à 30 %, comme le montrent les ratios des cellules eGFP détectées par la microscopie et la cytométrie du débit de fluorescence.
Avant d’appliquer ce système d’induction, qui est contrôlé par la tétracycline et ses dérivés, l’impact de ce médicament sur l’expression de notre GOI a été vérifié. Les cellules épithéliales alvéolaires ont été traitées avec la doxycycline de 1,0 g/mL pour évaluer son impact sur l’expression endogène de l’ARNm d’ENaC. Les traitements effectués sur une période de 1 à 24 h n’ont eu aucun impact significatif sur l’expression de la transcription endogène, comme le montre la figure 2.
Notre système d’expression plasmide contrôlé par transcription utilise une technique de normalisation qPCR qui diffère de la technique standard qui utilise des gènes d’entretien ménager. Dans le cas de l’expression de V5-ENaC, le signal a été normalisé selon le signal tTA-Adv pour déterminer l’efficacité de la transfection à l’aide de la méthode Cq. La figure 3 montre l’utilisation de la transcription tTA-Adv pour normaliser l’expression de l’ARNm.
Les résultats publiés précédemment suggèrent que l’utilisation de l’actinomycine D est inappropriée pour l’estimation de la stabilité de la transcription de l’AENaC, car elle indiquait une demi-vie anormalement élevée d’ARNm (environ 12 h)24. La demi-vie de l’ARNm de l’ANAC en présence du système Tet-Off (99 min) était jusqu’à 7 fois plus courte que celle trouvée en présence d’actinomycine D, comme le montre la figure 4. Cela confirme que l’actinomycine D conduit à une stabilisation de l’ARNmale de l’ÉnaC.
Ce système de Tet-Off a également été utilisé avec succès pour tester si différents facteurs de stress cellulaire connus pour affecter l’expression génique de l’ÉnaC pourraient moduler la stabilité de l’ARNm de l’ÉnaC. Comme le montre la figure 5, le traitement cycloheximide a considérablement diminué la stabilité (36 min) de la transcription, tandis que les lipopolysaccharides (LPS, utilisés pour imiter un stimulus infectieux) n’ont pas. Enfin, la cytokine pro-inflammatoire TNF-MD a provoqué une baisse drastique de la stabilité de l’ARNM V5-ENaC (avec une demi-vie de 16 min).
Dans le présent ouvrage, la stratégie de clonage avait pour but d’élucider la contribution de l’UTR 3' à la modulation de la transcription de l’ANAC. Plusieurs mutants de suppression séquentiels ont été générés et testés pour cartographier la contribution de différents domaines de l’UTR de l’ISNaC 3 à la stabilité des transcriptions. La figure 6 montre les changements importants dans la modulation de la stabilité de l’ARNM V5-ENaC en fonction des régions supprimées et incluses de l’UTR de 3'.
Enfin, la modulation de la stabilité de l’ARNm de l’ANAC par les protéines liant l’ARN (RBP) a été étudiée avec ce modèle. La transcription de l’ARNm de l’ENaC avec l’épitope V5 du vecteur pTRE-Tight est sous le contrôle exclusif de tTA-Adv. Dhx36, Tial1, et hnRNPK sont trois RBPs qui sont liés à l’UTR 3' de 'ENaC24. Par conséquent, toute modulation de l’expression de V5-ENaC après la cotransfection avec Dhx36, Tial1, ou hnRNPK, serait la conséquence de la modulation de la stabilité de l’ARNm et non de la modulation de transcription. La figure 7 montre que la surexpression du Dhx36 ou de Tial1, contrairement à celle de hnRNPK, a diminué la stabilité de l’ARNM V5-ENaC par rapport à la transfection avec le plasmide vide pcDNA3, qui montre la modulation spécifique de certains RBP.
Collectivement, ces résultats ont confirmé que le système d’expression plasmide Tet-Off contrôlé par transcription que nous avons développé représente un outil approprié pour évaluer la demi-vie réelle d’une transcription et les mécanismes impliqués dans sa modulation. Cet outil sera utile pour acquérir de nouvelles informations sur la régulation posttranscriptionnelle des IA clés impliquées dans la fonction de l’épithélium alvéolar dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Figure 1 : Efficacité de la transfection des cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire par électroporation de pipette. Les cellules épithéliales alvéolaires primaires ont été transitoirement transagènes avec 2 g d’un plasmide pcDNA3 (vide, clones #1 et #2) qui ont exprimé ou n’ont pas exprimé la protéine de GFP. L’efficacité de la transfection a été évaluée 48 h après transfection par (A) microscopie de fluorescence ou (B) cytométrie d’écoulement. ANOVA et Bonferroni test post hoc; P 'lt; 0.001 vs vide. Des cellules d’au moins quatre rats différents (n - 4) ont été utilisées pour chaque condition expérimentale. Barre d’échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Modulation de l’ARNm endogène de l’ENaC par la doxycycline dans les cellules épithéliales alvéolaires. Les cellules épithéliales alvéolaires ont été traitées avec la doxycycline de 1,0 g/mL pendant une période de 1-24 h. L’expression de l’ARNm de l’ENaC a été quantifiée par RT-PCR quantitative et présentée comme l’expression de l’ARNM de l’ENaC par rapport à celle des cellules non traitées (Ctrl; t et 0) après la normalisation selon l’expression d’actin (ANOVA à sens unique, n - 4). Doxycycline n’a pas modulé endogène l’ARNM de l’ANAC au fil du temps. Précédemment publié comme figure S4 dans Migneault et al.24. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Normalisation de l’expression d’ARNm de GOI avec une méthode modifiée de Cq selon l’expression de l’ARNM-Ad réglementaire. Les cellules épithéliales alvéolaires ont été transement cotransfectées par le plasmide pTet-Off et le plasmide pTRE-Tight codant de l’ENaC cDNA portant un V5 epitope en amont de son cadre de lecture ouvert et une séquence UTR complète de 3' . L’expression des V5-ENaC et des mARN tTA-Ad a été mesurée par RT-PCR quantitatif dans les cellules non traitées. (A) Les signaux fluorescents SYBR Green green (Rn) normalisés par delta de V5-ENaC et tTA-Ad de deux transfections distinctes (R1 et R2) sont représentés. (B) Graphique gauche : l’expression de l’ARNm de V5-ENaC et tTA-Ad dans chaque expérience (R1 et R2) sont exprimées comme valeur de quantification du cycle (Cq). La différence entre l’expression V5-ENaC et l’expression tTA-Ad mRNA (Cq) est présentée. Graphique à droite : L’utilisation de l’ARNM tTA-Ad à la place du gène d’entretien ménager permet la normalisation efficace de l’expression du GOI, qui a montré une expression relative de 0,98 en R1 par rapport à celle de R2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : La cinétique de dégradation de l’ARNM V5-ENaC lors de l’utilisation du système d’expression plasmide contrôlé par transcription en présence et en absence d’actinomycine D. Les cellules épithéliales alvéolaires primaires ont été transement cotransfectées par le plasmide pTet-Off et le plasmide moulant de pTRE-serré encodant le cDNA d’ENaC portant un V5 epitope en amont de son cadre de lecture ouvert et complète 3' séquences UTR. Les cellules prétraités ou non traitées avec l’actinomycine D (5,0 g/mL) pendant 30 min ont été incubées par la suite avec de la doxycycline (1,0 g/mL) pendant 15 min-6 h. L’expression de l’ARNM V5-ENaC a été mesurée par RT-PCR quantitative et présentée comme le pourcentage de V5-ENaC mRNA expression dans les cellules non traitées (t - 0) après normalisation selon l’expression de tTA-Ad. La demi-vie de l’ARNm V5-ENaC a été estimée par une régression non linéaire de désintégration d’une phase pour chaque préparation cellulaire. L’analyse de régression multiple a indiqué une différence statistiquement significative dans la stabilité de l’ARNM V5-ENaC dans les cellules traitées avec l’actinomycine D comparée à celle dans les cellules non traitées (p 'lt; 0.0001). Des cellules d’au moins quatre rats différents (n - 4) ont été utilisées pour chaque condition expérimentale. Publié précédemment sous le titre Figure 1 in Migneault et al.24. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Modulation de la stabilité de l’ARNM V5-ENaC par différents stress cellulaires et inflammatoires. Les cellules épithéliales alvéolaires primaires ont été transement cotransfectées par le plasmide pTet-Off et le plasmide moulant de pTRE-serré encodant le cDNA d’ENaC portant un V5 epitope en amont de son cadre de lecture ouvert et complète 3' séquences UTR. Les cellules ont été prétraités pendant 30 min avec 1,0 M cycloheximide (CHX) (A) ou 15 g/mL LPS (B) ou pour 5 h avec 100 ng/mL TNF- (C), suivis d’un traitement avec 1,0 g/mL doxycycline pour une période de 15-120 min. L’expression de l’ARNM V5-ENaC a été mesurée par RT-PCR quantitative et présentée comme le pourcentage de V5-ENaC mRNA expression dans les cellules non traitées (t - 0) après normalisation selon l’expression de tTA-Ad. Des cellules d’au moins trois rats différents (n - 3) ont été utilisées pour chaque condition expérimentale. (D) La demi-vie (t1/2) de V5-ENaC mRNA dans les cellules traitées a été comparée à la demi-vie de l’ARNm dans les cellules (Ctrl). Les demi-vies ont été mesurées en fonction de la constante de taux (K) de la courbe de dégradation de l’ARNM V5-ENaC à l’aide de l’équation t1/2 - ln 2/K, puis exprimées sous forme de min et seM (test ANOVA à sens unique et test post hoc Bonferroni; p 'lt; 0,01 contre contrôle; n 3). Adapté de la figure 36 publiée précédemment dans Migneault, F.25. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Utilisation de la stratégie séquentielle de clonage de suppression pour révéler le rôle des différentes régions de l’UTR de l’ÉNaC 3 dans la modulation de la stabilité de l’ARNm. (A) Carte schématique de la transcription V5-ENaC avec l’UTR complet de 3' inséré dans le vecteur d’expression pTRE-serré. Le cadre de lecture ouverte est représenté comme une boîte grise, tandis que l’UTR 3' est représenté comme une boîte blanche. La partie UTR de 3' de l’ARN de l’ANAC est représentée pour le clone portant un UTR complet de 3' et pour les différents mutants de suppression (Del 1 à Del 4). (B) Les cellules épithéliales alvéolaires primaires ont été transement cotransfectées avec des plasmides moudants codant différents mutants de suppression d’UTR de l’ENaC 3 ainsi que le plasmide pTet-Off, qui exprime tTA-Ad, pour permettre l’expression spécifique de la construction et de son inhibition par la doxycycline. Soixante-douze h après la transfection, les cellules ont été traitées avec de la doxycycline (1,0 g/mL) pendant 15 min à 6 h. L’expression de l’ARNV V5-ENaC a été mesurée par RT-PCR quantitatif et présentée comme le pourcentage de V5-ENaC mRNA expression dans les cellules non traitées (t - 0) après la normalisation selon l’expression de tTA-AD. La demi-vie V5-ENaC mRNA pour chaque construction a été estimée à partir de la constante de taux (K) de la courbe de dégradation de l’ARN MRNA V5-ENaC en utilisant l’équation suivante : t1/2 'ln 2/K. La pourriture de l’ARNm V5-ENaC est montrée pour le clone avec l’UTR complet de 3' (Comp) et pour les mutants del 1 à Del 4 3' de suppression UTR. La demi-vie (t1/2) de la pourriture de l’ARNm est donnée pour chaque clone. Dans le quadrant inférieur droit, le graphique montre une comparaison des différentes valeurs t1/2 - SEM estimées pour chaque clone. p 'lt; 0.05 entre les différents groupes selon le test Kruskal-Wallis. 0,05 euros selon le test post hoc de Dunn par rapport à l’UTR complet de 3'. 0,05 selon le test post hoc de Dunn par rapport à Del 3. Des cellules d’au moins cinq animaux différents (n - 5) ont été utilisées pour chaque condition expérimentale. Adapté des figures 2 et 3 publiées précédemment dans Migneault et coll.24. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Modulation posttranscriptionnelle de l’ARNM V5-ENaC par les protéines RNA-contraignantes hnRNPK, Dhx36 et Tial1. (A) Les cellules épithéliales alvéolaires primaires ont été cotransfectées par l’encodage plasmide à l’étox V5-ENaC avec un vecteur d’expression pour le Dhx36, hnRNPK, ou Tial1 RBPs et le plasmid pTet-Off. L’expression v5-ENaC mRNA a été quantifiée par RT-qPCR 72 h posttransfection et exprimée comme le pourcentage de l’expression V5-ENaC mRNA par rapport à celle des cellules transposées par un vecteur vide (pcDNA3) après normalisation selon l’expression tTA-Ad. La surexpression de Dhx36 et de Tial1 a considérablement inhibé l’expression de l’ARNM V5-ENaC, tandis que la surexpression de hnRNPK n’a eu aucun effet. 0,05 selon le test Kruskal-Wallis et le test post hoc de Dunn par rapport au vecteur vide; n 3 échantillons d’animaux différents ont été testés en double pour chaque condition expérimentale. (B) La partie proximale de l’UTR de l’ENaC 3' a été supprimée par clonage de la région distale de l’UTR 3' à côté du codon d’arrêt de l’ENaC dans le plasmide moulant (V5-ENaC-Del5). (C) Les cellules épithéliales alvéolaires primaires ont été cotransfectées par V5-ENaC ou V5-ENaC-Del5 dans le vecteur de pTRE-tight avec le plasmid pTet-Off et le vecteur d’expression pour la surexpression de Dhx36 ou Tial1 RBP. L’expression v5-ENaC mRNA a été quantifiée par RT-qPCR 72 h posttransfection et exprimée comme le pourcentage de LSI de v5-ENaC mRNA expression par rapport à celle dans les cellules transfected avec un vecteur vide (pcDNA3) après normalisation selon l’expression de tTA-Ad. La surexpression de Dhx36 et Tial1 n’a eu aucun effet sur l’expression V5-ENaC-Del5 mRNA. 0,05 selon le test Kruskal-Wallis et les tests post hoc de Dunn sur la comparaison des vecteurs expérimentaux au vecteur vide; #p’lt; 0,05 selon le Test U Mann-Whitney sur la comparaison des vecteurs expérimentaux au mutant UTR complet de 3'; n 6 pour chaque condition expérimentale. Adapté des figures 5 et 7 publiées précédemment dans Migneault et coll.24. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Un | |||
| Modèle | 3e UTR | Sens | Séquence |
| L’ADNA de l’ADNA de l’ADNA | Complet | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCCCT CCT-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCCCT-3' |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGCTTTTGGG-3' |
|
| Del 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| Del 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Cible | Sens | Séquence | |
| V5-ENaC | F | 5'-CCTAACCCTCCTCTGTGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTCTCC-3' | ||
Tableau 1 : Apprêts utilisés dans cette étude. (A) Apprêts utilisés pour le clonage et la génération des mutants V5-ENaC dans le vecteur inductible pTRE-tight. (B) Apprêts utilisés pour la mesure de l’expression de l’ARNm par RT-PCR quantitative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le faible taux de transfection des cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire a été une limitation sérieuse pour l’utilisation du système Tet-Off pour évaluer la stabilité de l’ARNm dans ces cellules. Cependant, cette limitation a été surmontée par l’électroporation de pipette, permettant une efficacité de transfection de 25-30%(figure 1 et figure 3)26.
La mesure de la stabilité de transcription est fondamentale pour comprendre la modulation d’un ARNm donné et son impact sur l’homéostasie cellulaire et le métabolisme. La variation de la biodisponibilité d’un GOI peut modifier l’efficacité de la traduction et avoir un impact direct sur l’expression du goI dans la cellule. Pour ces raisons, plusieurs techniques ont été développées pour déterminer la demi-vie des ARNm. Comme nous l’avons vu plus haut, chacune de ces techniques a des limites et des contraintes qui empêchent l’étude appropriée d’une transcription d’intérêt. Par rapport à d’autres techniques, le modèle TET-off développé ici a l’avantage de permettre l’estimation de demi-vie d’un ARNm donné dans n’importe quelle condition expérimentale. Cependant, il ne nous permet pas d’étudier directement la stabilité d’une transcription endogène. Pour surmonter cette limitation autant que possible, il est suggéré d’inclure les séquences UTR 5' et 3' UTR de la transcription dans le plasmide de sorte que la construction est aussi similaire que possible aux transcriptions endogènes. L’ajout de l’épitope V5 permet l’amplification spécifique de l’ARNm cible par RT-qPCR par rapport à celle de la transcription endogène. En ce qui concerne la stratégie de clonage, le choix de la séquence insérée en amont du gène d’intérêt est crucial pour empêcher l’amplification des signaux non spécifiques. L’ajout de la séquence d’épitope V5 5' de l’ORF est nécessaire pour l’amplification QPCR spécifique de la construction en raison de sa courte longueur et le manque de son expression dans les cellules épithéliales alvéolaires. Cette stratégie offre également l’occasion d’étudier la modulation de la traduction de protéines à l’aide du même système inductible. Malgré la petite taille de l’épitope V5 (42 nt), il est encore possible que cela puisse affecter la stabilité de la transcription. Pour cette raison, il est suggéré de tester également d’autres épitopes, tels que l’hémagglutinine de grippe humaine (HA) ou toute autre séquence qui n’est pas trouvée dans le transcriptome des cellules épithéliales alvéolaires.
Une limitation du système est l’utilisation de la doxycycline pour inhiber la transcription d’un GOI. Plusieurs rapports montrent que la doxycycline pourrait avoir un impact significatif sur le métabolisme cellulaire. L’utilisation de cet antibiotique dans 16HBE14 cellules bronchiques réduit la prolifération et augmente la mortalité due à l’apoptose27. En outre, la doxycycline a déjà été montrée pour être impliquée dans la modulation de la réponse inflammatoire de LPS28. Par conséquent, cet antibiotique pourrait avoir des effets hors cible qui peuvent affecter la stabilité de l’ARNm d’un GOI donné. Pour ces raisons, nous avons évalué l’impact de la doxycycline de 1 g/mL sur une période de 24 h sur les cellules non transs infectées et avons constaté qu’elle n’induisait aucun changement dans l’expression endogène de l’ARNm de l’ENaC(figure 2). Cette concentration a été choisie parce qu’elle est largement utilisée pour inhiber complètement la transcription du système Tet-Off et est recommandée pour minimiser les effets cytotoxiques29. Nous suggérons d’utiliser cette concentration dans les cellules épithéliales alvéolaires et nous recommandons de valider la concentration optimale pour l’étude d’autres gènes ou l’utilisation d’autres types de cellules avec le système Tet-Off.
Notre système utilise l’expression constitutive du GOI jusqu’à ce que sa transcription soit inhibée par la doxycycline. Il a été suggéré que les concentrations excessives d’ARNm peuvent être toxiques pour la cellule et affecter son métabolisme. Cela pourrait conduire à un changement dans la stabilité de la transcription goI, provoquant sa dégradation rapide en raison de la surexpression non physiologique30. Dans le cas de notre modèle Tet-Off, une telle toxicité n’a pas été observée, parce que les cellules transfected ont montré une morphologie semblable à celle des cellules saines non transsfected (données non montrées). Conformément à Tani et coll.31, qui ont démontré la validité du système Tet-Off dans la détermination de la demi-vie d’un ARNM, nos résultats ont montré que le système Tet-Off n’est pas toxique dans les cellules épithéliales alvéolaires et donne une demi-vie pour l’ARNm de l’ENaC qui ne reflète pas la surstatabilisation qui a été signalée en présence d’inhibiteurs transcriptionnels tels que actinomy Dcin(figure 4).
Le développement de ce système pour mesurer la demi-vie de l’ARNM remet en question les résultats observés lorsque la stabilité des transcriptions a été mesurée en présence d’inhibiteurs de transcription tels que l’actinomycine D. Cette méthode montre qu’une demi-vie de transcription peut être beaucoup plus courte que précédemment mesurée.
Notre modèle est très approprié pour étudier la modulation posttranscriptionale d’une transcription spécifique dans différentes conditions, y compris les conditions pro-inflammatoires ou la surexpression RBP, aussi bien qu’après le traitement avec l’ARN de silence. En outre, il permet la caractérisation des régions non traduites essentielles à la modulation posttranscriptionnelle des ARNm dans des conditions pathophysiologiques qui affectent les cellules épithéliales alvéolaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Francis Migneault a reçu une bourse du Réseau de santé respiratoire du Québec et du programme de formation pulmonaire des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), d’un programme d’études de la FRSQ et d’un poste d’étudiant de la Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Ces travaux ont été appuyés par la Chaire Gosselin-Lamarre en recherche clinique et les Instituts de recherche en santé du Canada [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
