Summary
Aquí, presentamos una herramienta que se puede utilizar para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en células epiteliales alveolares primarias mediante el uso de un sistema de expresión inducible acoplado a una técnica de electroporación de pipeta.
Abstract
El estudio de la regulación posttranscripcional es fundamental para entender la modulación de un ARN mensajero (ARNm) dado y su impacto en la homeostasis celular y el metabolismo. De hecho, las fluctuaciones en la expresión de transcripción podrían modificar la eficiencia de la traducción y, en última instancia, la actividad celular de una transcripción. Se han desarrollado varios enfoques experimentales para investigar la vida media del ARNm, aunque algunos de estos métodos tienen limitaciones que impiden el estudio adecuado de la modulación posttranscripcional. Un sistema de inducción promotor puede expresar un gen de interés bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite la estimación de la vida media de un ARNm dado bajo cualquier condición experimental sin perturbar la homeostasis celular. Un inconveniente importante de este método es la necesidad de transfectar las células, lo que limita el uso de esta técnica en células primarias aisladas que son altamente resistentes a las técnicas de transfección convencionales. Células epiteliales alveolares en el cultivo primario se han utilizado ampliamente para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Las características únicas y el fenotipo de las células alveolares primarias hacen que sea esencial estudiar las modulaciones posttranscripcionales de genes de interés en estas células. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar una herramienta novedosa para investigar las modulaciones posttranscripcionales de los ARNm de interés en las células epiteliales alveolares en el cultivo primario. Diseñamos un protocolo de transfección transitoria rápido y eficiente para insertar un sistema de expresión de plásmido controlado por transcripción en células epiteliales alveolares primarias. Esta estrategia de clonación, utilizando un epítopo viral para etiquetar la construcción, permite la fácil discriminación de la expresión de la construcción a partir de la de los ARNm endógenos. Mediante el uso de un método de ciclo de cuantificación (Cq) modificado, la expresión de la transcripción se puede cuantificar en diferentes intervalos de tiempo para medir su vida media. Nuestros datos demuestran la eficiencia de este enfoque novedoso en el estudio de la regulación posttranscripcional en diversas condiciones fisiopatológicas en células epiteliales alveolares primarias.
Introduction
Se han desarrollado varias técnicas para determinar la vida media de los ARNm. La técnica de descomposición de la persecución por pulsos, que utiliza ARNm etiquetados, permite la evaluación simultánea de una gran piscina de ARNm con mínima perturbación celular. Sin embargo, este enfoque no permite una estimación directa de la vida media de una sola transcripción genética y no se puede implementar para estudiar la modulación posttranscripcional de un ARNm después de la estimulación con factores de crecimiento, ROS, alarminas o inflamación1.
El uso de inhibidores de la transcripción, como la actinomicina D y la amanitina, es un método relativamente simple para medir la cinética de degradación del ARNm a lo largo del tiempo. Una ventaja principal de este enfoque sobre el de las técnicas anteriores , (es decir, la persecución por pulsos) se basa en la capacidad de estimar directamente la vida media de una transcripción determinada y comparar cómo diferentes tratamientos podrían afectar su cinética de degradación. Sin embargo, el impacto nocivo significativo de los inhibidores de la transcripción en la fisiología celular representa un inconveniente importante del enfoque2. De hecho, la inhibición de todo el transcriptoma celular con estos fármacos tiene el efecto secundario negativo de perturbar la síntesis de elementos clave involucrados en la estabilidad del ARNm, como los microARN (miRNAs), así como la expresión y síntesis de proteínas de unión al ARN, que son importantes para la degradación y estabilidad del ARNm. Por lo tanto, la perturbación severa de la transcripción génica por estos fármacos podría modificar artefrealmente las curvas de degradación de las transcripciones.
El sistema de inducción del promotor representa un tercer enfoque para medir la vida media de un ARNm específico. Este método mide la degradación de un ARNm específico de una manera similar a los métodos que utilizan inhibidores de la transcripción. Con frecuencia se utilizan dos tipos de sistemas de inducción: el promotor c-fos inducido por suero3 y el sistema inducible Tet-Off4. Con el sistema c-fos, no es necesario el uso de inhibidores de transcripción que pueden ser tóxicos para la célula. Sin embargo, este método requiere la sincronización del ciclo celular, que impide la evaluación de la estabilidad real de una transcripción durante la interfase5. Por el contrario, el sistema Tet-Off permite la fuerte expresión del gen de interés (GOI) bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requiere que la presencia de dos elementos que deben ser cotransinfectados en la célula sean funcionales. El primer plásmido (pTet-Off) expresa la proteína reguladora tTA-Adv, un factor de transcripción sintética híbrida compuesto por el represor prokariotate TetR (de Escherichia coli) fusionado a tres dominios de transactivación de transcripción de la proteína viral HSV VP16. El GOI se clona en el plásmido pTRE-Tight bajo el control de un promotor sintético (PTight),que comprende la secuencia mínima del promotor del citomegalovirus (CMV) fusionado a siete repeticiones de la secuencia del operador tetO. La transcripción del gen aguas abajo de PTight depende de la interacción de TetR con tetO. En presencia de tetraciclina o su derivado, doxiciclina, el represor TetR pierde su afinidad por el operador tetO, lo que lleva a un cese de la transcripción4. Las características del sistema Tet-Off lo convierten en un modelo ideal para el estudio de la expresión de ARNm específica en células eucariotas evitando al mismo tiempo posibles efectos pleiotrópicos que son secundarios a la ausencia de secuencias reguladoras procariotas en la célula eucariota6. Por lo general, las líneas celulares Tet-Off doblemente estables (HEK 293, HeLa y PC12) se utilizan con este sistema para integrar copias del regulador y plásmidos de respuesta para un acceso conveniente a la expresión génica controlable7,8,9.
Varios modelos de células epiteliales alveolares en cultivo se han utilizado para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Durante años, los investigadores han utilizado ampliamente células primarias humanas o roedores10,11, así como líneas celulares inmortalizadas como células Humanas A549 o ratas RLE-6TN12,13. Aunque generalmente son menos proliferativas y más difíciles de cultivar y transfectar, las células epiteliales alveolares en el cultivo primario siguen siendo el estándar de oro para el estudio de la función y disfunción del epitelio alveolar en condiciones fisiológicas y patológicas. De hecho, las líneas celulares inmortalizadas como las células A549 no presentan las características complejas y fenotipos de las células primarias, mientras que las células epiteliales alveolares en el cultivo primario recapitulan las principales propiedades del epitelio alveolar, en particular la capacidad de formar una barrera polarizada y estrecha14,15. Desafortunadamente, estas células son muy resistentes a las técnicas de transfección convencionales, como las que utilizan liposomas, haciendo muy difícil el uso de un sistema inducido por el promotor como Tet-Off.
La modulación posttranscripcional de los ARNM es uno de los métodos más eficaces para modular rápidamente la expresión génica de una transcripción16. La región no traducida del ARNM 3 (3' UTR) desempeña un papel importante en este mecanismo. Se ha demostrado que, a diferencia del UTR de 5', existe una correlación exponencial entre la longitud del UTR de 3' y las complejidades celulares y morfológicas de un organismo. Esta correlación sugiere que el UTR de 3', al igual que las regiones de codificación mRNA, ha sido sometido a una selección natural para permitir una modulación posttranscripcional cada vez más compleja a lo largo de la evolución17. El UTR de 3' contiene varios sitios de unión para proteínas y miRNAs que afectan a la estabilidad y traducción de la transcripción.
En el presente trabajo, desarrollamos una herramienta para investigar el papel de los dominios altamente conservados en el UTR de 3' de un GOI para el control de la estabilidad de la transcripción. Nos centramos en el canal epitelial de sodio, subunidad alfa ( ENaC), que desempeña un papel clave en la fisiología epitelial alveolar18. Las células epiteliales alveolares en el cultivo primario se transtrusaron transitoriamente con éxito con los dos componentes del sistema Tet-Off, lo que permite el estudio del papel de la UTR de 3' en la estabilidad del ARNm con un sistema que afecta mínimamente a la fisiología celular y al metabolismo en comparación con el uso de inhibidores de transcripción con otros protocolos. Se desarrolló una estrategia de clonación para diferenciar la expresión del GOI de la del gen endógeno utilizando un epítopo no endógeno (V5). La respuesta y los plásmidos reguladores se transfirieron a las células epiteliales alveolares mediante una técnica de electroporación de pipetas. Posteriormente, la expresión de la transcripción se midió incubando las células con doxiciclina en diferentes intervalos de tiempo. La vida media de la transcripción fue evaluada por RT-qPCR con un método Cq modificado utilizando el producto mRNA tTA-Ad transinfectado para su normalización. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en diferentes condiciones y definir la participación de las regiones no traducidas con más detalle.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales del Centro de Investigación del Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal (CRCHUM).
1. Diseño y generación del plásmido de respuesta expresando el gen de interés (GOI)
- Utilice un vector de desconexión de tetraciclina inducible, como pTRE-Tight.
- Analice la secuencia del GOI y del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector para identificar los sitios de restricción en el MCS que no están presentes internamente en el GOI.
- Aísle las células epiteliales alveolares primarias de los pulmones de rata Sprague-Dawley machos como se describió anteriormente19,20.
- Purificar el ARN total de las células epiteliales alveolares mediante la extracción de ARN utilizando un método estándar, como la extracción de fenol/cloroformo o el uso de columnas de espín de ARN a base de sílice.
- Transfiera el ARNm en ADN complementario (ADNc) utilizando oligo(dT) y transcriptasa inversa de alta fidelidad.
- Utilice técnicas de PCR de alta fidelidad taq polimerasa y superposición estándar para flanquear el GOI con dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción seleccionados utilizando imprimaciones diseñadas.
- Pida a la imprimación delantera que contenga un sitiode unión ribosoma de Kozak para mejorar los niveles de expresión para estudiar la expresión de proteínas en paralelo con la estabilidad del ARNm. Debe incluirse una secuencia que codifica el epítopo V5 aguas arriba del GOI para distinguir la expresión del GOI transinfectado de la expresión endógena (Tabla 1).
- Pida que la imprimación inversa contenga una señal de poliadenilación después del codón de parada.
- Los mutantes se pueden generar mediante eliminación secuencial para estudiar los efectos de diferentes regiones UTR de 3' en la estabilidad del ARNm del GOI utilizando imprimaciones inversas que codifican un sitio de poliadenilación que elimina gradualmente el extremo de 3' del GOI 3' UTR(Figura 6). Alternativamente, la mutagénesis dirigida por PCR se puede utilizar para dirigirse a una región específica de interés en el UTR22de 3'.
- Digerir el vector inducible y el inserto con las enzimas de restricción previamente elegidas a la temperatura de incubación adecuada durante 1 h, seguido de un tratamiento con fosfatasa durante la reacción vectorial durante 30 min para evitar la auto-ligación.
- Separe el vector digerido e inserte segmentos por electroforesis en un gel de agarosa de 1-1,5% (concentración dependiendo del tamaño de la plaquita).
- Usando una hoja y una luz UV, recoja los fragmentos de ADN que contienen el inserto y el vector deseados que se van a ligar.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. - Purificar los segmentos recogidos del gel de agarosa utilizando un kit de purificación de PCR a base de sílice y medir la concentración por espectrofotometría a 260 nm.
- Ligar el GOI y el vector inducible con ligas a ADN T4 utilizando una relación molar vector:insert de 1:3 para aumentar la probabilidad de ligadura. Incubar la reacción a temperatura ambiente (RT) durante 3 h.
- Transformar la reacción de ligadura en E. coli competente (DH5).
- Añadir 1-10 ng de vector y gen a un tubo que contenga 100 ml de células competentes. Incubar las células sobre hielo durante 30 minutos y luego calentar las células a 42 oC durante 45 s. Coloque el tubo en hielo durante 2 min y agregue 900 sl de medio RT LB. Incubar las células durante 1 h a 37oC con agitación a 225 rpm.
- Esparza 100 oL de la reacción en una placa de agar LB con un antibiótico adecuado (p. ej., 100 g/ml de ampicilina para el vector pTRE-Tight) para seleccionar las bacterias transformadas. Incubar la placa durante la noche a 37oC.
- Seleccione colonias individuales utilizando un bucle de inoculación o una punta de 20 ml e incubar durante la noche en un medio LB de 5 ml que contenga el antibiótico adecuado a 37 oC con agitación. Las bacterias transformadas pueden almacenarse en poblaciones de glicerol a -80 oC a una proporción de 400:600 de medio LB a glicerol.
- Extraiga el ADN plásmido utilizando columnas de plásmido a base de sílice y mida la concentración por espectrofotometría a 260 nm. Confirmar la inserción del GOI mediante el análisis de restricciones y su orientación y la ausencia de mutaciones potencialmente introducidas durante rt-PCR mediante la secuenciación.
2. Transfectar el plásmido de respuesta expresando el gen de interés (GOI) en células epiteliales alveolares primarias
- Aislar las células epiteliales alveolares tipo II de los pulmones de las ratas.
- Sembrar las células a una densidad de 1 x 106 células/cm2 en platos Petri de 100 mm con medio esencial mínimo completo (MEM completo). El MEM completo se complementa con 10% DE FBS, 0,08 mg/L de tobramicina, Septra (3 g/ml de trimetoprim y 17 g/mL de sulfamethoxazol), 0,2% de NaHCO3,0,01 M HEPES (pH a 7,3) y 2 mM de L-glutamina. Cultivo de las células durante 24 h a 37oC en 5% deCO2 en una incubadora humidificada.
- Al día siguiente, coloque 500 ml de MEM completo sin antibióticos en cada pocto de una nueva placa de 12 pocillos y precaliente la placa a 37 oC durante 30 min. Durante este paso, es importante utilizar suero bovino fetal libre de tetraciclinas contaminantes o con un nivel demasiado bajo para interferir con la inducibilidad.
- Preparar tubos de 1,5 ml que contengan el plásmido con el GOI inducible (plásmido GOI) y el vector regulador (por ejemplo, pTet-Off) añadiendo 1 g de plásmido GOI y 1 g de vector regulador por pozo en RT. Para los experimentos de coexpresión con proteínas de unión al ARN (RBP), se añade a la mezcla de ADN(Figura 7) 1 g de un vector constitutivo (por ejemplo, pcDNA3) que expresa el RPB de interés.
- Aspirar el medio y enjuagar suavemente las células con PBS (sin calcio y magnesio) precalentado a 37 oC.
- Añadir 5 ml de 0,05% de trippsina precalentada a 37 oC e incubar las células hasta que las células estén separadas (2-4 min). Neutralizar la trippsina añadiendo 10 ml de MEM completo sin antibióticos.
- Recoger la suspensión celular en un tubo de 50 ml, lavar la placa Petri con 4 ml de medio para recoger tantas células restantes como sea posible, y luego centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.
- Aspirar suavemente y desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de PBS. Cuente y calcule el número de células utilizando un hemocitómetro.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el pellet en tampón de resuspensión a una concentración de 4 x 107 células/ml. Agregue las células del tubo de 1,5 ml preparadoen en el paso 2.4 a una concentración de 400.000 células por pozo y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Coloque el tubo en el dispositivo de electroporación y llénelo con 3,5 ml de tampón electrolítico.
- Inserte una punta de electrodo chapada en oro en una pipeta presionando completamente el pistón. Mezcle suavemente el contenido del tubo de 1,5 ml y aspire cuidadosamente las células con la pipeta. Tenga cuidado de evitar que las burbujas de aire entren en la punta, ya que esto causará arco eléctrico durante la electroporación y conducirá a una menor eficiencia de transfección.
- Inserte la pipeta en la estación de electroporación hasta que haya un sonido de clic.
- Seleccione el protocolo de electroporación adecuado para las células epiteliales alveolales, correspondiente a una tensión de pulso de 1.450 V y 2 pulsos con una anchura de 20 ms, y pulse Iniciar en la pantalla táctil.
- Inmediatamente después de la transfección, retire la pipeta y transfiera las células a un pozo previamente lleno con MEM completo sin antibiótico que haya sido precalentado a 37 oC.
- Repita los pasos 2.11-2.14 para las muestras restantes.
- Agitar suavemente la placa para extender las células uniformemente sobre la superficie del pozo. Incubar las células a 37oC en 5% co2 en una incubadora humidificada. Después de 2 días, sustituya el medio por MEM completo con antibióticos.
- Confirmar el éxito de la transfección observando la expresión de eGFP bajo un microscopio de fluorescencia o mediante citometría de flujo utilizando un vector de control (Figura 1).
NOTA: Este paso es opcional y requiere un paso de transfección adicional utilizando un plásmido diferente que expresa eGFP, como pcDNA3-EGFP.
3. Inducción de la inhibición de la transcripción del GOI
NOTA: Las células se pueden pretratar con los tratamientos deseados antes de la inducción de la doxiciclina para evaluar su impacto en la estabilidad del ARNm(Figura 5).
- Preparar una solución de material de doxiciclina de 1 mg/ml en agua desionizada. Almacene la solución de stock a -20 oC protegida de la luz. La doxiciclina, un derivado de la tetraciclina, se utiliza en lugar de tetraciclina porque tiene una vida media más larga (2x) que la tetraciclina. Además, se requiere una menor concentración de doxiciclina para la inactivación completa del tet operon23.
NOTA: La doxiciclina podría afectar la expresión de ARNm del GOI endógeno. Para verificar esto, se debe probar el efecto de un tratamiento de 24 horas con doxiciclina en células alveolares para confirmar la ausencia de cambios en la expresión goI(Figura 2). - Preparar una solución de doxiciclina fresca de 1 g/ml en una posttransfección completa de MEM 72 h y calentarla a 37 oC.
- Sustituya el medio por 1 ml de MEM completo que contenga 1 g/ml de doxiciclina por pocto para inhibir la transcripción del GOI.
- Incubar múltiples pozos a 37oC en 5%CO2 para diferentes cantidades de tiempo de 15 min-6 h para evaluar la vida media del ARNm del GOI.
- Al final del tratamiento, lave las células con PBS helado y lilícea con un kit de extracción de ARN fenol-cloroformo disponible comercialmente añadiendo 500 ml de tampón por poca y agitando la placa para homogeneizar las células.
- Aísle el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Determinar el rendimiento y la pureza del ARN mediante espectrofotometría a 230, 260 y 280 nm. Las muestras de ARN con relaciones 260:230 y 260:280 de 1,8 y 2,0, respectivamente, se consideran puras.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Determinar la estabilidad del ARNm del GOI
- Tratar 1 g de ARN total con ADNsa libre de ARN I (grado de amplificación) para eliminar cualquier rastro de ADN plásmido que pueda interferir con la amplificación posterior del ADN.
- En un tubo de PCR de 0,2 ml, combine 1 g de ARN total, 1 l de tampón de reacción DNase I 10x, 1 l de DNAse I (1 U/L) y agua libre de ARNi para obtener un volumen total de 10 l.
- Incubar la reacción a RT durante 20 min.
- Desactive la DNAse I añadiendo 1 ml de EDTA de 25 mM a la mezcla de reacción de 10 ml e incubando la reacción a 70 oC durante 10 min.
- Transfiera inversamente el ARN total agotado por ADN en el ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc disponible comercialmente con una mezcla de imprimaciones de hexamer aleatorias y oligo(dT) para mejorar la eficiencia de la transcripción inversa.
- En resumen, añadir 4 l de mezcla de reacción de 5x, 1 l de transcriptasa inversa y 4 l de agua libre de ANR a 11 ml de la mezcla total de ARN agotada por ADN para obtener un volumen de reacción total de 20 l. Mezcle bien la reacción pipetándola hacia arriba y hacia abajo.
- Incubar la reacción durante 5 min a 25oC, seguida de 20 min a 46oC, y luego inactivar la reacción incubando a 95oC durante 1 min. Cada reacción producirá 50 ng/L de producto de ADNc.
- Diluir la reacción de ADNc a una concentración de 5 ng/L añadiendo 180 ml de agua de grado de biología molecular a la mezcla de reacción de 20 ml. Almacene los productos de ADNc a -80 oC o proceda inmediatamente a la realización de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR).
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Diseñe imprima imprimaciones qPCR hacia adelante y hacia atrás específicas del GOI.
- Debido a la expresión endógena del GOI en las células, las imprimaciones deben diseñarse para amplificar un amplicon de 100-150 bp del epítopo V5 acoplado al GOI (Tabla 1).
- Las imprimaciones genéticas de referencia interna también deben utilizarse como controles de normalización. Por lo general, los genes de limpieza, como los genes de beta-actina e hipoxantina fosforibosyltransferasa 1, se utilizan como genes de referencia. Sin embargo, estos no se pueden utilizar con este sistema de inducción debido a la variación de la eficiencia de la transfección. En su lugar, la expresión de la transcripción tTA-Ad se evalúa a los efectos de la normalización, porque su expresión es constitutiva en las células debido a la actividad del promotor del citomegalovirus. Cualquier variación en su expresión medida por qPCR será representativa de la eficiencia de la transfección (primers: adelante 5'-GCC TGA CGA CAA AAC TC-3' y reversa 5'-AGT GGG GAT GCC TGT CCCC CC-3; 129 bp amplicon) y permitirá la normalización de la expresión de los clones transinfectados (Figura 3).
- Prepare cada reacción qPCR en triplicado utilizando una mezcla maestra de tinte verde SYBR.
- Diluir la mezcla de ADNc de 5 ng/L a una concentración de 1,25 ng/L utilizando agua de grado de biología molecular.
- Combinar 5 l de mezcla maestra de tinte verde SYBR (2x), 0,1 l de agua de grado de biología molecular, 0,45 ml de imprimación de avance de 7,5 oM, 0,45 ml de imprimación inversa de 7,5 m y 4 l de 1,25 ng/L de ADN para obtener un volumen de reacción total de 10 ol. Mezcle bien enpipeando hacia arriba y hacia abajo en una placa de PCR de 96 g. Utilice una película adhesiva óptica para asegurarse de que la cubierta de la placa esté sellada y para evitar la contaminación y la evaporación.
- Gire brevemente la mezcla de reacción por centrifugación y coloque la placa en un termociclador qPCR.
- Amplifique los amplicons GOI y tTA-Ad con etiqueta V5 utilizando las siguientes condiciones qPCR: 95 oC durante 10 min como paso de desnaturalización, seguido de 40 ciclos de 95 oC para 10 s, 58 oC para 15 s y 72 oC para 20 s. Se debe generar una curva de fusión de alta resolución después de que se realicen los ciclos de amplificación para evaluar las temperaturas de fusión específicas de los amplicones deseados y garantizar la ausencia de picos de amplificación de ruido.
- Incluir controles negativos para el qRT-PCR realizando qPCR con ARN como plantilla sin transcriptasa inversa para servir como control para la posible contaminación por plásmido del ADN y qPCR sin ADNc añadido a la mezcla qPCR para asegurar la falta de dimers de imprimación o Contaminantes.
- La concentración óptima de ADNc, la eficiencia de imprimación y la concentración deben optimizarse de acuerdo con el GOI mediante un ensayo de curva estándar. Para ello, realice una dilución en serie utilizando ADNc de células no tratadas (cultivadas sin doxiciclina). La curva estándar se genera trazando los valores de Cq con el registro del factor de dilución cDNA, y la eficiencia de amplificación (E) se calcula de acuerdo con la pendiente de la curva estándar utilizando la siguiente fórmula:
E 10-1/pendiente
NOTA: La eficiencia de amplificación debe ser de aproximadamente 0,9 a 1,05. De lo contrario, las imprimaciones deben ser rediseñadas.
- Analice los datos qPCR utilizando el método cq comparativo normalizando los valores de expresión del GOI a la expresión de tTA-Ad para obtener los niveles de expresión relativos del GOI e informar de su expresión como un porcentaje de la expresión de ARNm del GOI en células del mismo animal en el punto de partida (t - 0) (Figura 4).
- La vida media se determina a partir de la constante de velocidad (K) de la curva de degradación del ARNm GOI utilizando la siguiente ecuación:
t1/2 ln 2/K.
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Representative Results
Este protocolo se utilizó con éxito para generar un sistema de expresión de plásmido controlado transcripciónteamente Tet-Off para evaluar la importancia de diferentes porciones de la UTR de 3' en la modulación de la estabilidad de la transcripción en células epiteliales alveolares primarias.
El primer paso en la implementación de este sistema fue establecer una técnica de transfección rápida, fácil y eficiente para las células epiteliales alveolares en el cultivo primario, que son difíciles de transfectar. Como se muestra en la Figura 1, la técnica de electroporación de pipetas permitió una tasa de eficiencia de transfección del 25-30%, como lo muestran las relaciones de las células eGFP detectadas por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.
Antes de aplicar este sistema de inducción, que es controlado por la tetraciclina y sus derivados, se verificó el impacto de este fármaco en la expresión de nuestro GOI. Las células epiteliales alveolares fueron tratadas con 1,0 g/ml de doxiciclina para evaluar su impacto en la expresión endógena del ARNm de ENaC. Los tratamientos realizados durante un período de 1-24 h no tuvieron un impacto significativo en la expresión de la transcripción endógena, como se muestra en la Figura 2.
Nuestro sistema de expresión de plásmido controlado por transcripción utiliza una técnica de normalización qPCR que difiere de la técnica estándar que utiliza genes de limpieza. En el caso de la expresión de V5-ENaC, la señal se normalizó de acuerdo con la señal tTA-Adv para determinar la eficiencia de la transfección utilizando el método Cq. La Figura 3 muestra el uso de la transcripción tTA-Adv para normalizar la expresión de ARNm.
Los resultados publicados anteriormente sugieren que el uso de actinomicina D es inapropiado para la estimación de la estabilidad de la transcripción de la ENaC, ya que indicaba una vida media de ARNm anormalmente alta (aproximadamente 12 h)24. La vida media del ARNm de ENaC en presencia del sistema Tet-Off (99 min) fue hasta 7 veces más corta que la que se encuentra en presencia de actinomicina D, como se muestra en la Figura 4. Esto confirma que la actinomicina D conduce a una estabilización del ARNm de eNaC.
Este sistema Tet-Off también se utilizó con éxito para probar si diferentes factores de estrés celular que se sabe que afectan a la expresión del gen ENaC podrían modular la estabilidad del ARNm de ENaC. Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con cicloheximida disminuyó significativamente la estabilidad (36 min) de la transcripción, mientras que los lipopolisacáridos (LPS, utilizados para imitar un estímulo infeccioso) no lo hicieron. Por último, la citoquina proinflamatoria TNF-o causó una drástica disminución en la estabilidad del ARNm de V5-ENaC (con una vida media de 16 min).
En el presente trabajo, la estrategia de clonación tenía por objeto dilucidar la contribución del UTR de 3' a la modulación de la transcripción de la ENaC. Se generaron varios mutantes de eliminación secuencial y se probaron para mapear la contribución de diferentes dominios de la UTR de 3' a la estabilidad de la transcripción. La Figura 6 muestra los cambios significativos en la modulación de la estabilidad del ARNm V5-ENaC dependiendo de las regiones eliminadas e incluidas del UTR de 3'.
Por último, se estudió la modulación de la estabilidad del ARNm de ENaC por proteínas de unión al ARN (RBP) con este modelo. La transcripción del ARNm de ENaC con el epítopo V5 del vector pTRE-Tight está bajo el control exclusivo de tTA-Adv. Dhx36, Tial1, y hnRNPK son tres RRP que están vinculados a la UTR de 3' de la unidad24. Por lo tanto, cualquier modulación de la expresión de V5--ENaC después de la cotransfección con Dhx36, Tial1, o hnRNPK, sería la consecuencia de la modulación de la estabilidad del ARNm y no de la modulación de transcripción. La Figura 7 muestra que la sobreexpresión de Dhx36 o Tial1, a diferencia de la de hnRNPK, disminuyó la estabilidad del ARNm V5-ENaC en comparación con la transfección con el plásmido pcDNA3 vacío, que muestra la modulación específica de algunos RBP.
En conjunto, estos resultados confirmaron que el sistema de expresión de plásmido controlado transcripciónteamente Tet-Off que desarrollamos representa una herramienta adecuada para evaluar la vida media real de una transcripción y los mecanismos involucrados en su modulación. Esta herramienta será útil para adquirir nuevos conocimientos sobre la regulación posttranscripcional de los GOI clave involucrados en la función del epitelio alveolar en condiciones fisiológicas y patológicas.
Figura 1: Eficiencia de la transfección de células epiteliales alveolares en cultivo primario por electroporación de pipetas. Las células epiteliales alveolares primarias se transtrataron de forma transitoria con 2 g de un plásmido pcDNA3 (vacío, clones #1 y #2) que expresaba o no expresaba la proteína GFP. La eficiencia de transfección se evaluó 48 h tras la transfección mediante (A) microscopía de fluorescencia o (B) citometría de flujo. Prueba post hoc de ANOVA y Bonferroni unidireccional; *p < 0.001 frente a vacío. Para cada condición experimental se utilizaron células de al menos cuatro ratas diferentes (n.o 4). Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Modulación del ARNm endógeno de ENaC por doxiciclina en células epiteliales alveolares. Las células epiteliales alveolares se trataron con doxiciclina de 1,0 g/ml durante un período de 1-24 h. La expresión de mRNA de ENaC se ha cuantificado mediante RT-PCR cuantitativo y se presentó como la expresión de mRNA de ENaC a SEM en comparación con la de las células no tratadas (Ctrl; t a 0) después de la normalización de acuerdo con la expresión de la acción (ANOVA unidireccional, n a 4). La doxiciclina no modulaba el ARNm endógeno de ENaC con el tiempo. Publicado anteriormente como Figura S4 en Migneault et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Normalización de la expresión de ARNm GOI con un método Cq modificado según la expresión del mRNA regulador tTA-Ad. Las células epiteliales alveolares fueron cotranspiradas transitoriamente con el plásmido pTet-Off y el plásmido pTRE-Tight con un eNaC cDNA con un epítopo V5 aguas arriba de su marco de lectura abierto y una secuencia UTR completa de 3'. La expresión de los ARNM V5-ENaC y tTA-Ad se midió mediante RT-PCR cuantitativo en células no tratadas. (A) Se representan las señales fluorescentes syBR verdes normalizadas en delta (Rn) de V5-ENaC y tTA-Ad a partir de dos transfecciones separadas (R1 y R2). (B) Gráfico izquierdo: la expresión de ARNm de V5-ENaC y tTA-Ad en cada experimento (R1 y R2) se expresa como el valor de cuantificación del ciclo (Cq). Se presenta la diferencia entre la expresión de mRNA V5-ENaC y tTA-Ad. Gráfico derecho: El uso de tTA-Ad mRNA en lugar del gen de limpieza permite la normalización eficiente de la expresión del GOI, que mostró una expresión relativa de 0,98 en R1 en comparación con la de R2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cinética de degradación del ARNm V5-ENaC cuando se utiliza el sistema de expresión de plásmido controlado por transcripción en presencia y ausencia de actinomicina D. Las células epiteliales alveolares primarias fueron cotranspiradas transitoriamente con el plásmido pTet-Off y el plásmido estamido pTRE con un eNaC cDNA con un epítopo V5 aguas arriba de su marco de lectura abierto y secuencias UTR completas de 3'. Las células pretratadas o no tratadas con actinomicina D (5,0 g/ml) durante 30 min se incubaron posteriormente con doxiciclina (1,0 g/ml) durante 15 min-6 h. La expresión del ARNm de V5-ENaC se midió mediante RT-PCR cuantitativo y se presentó como el porcentaje de expresión de ARNm de SeM de V5-ENaC en células no tratadas (t a 0) después de la normalización de acuerdo con la expresión de tTA-Ad. La vida media del ARNm de V5-ENaC se estimó mediante una regresión no lineal de descomposición monofásica para cada preparación celular. El análisis de regresión múltiple reveló una diferencia estadísticamente significativa en la estabilidad del ARNm V5-ENaC en células tratadas con actinomicina D en comparación con la de las células no tratadas (p < 0.0001). Para cada condición experimental se utilizaron células de al menos cuatro ratas diferentes (n.o 4). Publicado anteriormente como Figura 1 en Migneault et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Modulación de la estabilidad del ARNm de V5-ENaC por diferentes tensiones celulares e inflamatorias. Las células epiteliales alveolares primarias fueron cotranspiradas transitoriamente con el plásmido pTet-Off y el plásmido estamido pTRE con un eNaC cDNA con un epítopo V5 aguas arriba de su marco de lectura abierto y secuencias UTR completas de 3'. Las células fueron pretratadas durante 30 min con 1,0 m de cicloheximida (CHX) (A) o 15 g/ml LPS(B) o durante 5 h con 100 ng/ml de TNF-o(C),seguido de un tratamiento con doxiciclina de 1,0 g/ml durante un período de 15-120 min. La expresión del ARNm de V5-ENaC se midió mediante RT-PCR cuantitativo y se presentó como el porcentaje de expresión de ARNm de SeM de V5-ENaC en células no tratadas (t a 0) después de la normalización de acuerdo con la expresión de tTA-Ad. Para cada condición experimental se utilizaron células de al menos tres ratas diferentes (n.o 3). (D) La vida media (t1/2) del ARNm V5-ENaC en las células tratadas se comparó con la vida media del ARNm en las células (Ctrl). La vida media se midió de acuerdo con la constante de velocidad (K) de la curva de degradación del ARNm de V5-ENaC utilizando la ecuación t1/2 a ln 2/K y luego expresada como min - SEM (prueba de ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Bonferroni; *p < 0,01 contra control; n 3). Adaptado de la Figura 36 publicada anteriormente en Migneault, F.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Uso de la estrategia de clonación de eliminación secuencial para revelar el papel de las diferentes regiones de la UTR de 3' en la modulación de la estabilidad del ARNm. (A) Mapa esquemático de la transcripción V5-ENaC con el UTR completo de 3' insertado en el vector de expresión pTRE-tight. El marco de lectura abierto se representa como un cuadro gris, mientras que el UTR de 3' se muestra como un cuadro blanco. La porción de 3' UTR de mRNA de ENaC se representa para el clon que lleva un UTR completo de 3' y para los diferentes mutantes de eliminación (Del 1 a Del 4). (B) Las células epiteliales alveolares primarias fueron cotranspiradas transitoriamente con plásmidos estancos pTRE que codifican diferentes mutantes de eliminación de UTR de ENaC 3' junto con el plásmido pTet-Off, que expresa tTA-Ad, para permitir la expresión específica de la construcción y su inhibición por doxiciclina. Setenta y dos h después de la transfectuación, las células fueron tratadas con doxiciclina (1,0 g/ml) durante 15 min a 6 h. La expresión del ARNm V5-ENaC se midió por RT-PCR cuantitativo y se presentó como el porcentaje de sem de expresión de ARNm De5 a ENaC en células no tratadas (t a 0) después de la normalización de acuerdo con la expresión de tTA. La vida media del ARNm V5-ENaC para cada construcción se estimó a partir de la constante de velocidad (K) de la curva de degradación del ARNm V5--ENaC utilizando la siguiente ecuación: t1/2 a ln 2/K. La descomposición del ARNm de V5-ENaC se muestra para el clon con el UTR (Comp) completo de 3' y para los mutantes de eliminación UTR de Del 1 a Del 4 3'. La vida media (t1/2) de la descomposición del ARNm se da para cada clon. En el cuadrante inferior derecho, el gráfico muestra una comparación de los diferentes valores t1/2 - SEM estimados para cada clon. p < 0,05 entre los diferentes grupos según la prueba Kruskal-Wallis. *p < 0.05 según la prueba post hoc de Dunn en comparación con el UTR completo de 3'. 0,05 p < 0,05 según la prueba post hoc de Dunn en comparación con Del 3. Para cada condición experimental se utilizaron células de al menos cinco animales diferentes (n.o 5). Adaptado de las figuras 2 y 3 publicadas anteriormente en Migneault et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Modulación posttranscripcional del ARNm V5-ENaC por las proteínas de unión al ARN hnRNPK, Dhx36 y Tial1. (A) Las células epiteliales alveolares primarias fueron cotranspiradas con el plásmido pTRE-apretado que codifica el ARNm V5-ENaC junto con un vector de expresión para los RRP Dhx36, hnRNPK o Tial1 y el plásmido pTet-Off. La expresión de ARNm de V5-ENaC se cuantificó mediante la posttransfección RT-qPCR 72 h y se expresó como el porcentaje de sem de expresión de ARNm de V5-ENaC en comparación con el de las células transllenadas con un vector vacío (pcDNA3) después de la normalización según la expresión tTA-Ad. La sobreexpresión de Dhx36 y Tial1 inhibió significativamente la expresión de ARNm v5-ENaC, mientras que la sobreexpresión de hnRNPK no tuvo ningún efecto. *p < 0.05 según la prueba Kruskal-Wallis y la prueba post hoc de Dunn en comparación con el vector vacío; N 3 muestras de diferentes animales fueron probadas por duplicado para cada condición experimental. (B) La porción proximal de la UTR de 3' de ENaC se eliminó clonando la región distal del UTR de 3' junto al codón de parada de ENaC en el plásmido estancado pTRE (V5-ENaC-Del5). (C) Las células epiteliales alveolares primarias fueron cotranspiradas con V5-ENaC o V5-ENaC-Del5 en el vector pTRE-tight junto con el plásmido pTet-Off y el vector de expresión para la sobreexpresión de Dhx36 o Tial1 RBP. La expresión de ARNm de V5-ENaC se cuantificó mediante la posttransfección RT-qPCR 72 h y se expresó como el porcentaje de sem de expresión de ARNm de V5-ENaC en comparación con el de las células transllenadas con un vector vacío (pcDNA3) después de la normalización según la expresión de tTA-Ad. La sobreexpresión de Dhx36 y Tial1 no tuvo ningún efecto en la expresión de ARNm V5--ENaC-Del5. *p < 0.05 según la prueba Kruskal-Wallis y las pruebas post hoc de Dunn tras la comparación de los vectores experimentales con el vector vacío; #p < 0.05 según la prueba U de Mann-Whitney tras la comparación de los vectores experimentales con el mutante UTR completo de 3'; n 6 para cada condición experimental. Adaptado de las figuras 5 y 7 publicadas anteriormente en Migneault et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Un | |||
| Plantilla | 3' UTR | Sentido | Secuencia |
| -ENaC cDNA | íntegro | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGGTTTTGGG-3' |
|
| Del 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| Del 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Objetivo | Sentido | Secuencia | |
| V5--ENaC | F | 5'-CCTAACCCTCTCCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTGTCC-3' | ||
Tabla 1: Primers utilizados en este estudio. (A) Primers utilizados para la clonación y generación de los mutantes V5-ENaC en el vector inducible pTRE-tight. (B) Imprimaciones utilizadas para la medición de la expresión de ARNm por RT-PCR cuantitativo.
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Discussion
La baja tasa de transfección de las células epiteliales alveolares en el cultivo primario ha sido una grave limitación para el uso del sistema Tet-Off para evaluar la estabilidad del ARNm en estas células. Sin embargo, esta limitación fue superada por la electroporación de pipetas, permitiendo una eficiencia de transfección del 25-30%(Figura 1 y Figura 3)26.
La medición de la estabilidad de la transcripción es fundamental para entender la modulación de un ARNm dado y su impacto en la homeostasis celular y el metabolismo. La variación en la biodisponibilidad de un GOI puede cambiar la eficiencia de la traducción y tener un impacto directo en la expresión del GOI en la célula. Por estas razones, se han desarrollado varias técnicas para determinar la vida media de los ARNm. Como se mencionó anteriormente, cada una de estas técnicas tiene limitaciones y limitaciones que impiden el estudio adecuado de una transcripción de interés. En comparación con otras técnicas, el modelo TET-off desarrollado aquí tiene la ventaja de permitir la estimación de la vida media de un ARNm dado bajo cualquier condición experimental. Sin embargo, no nos permite estudiar directamente la estabilidad de una transcripción endógena. Para superar esta limitación tanto como sea posible, se sugiere incluir las secuencias UTR y UTR de 5' de la transcripción en el plásmido para que la construcción sea lo más similar posible a las transcripciones endógenas. La adición del epítopo V5 permite la amplificación específica del ARNm objetivo por RT-qPCR frente a la de la transcripción endógena. En cuanto a la estrategia de clonación, la elección de la secuencia insertada aguas arriba del gen de interés es crucial para evitar la amplificación de señales inespecíficas. La adición de la secuencia de epítopos V5 5' del ORF es necesaria para la amplificación específica qPCR de la construcción debido a su corta longitud y la falta de su expresión en células epiteliales alveolares. Esta estrategia también ofrece la oportunidad de estudiar la modulación de la traducción de proteínas utilizando el mismo sistema inducible. A pesar del pequeño tamaño del epítopo V5 (42 nt), todavía es posible que esto pueda afectar la estabilidad de la transcripción. Por esta razón, se sugiere también probar otros epítopos, como la gripe humana hemagglutinina (HA) o cualquier otra secuencia no encontrada en el transcriptoma de células epiteliales alveolares.
Una limitación del sistema es el uso de doxiciclina para inhibir la transcripción de un GOI. Varios informes muestran que la doxiciclina podría tener un impacto significativo en el metabolismo celular. El uso de este antibiótico en 16HBE14 células bronquiales reduce la proliferación y aumenta la mortalidad debido a la apoptosis27. Además, la doxiciclina ya ha demostrado estar implicada en la modulación de la respuesta inflamatoria LPS28. Por lo tanto, este antibiótico podría tener efectos fuera del objetivo que pueden afectar la estabilidad del ARNm de un GOI dado. Por estas razones, evaluamos el impacto de la doxiciclina de 1 g/ml durante un período de 24 h en las células no transinfectadas y descubrimos que no indujo ningún cambio en la expresión de ARNm endógena de ENaC(Figura 2). Esta concentración fue elegida porque se utiliza ampliamente para inhibir completamente la transcripción del sistema Tet-Off y se recomienda para minimizar los efectos citotóxicos29. Sugerimos utilizar esta concentración en células epiteliales alveolares y recomendamos validar la concentración óptima para el estudio de otros genes o el uso de otros tipos de células con el sistema Tet-Off.
Nuestro sistema utiliza la expresión constitutiva del GOI hasta que su transcripción es inhibida por la doxiciclina. Se ha sugerido que las concentraciones excesivas de ARNm pueden ser tóxicas para la célula y afectar su metabolismo. Esto podría conducir a un cambio en la estabilidad de la transcripción del GOI, causando su rápida degradación debido a la sobreexpresión no fisiológica30. En el caso de nuestro modelo Tet-Off, no se observó tal toxicidad, porque las células transinfectadas mostraron una morfología similar a las de las células no transinfectadas sanas (datos no mostrados). De acuerdo con Tani et al.31, que demostraron la validez del sistema Tet-Off en la determinación de la vida media de un ARNm, nuestros resultados mostraron que el sistema Tet-Off no es tóxico en las células epiteliales alveolares y produce una vida media para el ARNm de ENaC que no refleja la sobreestabilización que se informó en presencia de inhibidores de la transcripción como actinomycin D.
El desarrollo de este sistema para medir la vida media del ARNm desafía los resultados observados cuando la estabilidad de las transcripciones se midió en presencia de inhibidores de la transcripción como la actinomicina D. Este método muestra que una vida media de transcripción puede ser mucho más corta de lo medido anteriormente.
Nuestro modelo es muy apropiado para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción específica en diferentes condiciones, incluyendo condiciones proinflamatorias o sobreexpresión de RBP, así como después del tratamiento con ARN silenciante. Además, permite la caracterización de regiones no traducidas esenciales para la modulación posttranscripcional de ARNm en condiciones patofisiológicas que afectan a las células epiteliales alveolares.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Francis Migneault fue apoyado por una beca proporcionada por la Red de Salud Respiratoria de Quebec y el programa de formación pulmonar de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), una beca de FRSQ y una beca de la Faculté des études Supérieures et Postdoctorados, Universidad de Montreal. Este trabajo fue apoyado por la Cátedra Gosselin-Lamarre en investigación clínica y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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