Summary
Burada, bir pipet elektroporasyon tekniğiile birleştiğinde indüklenebilir bir ifade sistemi kullanılarak primer alveoler epitel hücrelerinde bir transkript posttranskripsiyonel modülasyonu incelemek için kullanılabilecek bir araç salıyoruz.
Abstract
Posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesi, belirli bir haberci RNA'nın (mRNA) modülasyonunun ve hücre homeostazları ve metabolizması üzerindeki etkisini anlamak için temel dir. Gerçekten de, transkript ifadesindeki dalgalanmalar çeviri verimliliğini ve nihayetinde bir transkriptin hücresel aktivitesini değiştirebilir. Bu yöntemlerden bazılarıposttranskripsiyonel modülasyonun uygun şekilde incelenmesini engelleyen sınırlamalara sahip olsa da, mRNA'nın yarıömrünü araştırmak için çeşitli deneysel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir organizatör indüksiyon sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi genifade edebilir. Bu yöntem, hücre homeostazını rahatsız etmeden herhangi bir deneysel koşul altında belirli bir mRNA'nın yarı-ömür tahminine olanak sağlar. Bu yöntemin en önemli dezavantajlarından biri, konvansiyonel transfeksiyon tekniklerine son derece dirençli izole birincil hücrelerde bu tekniğin kullanımını sınırlayan transfect hücrelerinin gerekliliğidir. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Birincil alveoler hücrelerin benzersiz özellikleri ve fenotip bu hücrelerde ilgi genlerin posttranskripsiyonel modülasyonları çalışma için gerekli olun. Bu nedenle amacımız, primer kültürde alveoler epitel hücrelerine ilgi çeken mRNA'ların posttranskripsiyonel modülasyonlarını araştırmak için yeni bir araç geliştirmekti. Transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemini primer alveoler epitel hücrelerine yerleştirmek için hızlı ve etkili bir geçici transfeksiyon protokolü tasarladık. Bu klonlama stratejisi, yapı etiketlemek için viral bir epitop kullanarak, endojen mRNA'lar bu yapı ifade kolay ayrımcılık sağlar. Değiştirilmiş δδ sayısallaştırma döngüsü (Cq) yöntemi kullanılarak, transkriptin ifadesi yarı ömrünü ölçmek için farklı zaman aralıklarında ölçülebilir. Verilerimiz, primer alveoler epitel hücrelerinde çeşitli patofizyolojik koşullarda posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesinde bu yeni yaklaşımın etkinliğini göstermektedir.
Introduction
mRNA'ların yarı ömrünü belirlemek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. MRNA etiketli pulse-chase bozunma tekniği, en az hücresel bozukluk ile mRNA'lar büyük bir havuzun eşzamanlı değerlendirilmesi için izin verir. Ancak, bu yaklaşım tek bir gen transkriptinin yarılanma ömrünün doğrudan tahmin edilmesine izin vermez ve büyüme faktörleri, ROS, alarminler veya inflamasyon1ile uyarılması nı takiben bir mRNA'nın posttransktranskripsiyonel modülasyonunu incelemek için uygulanamaz.
Aktinomisin D ve α-amanitin gibi transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımı, zaman içinde mRNA bozunma kinetiğini ölçmek için nispeten basit bir yöntemdir. Önceki teknikler üzerinde bu yaklaşımın bir ana avantajı, (yani, nabız-kovalamaca) doğrudan belirli bir transkript yarı ömrü tahmin etmek ve farklı tedaviler in bozunma kinetik nasıl etkileyebileceğini karşılaştırmak yeteneğine dayanır. Ancak transkripsiyon inhibitörlerinin hücre fizyolojisi üzerindeki önemli zararlı etkisi2. Gerçekten de, bu ilaçlarla tüm hücre transkripsiyonu inhibisyonu, mikroRNA 'lar (miRNA'lar) gibi mRNA stabilitesinde rol oynayan anahtar elementlerin sentezini ve mRNA bozunması ve stabilitesi için önemli olan RNA bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu ve sentezini perturbingin olumsuz yan etkisine sahiptir. Bu ilaçların gen transkripsiyonunun şiddetli pertürbasyonu bu nedenle artefactually transkript lerin bozulma eğrilerini değiştirebilir.
Organizatör indüksiyon sistemi belirli bir mRNA'nın yarı ömrünü ölçmek için üçüncü bir yaklaşımı temsil eder. Bu yöntem, transkripsiyon inhibitörlerini kullanan yöntemlere benzer şekilde belirli bir mRNA'nın bozulmasını ölçer. İki tip indüksiyon sistemi sıklıkla kullanılmaktadır: seruma bağlı c-fos promotörü3 ve Tet-Off indüklenebilir sistem4. C-fos sistemi ile hücre için toksik olabilecek transkripsiyon inhibitörlerinin kullanılmasına gerek yoktur. Ancak, bu yöntem hücre döngüsü senkronizasyonu gerektirir, hangiinterfaz5 sırasında bir transkript gerçek kararlılığının değerlendirilmesi engeller. Buna karşılık, Tet-Off sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi geninin güçlü ifade sağlar (GOI). Bu sistem işlevsel olması için hücre içine cotransfected gereken iki elementin varlığını gerektirir. İlk plazmid (pTet-Off) düzenleyici protein tTA-Adv ifade, prokaryotik represör TetR oluşan bir hibrid sentetik transkripsiyon faktörü (Escherichia coli itibaren) viral protein HSV VP16 üç transkripsiyon transaktivasyon etki erimiş. GOI sentetik bir promotör kontrolü altında pTRE-Tight plazmid içine klonlanır (PSıkı),sitomegalovirüs minimal dizi oluşan (CMV) promotör tetO operatör dizisinin yedi tekrarları erimiş. PTight geninin transkripsiyonu TetR'in tetO ile etkileşimine bağlıdır. Tetrasiklin veya türevi, doksisiklin varlığında, TetR represörü tetO operatörü için yakınlık kaybeder, transkripsiyon bir kesilmesine yol açan4. Tet-Off sisteminin özellikleri ökaryotik hücrelerde spesifik mRNA ekspresyonunun incelenmesi için ideal bir model oluştururken, ökaryotik hücrede prokaryotik düzenleyici dizilerin yokluğuna sekonder olan potansiyel pleiotropik etkilerden kaçınılmalıdır6. Genellikle, iki kat kararlı Tet-Off hücre hatları (HEK 293, HeLa, ve PC12) kontrol edilebilir gen ekspresyonu7,8,9uygun erişim için regülatör ve yanıt plazmidlerin kopyalarını entegre etmek için bu sistem ile kullanılır .
Alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için kültürdeki alveoler epitel hücrelerinin çeşitli modelleri kullanılmıştır. Yıllardır, araştırmacılar yaygın insan veya kemirgenbirincil hücreleri10,11 yanı sıra insan A549 veya sıçan RLE-6TN hücreleri12,13gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullandık. Genellikle daha az proliferatif ve kültür ve transfect daha zor olmasına rağmen, primer kültür alveoler epitel hücreleri fizyolojik ve patolojik koşullarda alveoler epitel fonksiyonu ve disfonksiyonu çalışma için altın standart olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, A549 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri birincil hücrelerin karmaşık özelliklerini ve fenotiplerini sergilemezken, birincil kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin ana özelliklerini, özellikle de polarize ve sıkı bariyer oluşturma yeteneğini yeniden özetlez14,15. Ne yazık ki, bu hücreler çok zor Tet-Off gibi bir organizatör kaynaklı sistem kullanımı yapma, lipozomkullananlar gibi geleneksel transfeksiyon teknikleri, çok dayanıklıdır.
mRNA'ların posttranskripsiyonel modülasyonu, transkriptin gen ekspresyonunu hızla modüle etmek için en etkili yöntemlerden biridir16. MRNA 3' çevrilmemiş bölge (3' UTR) bu mekanizmada önemli bir rol oynar. 5' UTR'nin aksine, 3' UTR'nin uzunluğu ile bir organizmanın hücresel ve morfolojik karmaşıklıkları arasında üstel bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bu korelasyon, 3' UTR, mRNA kodlama bölgeleri gibi, evrim 17 boyunca giderek daha karmaşık posttranskripsiyonel modülasyon için izin doğal seçilim tabi olduğunu göstermektedir17. 3' UTR, transkriptin stabilitesini ve çevirisini etkileyen proteinler ve miRNA'lar için çeşitli bağlayıcı bölgeler içerir.
Bu çalışmada, transkript kararlılığının kontrolü için bir GOI 3 'UTR son derece korunmuş etki alanlarının rolünü araştırmak için bir araç geliştirdi. Alveoler epitel fizyolojisinde önemli bir rol oynayan epitel sodyum kanalı alfa alt ünitesi (αENaC) üzerinde yoğunlaştık18. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri, diğer protokollerle transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımına kıyasla hücre fizyolojisini ve metabolizmasını en az etkileyen bir sistemle 3' UTR'nin mRNA stabilitesinde rolünün incelenmesine olanak sağlayan Tet-Off sisteminin iki bileşeni ile başarılı bir şekilde transekse edildi. GoI ekspresyonunu endojen genin ekspresyonundan ayırt etmek için endojen bir epitop (V5) kullanarak bir klonlama stratejisi geliştirilmiştir. Yanıt ve düzenleyici plazmidler daha sonra pipet elektroporasyon tekniği kullanılarak alveoler epitel hücrelerine aktarıldı. Daha sonra, transkript infeksiytin ekspresyonu farklı zaman aralıklarında doksisiklin ile hücreleri kuluçka ile ölçüldü. Transkriptin yarılanma ömrü RT-qPCR tarafından normalizasyon için transfected tTA-Ad mRNA ürünü kullanılarak modifiye edilmiş bir Cq yöntemi ile değerlendirildi. Protokolümüz sayesinde, bir transkriptin transkripsiyonel modülasyonunu farklı koşullar altında incelemek ve çevrilmemiş bölgelerin katılımını daha ayrıntılı olarak tanımlamak için uygun bir yol sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine göre yürütülmüş ve Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Araştırma Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. İlgi genini ifade eden yanıt plazmidinin tasarımı ve üretimi (GOI)
- pTRE-Tight gibi indüklenebilir bir tetrasiklin-off vektörü kullanın.
- GOI'da dahili olarak bulunmayan MCS'deki kısıtlama sitelerini tanımlamak için GOI'nin ve vektörün birden fazla klonlama alanının (MCS) dizisini analiz edin.
- Daha önce açıklandığı gibi erkek Sprague-Dawley sıçan akciğerlerinden primer alveoler epitel hücreleri izole19,20.
- Fenol/kloroform ekstraksiyonu veya silika bazlı RNA spin kolonları kullanımı gibi standart bir yöntem kullanarak alveoler epitel hücrelerinden gelen toplam RNA'yı Standart bir yöntemle RNA ekstraksiyonu ile arındırın.
- Oligo(dT) ve yüksek sadakatli ters transkriptaz kullanarak mRNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters yazınız.
- Yüksek sadakatli Taq polimeraz ve standart üst üste pcr tekniklerini kullanarak GOI'yi tasarlanmış astarlar kullanarak seçilen iki kısıtlama enzim tanıma alanı yla kuşatın.
- Ileri astar mRNA stabilitesine paralel olarak protein ekspresyonu çalışması için ifade düzeylerini artırmak için bir Kozak konsensus ribozom bağlama sitesi21 içerir. GOI'nin V5 epitopesini kodlayan bir dizi, transfected GOI'nin ekspresyonunu endojen ifadeden ayırt etmek için eklenmelidir (Tablo 1).
- Stop kodonundan sonra ters astarpoliadenilasyon sinyali içersin.
- Mutantlar, goi 3' UTR'nin 3' ucunu yavaş yavaş silen bir poliadenilasyon sitesini kodlayan ters astarlar kullanarak farklı 3' UTR bölgelerinin GOI'nin mRNA'sının stabilitesi üzerindeki etkilerini incelemek için sıralı silme ile oluşturulabilir (Şekil 6). Alternatif olarak, PCR yönelimli mutagenez 3 'UTR22ilgi belirli bir bölgeyi hedeflemek için kullanılabilir.
- Indüklenen vektörü ve kesici uç, daha önce seçilmiş restriksiyon enzimleri ile 1 saat boyunca uygun kuluçka sıcaklığında sindirin, ardından kendi kendine ligasyondan kaçınmak için 30 dk vektör reaksiyonu sırasında fosfataz ile tedavi edin.
- Sindirilmiş vektörü ve kesici uçları elektroforez ile %1-1,5 agarose jel (kesici uç büyüklüğüne bağlı olarak konsantrasyon) ayırın.
- Bir bıçak ve UV ışığı kullanarak, istenilen kesici uç ve vektör içeren DNA parçalarını toplayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Bir silika tabanlı PCR arıtma kiti kullanarak agarose jel toplanan segmentleri arındırın ve 260 nm spektrofotometri ile konsantrasyonu ölçmek.
- GI ve T4 DNA ligaz ile indüklanabilir vektör bir vektör kullanarak ligate:ligasyon olasılığını artırmak için 1:3 insert molar oranı. Reaksiyonu oda sıcaklığında (RT) 3 saat kuluçkaya yatırın.
- Ligasyon reaksiyonunu yetkin E. coli'ye (DH5α) dönüştürün.
- 100 μL'lik yetkin hücre içeren bir tüpe 1-10 ng vektör ve gen ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve 42 °C'de 45 s. Tüpü 2 dk buzüzerine yerleştirin ve 900 μL RT LB ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca 225 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Dönüştürülmüş bakterileri seçmek için lb agar plakasına uygun bir antibiyotikle (örneğin, pTRE-Tight vektörü için 100 μg/mL ampillin) reaksiyonun 100 μL'sini yayın. Plakayı bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Bir aşılama döngüsü veya 20 μL ucu kullanarak tek tek kolonileri seçin ve sallayarak 37 °C uygun antibiyotik içeren 5 mL LB orta gecede kuluçka. Dönüştürülmüş bakteriler gliserol stoklarında -80 °C'de 400:600 LB orta gliserol oranında saklanabilir.
- Plazmid DNA'sını silika bazlı plazmid kolonları kullanarak ayıklayın ve konsantrasyonu 260 nm'de spektrofotometri ile ölçün. GoI'nin restriksiyon analizi, oryantasyonu ve RT-PCR sırasında potansiyel olarak ortaya çıkan mutasyonların olmamasını sıralama ile onaylayın.
2. İlgi genini ifade eden yanıt plazmidinin (GOI) primer alveoler epitel hücrelerine aktarılması
- Sıçan akciğerlerinden tip II alveoler epitel hücrelerini izole edin.
- Hücreleri 100 mm Petri kaplarında 1 x 106 hücre/cm2 yoğunlukta, tam minimum gerekli ortam (komple MEM) ile tohumlayın. Komple MEM% 10 FBS, 0.08 mg / L tobramisin, Septra (3 μg / mL trimetoprim ve 17 μg / mL sulfamethoxazole), 0.2% NaHCO3,0.01 M HEPES (pH = 7.3) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmektedir. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 24 saat eve kültürlendirin.
- Ertesi gün, yeni bir 12 kuyu plakaher kuyuya antibiyotik olmadan tam MEM 500 μL yerleştirin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de plaka önceden ısıtın. Bu adımda, tetrasiklinleri kirletmeden veya inducibility müdahale etmek için çok düşük bir düzeyde fetal sığır serumu kullanmak önemlidir.
- Rt'de her kuyuda 1 μg GOI plazmid ve 1 μg düzenleyici vektör ekleyerek plazmid içeren 1,5 mL tüplerin indüklenebilir GOI (GOI plazmid) ve düzenleyici vektörü (örn. pTet-Off) hazırlayın. RNA bağlayıcı proteinler (RBP) ile birlikte ifade deneyleri için, 1 μg'lık kurucu vektör (örneğin, pcDNA3) RPB'yi ifade eden ve DNA karışımına eklenir (Şekil 7).
- Orta aspire ve yavaşça PBS ile hücreleri durulayın (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 37 °C önceden ısıtılır.
- 37 °C'de önceden ısıtılmış %0,05 tripsin 5 mL ekleyin ve hücreler ayrılana kadar hücreleri kuluçkaya yatırın (2-4 dk). Antibiyotik olmadan tam MEM 10 mL ekleyerek tripsin nötralize.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın, Petri kabını 4 mL orta ile yıkayın ve mümkün olduğunca çok sayıda hücre toplayın ve hücre süspansiyonuna 5 dk boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
- Yavaşça aspire ve supernatant atın ve PBS 1 mL pelet resuspend. Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve hesaplay.
- Hücreleri 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı nazikçe aspire edin ve 4 x 107 hücre/mL konsantrasyonda resuspension tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Adım 2.4'te hazırlanan 1,5 mL'lik tüpün hücrelerini kuyu başına 400.000 hücre konsantrasyonunda ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
- Tüpü elektroporasyon cihazına yerleştirin ve 3,5 mL elektrolitik tampon ile doldurun.
- Pistonun tamamına basarak bir pipete altın kaplama elektrot ucu yerleştirin. 1,5 mL'lik tüpün içeriğini hafifçe karıştırın ve pilleri pipetle dikkatlice aspire edin. Bu elektroporasyon sırasında elektrik arkneden ve azaltılmış transfeksiyon verimliliğiyol açacaktır gibi, ucu girmesini hava kabarcıkları önlemek için dikkatli olun.
- Bir tıklama sesi olana kadar pipeti elektroporasyon istasyonuna takın.
- 1.450 V ve 2 0 ms genişliğinde 2 darbe gerilimine karşılık gelen alveoler epitel hücreleri için uygun elektroporasyon protokolünü seçin ve dokunmatik ekranda Başlat tuşuna basın.
- Transfeksiyondan hemen sonra pipeti çıkarın ve hücreleri önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış antibiyotik olmadan tam MEM ile dolu bir kuyuya aktarın.
- Kalan örnekler için 2.11-2.14 adımlarını yineleyin.
- Hücreleri kuyu yüzeyine eşit olarak yaymak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. 2 gün sonra orta ortamı tam MEM ile antibiyotiklerle değiştirin.
- EGFP'nin ekspresyonunu floresan mikroskobu altında gözlemleyerek veya bir kontrol vektörü kullanarak akış sitometrisi ile transfeksiyonun başarısını doğrulayın(Şekil 1).
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve pcDNA3-EGFP gibi eGFP'yi ifade eden farklı bir plazmid kullanarak ek bir transfeksiyon adımı gerektirir.
3. GOI transkripsiyon inhibisyonunun indüksiyonu
NOT: Hücreler, mRNA stabilitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için doksisiklin indüksiyonundan önce istenilen tedavilerle ön tedavi edilebilir (Şekil 5).
- Deiyonize suda 1 mg/mL'lik doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini ışıktan korunan -20 °C'de saklayın. Tetrasiklin türevi olan Doksisiklin, tetrasiklin yerine kullanılır, çünkü tetrasiklinden daha uzun bir yarı ömüre (2x) sahiptir. Ayrıca, doksisiklin daha düşük bir konsantrasyon tet operon23tam inaktivasyonu için gereklidir.
NOT: Doksisiklin endojen GOI mRNA ekspresyonunu etkileyebilir. Bunu doğrulamak için, doksisiklin ile 24 saattedavinin alveoler hücreler üzerindeki etkisi GOI ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmadığını doğrulamak için test edilmelidir(Şekil 2). - Tam MEM 72 h posttransfeksiyon da taze 1 μg/mL doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'ye ısıtın.
- GOI'nin transkripsiyonuna inhibe etmek için orta yı kuyu başına 1 μg/mL doksisiklin içeren 1 mL tam MEM ile değiştirin.
- GOI'nin mRNA yarı ömrünü değerlendirmek için 15 dakika-6 saat arasında farklı süreler için 37 °C'de %5 CO2'de birden fazla kuyu kuluçkaya yatırın.
- Tedavinin sonunda, hücreleri buz gibi PBS ile yıkayın ve iyi başına 500 μL tampon ekleyerek ve hücreleri homojenize etmek için plakasal sallayarak ticari olarak kullanılabilir fenol-kloroform RNA ekstraksiyon kiti ile lyse.
- Üreticinin protokolüne göre RNA'yı izole edin. 230, 260 ve 280 nm spektrofotometri ile RNA verimini ve saflığını belirleyin. Sırasıyla 1,8 ve 2,0 oranları 260:230 ve 260:280 olan RNA örnekleri saf kabul edilir.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
4. GOI'nin mRNA stabilitesinin belirlenmesi
- Sonraki DNA amplifikasyonuna müdahale edebilecek plazmid DNA izlerini gidermek için toplam RNA'nın 1 μg'sini RNa içermeyen DNA I (amplifikasyon derecesi) ile tedavi edin.
- 0,2 mL'lik bir PCR tüpünde, toplam 1 000 RNA, 1 0x DNase I reaksiyon arabelleği, 1 μL DNaase I (1 U/μL) ve RNAe içermeyen suyu birleştirerek toplam 10 μL'lik bir hacim elde edin.
- 20 dakika RT'de reaksiyon uyguluyor.
- 10 μL reaksiyon karışımına 1 μL 25 mM EDTA ekleyerek ve reaksiyonu 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırarak DNAse I'yi etkisiz hale getirin.
- Ters transkripsiyon verimliliğini artırmak için oligo(dT) ve rasgele hexamer astarların karışımı ile ticari olarak kullanılabilen bir cDNA sentez kiti kullanarak DNA'ya tükenmiş toplam RNA'yı cDNA'ya ters yazınız.
- Kısaca, 20 μL toplam reaksiyon hacmi elde etmek için DNA tükenmiş toplam RNA karışımının 11 μL'sine 4 μL 5x reaksiyon karışımı, 1 μL ters transkriptaz ve 4 μL RNa içermeyen su ekleyin.
- 25 °C'de 5 dk, ardından 46 °C'de 20 dk reaksiyon uyguluyor ve 1 dk boyunca 95 °C'de kuluçkaya yatarak reaksiyonu inkübedin. Her reaksiyon 50 ng/μL cDNA ürünü verecektir.
- 20 μL reaksiyon karışımına 180 μL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyerek cDNA reaksiyonunu 5 ng/μL konsantrasyonuna seyreltin. CDNA ürünlerini -80 °C'de saklayın veya hemen gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) yapmaya başlayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- GOI'ye özgü ileri ve geri qPCR astarları tasarla.
- Hücrelerdeki GOI'nin endojen ekspresyonu nedeniyle astarlar, GOI ile birleşen V5 epitopunun 100-150 bp amplicon'unu güçlendirecek şekilde tasarlanmalıdır (Tablo 1).
- Dahili referans gen astarları da normalleştirme kontrolleri olarak kullanılmalıdır. Genellikle beta-aktin ve hipoksantin fosforibosiltransferaz 1 genleri gibi temizlik genleri referans genler olarak kullanılır. Ancak transfeksiyon veriminin değişimi nedeniyle bu indüksiyon sistemi ile bu sistem kullanılamaz. Bunun yerine, tTA-Reklam transkriptinin ifadesi normalleştirme amacıyla değerlendirilir, çünkü ifadesi sitomegalovirüs organizatörünün aktivitesi nedeniyle hücrelerde kurucudur. QPCR ile ölçülen ifadesinde herhangi bir varyasyon transfeksiyon verimliliği temsil edecek (astarlar: ileri 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' ve ters 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) ve transfected klonlar ifade normalleştirilmesi sağlayacaktır(Şekil 3).
- Bir SYBR Yeşil boya ana karışımı kullanarak triplicate her qPCR reaksiyon hazırlayın.
- Moleküler biyoloji sınıfı su kullanarak 5 ng/μL cDNA karışımını 1,25 ng/μL konsantrasyonuna seyreltin.
- 5 μL SYBR Yeşil boya ana karışımını (2x), 0,1 μL moleküler biyoloji sınıfı suyu, 0,45 μL 7,5 m ileri astar, 0,45 μL 7,5 m geri astar ve 4 μL 1,25 ng/μL cDNA birleştirerek 96 iyi bir plakada borulama yı karıştırın. Plaka kapağının kapalı olduğundan emin olmak ve kontaminasyon ve buharlaşmayı önlemek için optik yapışkan film kullanın.
- Reaksiyon karışımını kısa bir süre santrifüj le aşağı çevirin ve plakayı bir qPCR termocycler'a yerleştirin.
- V5 etiketli GOI ve tTA-Ad amplicon'ları aşağıdaki qPCR koşullarını kullanarak yükseltin: denatürasyon adımı olarak 10 dk için 95 °C, ardından 10 s için 95 °C 40 devir, 15 s için 58 °C ve 20 s için 72 °C. İstenilen amperatörlerin spesifik erime sıcaklıklarını değerlendirmek ve gürültü amplifikatör zirvelerinin yokluğunu sağlamak için amplifikasyon döngüleri yapıldıktan sonra yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi oluşturulmalıdır.
- Ters transkriptaz olmadan bir şablon olarak RNA ile qPCR gerçekleştirerek qRT-PCR için negatif kontroller ekleyin potansiyel plazmid DNA kontaminasyonu ve qPCR için bir kontrol olarak hizmet vermek için qPCR dahil hiçbir cDNA ile qPCR karışımı astar dimers veya eksikliği sağlamak için Kirletici.
- Optimal cDNA konsantrasyonu, astar verimliliği ve konsantrasyon, GOI'ye göre standart bir eğri testi ile optimize edilmelidir. Bunu yapmak için, tedavi edilmeyen hücrelerden cDNA kullanarak bir seri seyreltme gerçekleştirmek (doksisiklin olmadan kültürlü). Standart eğri cDNA seyreltme faktörünün kütüğüne göre Cq değerlerinin çizilmesiyle oluşturulur ve amplifikasyon verimliliği (E) aşağıdaki formül kullanılarak standart eğrinin eğimine göre hesaplanır:
E = 10-1/eğim
NOT: Amplifikasyon verimi yaklaşık 0,9 ila 1,05 olmalıdır. Aksi takdirde, astarlar yeniden tasarlanmalıdır.
- GoI'nin göreli ifade düzeylerini elde etmek ve goi'nin aynı hayvanın hücrelerindeki mRNA ifadesinin bir yüzdesi olarak ifadesini başlangıç noktasında (t = 0)(Şekil 4)olarak bildirmek için GOI'nin ifade değerlerini tTA-Ad ifadesine normalleştirerek karşılaştırmalı Cq yöntemini kullanarak qPCR verilerini analiz edin.
- Yarılanma ömrü, GOI mRNA bozunma eğrisinin oran sabitinden (K) aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenir:
t1/2 = ln 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, primer alveoler epitel hücrelerinde transkript stabilitesinin modülasyonunda αENaC 3' UTR'nin farklı bölümlerinin önemini değerlendirmek için transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemi oluşturmak için başarıyla kullanılmıştır.
Bu sistemin uygulanmasında ilk adım, transfect zor birincil kültürde alveoler epitel hücreleri için hızlı, kolay ve verimli transfeksiyon tekniği kurmak oldu. Şekil 1'degösterildiği gibi, floresan mikroskobu ve akış sitometrisi tarafından saptanan eGFP hücrelerinin oranlarından da gösterildiği gibi, pipet elektroporasyon tekniği %25-30 transfeksiyon verimlilik oranına izin vermiştir.
Tetrasiklin ve türevleri tarafından kontrol edilen bu indüksiyon sistemini uygulamadan önce, bu ilacın GOI'mizin ekspresyonu üzerindeki etkisi doğrulandı. Alveoler epitel hücreleri endojen αENaC mRNA ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için 1.0 g/mL doksisiklin ile tedavi edildi. 1-24 saat arasında yapılan tedavilerin şekil 2'degösterildiği gibi endojen transkriptin ekspresyonu üzerinde anlamlı bir etkisi yoktur.
Transkripsiyonla kontrol edilen plazmid ekspresyonu sistemimiz, temizlik genlerini kullanan standart teknikten farklı bir qPCR normalleştirme tekniği kullanır. V5-αENaC ekspresyonu durumunda, cq yöntemi kullanılarak transfeksiyonun etkinliğini belirlemek için sinyal tTA-Adv sinyaline göre normalleştirildi. Şekil 3, mRNA ekspresyonunu normalleştirmek için tTA-Adv transkriptinin kullanımını göstermektedir.
Daha önce yayınlanan sonuçlar, anormal derecede yüksek mRNA yarı ömrü (yaklaşık 12 saat)24olarak belirtildiği için, aktinomisin D kullanımının αENaC transkript stabilitesinin tahmini için uygun olmadığını göstermektedir. ΑENaC mRNA'nın Tet-Off sisteminin (99 dk) varlığında yarı ömrü, Şekil 4'tegösterildiği gibi aktinomisin D varlığında bulunandan 7 kat daha kısaydı. Bu, aktinomisin D'nin artifactual αENaC mRNA stabilizasyonuna yol açtığını doğrular.
Bu Tet-Off sistemi, αENaC gen ekspresyonunu etkilediği bilinen farklı hücre streslerinin αENaC mRNA stabilitesini modüle edip edemeyeceğini test etmek için de başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Şekil 5'tegösterildiği gibi siklohekmid tedavisi transkriptin stabilitesini (36 dk) önemli ölçüde azaltırken, lipopolisakkaritler (LPS, enfeksiyöz uyaranları taklit etmek için kullanılır) bunu yapmadı. Son olarak, pro-inflamatuar sitokin TNF-α V5-αENaC mRNA stabilitesinde (16 dk yarı ömrü ile) ciddi bir düşüşe neden oldu.
Bu çalışmada, klonlama stratejisi αENaC transkript modülasyonu için 3 'UTR katkısı açıklamak için tasarlanmıştır. ΑENaC 3' UTR'nin farklı etki alanlarının transkript kararlılığına katkısını haritalamak için birkaç sıralı silme mutantı oluşturuldu ve test edildi. Şekil 6, V5-αENaC mRNA'nın 3' UTR'nin silinen ve dahil edilen bölgelerine bağlı olarak stabilitesinin modülasyonundaki önemli değişiklikleri göstermektedir.
Son olarak bu modelle αENaC mRNA'nın RNA bağlayıcı proteinler (RBP) ile stabilitesi incelenmiştir. αENaC mRNA'nın pTRE-Tight vektöründen V5 epitopu ile transkripsiyonu tTA-Adv. Dhx36, Tial1 ve hnRNPK'nın özel kontrolü altındadır ve αENaC24'ün3' UTR'sine bağlı üç RP'dir. Bu nedenle, Dhx36, Tial1 veya hnRNPK ile cotransfection sonrası V5-αENaC ekspresyonunun herhangi bir modülasyonu, transkripsiyon modülasyonunun değil, mRNA stabilitesinin modülasyonunun sonucu olacaktır. Şekil 7, Dhx36 veya Tial1'in aşırı ekspresyonunun hnRNPK'nın aksine, v5-αENaC mRNA'nın stabilitesini, boş pcDNA3 plazmidi ile transfeksiyona göre azalttığını göstermektedir, bu da bazı RP'lerin spesifik modülasyonlarını gösterir.
Bu sonuçlar, geliştirdiğimiz Tet-Off transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyon sisteminin bir transkriptin gerçek yarılanma ömrünü ve modülasyonunda yer alan mekanizmaları değerlendirmek için uygun bir aracı temsil ettiğini doğruladı. Bu araç, fizyolojik ve patolojik koşullarda alveoler epitelin işlevinde yer alan anahtar GOI'lerin posttranskripsiyonel düzenlemesi ne yeni anlayışlar elde edilmesinde yararlı olacaktır.
Şekil 1: Alveoler epitel hücrelerinin primer kültürde pipet elektroporasyonu ile transfeksiyonunun etkinliği. Primer alveoler epitel hücreleri gfp proteinini ifade eden veya ifade etmemiş bir pcDNA3 plazmidinin (boş, klonlar #1 ve #2) 2 μg'ı ile geçici olarak transeksif edildi. Transfeksiyon verimi transfeksiyondan sonra 48saat floresan mikroskopisi veya (B) akış sitometrisi ile değerlendirildi. Tek yönlü ANOVA ve Bonferroni sonrası hoc testi; *p < 0.001 vs. boş. Her deneysel durum için en az dört farklı sıçandan (n ≥ 4) hücre kullanıldı. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Alveoler epitel hücrelerinde doksisiklin ile endojen αENaC mRNA modülasyonu. Alveoler epitel hücreleri 1-24 saat süreyle 1.0 g/mL doksisiklin ile tedavi edildi. αENaC mRNA ekspresyonu kantitatif RT-PCR ile ölçüldü ve β-aktin ekspresyonuna göre normalizasyondan sonra (Ctrl; t = 0) ile karşılaştırıldığında αENaC mRNA ± SEM ifadesi olarak sunuldu (tek yönlü ANOVA, n = 4). Doksisiklin zaman içinde endojen αENaC mRNA modüle etmedi. Daha önce Migneault ve ark.24 şekil S4 olarak yayınlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: GoI mRNA ekspresyonunun düzenleyici mRNA tTA-Ad ifadesine göre değiştirilmiş bir Cq yöntemi ile normalleştirilmesi. Alveolar epitel hücreleri, açık okuma çerçevesinin v5 epitopunu ve tam 3' UTR dizilimini taşıyan pTRE-Tight plazmid kodlamaαENaC cDNA kodlaması ile geçici olarak cotransfeced edildi. V5-αENaC ve tTA-Ad mRNA'ların ekspresyonu tedavi edilmeyen hücrelerde kantitatif RT-PCR ile ölçüldü. (A) V5-αENaC'ın delta-normalize Edilmiş SYBR Yeşil floresan sinyalleri (ΔRn) ve iki ayrı transfeksiyondan (R1 ve R2) tTA-Ad gösterilmiştir. (B) Sol grafik: Her deneyde V5-αENaC ve tTA-Ad'ın mRNA ekspresyonu (R1 ve R2) döngü niceleme değeri (Cq) olarak ifade edilir. V5-αENaC ile tTA-Ad mRNA ekspresyonu (ΔCq) arasındaki fark sunulmuştur. Sağ grafik: TTA-Ad mRNA'nın temizlik geni yerine kullanılması, R2'dekiyle karşılaştırıldığında R1'de 0.98 göreceli bir ifade gösteren GOI ekspresyonunun etkin bir şekilde normalleştirilmesine olanak sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: V5-αENaC mRNA'nın dgradasyon kinetiği transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemi actinomisin D varlığında ve yokluğunda kullanılması. Primer alveoler epitel hücreleri pTet-Off plazmid ivedive pTRE-tight plazmid kodlama αENaC cDNA açık okuma çerçevesinin V5 epitop upstream ve tam 3' UTR dizileri ile eşzamanlı edildi. 30 dk için aktinomisin D (5.0 μg/mL) ile önceden tedavi edilen veya tedavi edilmeyen hücreler daha sonra 15 dakika boyunca doksisiklin (1.0 g/mL) ile inkübedildi. V5-αENaC mRNA ekspresyonu kantitatif RT-PCR ile ölçüldü ve tTA-Ad ifadesine göre normalizasyondan sonra tedavi edilmeyen hücrelerde (t = 0) V5-αENaC mRNA ekspresyonunun % ± SEM'i olarak sunuldu. V5-αENaC mRNA yarı lanma ömrü, her hücre hazırlığı için bir fazlı çürüme doğrusal olmayan regresyon ile tahmin edilebildi. Çoklu regresyon analizi, aktinomisin D ile tedavi edilen hücrelerde V5-αENaC mRNA stabilitede tedavi edilmeyen hücrelerde istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptadı (p < 0.0001). Her deneysel durum için en az dört farklı sıçandan (n ≥ 4) hücre kullanıldı. Daha önce Şekil 1 olarak Migneault ve ark.24olarak yayınlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: V5-αENaC mRNA stabilitesinin farklı hücresel ve inflamatuar stresler ile modülasyonu. Primer alveoler epitel hücreleri pTet-Off plazmid ivedive pTRE-tight plazmid kodlama αENaC cDNA açık okuma çerçevesinin V5 epitop upstream ve tam 3' UTR dizileri ile eşzamanlı edildi. Hücreler 30 dk boyunca 1.0 μM siklohekamid (CHX)(A)veya 15 μg/mL LPS(B)veya 5 saat 100 ng/mL TNF-α(C)ile ön tedavi edildi ve ardından 15-120 dk. V5-αENaC mRNA ekspresyonu kantitatif RT-PCR ile ölçüldü ve tTA-Ad ifadesine göre normalizasyondan sonra tedavi edilmeyen hücrelerde (t = 0) V5-αENaC mRNA ekspresyonunun % ± SEM'i olarak sunuldu. Her deneysel durum için en az üç farklı sıçandan (n ≥ 3) hücre kullanıldı. (D) Tedavi edilen hücrelerde V5-αENaC mRNA'nın yarı ömrü (t1/2)hücrelerdeki mRNA'nın yarı ömrüyle karşılaştırıldı (Ctrl). Yarı-ömürler V5-αENaC mRNA bozulma eğrisinin hız sabitine (K) göreölçüldü ve daha sonra min ± SEM (tek yönlü ANOVA testi ve Bonferroni sonrası hoc testi; *p < 0.01 vs. kontrol; n ≥ 3) denklemi kullanılarak ölçüldü. Şekil 36 daha önce Migneault, F.25yayınlanan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: αENaC 3' UTR'nin farklı bölgelerinin mRNA stabilitesinin modülasyonundaki rolünü ortaya çıkarmak için sıralı silme klonlama stratejisinin kullanılması. (A) V5-αENaC transkriptinin şematik haritası ve pTRE-sıkı ifade vektörüne tam 3' UTR yerleştirilir. Açık okuma çerçevesi gri bir kutu olarak, 3' UTR ise beyaz bir kutu olarak gösterilir. αENaC mRNA'nın 3' UTR kısmı tam 3' UTR taşıyan klon ve farklı silme mutantları için (Del 1'den Del 4'e) gösterilmiştir. (B) Primer alveoler epitel hücreleri, doksisiklin ile yapının spesifik ekspresyonunu ve inhibisyonunu sağlayan pTet-Off plazmidi ile birlikte farklı αENaC 3' UTR deletion mutantlarını kodlayan pTRE-sıkı plazmidlerle geçici olarak cotransfeced edildi. Transfeksiyondan sonra hücreler 15 dakika ile 6 saat arasında doksisiklin (1.0 g/mL) ile tedavi edildi. Her yapıiçin V5-αENaC mRNA yarı ömrü, V5-αENaC mRNA bozulma eğrisinin hız sabitinden (K) aşağıdaki denklemkullanılarak tahmin edilebilmiştir: t1/2 = ln 2/K. V5-αENaC mRNA bozunumu klonu için tam 3' UTR (Comp) ve Del 1 ile Del 4 3' UTR silme mutantları için gösterilir. MRNA bozunma yarı ömrü (t1/2) her klon için verilir. Sağ alt kadranda, grafik her klon için tahmin edilen farklı t1/2 ± SEM değerlerinin karşılaştırılmasını gösterir. p < Kruskal-Wallis testine göre farklı gruplar arasında 0.05. * p < 0.05 Dunn sonrası hoc testi ne göre tam 3 'UTR göre. Φp < 0.05 Dunn sonrası hoc testi ne göre Del 3 ile karşılaştırıldığında. Her deneysel durum için en az beş farklı hayvandan (n ≥ 5) hücre kullanıldı. Daha önce Migneault ve ark.24'teyayınlanan Şekil 2 ve 3'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: V5-αENaC mRNA'nın RNA bağlayıcı proteinler hnRNPK, Dhx36 ve Tial1 ile posttranskripsiyonel modülasyonu. (A) Primer alveoler epitel hücreleri V5-αENaC mRNA kodlamap Dhx36, hnRNPK veya Tial1 RbPs ve pTet-Off plazmidi için bir ifade vektörü ile birlikte pTRE-sıkı plazmid kodlama sı ile cotransfeced edildi. V5-αENaC mRNA ekspresyonu RT-qPCR 72 h posttransfeksiyon ile ölçüldü ve tTA-Ad ifadesine göre normalizasyondan sonra boş bir vektörle transfece edilen hücrelere kıyasla V5-αENaC mRNA ekspresyonunun % ± SEM'i olarak ifade edildi. Dhx36 ve Tial1 aşırı ekspresyonu V5-αENaC mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe ederken, hnRNPK'nın aşırı ekspresyonu etkili olmadı. *p < 0.05 Kruskal-Wallis testine ve Dunn'ın sonrası hoc testine göre boş vektöre göre; n ≥ Farklı hayvanlardan alınan 3 numune her deneysel durum için çoğaltılmış olarak test edildi. (B) αENaC 3' UTR'nin proksimal kısmı, pTRE-sıkı plazmid (V5-αENaC-Del5) içinde αENaC stop kodonun yanındaki 3' UTR distal bölgesiklonlandırılarak silindi. (C) Primer alveoler epitel hücreleri pTRE-Off plazmidi ve Dhx36 veya Tial1 RBP aşırı ekspresyonu için ekspresyon vektörü ile birlikte pTRE-sıkı vektörde V5-αENaC veya V5-αENaC-Del5 ile birlikte cotransfeced edildi. V5-αENaC mRNA ekspresyonu RT-qPCR 72 h posttransfeksiyon ile ölçüldü ve tTA-Ad ifadesine göre normalizasyondan sonra boş bir vektörle transfece edilen hücrelere kıyasla V5-αENaC mRNA ekspresyonunun % ± SEM'i olarak ifade edildi. Dhx36 ve Tial1'in aşırı ekspresyonu V5-αENaC-Del5 mRNA ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı. *p < 0.05 Kruskal-Wallis testine ve Dunn'ın post hoc testlerine göre deneysel vektörlerin boş vektörle karşılaştırılması üzerine; #p < 0.05 Mann-Whitney U-testine göre deneysel vektörlerin tam 3' UTR mutantı ile karşılaştırılması üzerine; n ≥ 6 her deneysel durum için. Daha önce Migneault ve ark.24'teyayınlanan Şekil 5 ve 7'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| A | |||
| Şablon | 3' UTR | Anlamda | Sıra |
| αENaC cDNA | Tam | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGCTTTTGGG-3' |
|
| Del 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| Del 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 | R | 5'-ATCGCAGAATCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Hedef | Anlamda | Sıra | |
| V5-αENaC | F | 5'-CCTAACCCTCTCCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTGTCC-3' | ||
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan astarlar. (A) V5-αENaC mutantlarının klonlanması ve üretilmesi için kullanılan astarlar indükleyici pTRE-sıkı vektörde. (B) Kantitatif RT-PCR ile mRNA ekspresyonunun ölçülmesinde kullanılan astarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birincil kültürde alveoler epitel hücrelerinin düşük transfeksiyon oranı bu hücrelerde mRNA kararlılığını değerlendirmek için Tet-Off sisteminin kullanımı için ciddi bir sınırlama olmuştur. Ancak bu sınırlama pipet elektroporasyonu ile aşılarak %25-30 transfeksiyon verimi(Şekil 1 ve Şekil 3)26'yaizin verebilmiştir.
Transkript stabilitesinin ölçülmesi, belirli bir mRNA'nın modülasyonunun ve hücre homeostazı ve metabolizması üzerindeki etkisini anlamak için temel dir. Bir GOI'nin biyoyararlanımDaki değişim, çeviri verimliliğini değiştirebilir ve hücredeki GOI'nin ekspresyonu üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenlerden dolayı mRNA'ların yarı ömrünü belirlemek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Yukarıda da belirtildiği gibi, bu tekniklerin her biri ilgi bir transkript uygun çalışma önlemek sınırlamalar ve kısıtlamalar vardır. Diğer tekniklere kıyasla, burada geliştirilen TET-off modeli, herhangi bir deneysel koşulaltında belirli bir mRNA'nın yarı ömrü tahminine izin verme avantajına sahiptir. Ancak, doğrudan bir endojen transkript istikrarı çalışma izin vermez. Bu sınırlamayı mümkün olduğunca aşmak için, transkriptin 5' UTR ve 3' UTR dizilerini plazmid'e eklemesi önerilmektedir, böylece yapı endojen transkriptlere mümkün olduğunca benzer olur. V5 epitopunun eklenmesi, rt-qPCR ile hedef mRNA'nın spesifik amplifikasyonunun endojen transkripte karşı özel amplifikasyonuna olanak sağlar. Klonlama stratejisi ile ilgili olarak, ilgi geninin yukarı yada yerleştirilen sırasıseçimi nonspesifik sinyallerin amplifikasyonunu önlemek için çok önemlidir. ORF'nin V5 epitop dizisi 5'inin eklenmesi, yapının kısa uzunluğu ve alveoler epitel hücrelerinde ekspresyonun olmaması nedeniyle yapının spesifik qPCR amplifikasyonu için gereklidir. Bu strateji aynı zamanda aynı indüklemez sistemi kullanarak protein çevirisi modülasyonu çalışma fırsatı sağlar. V5 epitopunun küçük boyutuna (42 nt) rağmen, bunun transkripsiyon kararlılığını etkilemesi hala mümkündür. Bu nedenle, aynı zamanda diğer epitopsittest önerilmektedir, insan influenza hemagglutinin gibi (HA) veya alveoler epitel hücrelerinin transkripsiyon bulunmayan başka bir dizi.
Sistemin bir sınırlama bir GOI transkripsiyonini inhibe etmek için doksisiklin kullanımıdır. Çeşitli raporlar doksisiklin hücre metabolizması üzerinde önemli bir etkisi olabileceğini göstermektedir. Bu antibiyotiğin 16HBE14 bronşiyal hücrelerde kullanımı proliferasyonu azaltır ve apoptosis27nedeniyle mortaliteyi artırır. Buna ek olarak, doksisiklin zaten LPS inflamatuar yanıt modülasyonu dahil olduğu gösterilmiştir28. Bu nedenle, Bu antibiyotik belirli bir GOI mRNA istikrarını etkileyebilir off-hedef etkileri olabilir. Bu nedenlerle, 1 μg/mL doksisiklinin transfekte olmayan hücreler üzerindeki etkisini değerlendirdik ve endojen αENaC mRNA ekspresyonunda herhangi bir değişikliğe yol açmadığını gördük (Şekil 2). Yaygın olarak Tet-Off sisteminin transkripsiyonunu inhibe etmek için yaygın olarak kullanıldığı ndan ve sitotoksik etkileri en aza indirmek için tavsiye edilir çünkü bu konsantrasyon seçildi29. Bu konsantrasyonu alveoler epitel hücrelerinde kullanmanızı öneririz ve tet-Off sistemi ile diğer genlerin incelenmesi veya diğer hücre tiplerinin kullanımı için en uygun konsantrasyonu doğrulamanızı öneririz.
Sistemimiz transkripsiyon doksisiklin tarafından inhibe edilene kadar GOI kurucu ifadesi kullanır. Aşırı mRNA konsantrasyonlarının hücre için toksik olabileceği ve metabolizmasını etkileyebileceği ileri sürülmüşlerdir. Bu GOI transkript istikrarında bir değişime yol açabilir, fizyolojik olmayan aşırı ekspresyon nedeniyle hızlı bozulmasına neden30. Tet-Off modelimiz söz konusu olduğunda, transfected hücreler sağlıklı transfekte olmayan hücrelere benzer bir morfoloji gösterdiğinden (veriler gösterilmedi) böyle bir toksisite gözlenmemiştir. Tani ve ark.31, bir mRNA yarılanma ömrü belirlemede Tet-Off sisteminin geçerliliğini gösterdi, bizim sonuçlar Tet-Off sistemi alveoler epitel hücrelerinde toksik olmadığını gösterdi ve aktinomisin D gibi transkripsiyonel inhibisyon varlığında bildirilen aşırı stabilizasyonu yansıtmayan αENaC mRNA için bir yarı lanma ömrü verir (Şekil 4).
MRNA'nın yarı ömrünü ölçmek için bu sistemin geliştirilmesi, transkriptlerin stabilitesi aktinomisin D gibi transkripsiyon inhibitörleri varlığında ölçüldüğünde gözlenen sonuçlara meydan okumaktadır. Bu yöntem, bir transkript yarı ömrü çok daha önce ölçülen daha kısa olabileceğini göstermektedir.
Modelimiz, pro-inflamatuar koşullar veya RBP aşırı ekspresyonu da dahil olmak üzere farklı koşullar altında belirli bir transkriptin posttranskripsiyonel modülasyonunun incelenmesi ve rna susturma ile tedavi den sonra incelenmesi için son derece uygundur. Buna ek olarak, alveoler epitel hücreleri etkileyen patofizyolojik koşullarda mRNA'ların posttransktranskripsiyonel modülasyonu için gerekli çevrilmemiş bölgelerin karakterizasyonuna olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Francis Migneault Quebec Solunum Sağlığı Ağı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) akciğer eğitim programı, FRSQ'dan bir öğrencilik ve Faculté des Études Supérieures et'den bir öğrencilik tarafından sağlanan bir burs tarafından desteklendi. Doktora sonrası, Université de Montréal. Bu çalışma Gosselin-Lamarre Klinik Araştırma Başkanı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri [YBMOP-79544] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
