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Genetics

प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता की जांच के लिए कुशल ट्रांसक्रिप्शनी नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली

Published: March 6, 2020 doi: 10.3791/60654
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,3, 2,3, 2,3
1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 3Département de médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

Summary

यहां, हम एक उपकरण प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्ट के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो एक प्रेरक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके एक पिपेट इलेक्ट्रोपोराशन तकनीक के साथ मिलकर किया जा सकता है।

Abstract

पोस्टट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन का अध्ययन किसी दिए गए मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के मॉड्यूलेशन और सेल होमोस्टोसिस और मेटाबोलिज्म पर इसके प्रभाव को समझने के लिए मौलिक है। दरअसल, ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति में उतार-चढ़ाव अनुवाद दक्षता और अंततः ट्रांसक्रिप्ट की सेलुलर गतिविधि को संशोधित कर सकता है। एमआरएनए के आधे जीवन की जांच करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, हालांकि इनमें से कुछ विधियों की सीमाएं हैं जो पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन के उचित अध्ययन को रोकती हैं। एक प्रमोटर इंडक्शन सिस्टम सिंथेटिक टेट्रासाइक्लिन-विनियमित प्रमोटर के नियंत्रण में ब्याज के जीन को व्यक्त कर सकता है। यह विधि सेल होमोस्टोसिस को परेशान किए बिना किसी भी प्रायोगिक स्थिति के तहत दिए गए एमआरएनए के आधे जीवन के अनुमान की अनुमति देती है। इस विधि की एक प्रमुख खामी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की आवश्यकता है, जो अलग प्राथमिक कोशिकाओं में इस तकनीक के उपयोग को सीमित करती है जो पारंपरिक ट्रांसफेक्शन तकनीकों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं। प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर उपयोग अल्वेलर एपिथेलियम के सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। प्राथमिक अल्वेलर कोशिकाओं की अनूठी विशेषताएं और फेनोटाइप इन कोशिकाओं में रुचि के जीन के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करना आवश्यक बनाते हैं। इसलिए, हमारा उद्देश्य प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में रुचि के mRNA के पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन की जांच करने के लिए एक उपन्यास उपकरण विकसित करना था। हमने प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में प्रतिलेखन रूप से नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली डालने के लिए एक तेज और कुशल क्षणिक क्षणिक प्रोटोकॉल तैयार किया। निर्माण को टैग करने के लिए एक वायरल एपिटोप का उपयोग करके यह क्लोनिंग रणनीति, एंडोजेनस mRNAs से अभिव्यक्ति का निर्माण करने के आसान भेदभाव के लिए अनुमति देती है। एक संशोधित क्वांटिफिकेशन चक्र (सीक्यू) विधि का उपयोग करके, ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति को अपने आधे जीवन को मापने के लिए विभिन्न समय अंतराल पर निर्धारित किया जा सकता है। हमारे डेटा प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में विभिन्न रोगविज्ञानी स्थितियों में पोस्टट्रांसक्रिप्शनियल विनियमन का अध्ययन करने में इस उपन्यास दृष्टिकोण की दक्षता प्रदर्शित करते हैं।

Introduction

mRNAs के आधे जीवन का निर्धारण करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है। पल्स-चेस क्षय तकनीक, जो लेबल वाले mRNAs का उपयोग करती है, न्यूनतम सेलुलर अशांति के साथ mRNAs के एक बड़े पूल के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है। हालांकि, यह दृष्टिकोण एक जीन ट्रांसक्रिप्ट के आधे जीवन के प्रत्यक्ष अनुमान की अनुमति नहीं देता है और विकास कारकों, आरओएस, अलार्मिन या सूजन1के साथ उत्तेजना के बाद एमआरएनए के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है।

ट्रांसक्रिप्शन अवरोधकों का उपयोग, जैसे कि ऐक्टिनोमाइसिन डी और α-amanitin, समय के साथ एमआरएनए क्षरण काइनेटिक्स को मापने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तरीका है। पिछली तकनीकों पर इस दृष्टिकोण का एक मुख्य लाभ, (यानी, पल्स-चेस) सीधे किसी दिए गए ट्रांसक्रिप्ट के आधे जीवन का अनुमान लगाने की क्षमता पर निर्भर करता है और तुलना करता है कि विभिन्न उपचार इसके क्षरण गतिज को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, सेल फिजियोलॉजी पर प्रतिलेखन अवरोधकों का महत्वपूर्ण हानिकारक प्रभाव दृष्टिकोण2की एक बड़ी खामी का प्रतिनिधित्व करता है। दरअसल, इन दवाओं के साथ पूरे सेल ट्रांसक्रिप्टोम के अवरोध में एमआरएनए स्थिरता में शामिल प्रमुख तत्वों के संश्लेषण को क्षत-भंग करने का नकारात्मक दुष्प्रभाव होता है, जैसे माइक्रोआरएनए (miRNAs), साथ ही आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति और संश्लेषण, जो एमआरएनए क्षरण और स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए इन दवाओं द्वारा जीन प्रतिलेखन का गंभीर क्षोभ टेप के क्षरण घटता को कलाकृतियों से संशोधित कर सकता है ।

प्रमोटर इंडक्शन सिस्टम एक विशिष्ट एमआरएनए के आधे जीवन को मापने के लिए एक तीसरे दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। यह विधि एक विशिष्ट एमआरएनए के क्षरण को इसी तरह से उन तरीकों के रूप में मापता है जो प्रतिलेखन अवरोधकों का उपयोग करते हैं। दो प्रकार के इंडक्शन सिस्टम का अक्सर उपयोग किया जाता है: सीरम-प्रेरित सी-फॉस प्रमोटर3 और टीईटी-ऑफ इंड्यूसिबल सिस्टम4। सी-फॉस सिस्टम के साथ, ट्रांसक्रिप्शन अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है जो कोशिका के लिए विषाक्त हो सकते हैं। हालांकि, इस विधि के लिए सेल चक्र सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता होती है, जो इंटरफेज5के दौरान ट्रांसक्रिप्ट की वास्तविक स्थिरता के मूल्यांकन को रोकता है। इसके विपरीत, टीईटी-ऑफ प्रणाली सिंथेटिक टेट्रासाइक्लिन-विनियमित प्रमोटर के नियंत्रण में जीन ऑफ इंटरेस्ट (भारत सरकार) की मजबूत अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। इस प्रणाली को दो तत्वों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है जिन्हें कार्यात्मक होने के लिए कोशिका में प्रतिकार किया जाना चाहिए। पहला प्लाज्मिड (पीटीईटी-ऑफ) नियामक प्रोटीन टीटीए-एडीवी को व्यक्त करता है, जो प्रोकैरियोटिक दमनक टेटर (एस्चेरिचिया कोलाई से) से बना एक हाइब्रिड सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है, जो वायरल प्रोटीन एचएसवी VP16 से तीन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसएक्टिवेशन डोमेन में जुड़ा हुआ है। भारत सरकार को एक सिंथेटिक प्रमोटर (पीटाइट)के नियंत्रण में PTRE-तंग प्लाज्मिड में क्लोन किया जाता है, जिसमें साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर के न्यूनतम अनुक्रम शामिल हैं जो टेटओ ऑपरेटर अनुक्रम के सात दोहराता है। पीटाइट के जीन डाउनस्ट्रीम का ट्रांसक्रिप्शन टेटओ के साथ टेटआर की बातचीत पर निर्भर है। टेट्रासाइक्लिन या इसके व्युत्पन्न, डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में, टेटआर दमन टीईटीओ ऑपरेटर के लिए अपनी आत्मीयता खो देता है, जिससे ट्रांसक्रिप्शन4की समाप्ति होती है। टीईटी-ऑफ प्रणाली की विशेषताएं इसे यूकेरियोटिक कोशिकाओं में विशिष्ट एमआरएनए अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल बनाती हैं, जबकि संभावित प्लियोट्रोपिक प्रभावों से बचती हैं जो यूकेरियोटिक सेल6में प्रोकैरियोटिक नियामक दृश्यों के अभाव के लिए माध्यमिक हैं। आमतौर पर, नियंत्रणीय जीन अभिव्यक्ति7,8,9तक सुविधाजनक पहुंच के लिए नियामक और प्रतिक्रिया प्लाज्मिड की प्रतियों को एकीकृत करने के लिए इस प्रणाली के साथ दोगुना स्थिर टीईटी-ऑफ सेल लाइनों (एचईके 293, वाघेला और पीसी12) का उपयोग किया जाता है।

संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के कई मॉडलों का उपयोग अल्वेलर एपिथेलियम के सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। वर्षों से, शोधकर्ताओं ने मानव या कृंतक प्राथमिक कोशिकाओं10,11 के साथ-साथ मानव A549 या चूहा RLE-6TN कोशिकाओं12,13के रूप में अमर सेल लाइनों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया है । यद्यपि वे आम तौर पर कम प्रोलिफेरेटिव और संस्कृति के लिए अधिक कठिन होते हैं और ट्रांसफेट करने के लिए, प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाएं शारीरिक और रोग की स्थितियों में अल्वेलर एपिथेलियम के कार्य और शिथिलता के अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई हैं। दरअसल, अमर सेल लाइनें जैसे A549 कोशिकाएं प्राथमिक कोशिकाओं की जटिल विशेषताओं और फेनोटाइप का प्रदर्शन नहीं करती हैं, जबकि प्राथमिक संस्कृति में एल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाएं अल्वेलर एपिथेलियम के मुख्य गुणों को फिर से तैयार करती हैं, विशेष रूप से ध्रुवीकृत और तंग बाधा14,15बनाने की क्षमता। दुर्भाग्य से, ये कोशिकाएं पारंपरिक ट्रांसफेक्शन तकनीकों के लिए बहुत प्रतिरोधी हैं, जैसे कि लिपोसोम का उपयोग करने वाले, टीईटी-ऑफ जैसे प्रमोटर-प्रेरित प्रणाली का उपयोग बहुत मुश्किल बना रहे हैं।

16की जीन अभिव्यक्ति को तेजी से कम करने के लिए mRNA का पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन सबसे प्रभावी तरीकों में से एक है । एमआरएनए 3 का अअनुवादित क्षेत्र (3' यूटीआर) इस तंत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यह दिखाया गया है कि, 5 ' यूटीआर के विपरीत, 3 ' यूटीआर की लंबाई और किसी जीव की सेलुलर और रूपात्मक जटिलताओं के बीच एक घातीय संबंध है । इस सहसंबंध से पता चलता है कि एमआरएनए कोडिंग क्षेत्रों की तरह 3 ' यूटीआर, प्राकृतिक चयन के अधीन किया गया है ताकि पूरे विकास17में तेजी से जटिल पोस्टट्रांसक्रिप्शनी मॉड्यूलेशन की अनुमति दी जा सके। 3' यूटीआर में प्रोटीन और एमआईएनआरए के लिए कई बाध्यकारी साइटें शामिल हैं जो ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता और अनुवाद को प्रभावित करती हैं।

वर्तमान कार्य में, हमने ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता के नियंत्रण के लिए भारत सरकार के 3 'यूटीआर में अत्यधिक संरक्षित डोमेन की भूमिका की जांच करने के लिए एक उपकरण विकसित किया। हमने एपिथेलियल सोडियम चैनल, अल्फा सबयूनिट (αENaC) पर ध्यान केंद्रित किया, जो अल्वेलर एपिथेलियल फिजियोलॉजी18में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को टीईटी-ऑफ प्रणाली के दो घटकों से सफलतापूर्वक क्षणिक रूप से ट्रांसिफिक रूप से ट्रांसिफेशन सिस्टम के दो घटकों से संक्रमित किया गया था, जो एक ऐसी प्रणाली के साथ एमआरएनए स्थिरता में 3 ' यूटीआर की भूमिका के अध्ययन के लिए अनुमति देता है जो अन्य प्रोटोकॉल के साथ ट्रांसक्रिप्शन अवरोधकों के उपयोग की तुलना में सेल फिजियोलॉजी और चयापचय को कम से प्रभावित करता है। एक गैर-व्यक्त किए गए एपिटोप (V5) का उपयोग करके भारत सरकार की अभिव्यक्ति को एंडोजेनस जीन से अलग करने के लिए एक क्लोनिंग रणनीति विकसित की गई थी। प्रतिक्रिया और नियामक प्लाज्मिड को फिर पिपेट इलेक्ट्रोपोराशन तकनीक का उपयोग करके अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया गया था। बाद में, ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति को विभिन्न समय अंतराल पर डॉक्सीसाइक्लिन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करके मापा गया था। ट्रांसक्रिप्ट के आधे जीवन का मूल्यांकन आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सामान्यीकरण के लिए ट्रांससंक्रमित टीटीए-एड एमआरएनए उत्पाद का उपयोग करके संशोधित सीक्यू विधि के साथ किया गया था। हमारे प्रोटोकॉल के माध्यम से, हम विभिन्न परिस्थितियों में एक ट्रांसक्रिप्ट के पोस्टट्रांसक्रिप्शनमॉड्यूलेशन का अध्ययन करने और अअनुवादित क्षेत्रों की भागीदारी को अधिक विस्तार से परिभाषित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं पशु देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया और केंद्र अस्पताल में टरमेंटर डी l 'Université de मॉन्ट्रियल (CRCHUM) के अनुसंधान केंद्र की संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. डिजाइन और प्रतिक्रिया प्लाज्मिड की पीढ़ी ब्याज के जीन व्यक्त (भारत सरकार)

  1. एक प्रेरक टेट्रासाइक्लिन-ऑफ वेक्टर का उपयोग करें, जैसे कि PTRE-टाइट।
  2. भारत सरकार में आंतरिक रूप से मौजूद एमसीएस में प्रतिबंध स्थलों की पहचान करने के लिए भारत सरकार और वेक्टर की मल्टीपल क्लोनिंग साइट (एमसीएस) के अनुक्रम का विश्लेषण करें।
  3. प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को पुरुष स्प्राग-डाबले चूहे फेफड़ों से अलग करें जैसा कि पहले19,20वर्णित था।
  4. इस तरह के phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण या सिलिका आधारित आरएनए स्पिन स्तंभों के उपयोग के रूप में एक मानक विधि का उपयोग कर आरएनए निष्कर्षण द्वारा alveolar एपिथेलियल कोशिकाओं से कुल आरएनए शुद्ध ।
  5. रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन एमआरएनए को ओलिगो (डीटी) और उच्च निष्ठा रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस का उपयोग करके पूरक डीएनए (सीडीएनए) में टाइप करें।
  6. डिजाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करके दो चयनित प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों के साथ भारत सरकार को पार्श्व करने के लिए उच्च निष्ठा Taq बहुलक और मानक ओवरलैप पीसीआर तकनीकों का उपयोग करें।
    1. क्या फॉरवर्ड प्राइमर में एमआरएनए स्थिरता के समानांतर प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए अभिव्यक्ति के स्तर में सुधार करने के लिए एक कोजाक आम सहमति राइबोसोम बाध्यकारी साइट21 शामिल है। भारत सरकार के V5 epitope अपस्ट्रीम को एन्कोडिंग करने वाले एक अनुक्रम को अंतरित भारत सरकार की अभिव्यक्ति(तालिका 1)से ट्रांससंक्रमित भारत सरकार की अभिव्यक्ति को अलग करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए।
    2. क्या रिवर्स प्राइमर में स्टॉप कोडन के बाद पॉलीएडेनेशन सिग्नल होता है।
  7. म्यूटेंट को अनुक्रमिक विलोपन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है ताकि सरकार के एमआरएनए की स्थिरता पर विभिन्न 3 ' यूटीआर क्षेत्रों के प्रभावों का अध्ययन किया जा सके, जो एक पॉलीएडेनेशन साइट को एन्कोडिंग रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके है जो धीरे-धीरे सरकार 3 'यूटीआर(चित्रा 6)के 3 के अंत को हटा देता है। वैकल्पिक रूप से, पीसीआर निर्देशित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग 3 ' यूटीआर22में रुचि के एक विशिष्ट क्षेत्र को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है।
  8. 1 घंटे के लिए उपयुक्त ऊष्मायन तापमान पर पहले से चुने गए प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्रेरक वेक्टर और डालने को पचाएं, इसके बाद आत्म-लिगेशन से बचने के लिए 30 न्यूनतम के लिए वेक्टर प्रतिक्रिया के दौरान फॉस्फेटेज़ के साथ उपचार किया जाता है।
  9. 1-1.5% अगारोज जेल (डालने के आकार के आधार पर एकाग्रता) में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पचाए गए वेक्टर और डालें खंडों को अलग करें।
  10. एक ब्लेड और यूवी प्रकाश का उपयोग करना, वांछित डालने और वेक्टर युक्त डीएनए टुकड़े इकट्ठा करने के लिए ligated किया जाएगा ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  11. सिलिका आधारित पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके अगारोज जेल से एकत्र किए गए खंडों को शुद्ध करें और 260 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा एकाग्रता को मापें।
  12. एक वेक्टर का उपयोग कर टी 4 डीएनए लिगास के साथ भारत सरकार और प्रेरक वेक्टर को लिगेट करें: लिगेशन की संभावना को बढ़ाने के लिए 1:3 का मोलर अनुपात डालें। 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रतिक्रिया इनक्यूबेट करें ।
  13. लिगेशन रिएक्शन को सक्षम ई कोलाई (DH5α) में बदलें।
    1. सक्षम कोशिकाओं के 100 माइक्रोन युक्त ट्यूब में वेक्टर और जीन के 1-10 एनजी जोड़ें। बर्फ पर कोशिकाओं को 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें और फिर 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हीट शॉक कोशिकाएं। 2 मिन के लिए ट्यूब को बर्फ पर रखें और आरटी एलबी मीडियम के 900 माइक्रोन जोड़ें। 225 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. एक उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ एक पौंड आगर प्लेट पर प्रतिक्रिया के 100 μL फैल (जैसे, 100 μg/pTRE-तंग वेक्टर के लिए एमएल ampicillin) बदल बैक्टीरिया का चयन करने के लिए। प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कर लें।
    3. एक टीका पाश या एक 20 μL टिप का उपयोग कर व्यक्तिगत कालोनियों का चयन करें और 5 mL पौंड माध्यम में रातोंरात इनक्यूबेट जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबायोटिक मिलाते हुए मिलाते हुए। परिवर्तित बैक्टीरिया को ग्लाइसेरोल के 400:600 के अनुपात में -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लाइसेरोल स्टॉक में संग्रहित किया जा सकता है।
  14. सिलिका आधारित प्लाज्मिड कॉलम का उपयोग करप्लामिड डीएनए निकालें और 260 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा एकाग्रता को मापें। प्रतिबंध विश्लेषण और उसके अभिविन्यास और अनुक्रमण द्वारा आरटी-पीसीआर के दौरान संभावित रूप से पेश किए गए म्यूटेशन की अनुपस्थिति द्वारा भारतीय सरकार के सम्मिलन की पुष्टि करें।

2. प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में ब्याज (भारत सरकार) के जीन को व्यक्त करने वाली प्रतिक्रिया प्लाज्मिड का ट्रांसफेक्शन

  1. चूहे के फेफड़ों से टाइप II अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करें।
  2. 1x 106 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर कोशिकाओं को पूर्ण न्यूनतम आवश्यक माध्यम (पूर्ण एमईएम) के साथ 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में बीज करें। पूर्ण MEM 10% FBS, ०.०८ मिलीग्राम/एल टोब्रामाइसिन, सेप्ट्रा (3 μg/mL trimethoprim और 17 μg/mL sulfamethoxazole), ०.२% NaHCO3,०.०१ एम HEPES (pH = ७.३), और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक है । कल्चर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं।
  3. अगले दिन, एक नई 12 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एंटीबायोटिक के बिना पूर्ण एमईएम के 500 माइक्रोन रखें और 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को प्रीवार्म करें। इस चरण के दौरान, टेट्रासाइक्लिन को दूषित करने से मुक्त या उत्प्रेरण में हस्तक्षेप करने के लिए बहुत कम स्तर के साथ भ्रूण गोजातीय सीरम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
  4. प्रेरक सरकार (जीओआई प्लाज्मिड) और नियामक वेक्टर (जैसे, पीटीईटी-ऑफ) के साथ प्लाज्मिड युक्त 1.5 एमएएल ट्यूब तैयार करें, जिसमें आरटी में प्रति अच्छी तरह से सरकार के प्लाज्मिड के 1 μg और 1 ग्राम नियामक वेक्टर जोड़कर। आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) के साथ सहअभिव्यक्ति प्रयोगों के लिए, आरपीबी ऑफ इंटरेस्ट को व्यक्त करने वाले संविलियन वेक्टर (उदाहरण के लिए, pcDNA3) का 1 μg डीएनए मिश्रण(चित्रा 7)में जोड़ा जाता है।
  5. मध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) के साथ कोशिकाओं को कुल्लाएं।
  6. 0.05% ट्रिप्सिन के 5 मिलील को 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ही जोड़ें और कोशिकाओं को अलग होने तक कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (2-4 मिन)। एंटीबायोटिक के बिना पूर्ण एमईएम के 10 mL जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें।
  7. एक 50 मीटर ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए, मध्यम के 4 mL के साथ पेट्री डिश धोने के लिए संभव के रूप में कई शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, और फिर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  8. धीरे-धीरे एस्पिरेट करें और सुपरनेटेंट को त्यागें और पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना और गणना करें।
  9. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। 4 x 107 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर रिस्पेंशन बफर में गोली को धीरे से एस्पिरेट करें। 1.5 mL ट्यूब से कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति 400,000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर 2.4 चरण में तैयार करें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके उन्हें मिलाएं।
  10. ट्यूब को इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस में रखें और इसे इलेक्ट्रोलाइटिक बफर के 3.5 mL से भरें।
  11. पिस्टन को पूरी तरह से दबाकर एक पिपेट में सोने पर चढ़ाया इलेक्ट्रोड टिप डालें। धीरे-धीरे 1.5 मिलील ट्यूब की सामग्री को मिलाएं और ध्यान से कोशिकाओं को पिपेट के साथ एस्पिरेट करें। टिप में प्रवेश करने से हवा के बुलबुले को रोकने के लिए सावधान रहें, क्योंकि इससे इलेक्ट्रोपोराशन के दौरान इलेक्ट्रिक आर्किंग होगी और ट्रांसफेक्शन दक्षता में कमी आएगी।
  12. इलेक्ट्रोपॉशन स्टेशन में पिपेट डालें जब तक कि क्लिक करने वाली आवाज न हो।
  13. अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए उपयुक्त इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का चयन करें, 1,450 वी और 2 दालों की एक पल्स वोल्टेज के अनुरूप 20 एमएस की चौड़ाई के साथ, और टचस्क्रीन पर प्रेस स्टार्ट।
  14. ट्रांसफेक्शन के तुरंत बाद, पिपेट को हटा दें और कोशिकाओं को एंटीबायोटिक के बिना पूर्ण एमईएम से भरे कुएं में स्थानांतरित करें जिसे 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म किया गया है।
  15. शेष नमूनों के लिए 2.11-2.14 कदम दोहराएं।
  16. कोशिकाओं को अच्छी तरह से सतह पर समान रूप से फैलाने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं। आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 2 दिनों के बाद, माध्यम को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूर्ण एमईएम के साथ बदलें।
  17. एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत eGFP की अभिव्यक्ति देख या एक नियंत्रण वेक्टर(चित्रा 1)का उपयोग कर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ट्रांसफेक्शन की सफलता की पुष्टि करें ।
    नोट: यह कदम वैकल्पिक है और इस तरह के pcDNA3-EGFP के रूप में eGFP व्यक्त एक अलग प्लाज्मिड का उपयोग कर एक अतिरिक्त ट्रांसफेक्शन कदम की आवश्यकता है ।

3. सरकार के प्रतिलेखन अवरोध को शामिल करना

नोट: कोशिकाओं को mRNA स्थिरता पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए doxycycline प्रेरण से पहले वांछित उपचार के साथ पुनर्व्यवहार किया जा सकता है(चित्रा 5)।

  1. डिओनाइज्ड पानी में 1 एमजी/एमजी का डॉक्सीसाइक्लीन स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस प्रकाश से संरक्षित स्टॉक समाधान स्टोर करें। डॉक्सीसाइक्लिन, एक टेट्रासाइक्लिन डेरिवेटिव, टेट्रासाइक्लिन के बजाय उपयोग किया जाता है क्योंकि इसमें टेट्रासाइक्लिन की तुलना में लंबा आधा जीवन (2x) होता है। इसके अलावा, टीईटी ऑपरन23के पूर्ण निष्क्रियता के लिए डॉक्सीसाइक्लिन की कम एकाग्रता की आवश्यकता होती है।
    नोट: Doxycycline एंडोजेन्सस भारत सरकार की एमआरएनए अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है। इसे सत्यापित करने के लिए, भारत सरकार की अभिव्यक्ति(चित्रा 2)में किसी भी परिवर्तन की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए अल्वेलर कोशिकाओं पर डॉक्सीसाइक्लिन के साथ 24 घंटे के उपचार के प्रभाव का परीक्षण किया जाना चाहिए।
  2. पूरा एमईएम 72 एच पोस्टट्रांसफेक्शन में एक ताजा 1 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन समाधान तैयार करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. भारत सरकार के प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए 1 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन प्रति अच्छी तरह से युक्त पूर्ण एमईएम के 1 mL के साथ माध्यम को बदलें ।
  4. भारत सरकार के एमआरएनए के आधे जीवन का आकलन करने के लिए 15 मिन-6 एच से अलग-अलग समय के लिए 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कई कुओं को इनक्यूबेट करें।
  5. उपचार के अंत में, कोशिकाओं को बर्फ-ठंडा पीबीएस से धोएं और उन्हें वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फिनॉल-क्लोरोफॉर्म आरएनए निष्कर्षण किट के साथ प्रति अच्छी तरह से बफर के 500 माइक्रोन जोड़कर और कोशिकाओं को समरूप करने के लिए प्लेट मिलाते हुए।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए को अलग करें। 230, 260, और 280 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा आरएनए उपज और शुद्धता निर्धारित करें। क्रमशः 1.8 और 2.0 के 260:230 और 260:280 अनुपात वाले आरएनए नमूने को शुद्ध माना जाता है।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

4. सरकार की एमआरएनए स्थिरता का निर्धारण

  1. प्लाज्मिड डीएनए के किसी भी निशान को हटाने के लिए RNAse-मुक्त DNAse I (प्रवर्धन ग्रेड) के साथ कुल आरएनए के 1 μg का इलाज करें जो बाद के डीएनए प्रवर्धन में हस्तक्षेप कर सकता है।
    1. 0.2 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूब में, कुल आरएनए के 1 μg, 1 0x DNase I रिएक्शन बफर के 1 μL, DNAse I (1 U/μL) के 1 μL, और RNAse मुक्त पानी 10 μL की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए गठबंधन ।
    2. 20 मिन के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया इनक्यूबेट ।
    3. DNAse I को निष्क्रिय करें 10 माइक्रोन रिएक्शन मिक्स में 25 मीटर ईटीए के 1 माइक्रोन जोड़कर और 10 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेटकरन करें।
  2. रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता में सुधार करने के लिए ओलिगो (डीटी) और यादृच्छिक हाइक्कर प्राइमर के मिश्रण के साथ वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके डीएनए-समाप्त कुल आरएनए को सीडीएनए में समाप्त कर दिया जाता है।
    1. संक्षेप में, 5x रिएक्शन मिक्स के 4 माइक्रोन, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ के 1 माइक्रोन, और आरएनएएसई-फ्री वॉटर के 4 माइक्रोन को डीएनए-समाप्त कुल आरएनए मिश्रण के 11 माइक्रोन में जोड़ें ताकि 20 माइक्रोन की कुल प्रतिक्रिया मात्रा प्राप्त की जा सके। प्रतिक्रिया को अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, इसके बाद 20 मिन 46 डिग्री सेल्सियस पर, और फिर 1 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया से सीडीएनए उत्पाद का 50 एनजी/माइक्रोन निकलेगा।
    3. 20 माइक्रोन रिएक्शन मिक्स में आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी के १८० माइक्रोन जोड़कर 5 एनजी/μL की एकाग्रता के लिए सीडीएनए प्रतिक्रिया को कमजोर करें । सीडीएनए उत्पादों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  3. भारतीय सरकार के लिए विशिष्ट आगे और रिवर्स qPCR प्राइमर डिजाइन।
    1. कोशिकाओं में भारत सरकार की एंडोजेनस अभिव्यक्ति के कारण, प्राइमर को भारत सरकार(तालिका 1)के साथ मिलकर V5 एपिटोप के 100-150 बीपी एम्प्लिकेशन को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए।
    2. आंतरिक संदर्भ जीन प्राइमर का उपयोग सामान्यीकरण नियंत्रण के रूप में भी किया जाना चाहिए। आमतौर पर हाउसकीपिंग जीन, जैसे बीटा-ऐक्टिन और हाइपोक्सेंथिन फॉस्फोरीबोसिलट्रांसफरेज़ 1 जीन, संदर्भ जीन के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि, ट्रांसफेक्शन दक्षता की भिन्नता के कारण इस इंडक्शन सिस्टम के साथ इनका उपयोग नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, टीटीए-विज्ञापन ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति को सामान्यीकरण के प्रयोजनों के लिए मूल्यांकन किया जाता है, क्योंकि साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर की गतिविधि के कारण कोशिकाओं में इसकी अभिव्यक्ति संविलियन होती है। क्यूपीसीआर द्वारा मापी गई इसकी अभिव्यक्ति में कोई भिन्नता ट्रांसफेक्शन दक्षता (प्राइमर: फॉरवर्ड 5'-जीसीसी टीजीए सीजीए सीएए एसी टीसी-3' और रिवर्स 5'-एजीटी जीजीजी एट गेट जीसीसी टीजीटी सीसी-3; 129 बीपी एम्प्लिकन) का प्रतिनिधि होगा और ट्रांससंक्रमित क्लोन(चित्रा 3)की अभिव्यक्ति को सामान्य बनाने की अनुमति देगा।
  4. एक SYBR ग्रीन डाये मास्टर मिश्रण का उपयोग कर ट्रिपलेट में प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया तैयार करें।
    1. आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी का उपयोग करके 1.25 एनजी/माइक्रोन मिश्रण को 1.25 एनजी/माइक्रोन की एकाग्रता में पतला करें।
    2. SYBR ग्रीन डाये मास्टर मिक्स (2x), आणविक जीव विज्ञान के ०.१ μL-ग्रेड पानी, ७.५ माइक्रोएम फॉरवर्ड प्राइमर के ०.४५ μL, ७.५ माइक्रोएम रिवर्स प्राइमर के ०.४५ माइक्रोन, और १.२५ एनजी/μL cDNA के 4 μL को मिलाकर 10 माइक्रोन की कुल प्रतिक्रिया मात्रा प्राप्त करने के लिए मिक्स करें । यह सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म का उपयोग करें कि प्लेट कवर को सील कर दिया जाए और संदूषण और वाष्पीकरण को रोका जा सके।
    3. प्रतिक्रिया मिश्रण को संक्षेप में केंद्रीकरण द्वारा स्पिन करें और प्लेट को क्यूपीसीआर थर्मोसाइकिलर में रखें।
  5. निम्नलिखित क्यूपीसीआर स्थितियों का उपयोग करके V5-टैग किए गए भारत सरकार और टीटीए-विज्ञापन एम्प्लिस को बढ़ाना: 10 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस एक डेनाटुरिशन चरण के रूप में, इसके बाद 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 15 एस के लिए 58 डिग्री सेल्सियस और 20 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। वांछित एम्प्लिस के विशिष्ट पिघलने वाले तापमान का आकलन करने और शोर एम्प्लिकन चोटियों की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए प्रवर्धन चक्र ों के प्रदर्शन के बाद एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने वाले वक्र उत्पन्न किए जाने चाहिए।
    1. क्यूपीसीआर मिक्स में बिना सीडीएनए के लिए नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ के बिना आरएनए के साथ क्यूपीसीआर प्रदर्शन करके क्यूआरटी-पीसीआर के लिए नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें या प्राइमर डिमर्स या Contaminants.
    2. इष्टतम सीडीएनए एकाग्रता, प्राइमर दक्षता और एकाग्रता को मानक वक्र परख द्वारा सरकार के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, अनुपचारित कोशिकाओं (डॉक्सीसाइक्लिन के बिना सुसंस्कृत) से सीडीएनए का उपयोग करके एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। मानक वक्र सीडीएनए कमजोर पड़ने कारक के लॉग के खिलाफ सीक्यू मूल्यों की साजिश रचने से उत्पन्न होता है, और प्रवर्धन दक्षता (ई) की गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके मानक वक्र की ढलान के अनुसार की जाती है:
      ई = 10-1/ढलान
      नोट: प्रवर्धन दक्षता लगभग 0.9 से 1.05 होनी चाहिए। अन्यथा, प्राइमर को फिर से डिजाइन किया जाना चाहिए।
  6. भारत सरकार के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए टीटीए-विज्ञापन की अभिव्यक्ति के लिए भारत सरकार के अभिव्यक्ति मूल्यों को सामान्य बनाकर तुलनात्मक सीक्यू विधि का उपयोग करके क्यूपीसीआर डेटा का विश्लेषण करें और प्रारंभिक बिंदु (टी = 0)(चित्रा 4)पर एक ही जानवर से कोशिकाओं में भारत सरकार की एमआरएनए अभिव्यक्ति के प्रतिशत के रूप में अपनी अभिव्यक्ति की रिपोर्ट करें।
  7. आधा जीवन निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके भारत सरकार के एमआरएनए क्षरण वक्र की दर स्थिर (कश्मीर) से निर्धारित किया जाता है:
    टी1/2 = एलएन 2/K ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्राथमिक एल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता के मॉड्यूलेशन में αENaC 3 ' यूटीआर के विभिन्न भागों के महत्व का मूल्यांकन करने के लिए टीईटी-ऑफ ट्रांसक्रिप्शनी नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली उत्पन्न करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था।

इस प्रणाली के कार्यान्वयन में पहला कदम प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक तेज, आसान और कुशल ट्रांसफेक्शन तकनीक स्थापित करना था, जिसे स्थानांतरित करना मुश्किल है। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, पिपेट इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक 25-30% ट्रांसफेक्शन दक्षता दर के लिए अनुमति दी गई है, जैसा कि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पता लगाए गए ईजीएफपी कोशिकाओं के अनुपात से दिखाया गया है।

इस इंडक्शन सिस्टम को लागू करने से पहले, जिसे टेट्रासाइक्लिन और इसके डेरिवेटिव द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हमारे भारत सरकार की अभिव्यक्ति पर इस दवा के प्रभाव का सत्यापन किया गया था। एल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को एंडोजेनस αENaC एमआरएनए अभिव्यक्ति पर इसके प्रभाव का आकलन करने के लिए 1.0 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज किया गया था। 1-24 घंटे की अवधि में किए गए उपचारों का एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है।

हमारी ट्रांसक्रिप्शनी नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली एक क्यूपीसीआर सामान्यीकरण तकनीक का उपयोग करती है जो हाउसकीपिंग जीन का उपयोग करने वाली मानक तकनीक से अलग है। V5-αENaC की अभिव्यक्ति के मामले में, सीक्यू विधि का उपयोग करके ट्रांसफेक्शन की दक्षता निर्धारित करने के लिए टीटीए-एडीवी सिग्नल के अनुसार सिग्नल को सामान्यीकृत किया गया था। चित्रा 3 एमआरएनए अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए टीटीए-एडीवी ट्रांसक्रिप्ट के उपयोग को दर्शाता है।

पहले प्रकाशित परिणामों से पता चलता है कि ऐक्टिनोमाइसिन डी का उपयोग αENaC ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता के अनुमान के लिए अनुपयुक्त है, क्योंकि इसने असामान्य रूप से उच्च एमआरएनए आधा जीवन (लगभग 12 घंटे)24का संकेत दिया। टीईटी-ऑफ सिस्टम (99 मिन) की उपस्थिति में αENaC एमआरएनए का आधा जीवन ऐक्टिनोमाइसिन डी की उपस्थिति में पाए जाने वाले 7x तक कम था, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। यह पुष्टि करता है कि ऐक्टिनोमाइसिन डी एक आर्टितथ्यात्मक αENaC एमआरएनए स्थिरीकरण की ओर जाता है।

इस टीईटी-ऑफ प्रणाली का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था कि क्या αENaC जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए जाने जाने वाले विभिन्न सेल तनाव αENaC एमआरएनए स्थिरता को मिलासकते हैं। जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है, साइक्लोहेक्सिमाइड उपचार ने ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता (36 मिन) में काफी कमी की, जबकि लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस, जो संक्रामक उत्तेजनाओं की नकल करने के लिए उपयोग किया जाता था) नहीं था। अंत में, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन टीएनएफ-α V5-αENaC mRNA स्थिरता में एक कठोर गिरावट का कारण बना (16 मिन के आधे जीवन के साथ) ।

वर्तमान कार्य में, क्लोनिंग रणनीति का उद्देश्य αENaC ट्रांसक्रिप्ट के मॉड्यूलेशन में 3 'यूटीआर के योगदान को स्पष्ट करना था। स्थिरता को ट्रांसक्रिप्ट करने के लिए αENaC 3 ' यूटीआर के विभिन्न डोमेन के योगदान को मैप करने के लिए कई अनुक्रमिक विलोपन म्यूटेंट उत्पन्न किए गए और परीक्षण किए गए। चित्रा 6 हटाए गए और 3 'यूटीआर के क्षेत्रों के आधार पर V5-αENaC mRNA की स्थिरता के मॉड्यूलेशन में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाता है।

अंत में, आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) द्वारा αENaC एमआरएनए की स्थिरता के मॉड्यूलेशन का अध्ययन इस मॉडल के साथ किया गया था। PTRE-तंग वेक्टर से V5 epitope के साथ αENaC mRNA के प्रतिलेखन टीटीए-Adv. Dhx36, Tial1 के अनन्य नियंत्रण में है, और hnRNPK तीन RBPs है कि αENaC24के 3 ' यूटीआर से जुड़े हुए हैं । इसलिए, Dhx36, Tial1, या hnRNPK के साथ cotransfection के बाद V5-αENaC की अभिव्यक्ति का कोई भी मॉड्यूलेशन, एमआरएनए स्थिरता के मॉड्यूलेशन का परिणाम होगा न कि ट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का। चित्रा 7 से पता चलता है कि एचएनआरएनपीके के विपरीत, Dhx36 या Tial1 की अतिअभिव्यक्ति, खाली pcDNA3 प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफेक्शन की तुलना में V5-αENaC एमआरएनए की स्थिरता में कमी आई, जो कुछ आरबीपी के विशिष्ट मॉड्यूलेशन को दर्शाता है।

सामूहिक रूप से, इन परिणामों ने पुष्टि की कि टीईटी-ऑफ ट्रांसक्रिप्शनी नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली जिसे हमने विकसित किया है, एक ट्रांसक्रिप्ट के वास्तविक आधे जीवन और इसके मॉड्यूलेशन में शामिल तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। यह उपकरण शारीरिक और रोग की स्थिति में अल्वेलर एपिथेलियम के कार्य में शामिल प्रमुख जीओआई के पोस्टट्रांसक्रिप्शनल नियमन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में उपयोगी होगा।

Figure 1
चित्रा 1: पिपेट इलेक्ट्रोपोराशन द्वारा प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन की दक्षता। प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को एक pcDNA3 प्लाज्मिड (खाली, क्लोन #1 और #2) के 2 μg से क्षणिक रूप से ट्रांसलेट किया गया था जो GFP प्रोटीन को व्यक्त या व्यक्त नहीं करता था। ट्रांसफेक्शन दक्षता का आकलन 48 घंटे(ए)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी या(बी)प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ट्रांसफेक्शन के बाद किया गया था। एक तरह से ANOVA और Bonferroni पोस्ट तदर्थ परीक्षण; * पी एंड एलटी; 0.001 बनाम खाली। प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कम से कम चार अलग-अलग चूहों (एन ♫ 4) से कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में डॉक्सीसाइक्लिन द्वारा एंडोजेनस αENaC एमआरएनए का मॉड्यूलेशन। अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को 1-24 घंटे की अवधि के लिए 1.0 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज किया गया था। αENaC mRNA की अभिव्यक्ति मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था और इसकी तुलना में अनुपचारित कोशिकाओं (सीटीआरएल; टी = 0) में सामान्यीकरण के बाद -ए-एसीटीन एक्सप्रेशन (वन-वे एनोवा, एन = 4) की तुलना में αENaC mRNA ± एसईएम की अभिव्यक्ति के रूप में प्रस्तुत किया गया था। डॉक्सीसाइक्लिन ने समय के साथ एंडोजेनस αENaC एमआरएनए को मिलाना नहीं था। पहले Migneault एट अल24में चित्रा S4 के रूप में प्रकाशित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: नियामक एमआरएआरटीए-विज्ञापन की अभिव्यक्ति के अनुसार संशोधित सीक्यू विधि के साथ सरकार आई एमआरएनए अभिव्यक्ति का सामान्यीकरण। अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को पीटीईटी-ऑफ प्लाज्मिड और पीटीई-टाइट प्लाज्मिड एन्कोडिंग αENaC सीडीएनए से ट्रांसिएंट किया गया था, जिसमें इसके खुले रीडिंग फ्रेम के V5 एपिटोप अपस्ट्रीम और एक पूर्ण 3 ' यूटीआर अनुक्रम था। V5-αENaC और TTA-विज्ञापन mRNAs की अभिव्यक्ति अनुपचारित कोशिकाओं में मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था । (A)वी5-αENaC के डेल्टा-सामान्यीकृत SYBR ग्रीन फ्लोरोसेंट सिग्नल (एवीआरएन) और टीटीए-विज्ञापन को दो अलग ट्रांसफेक्शन (आर 1 और आर 2) से दर्शाया गया है। (ख)बाएं ग्राफ: प्रत्येक प्रयोग (R1 और R2) में V5-αENaC और tTA-विज्ञापन की एमआरएनए अभिव्यक्ति चक्र परिमाण मूल्य (सीक्यू) के रूप में व्यक्त की जाती है। V5-αENaC और TTA-विज्ञापन mRNA अभिव्यक्ति (ΤCq) के बीच अंतर प्रस्तुत किया है। सही ग्राफ: हाउसकीपिंग जीन के स्थान पर टीटीए-विज्ञापन एमआरएनए का उपयोग करना भारत सरकार की अभिव्यक्ति के कुशल सामान्यीकरण की अनुमति देता है, जिसने R2 में उसकी तुलना में R1 में 0.98 की सापेक्ष अभिव्यक्ति दिखाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक्टिनोमाइसिन डी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में ट्रांसक्रिप्शन रूप से नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते समय V5-αENaC एमआरएनए के क्षरण काइनेटिक्स। प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को पीटीईटी-ऑफ प्लाज्मिड और पीटीई-टाइट प्लाज्मिड एनकोडिंग αENaC cDNA से ट्रांसिएंट किया गया था, जो इसके खुले पठन फ्रेम के V5 एपिटोप अपस्ट्रीम और 3 ' यूटीआर दृश्यों को पूरा करता है। 30 मिन के लिए ऐक्टिनोमाइसिन डी (5.0 μg/mL) के साथ अनुपचारित या अनुपचारित कोशिकाओं को 15 मिन-6 एच के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (1.0 μg/mL) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। V5-αENaC mRNA की अभिव्यक्ति मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था और टीटीए-विज्ञापन की अभिव्यक्ति के अनुसार सामान्यीकरण के बाद अनुपचारित कोशिकाओं (टी = 0) में V5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति के प्रतिशत ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया था। प्रत्येक सेल की तैयारी के लिए एक चरण क्षय nonlinear प्रतिगमन द्वारा V5-αENaC mRNA आधा जीवन का अनुमान लगाया गया था । कई प्रतिगमन विश्लेषण से पता चला है कि अनुपचारित कोशिकाओं (पी एंड एलटी; 0.0001) की तुलना में ऐक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज कोशिकाओं में V5-αENaC mRNA स्थिरता में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर है। प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कम से कम चार अलग-अलग चूहों (एन ♫ 4) से कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। पहले Migneault एट अल24में चित्रा 1 के रूप में प्रकाशित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न सेलुलर और भड़काऊ तनावों द्वारा V5-αENaC mRNA स्थिरता का मॉड्यूलेशन। प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को पीटीईटी-ऑफ प्लाज्मिड और पीटीई-टाइट प्लाज्मिड एनकोडिंग αENaC cDNA से ट्रांसिएंट किया गया था, जो इसके खुले पठन फ्रेम के V5 एपिटोप अपस्ट्रीम और 3 ' यूटीआर दृश्यों को पूरा करता है। कोशिकाओं को 1.0 माइक्रोएम साइक्लोहेक्सिमाइड (सीएचएक्स)(ए)या 15 μg/mL LPS(B)के साथ या 100 एनजी/एमएल टीएनएफ-α(सी)के साथ 5 घंटे के लिए 30 मिन के लिए पूर्वशोधक किया गया था, जिसके बाद 15-120 मिन की अवधि के लिए 1.0 μg/mL doxycycline के साथ उपचार किया गया। V5-αENaC mRNA की अभिव्यक्ति मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था और टीटीए-विज्ञापन की अभिव्यक्ति के अनुसार सामान्यीकरण के बाद अनुपचारित कोशिकाओं (टी = 0) में V5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति के प्रतिशत ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया था। प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कम से कम तीन अलग-अलग चूहों (एन 3) की कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। (घ)उपचारित कोशिकाओं में V5-αENaC mRNA के आधे जीवन (टी1/2)कोशिकाओं (Ctrl) में mRNA के आधे जीवन की तुलना में किया गया था । आधे जीवन V5-αENaC mRNA गिरावट वक्र की दर स्थिर (कश्मीर) के अनुसार मापा गया समीकरण टी1/2 = ln 2/K का उपयोग कर और फिर मिन ± SEM (एक तरह से ANOVA परीक्षण और Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षण के रूप में व्यक्त; * पी & ०.०१ बनाम नियंत्रण; n चित्रा ३६ से अनुकूलित पहले Migneault, एफ25में प्रकाशित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एमआरएनए स्थिरता के मॉड्यूलेशन में αENaC 3 ' यूटीआर के विभिन्न क्षेत्रों की भूमिका को प्रकट करने के लिए अनुक्रमिक विलोपन क्लोनिंग रणनीति का उपयोग करें। (A)PTRE-तंग अभिव्यक्ति वेक्टर में डाला गया पूर्ण 3 ' यूटीआर के साथ V5-αENaC ट्रांसक्रिप्ट का योजनाबद्ध नक्शा। ओपन रीडिंग फ्रेम को ग्रे बॉक्स के रूप में दर्शाया गया है, जबकि 3 ' यूटीआर को व्हाइट बॉक्स के रूप में दिखाया गया है । αENaC mRNA के 3 ' यूटीआर भाग को क्लोन के लिए दिखाया गया है जिसमें एक पूर्ण 3 ' यूटीआर और विभिन्न विलोपन म्यूटेंट (डेल 1 से डेल 4) के लिए दर्शाया गया है। (ख)प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को पीटीईटी-ऑफ प्लाज्मिड के साथ विभिन्न αENaC 3 ' यूटीआर हटाने म्यूटेंट से ट्रांसिएंट किया गया था, जो टीटीए-विज्ञापन को व्यक्त करता है, ताकि doxycycline द्वारा निर्माण की विशिष्ट अभिव्यक्ति और इसके अवरोध की अनुमति दी जा सके । ट्रांसफेक्शन के बाद ७२ एच, कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (१.० μg/mL) के साथ इलाज किया गया V5-αENaC mRNA की अभिव्यक्ति मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था और टीटीए-एडी की अभिव्यक्ति के अनुसार सामान्यीकरण के बाद वी5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति के प्रतिशत ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया था । प्रत्येक निर्माण के लिए V5-αENaC mRNA आधा जीवन निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर V5-αENaC mRNA गिरावट वक्र की दर स्थिर (कश्मीर) से अनुमान लगाया गया था: टी1/2 = ln 2/K V5-αENaC mRNA क्षय पूर्ण 3 ' यूटीआर (Comp) के साथ क्लोन के लिए और डेल 1 से डेल 4 3 ' यूटीआर हटाने म्यूटेंट के लिए दिखाया गया है । एमआरएनए क्षय का आधा जीवन (टी1/2)प्रत्येक क्लोन के लिए दिया जाता है। कम सही चतुर्भुज में, ग्राफ प्रत्येक क्लोन के लिए अनुमानित विभिन्न टी1/2 ± एसईएम मूल्यों की तुलना दिखाता है। क्रुस्कल-वालिस टेस्ट के अनुसार विभिन्न समूहों के बीच पी एंड एलटी; 0.05। * पी एंड एलटी; 0.05 डन के पोस्ट हॉक टेस्ट के अनुसार पूरा 3 ' यूटीआर की तुलना में । डेल 3 की तुलना में डन के पोस्ट हॉक टेस्ट के अनुसार 0.05 रुपये और एलटी। प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कम से कम पांच अलग-अलग जानवरों (एन 5) की कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। पहले मिगनेल्ट एट अल24में प्रकाशित आंकड़े 2 और 3 से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन hnRNPK, Dhx36, और Tial1 द्वारा V5-αENaC mRNA के पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन । (A)प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को ट्रेक-टाइट प्लाज्मिड एन्कोडिंग V5-αENaC एमआरएनए से ट्रांसट्रांस किया गया था, साथ ही डीएचएक्स36, एचएनआरएनपीके, या टिल1 आरबीपी और पीटीईटी-ऑफ प्लाज्मिड के लिए एक्सप्रेशन वेक्टर के साथ। V5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति आरटी-qPCR 72 h posttransfection द्वारा निर्धारित किया गया था और अभिव्यक्ति टीटीए-विज्ञापन के अनुसार सामान्यीकरण के बाद एक खाली वेक्टर (pcDNA3) से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में V5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति के प्रतिशत ± SEM के रूप में व्यक्त किया गया था। Dhx36 और Tial1 की अतिअभिव्यक्ति ने V5-αENaC एमआरएनए अभिव्यक्ति को काफी हद तक बाधित किया, जबकि एचएनआरएनपीके की अतिअभिव्यक्ति का कोई प्रभाव नहीं पड़ा। * पी एंड एलटी; 0.05 क्रुस्कल-वालिस टेस्ट और डन के पोस्ट हॉक टेस्ट के अनुसार खाली वेक्टर की तुलना में; n ♫ प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए विभिन्न जानवरों के 3 नमूनों का परीक्षण डुप्लीकेट में किया गया था। (ख)αENaC 3 ' यूटीआर के समीपस्थ भाग को pTRE-तंग प्लाज्मिड (V5-αENaC-Del5) में αENaC स्टॉप कोडन के बगल में 3 ' यूटीआर के डिस्टल क्षेत्र की क्लोनिंग करके हटा दिया गया था । (C)प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को पीटीईटी-ऑफ प्लाज्मिड और डीएचएक्स36 या टिल1 आरबीपी अतिअभिव्यक्ति के लिए अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ पीटीआर-टाइट वेक्टर में V5-αENaC या V5-αENaC-Del5 से मिलाया गया था । V5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति आरटी-qPCR 72 h posttransfection द्वारा निर्धारित किया गया था और टीटीए-विज्ञापन की अभिव्यक्ति के अनुसार सामान्यीकरण के बाद एक खाली वेक्टर (pcDNA3) से संक्रमित कोशिकाओं में की तुलना में V5-αENaC mRNA अभिव्यक्ति के प्रतिशत ± SEM के रूप में व्यक्त किया गया था। Dhx36 और Tial1 के अतिअभिव्यक्ति V5-αENaC-Del5 mRNA अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा । * पी एंड एलटी; 0.05 क्रुस्कल-वालिस परीक्षण और डन के पोस्ट हॉक परीक्षणों के अनुसार एक्सपेरिमेंटल वेक्टर की तुलना में; प्रायोगिक वेक्टर की तुलना में मान-व्हिटनी यू-टेस्ट के अनुसार #p एंड एलटी; 0.05 पूर्ण 3 'यूटीआर उत्परिवर्ती; n प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए 6 ♫ । पहले मिगनेल्ट एट अल24में प्रकाशित आंकड़ों 5 और 7 से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक
टेम्पलेट 3'यूटीआर भावना अनुक्रम
αENaC cDNA पूरा F 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG
GTAAGCCTCTCTCTCTCTCT
सीटीसी-3'
आर 5'-GCACTAATCGATTTATATGAGTAC
सीटीजीसीसीटीएसीसीसीजीसी-3 '
डेल 1 आर 5'- GCACTAATCGATATTTTGTTTTCT
GAGGGACAGTGAAG-3 '
डेल 2 आर 5'- GCACTAATCGATATATATATAAa
CAAGGGGGCTTTTG-3 '
डेल 3 आर 5'-GCACTAATCGATTTATGTGTGTCC
CTGAAGGCAGTGAGGC-3 '
डेल 4 आर 5'-GCACTAATCGATTTTTCAGAG
सीजीसीजीसीजीजीसीएजी-3 '
डेल 5 आर 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC
GCCAGGGCACAG-3 '
F 5'-ATCGCAGAATTCTGATCTCTGCT
सीसीटीसीटीसीसीटीजी-3'
बी
लक्ष्य भावना अनुक्रम
V5-αEnaC F 5'-CCTAACCCTCTCCTCTCTCT-3'
आर 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3 '
टीटीए-अभिव F 5'-GCCTGAACAAAAACTC-3 '
आर 5'-AGTGGGTGATGATGCCTCC-3'

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। (A)प्रेरक pTRE-तंग वेक्टर में V5-αENaC म्यूटेंट की क्लोनिंग और पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर। (ख)मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा एमआरएनए अभिव्यक्ति के मापन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

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Discussion

प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं की कम ट्रांसफेक्शन दर इन कोशिकाओं में एमआरएनए स्थिरता का आकलन करने के लिए टीईटी-ऑफ प्रणाली के उपयोग के लिए एक गंभीर सीमा रही है। हालांकि, इस सीमा को पिपेट इलेक्ट्रोपोराशन द्वारा दूर किया गया था, जिससे 25-30% ट्रांसफेक्शन दक्षता(चित्रा 1 और चित्रा 3)26की अनुमति मिलती है।

ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता का माप एक दिए गए एमआरएनए के मॉड्यूलेशन और सेल होमोस्टोसिस और चयापचय पर इसके प्रभाव को समझने के लिए मौलिक है। भारत सरकार की जैव उपलब्धता में भिन्नता अनुवाद दक्षता को बदल सकती है और कोशिका में भारत सरकार की अभिव्यक्ति पर सीधा प्रभाव डाल सकती है। इन कारणों से, mRNAs के आधे जीवन का निर्धारण करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, इनमें से प्रत्येक तकनीक की सीमाएं और बाधाएं हैं जो ब्याज की प्रतिलिपि के उचित अध्ययन को रोकती हैं। अन्य तकनीकों की तुलना में, यहां विकसित टीईटी-ऑफ मॉडल को किसी भी प्रायोगिक स्थिति में दिए गए एमआरएनए के आधे जीवन अनुमान की अनुमति देने का लाभ है। हालांकि, यह हमें सीधे एक एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता का अध्ययन करने की अनुमति नहीं देता है । जितना संभव हो इस सीमा को दूर करने के लिए, प्लाज्मिड में ट्रांसक्रिप्ट के 5 ' यूटीआर और 3 ' यूटीआर दृश्यों को शामिल करने का सुझाव दिया जाता है ताकि निर्माण एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट्स के जितना संभव हो सके उतना ही समान हो । V5 epitope के अलावा आर टी-qPCR बनाम एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट द्वारा लक्ष्य एमआरएनए के विशिष्ट प्रवर्धन की अनुमति देता है। क्लोनिंग रणनीति के बारे में, ब्याज के जीन के ऊपर डाला अनुक्रम का चुनाव गैर विशिष्ट संकेतों के प्रवर्धन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । ओआरएफ के V5 एपिटोप अनुक्रम 5 ' के अलावा इसकी कम लंबाई और अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में इसकी अभिव्यक्ति की कमी के कारण निर्माण के विशिष्ट क्यूपीसीआर प्रवर्धन के लिए आवश्यक है। यह रणनीति एक ही प्रेरित प्रणाली का उपयोग करके प्रोटीन अनुवाद के मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने का अवसर भी प्रदान करती है। V5 एपिटोप (42 एनटी) के छोटे आकार के बावजूद, यह अभी भी संभव है कि यह प्रतिलेखन की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। इस कारण से, अन्य एपिटोपका का भी परीक्षण करने का सुझाव दिया जाता है, जैसे मानव इन्फ्लूएंजा हेमग्ग्लूटिनिन (एचए) या अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के ट्रांसपेम में नहीं पाया जाने वाला कोई अन्य अनुक्रम।

सिस्टम की एक सीमा भारत सरकार के प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए डॉक्सीसाइक्लिन का उपयोग है। कई रिपोर्टों से पता चलता है कि डॉक्सीसाइक्लिन सेल मेटाबोलिज्म पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। 16एचबीई 14 ब्रोंकियल कोशिकाओं में इस एंटीबायोटिक का उपयोग प्रसार को कम करता है और एपोप्टोसिस27के कारण मृत्यु दर को बढ़ाता है । इसके अलावा, डॉक्सीसाइक्लिन को पहले ही एलपीएस भड़काऊ प्रतिक्रिया28के मॉड्यूलेशन में शामिल दिखाया गया है। इसलिए, इस एंटीबायोटिक में ऑफ-टारगेट प्रभाव हो सकते हैं जो किसी दिए गए सरकार की एमआरएनए स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं। इन कारणों से, हमने गैर-ट्रांसट्रांसेटेड कोशिकाओं पर 24 घंटे की अवधि में 1 μg/mL doxycycline के प्रभाव का आकलन किया और पाया कि यह एंडोजेनस αENaC एमआरएनए अभिव्यक्ति(चित्रा 2)में कोई परिवर्तन नहीं करता है । इस एकाग्रता को इसलिए चुना गया क्योंकि इसका व्यापक रूप से टीईटी-ऑफ प्रणाली के प्रतिलेखन को पूरी तरह से बाधित करने के लिए उपयोग किया जाता है और साइटोटॉक्सिक प्रभाव29को कम करने की सिफारिश की जाती है। हम अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में इस एकाग्रता का उपयोग करने का सुझाव देते हैं और अन्य जीन ों के अध्ययन या टीईटी-ऑफ प्रणाली के साथ अन्य कोशिका प्रकारों के उपयोग के लिए इष्टतम एकाग्रता को मान्य करने की सलाह देते हैं।

हमारी प्रणाली जब तक इसके प्रतिलेखन doxycycline द्वारा बाधित है जब तक सरकार की संविलियन अभिव्यक्ति का उपयोग करता है । यह सुझाव दिया गया है कि अत्यधिक एमआरएनए सांद्रता कोशिका के लिए विषाक्त हो सकती है और इसके चयापचय को प्रभावित कर सकती है। इससे सरकार की ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता में बदलाव आ सकता है, जिससे नॉनफिजियोलॉजिकल ओवरएक्सप्रेशन30की वजह से इसकी तेजी से गिरावट आ सकती है । हमारे टीईटी-ऑफ मॉडल के मामले में, इस तरह की विषाक्तता नहीं देखी गई थी, क्योंकि ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं ने स्वस्थ गैर-ट्रांसट्रांस संक्रमित कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाए गए) के समान एक आकृति विज्ञान दिखाया। एक mRNA के आधे जीवन का निर्धारण करने में टीईटी-ऑफ प्रणाली की वैधता का प्रदर्शन करने वाले तानी एट अल31के अनुसार, हमारे परिणामों से पता चला है कि टीईटी-ऑफ प्रणाली अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में विषाक्त नहीं है और αENaCएमआरएनए के लिए आधा जीवन पैदावार करती है जो ट्रांसक्रिप्शनल अवरोधकों की उपस्थिति में रिपोर्ट की गई थी।

एमआरएनए के आधे जीवन को मापने के लिए इस प्रणाली का विकास परिणामों को चुनौती देता है जब ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता को ट्रांसक्रिप्टीन अवरोधकों जैसे एक्टिनोमाइसिन डी की उपस्थिति में मापा गया था। इस विधि से पता चलता है कि एक प्रतिलिपि आधा जीवन बहुत पहले मापा से कम हो सकता है ।

हमारा मॉडल विभिन्न परिस्थितियों में एक विशिष्ट प्रतिलिपि के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयुक्त है, जिसमें समर्थक भड़काऊ स्थितियां या आरबीपी अतिअभिव्यक्ति, साथ ही मुंह में आरएनए के साथ उपचार के बाद भी शामिल हैं। इसके अलावा, यह एल्वेलोलर एपिथेलियल कोशिकाओं को प्रभावित करने वाली रोगविज्ञानी स्थितियों में आरएमएनआरए के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन के लिए आवश्यक अअनुवादित क्षेत्रों के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

फ्रांसिस Migneault क्यूबेक श्वसन स्वास्थ्य नेटवर्क और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (CIHR) फेफड़ों के प्रशिक्षण कार्यक्रम, FRSQ से एक छात्र और Faculté des Études Supérieures एट से एक छात्र त्व द्वारा प्रदान की एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था पोस्टडॉक्टोरल्स, यूनीवर्सिट डी मॉन्ट्रियल। इस काम को नैदानिक अनुसंधान में गॉसेलिन-लामरे चेयर और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान [YBMOP-79544] द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A9415
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593
Bright-LineHemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Chloroform - Molecular biology grade Sigma-Aldrich C2432
ClaI New England Biolabs R0197S
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast Leica -
DNase I, Amplification Grade Invitrogen 18068015
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium Wisent Bioproducts 311-425-CL
Ethanol - Molecular biology grade Fisher Scientific BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker Eppendorf 1220G76
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
HEPES pH 7.3 Sigma-Aldrich H3784
Heracell 240i ThermoFisher Scientific 51026420
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad Laboratories 1708890
Isopropanol - Molecular biology grade Sigma-Aldrich I9516
LB Broth (Lennox) Sigma-Aldrich L3022
LB Broth with agar (Lennox) Sigma-Aldrich L2897
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 Sigma-Aldrich L9143
MEM, powder Gibco 61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets ThermoFisher Scientific 51025413
Mupid-exU electrophoresis system Takara Bio AD140
NanoDrop 2000c ThermoFisher Scientific ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit Invitrogen MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack Invitrogen MPK5000S
NheI New England Biolabs R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli Invitrogen C854003
pcDNA3 vector ThermoFisher Scientific V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid Addgene 13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
pTet-Off Advanced vector Takara Bio 631070
pTRE-Tight vector Takara Bio 631059
Purified alveolar epithelial cells n.a. n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit QIAGEN 20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software Applied Biosystems n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast Applied Biosystems 4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein R&D Systems 510-RT-010
Septra Sigma-Aldrich A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England Biolabs M0371S
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase Invitrogen 18090010
T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific EL0011
Tet System Approved FBS Takara Bio 631367
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
Water, Molecular biology Grade Wisent Bioproducts 809-115-EL

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References

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