Summary
Ein neuartiges dreidimensionales Sphäroidmodell, das auf der heterotypischen Interaktion von Tumorzellen und stromalen Fibroblasten basiert, wird etabliert. Hier präsentieren wir Kokultur von Tumorzellen und stromalen Fibroblasten, Zeitraffer-Bildgebung und konfokale Mikroskopie, um die Bildung von Sphäroiden zu visualisieren. Dieses dreidimensionale Modell bietet eine entsprechende Plattform, um Tumor-Stroma-Wechselwirkungen zu untersuchen und Krebstherapeutika zu testen.
Abstract
Tumor-Stroma-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle bei der Krebsprogression. Dreidimensionale (3D) Tumorsphäroidmodelle sind das am weitesten verbreitete In-vitro-Modell bei der Untersuchung von Krebsstamm-/Initiierungszellen, präklinischer Krebsforschung und Arzneimittelscreening. Die 3D-Sphäroidmodelle sind der konventionellen Tumorzellkultur überlegen und reproduzieren einige wichtige Charaktere realer solider Tumoren. Herkömmliche 3D-Tumorsphäride bestehen jedoch ausschließlich aus Tumorzellen. Ihnen fehlt die Beteiligung von Tumorstromalzellen und sie haben eine unzureichende extrazelluläre Matrix (ECM) Abscheidung, wodurch die In-vivo-Bedingungen von Tumorgeweben nur teilweise imitiert werden. Wir haben ein neues multizelluläres 3D-Sphäroidmodell aus Tumorzellen und stromalen Fibroblasten entwickelt, das die heterogene Tumormikroumgebung in vivo und ihre native Desmoplasie besser imitiert. Die Bildung von Sphäroiden wird streng durch die tumorstromalen Fibroblasten reguliert und durch die Aktivität bestimmter wichtiger intrazellulärer Signalwege (z.B. Notch-Signalisierung) in stromalen Fibroblasten bestimmt. In diesem Artikel stellen wir die Techniken für die Kokultur von Tumorzellen-stromalen Fibroblasten, Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung von Zell-Zell-Interaktionen und konfokale Mikroskopie vor, um die 3D-Architekturmerkmale der Sphäroide darzustellen. Wir zeigen auch zwei Beispiele für die praktische Anwendung dieses 3D-Sphäroidmodells. Dieses neuartige multizelluläre 3D-Sphäroidmodell bietet eine nützliche Plattform für die Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion, indem es erläutert, wie stromale Fibroblasten Krebsstamm-/initiierende Zellen regulieren, die die Tumorprogression und Aggressivität bestimmen, und die Einbeziehung der stromalen Reaktion in die Empfindlichkeit und Resistenz von Krebsmedikamenten untersucht. Diese Plattform kann auch ein relevantes In-vitro-Modell für die Entdeckung von Arzneimitteln sein.
Introduction
Solide Tumoren stellen komplexe Gewebe dar, die aus neoplastischen Zellen und einer Vielzahl von Stromalzellen1,2,3,4bestehen. Stromal-Fibroblasten, oder krebsassoziierte Fibroblasten (CAF), sind eine der prominentesten Stromalzellpopulationen in den meisten Arten von soliden Tumoren. Sie sind entscheidend an der Regulierung von Tumorwachstum, Stammheit, Metastasierung, Angiogenese und Arzneimittelresistenz durch die Produktion von Wachstumsfaktoren, Zytokinen/Chemokinen, Synthese von ECM und Remodeling-Enzymen (z. B. Kollagen, Fibronectin und Matrixmetalloproteasen), Freisetzung von Exosomen und direkter heterotypischer Zell-Zell-Interaktion5,6,7,9,11 ,11 . CAF beteiligt sich auch an der Bestimmung der krebsorganspezifischen Metastasierung, indem eine Teilmenge von Tumorklonen aus heterogenen Tumorzellpopulationen in der primären Läsion vorgewählt und diese ausgewählten Klone gefördert werden, die für Metastasen zu einem bestimmten entfernten Organ grundiert werden sollen, dessen Mikroumgebung für die Rekolonisierung ausgewählter Klone optimal ist12. Darüber hinaus sind Fibroblasten und ihre abgesonderten löslichen Faktoren und ECM an der Modulation der Tumorangiogenese13,14, Anti-Tumor-Immunantwort15, und sind sogar an Medikamentenresistenz und Tumorrezidivbeteiligt 16,17.
In vitro 3D-Tumorsphäroidmodelle wurden entwickelt und in der Krebsforschung als Zwischenmodell zwischen in vitro Krebszellkulturen und in vivo Tumormodellen18,19,20,21verwendet. Die 3D-Tumor-Sphäroid-Modelle haben Popularität in der Krebsstammzellforschung, präklinischen Krebsforschung und Arzneimittel-Screening gewonnen, weil diese Modelle einige wichtige Merkmale von echten Tumoren reproduzieren, die in traditionellen 2D-Monolayern fehlen22. Viele bestehende 3D-Tumor-Sphäroid-Modelle bestehen ausschließlich aus Tumorzellen und haben keine Beteiligung von Tumorstromzellen. Dies führt oft dazu, dass Tumorsphäride eine unzureichende ECM-Abscheidung haben und keine heterotypischen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorhanden sind. Herkömmliche 3D-Sphäroide, die ausschließlich von Krebszellen und homotypischer Zellzelladhäsion gebildet werden, können die In-vivo-Bedingungen von Tumorgeweben nur teilweise imitieren. Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, haben die Forscher vorgeschlagen, mehrere Arten von Stromalzellen in 3D-Kokulturen zu integrieren und mehrere heterotype 3D-Tumorsphäroidmodelle23,24,25,26,27entwickelt. Darüber hinaus haben die Forscher exogene 3D-Matrizen, einschließlich natürlicher Hydrogele oder synthetischer Polymere wie Polyethylenglykol, Poly (Laktid-Co-Glylid) und Poly (N-Isopropylacrylamid), eingesetzt, um monozelluläre und multizelluläre Sphäroidmodelle einzubetten, eine zellunterstützende Umgebung zu schaffen und Zellmatrix-Wechselwirkungen28,29zu reproduzieren, wodurch diese Systeme biologisch relevanter werden30. Die Einbeziehung bestimmter Arten von Stromalzellen, wie endotheliale Zellen, in 3D-Kokulturen führt jedoch zu einer zusätzlichen Komplexität für ein In-vitro-System und erschwert die Untersuchung heterotypischer Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Zelltypen, wie z. B. Krebszell-Fibroblasten-Wechselwirkungen. Darüber hinaus interagieren Endothelzellen in realen Geweben nicht immer direkt mit Krebszellen und anderen Stromalzellen, da es eine Schicht von Kellermembran außerhalb der Kapillaren umwickelt gibt, die verhindert, dass Endothelzellen direkt mit Krebszellen und anderen Stromalzellen interagieren. In diesen 3D-Sphäroidmodellen bilden eingebaute Endothelzellen keine Blutgefäße, interagieren aber direkt mit Krebszellen und anderen Stromalzellen, was in vivo selten vorkommt. In ähnlicher Weise sind exogene Matrizen, die in einigen der 3D-Sphäroidmodelle verwendet werden, nicht identisch mit dem ECM in realen Tumorgeweben in Bezug auf Struktur und Zusammensetzung. All diese künstlichen Bedingungen können zu irreführenden Daten führen.
Wir haben vor kurzem ein neues multizelluläres 3D-Sphäroid-Modell aus Tumorzellen und CAF erstellt. In unserem Modell wird die Bildung von 3D-Tumorsphäroiden vollständig durch CAF bestimmt. CAF induzieren und regulieren den Phänotyp von Tumorstamm/auslösenden Zellen. Das von CAF produzierte ECM ist natürlich und ermöglicht es der desmoplastischen Struktur, die In-vivo-Tumormikroumgebung besser nachzuahmen. Dieses neuartige 3D-Modell kann ein nützliches Werkzeug für das Screening von Krebsmedikamenten sein und bietet eine einzigartige Plattform, um die Tumor-Stroma-Interaktion zu untersuchen, zu erklären, wie CAF Krebsstamm-/Initiierungszellen reguliert, und die Einbeziehung stromaler Wechselwirkungen in der Empfindlichkeit und Resistenz von Krebsmedikamenten zu untersuchen.
Protocol
1. Culturing Melanome Zellen und Haut-Fibroblasten
- Kultivieren menschlicher Melanomzellen
- Kultur humane Melanomzellen, C816131 unter konventionellen haftende Zellkulturbedingungen in vollständigem W489-Medium (siehe Schritt 1.2) in einem 37 °C-Inkubator, der mit 5%CO2 geliefert wird, wie zuvor beschrieben32. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:5 auf, wenn sie eine Konfluenz von 90 % erreichen.
- Melanom-Zellkulturmedium (W489)
- Für komplettes W489-Medium verwenden Sie 80% MCDB153 medium, 20% L-15 medium (siehe Materialtabelle), 2% fetales Rinderserum (FBS), 5 g/ml Insulin, 1,68 mM CaCl2und 0,11% Natriumbicarbonat. Für Cokultur, fügen Sie nicht FBS, Insulin, und CaCl2.
- Maushaut Fibroblastisolation
- Schneiden Sie ein 1 cm x 1 cm großes Hautfragment von einer Maus gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Tierschutzausschusses (IACUC) der Einrichtung.
- Verdauen Sie die Haut durch Dispase (siehe Materialtabelle)bei 4 °C über Nacht. Entfernen Sie die Dermis von der Epidermis und verdauen Sie sie mit Kollagenase (1 mg/ml in DMEM, siehe Materialtabelle)über Nacht bei Raumtemperatur (RT).
- Maushaut Fibroblasten-Kultur
- Waschen Sie die Gewebepellets mit PBS und kultichen Sie sie in DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in 37 °C/5%CO2. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 auf, wenn sie eine Konfluenz von 90 % erreichen.
- Transduce die Haut-Fibroblasten mit GFP/lentivirus mit Standardmethoden vor der Kokultur.
- Charakterisierung von Maushaut-Fibroblasten durch Immunostainierung
- Zellvorbereitung zur Färbung
- Säen Sie die Haut-Fibroblasten in 24 Brunnenplatte mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/gut. Am 2. Tag die Zellen mit PBS 2x waschen und in 2% neutral gepuffertem Formalin für 10 min fixieren. Formalin entfernen und die festen Zellen zweimal mit PBS waschen.
- Immunostaining
- Fügen Sie 200 L Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte für 30 min bei RT, dann fügen Sie Maus Anti-A-SMA bei 1:200 verdünnt und bei 37 °C für 1 h inkubieren. Waschen Sie mit PBS 3x, 5 min jeder.
- Fügen Sie Alex Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG bei 1:400 Verdünnung und inkubieren bei RT für 1 h. Waschen Sie die Antikörper 3x mit PBS, 5 min jeder.
- Fügen Sie 1 g/ml DAPI hinzu und brüten Sie bei RT für 2 min. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und fügen Sie jedem Bohrwert 500 l PBS hinzu.
- Beobachten Sie die Zellen und nehmen Sie Bilder mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop auf.
- Zellvorbereitung zur Färbung
- Voretikettierung von Fibroblasten und Melanomzellen
- Saat-Fibroblasten in eine 100-mm-Schale am ersten Tag, so dass die Zellkonfluency am nächsten Tag 60 % erreicht. Entfernen Sie am 2. Tag das Kulturmedium und fügen Sie das GFP/Lentivirus (1:3–1:5 aus dem Lager verdünnt) in das reguläre Kulturmedium mit 4 g/ml Polybren ein. Inkubieren Sie Zellen in einem 37 °C Inkubator für 6 h, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie durch frische regelmäßige Kulturmedium. Beobachten Sie nach 2 Tagen das GFP-Signal der Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop. Transduce C8161-Zellen mit DsRed/lentivirus unter ähnlichen Bedingungen. Protokolle zur Herstellung von GFP/lentivirus und DsRed/lentivirus wurden zuvor beschrieben14,34.
2. Zellkokultur
- Samen sie die C8161-Fibroblasten-Kokultur.
- Am Tag 0 des Sphäroid-Formationstestes lösen Sie sowohl den C8161 als auch die Hautfibroblasten mit 0,25% Trypsin-EDTA. Drehen Sie die Zellen bei 250 g für 5 min bei RT und waschen Sie einmal mit PBS.
- Setzen Sie die Zellen im Zellkokulturmedium (serumfrei, insulinfrei und kalziumfrei W489 medium gemischt mit Serumfreies DMEM im Verhältnis 1:1) wieder auf. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 104 Zellen/ml ein.
- Mischen Sie die C8161-Zellen mit den Fibroblasten im Verhältnis 1:1 und fügen Sie 2 ml der Zellmischungen zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Jeder Brunnen sollte 2 x 104 von jedem Zelltyp enthalten. Jede Bedingung sollte in dreifacher Ausführung erfolgen.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine nicht-Gewebekultur behandelte Platte zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien). Andernfalls werden die Zellen stark an eine Platte anheften und sind nicht in der Lage, Sphäroide aufzuhängen.
- Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 4 h, bis die Zellen an die Platte anheften, und führen Sie dann Zeitraffer-Bildgebung oder konfokales Scannen zu den angegebenen Zeitpunkten für jeden Test durch.
3. Live Cell Time-lapse Imaging
- Schalten Sie vor der Cokultur das Zeitraffer-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) nach den Anweisungen des Herstellers ein und lassen Sie den Inkubator 37 °C und 5 %CO2erreichen. Es dauert in der Regel 1 h für das System, um das Gleichgewicht zu erreichen. Stellen Sie die Kulturplatte vorsichtig auf die Bühne des Mikroskops im Inkubator und verriegeln Sie die Tür sicher.
- Öffnen Sie die Software des Zeitraffer-Bildgebungssystems (siehe Materialtabelle) und wählen Sie den Plattentyp und den Hersteller aus, damit das Mikroskop den Scanbereich genau lokalisieren kann. Wählen Sie die Brunnen von Interesse und eine 10x Objektivlinse. Wählen Sie die Einstellungen für den Scanbereich, die Intervallzeit zwischen den Scans und eine Start- und Endzeit aus. In diesem Protokoll beträgt die maximale Formatnummer für den Scanbereich für 1 Well 36 und die Intervallzeit 1 h.
- Rekordzeitraffer-Bildgebung von 4-52 h.
HINWEIS: Startzeit, Endzeit und Dauer sollten nach Zelltyp und Dem Zweck des Experiments optimiert werden. - Verwenden Sie beim Abschließen der Bildaufzeichnung die Software des Zeitraffer-Imaging-Systems, um die Daten abzurufen und Videos oder Bildsätze zu exportieren.
4. Konfokale Mikroskopie und 3D-Filme
- Legen Sie die Zellkokulturplatte auf die Bühne eines invertierten Fluoreszenzmikroskops (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie rote und grüne Laserstrahlen. Beobachten Sie die Zellen unter einer 5x- oder 10x-Objektivlinse und wählen Sie ein Sphäroid, um mit dem Scannen zu beginnen.
- Verwenden Sie einen Z-Schritt von 1 m, um von unten nach oben des Sphäroids zu scannen. Verarbeiten Sie die Daten mithilfe von Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien), um ein 3D-Bild zu rekonstruieren, das weiter gedreht und als 3D-Film gespeichert werden kann.
5. Solokultur von Melanomzellen und Bildung von 2D-Clustern/Aggregaten
- Samen 2 x 104 C8161 Melanomzellen in jeden Brunnen einer 24-Well-Platte, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Kulturen Sie die Zellen für 7-10 Tage und fotografieren Sie sie mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
6. Überprüfen, ob 3D-Sphäroide und 2D-Zell-Cluster/Aggregate im Medium aufgehängt oder an die Platten angefügt sind
- Für Zellkokultur, überprüfen Sie die 3D-Sphäroide am Tag 7 gebildet. Überprüfen Sie auf die Einzelzellkultur die 2D-Cluster/Aggregate, die am 10. Tag gebildet wurden.
- Stellen Sie Zellkulturplatten auf die Plattform eines invertierten Fluoreszenzmikroskops. Eine gebogene Nadel mit einer Spritze in einen Brunnen geben und das Kulturmedium sanft ein- und aussaugen, um das Kulturmedium in den Brunnen zu stören. Zeichnen Sie diesen Prozess mit dem Filmmodus der Filmsoftware auf (siehe Tabelle der Materialien). Die 3D-Sphäroide sind mobil, aber die 2D-Zellcluster/Aggregate bleiben standhaft.
7. Konfokales Bild von 3D Spheroiden
HINWEIS: Cokultivierte Zellen beginnen, Sphäroide von 48–72 h zu bilden, abhängig von der Art der verwendeten Fibroblasten. Im Allgemeinen vergrößern sich Sphäroide mit der Zeit allmählich. Kleine Sphäroide können bis zum 7. Tag zu größeren Sphäroiden verschmelzen. Nachdem Sphäroide in der Größe stabilisiert sind, können sie mehr als 10 Tage dauern. Danach lösen sich die Sphäroide oft von der Unterseite der Kulturplatte und versammeln sich in der Mitte der Brunnen. Während der Vergrößerung der Sphäroide sterben die Zellen in der Mitte in der Regel aufgrund unzureichender Ernährung und/oder einer toxischen Mikroumgebung ab. Daher sollte die Spitze der 3D-Sphäroidbildung und Timing, um die ausgereiften Sphäroide abzubilden, mithilfe von Pilotversuchen optimiert werden. Für dieses Protokoll wurde die konfokale Mikroskopie um Tag 7 durchgeführt, als die Sphäroide ausgereift waren und die Zellen im Zentrum der Sphäroide gemäß der Fluoreszenz und Morphologie der Zellen im Zentrum noch am Leben waren.
- Um die konfokale Mikroskopie zu machen, verwenden Sie einen grünen und roten Laser, um die Sphäroide zu scannen. Bestimmen Sie den Scanbereich unter einem 10-fachen Objektiv und bewegen Sie sich mit einem 1-m-Z-Schritt von unten nach oben des Sphäroids.
- Generieren Sie die 3D-Sphäroid-Formations- und -Rotationsvideos mit der 3D-Projektionsfunktion der Bildverarbeitungssoftware (z.B. ImageJ).
8. Intrazelluläre Notch1 Signalwegaktivität bei der Bestimmung der Stromalregulation von Krebsstamm/Anitierzellen
- Isolierung und Charakterisierung von Haut-Fibroblasten von Gain- und Verlust-Funktions-Notch1-Mäusen
- Isolieren Sie Haut-Fibroblasten von zwei Paaren von genetisch veränderten Mäusen: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) Mäuse im Vergleich zu ihrer Gegenkontrolle (GOFstrg : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) Mäuse und Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) Mäuse im Vergleich zu ihrer Gegenstückkontrolle (LOFstrg : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) Mäuse31bzw. . Isolieren und charakterisieren Sie Hautfibroblasten mit dem in den Abschnitten 1.3-1.5 beschriebenen Protokoll.
- Transduce die Maus Haut Fibroblasten mit GFP/lentivirus.
- Siehe Abschnitt 1 für die Methode zur Transduce der Zellen mit dem lentiviralen Vektor.
- Kokultur von Fibroblasten und Melanomzellen
- Führen Sie das Zellkokulturexperiment wie in Abschnitt 2 beschrieben durch.
- Bewertung der Wirkung der intrazellulären Notch1-Signalwegaktivität in den Fibroblasten auf die Bestimmung der stromalen Regulation von Krebsstamm/Initiierungszellen durch Messung der Größe der 3D-Sphäroide
- Führen Sie die Quantifizierung der Sphäroidbildung unter jeder Bedingung durch Fotografieren der Sphäroide zu dem Zeitpunkt, wenn Sphäroide reif sind (angezeigt durch den Stopp des Wachstums um Tag 5 bis 7, abhängig von den Arten von Fibroblasten). Messen Sie die Größe der 3D-Sphäroide mit der Bildverarbeitungssoftware.
9. Testen der Arzneimittelreaktion von Krebsstamm/Anitiieren von Zellen mit dem 3D Spheroid Assay
HINWEIS: CAF kann die Heterogenität von Krebs regulieren und einen Phänotyp von Krebsstamm-/initiierenden Zellen induzieren. CAF unterstützt auch Krebsstamm/anitiierende Zellen, um klinische Behandlungen zu ertragen. Krebsstammzellen sind nachweislich für die Arzneimittelresistenz verantwortlich. Daher haben wir dieses 3D-Sphäroidmodell verwendet, um die medikamentöse Reaktion von Krebsstamm/initiierenden Zellen zu bewerten. Das Ergebnis kann die potenzielle klinische Wirksamkeit von Anti-Krebs-Medikamenten gut bewerten.
- Arzneimittelverwaltung
- Direkt nach der Kokultivierung der Zellen in einer 24-Well-Platte bereiten Sie die Medikamente in einer seriellen Verdünnung im Kulturmedium vor, um das 5-fache eines gewünschten Konzentrationsbereichs auf der Grundlage von Pilotversuchen (d. h. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM und 25 nM) zu erreichen.
Fügen Sie 0,5 ml entsprechende Wirkstofflösungen zu jedem Brunnen der kokultivierten Zellen hinzu. Behandeln Sie die Kontrollgruppe mit regulären Cokulturmedien, wie oben erwähnt. - HINWEIS: MEK-Hemmer ist in Zellkulturmedien löslich. Daher sind leere Steuerelemente 2,5 ml Zellkulturmedium. Wenn das Medikament jedoch nicht in wässriger Lösung löslich ist und Lösungsmittel wie DMSO benötigt, sollten Zellkulturmedien mit der gleichen DMSO-Konzentration auf die Kontrollgruppe angewendet werden.
- Direkt nach der Kokultivierung der Zellen in einer 24-Well-Platte bereiten Sie die Medikamente in einer seriellen Verdünnung im Kulturmedium vor, um das 5-fache eines gewünschten Konzentrationsbereichs auf der Grundlage von Pilotversuchen (d. h. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM und 25 nM) zu erreichen.
- Quantifizierung der Arzneimittelreaktion durch Zählen von Sphäroiden
- Beobachten Sie die behandelten Zellen und unbehandelten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und fotografieren Sie die Zellen jeden Tag. Quantifizieren Sie die Sphäroidbildung in den verschiedenen experimentellen Gruppen und vergleichen Sie die sphäroidbildende Fähigkeit der Zellkulturen unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen.
HINWEIS: Die Sphäroide erscheinen in der Regel 5 bis 7 Tage nach der Kokultur. Die Drogeneffekte werden zu diesem Zeitpunkt spürbar werden. - Verwenden Sie das Fluoreszenzmikroskop, um die Sphäroide und Zellen in den Brunnen abzubilden/fotografieren und dann die Bildsoftware zu verwenden, um die durchschnittliche Größe der Sphäroide und die Anzahl der Sphäroide zu berechnen, die pro Low Power Field (LPF x 4) in jeder Behandlungsgruppe im Laufe der Zeit gebildet wurden.
HINWEIS: Zellen, die eine wirksame medikamentöse Behandlung erhalten, sollten im Vergleich zur Kontrollgruppe weniger oder gar keine Sphäroide bilden. Dies ist ein Hinweis auf die Wirksamkeit des getesteten Medikaments bei der Unterdrückung von Krebsstammzellen.
- Beobachten Sie die behandelten Zellen und unbehandelten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und fotografieren Sie die Zellen jeden Tag. Quantifizieren Sie die Sphäroidbildung in den verschiedenen experimentellen Gruppen und vergleichen Sie die sphäroidbildende Fähigkeit der Zellkulturen unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen.
Representative Results
Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden mit einem in vitro heterotypischen Zellkokultursystem, das die in vivo Tumormikroumgebung imitiert. Fibroblasten werden von Maushaut-Fibroblasten abgeleitet. Hautfibroblasten wurden wie oben beschrieben erzeugt und als Zellen von SMA+/Vimentin+/FSP-1+ gekennzeichnet. Menschliche metastasierende Melanomzellen (C8161) wurden in W489 medium kultiviert, wiebeschrieben 32. Um Fibroblasten von Tumorzellen zu visualisieren und zu unterscheiden, wurden Fibroblasten und Melanomzellen mit GFP/lentivirus und DsRed/lentivirus bzw.34,36, vor der Zellkokultur prätransduziert.
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für multizelluläre 3D-Sphäroide, die durch die Kokultivierung von Melanomzellen und Fibroblasten gebildet werden. Melanomzellen, die in Abwesenheit von Fibroblasten kultiviert wurden, bildeten keine typischen 3D-Sphäroide, obwohl einige Melanomzellen 2D-Cluster/Aggregate mit der erweiterten Kultur bilden. Die durchschnittliche Größe der Sphäroide betrug an Tag 5 bis 7 einen Durchmesser von ca. 170–360 m (Mittelwert = 275, SD = 37). Mit Hilfe von Zeitraffer-Bildgebung beobachteten wir, dass Fibroblasten und Tumorzellen in Derkokultur interagierten und begannen, 3D-Sphäroide bei etwa 36 h Cokultur zu bilden, wie in Video 1gezeigt. Die Zeitraffer-Bildgebung zeichnete den dynamischen Prozess der Zell-Zell-Interaktion und die Anfangsphase der Sphäroidbildung bei 4–52 h Cokultur auf. Der Höhepunkt der 3D-Sphäroidbildung trat um den Tag 5 bis 7 auf. Die gebildeten 3D-Sphäroide setzten sich aus Fibroblasten und Melanomzellen zusammen, wobei die Mehrheit (ca. 80%) waren Tumorzellen. Video 2 zeigt den dynamischen Prozess einzelner kultivierter Melanomzellen (DsRed+/C8161) bei der Bildung von Zellclustern/-aggregaten ab 4–52 h in einer Einzelkultur. Die Bildung von 2D-Clustern/Aggregaten erreichte ihren Höhepunkt um den Tag 7–10. Video 3 und Video 4 zeigen die Strukturen eines 3D-Sphäroids und eines 2D-Tumorzellclusters, die durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden. Das 3D-Sphäroid und die 2D-Tumorzellcluster wurden am 7. Tag der Zellkokultur konfokale Mikroskopie untersucht. Video 5 zeigt, dass die 3D-Sphäroide im Kulturmedium und mobil aufgehängt wurden, während Video 6 zeigt, dass der 2D-Tumorzellcluster an der Kulturplatte befestigt und unbeweglich war. Die Aufhängung im Medium ist ein Merkmal von 3D-Sphäroiden, das sie von 2D-Clustern unterscheidet. Wenn das Medium in der Zellkulturschale oder brunnen durch das Fallenlassen oder sanfte Pipettieren des Kulturmediums gestört wird, bewegen sich die suspendierten 3D-Sphäroide, während 2D-Zellcluster unbeweglich sind. Nur wenige einzelne abgestorbene Zellen sind mobil.
Abbildung 2A zeigt ein Beispiel für dieses 3D-Modell, das als einzigartige Plattform dient, um Tumor-Stroma-Wechselwirkungen zu untersuchen und aufzuklären, wie die intrazelluläre Notch1-Signalwegaktivität in CAF Krebsstamm-/Initiierungszellen und Sphäroidbildung reguliert. Zwei Paare von Fibroblasten (Fb) isoliert aus der Haut von Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) Mäuse im Vergleich zu ihrer Gegenkontrolle (GOFstrg : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) Mäuse und Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) Mäuse im Vergleich zu ihrer Gegenstückkontrolle (LOFstrg : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) Mäuse35bzw. . Alle Fibroblasten wurden durch GFP/lentivirus transduziert und mit C8161-Melanomzellen kokultiviert, die mit DsRed/lentivirus prätransduziert wurden. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigt, dass Fb-GOFNotch1 Die C8161-Melanomzellen daran gehindert hat, 3D-Sphäroide im Vergleich zu Fb-GOF-Ctrl während der ersten 4-52 h Zellkokultur zu bilden. Im Gegensatz dazu förderte Fb-LOFNotch1 die Bildung von 3D-Sphäroiden durch C8161 Melanomzellen im Vergleich zu Fb-LOFCtrl. Abbildung 2B, oben, zeigt repräsentative Bilder von 3D-Sphäroiden, die am 7. Tag der Zellkokultur mit verschiedenen Fibroblasten gebildet wurden, die verschiedene Kerbwegaktivitäten durchführen. Abbildung 2B, unten, zeigt die quantitativen Daten über die durchschnittliche Größe von 3D-Sphäroiden, die am Tag 7 der Zellkokultur mit verschiedenen Fibroblasten gebildet wurden, die unterschiedliche Kerbwegaktivitäten mit sich bringen.
Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für dieses 3D-Modell, das verwendet wird, um die medikamentöse Reaktion von Krebsstamm-/initiierenden Zellen zu testen. Krebsstamm/anitiierende Zellen sind nachweislich für Arzneimittelresistenzund krebsrezidivierende Zellen verantwortlich. Daher kann die Bewertung der Arzneimittelreaktion mit diesem 3D-Modell die klinische Wirksamkeit eines potenziellen Medikaments für die Krebsbehandlung besser aufzeigen. Die C8161 Melanomzellen verlassen sich auf aktive MAPK-Signalisierung für Zellwachstum und Invasion. Sie drücken auch hohe Konzentrationen von CDK4/Kit aus, tragen aber keine BRAF-Mutation. Um die medikamentöse Reaktion von Krebsstammzellen/-initiierenden Zellen auf den MAPK-Hemmer mit diesem 3D-Modell zu testen, haben wir C8161-Melanomzellen und Fibroblasten in 24 Brunnenplatten kokultiviert. PD0325901 (siehe Materialtabelle), ein MAPK-Inhibitor, wurde in einer seriellen Verdünnung in einem Bereich von Konzentrationen von 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM und 25 nM hergestellt. Der PD0325901 wurde den Zellkokulturen bei der Plattierung von Zellmischungen zugesetzt. Unbehandelte Kokulturzellen wurden als Kontrolle verwendet. Wir haben die sphäroidbildende Fähigkeit der Zellkokulturen unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen bewertet und mit der unbehandelten Kontrolle verglichen. Abbildung 3A zeigt repräsentative Bilder von 3D-Sphäroiden, die am 5. Tag der Zellkokultur unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen gebildet wurden. Abbildung 3B sind die quantitativen Daten der durchschnittlichen Größe pro Sphäroid und der Anzahl der 3D-Sphäroide, die pro Niederleistungsfeld (LPF x 4) am Tag 5 der Zellkokultur unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen gebildet wurden.
Abbildung 1: Bildung von 3D-Sphäroiden und 2D-Clustern. (A) Repräsentatives Bild von 3D-Sphäroiden, die durch Kokultur menschlicher C8161-Melanomzellen und Maushaut-Fibroblasten gebildet werden. Die 3D-Sphäroide wurden am 7. Tag der Kokultur von Melanomzellen und Fibroblasten fotografiert. Die durchschnittliche Größe der Sphäroide betrug am Tag 5 bis 7 einen Durchmesser von 170–360 m (Mittelwert = 275, SD = 37). Die durchschnittliche Anzahl der Sphäroide betrug 18–26 (20,5 x 3,6) pro Low-Power-Feld (LPF x4). (B) Repräsentatives Bild von 2D-Tumorzellclustern, die durch eine einzelne Kultur von C8161-Melanomzellen gebildet werden. Die 2D-Melanom-Zell-Cluster wurden am 7. Tag der Einzelkultur von Melanomzellen fotografiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aufklärung der Rolle der intrazellulären Notch1-Signalwegaktivität bei CAF bei der Regulierung von Krebsstamm-/Initiierungszellen unter Verwendung des 3D-Sphäroidmodells. (A) Intrazelluläre Notch1-Signalwegaktivität in CAF bestimmte die Bildung von Sphäroiden durch Melanomzellen in der Zellkokultur. Das Zeitraffervideo zeigt, dass Fb-GOFNotch1 die Bildung von 3D-Sphäroiden durch die C8161-Melanomzellen stoppte, während Fb-LOFNotch1 die Bildung weiterer 3D-Sphäroide durch die C8161-Melanomzellen während der ersten 4–52 h Zellkokultur förderte. (B) Oben: Repräsentative Bilder von 3D-Sphäroiden, die am 7. Tag der Zellkokultur mit verschiedenen Fibroblasten gebildet wurden, die unterschiedliche Kerbwegfunktionen tragen. Unten: Die quantitativen Daten der durchschnittlichen Größe (Durchmesser [m]/Sphäroid) der 3D-Sphäroide, die am 7. Tag der Zellkokultur mit verschiedenen Fibroblasten gebildet wurden, die unterschiedliche Kerbwegaktivitäten mit sich bringen. Der T-Test des Zwei-Schwanz-Schülers wurde für statistische Analysen verwendet. Die Daten werden als Mittelwert für Standardabweichungen (SD) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der arzneimittelen Reaktion von Krebsstamm/anitiierenden Zellen unter Verwendung des 3D-Sphäroidmodells. (A) Repräsentative Bilder von 3D-Sphäroiden, die am 5. Tag der Zellkokultur unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen gebildet wurden. (B) Die quantitativen Daten der durchschnittlichen Größe (Durchmesser [m]/Sphäroid) und der Anzahl der 3D-Sphäroide pro Low-Power-Feld (LPF x 4), die am Tag 5 der Zellkokultur unter verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen gebildet wurden. Quantitative Daten werden als Mittelwert ausgedrückt, Standardabweichung (SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Dynamischer Prozess der Bildung von 3D-Sphäroiden in der frühen Phase der Zellkokultur. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigt dynamische Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Fibroblasten und Tumorzellen in der Kokultur und Bildung von 3D-Sphäroiden während der ersten 4-52 h Zellkokultur. Die Zellen begannen, 3D-Sphäroide um 48 h nach dem Beginn der Kokultur zu bilden. Der Höhepunkt der 3D-Sphäroidbildung trat am Tag 5 bis 7 auf (hier nicht angezeigt). Die 3D-Sphäroide setzten sich aus Fibroblasten und Melanomzellen zusammen, wobei die Mehrheit (80 %) waren Tumorzellen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Dynamischer Prozess der Bildung von 2D-Clustern in der frühen Phase der Zellkokultur. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigt den dynamischen Prozess von 2D-Clustern, die von C8161melanom-Zellen in einer Einzelkultur gebildet werden. Die Bildung von 2D-Clustern erfolgte um den Tag 7–10. Die Zeitraffer-Bildgebung zeichnet den Zeitraum von 4–52 h in der Einzelkultur von DsRed+/C8161 Melanomzellen auf. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Architektur und Rotation eines 3D-Sphäroids, wie es durch konfokale Mikroskopie visualisiert wird. Architektur und Drehung eines 3D-Sphäroids. Grüne und rote Laser wurden verwendet, um die Sphäroide zu scannen, die am 7. Tag in der Zellkokultur gebildet wurden. Der Scanbereich wurde unter einem 10-fachen Objektiv ermittelt. Der Scan beginnt von unten bis oben im Sphäroid bei einem 1-m-Z-Schritt. Der 3D-Sphäroid-Rotationsfilm wurde mit Fidschi-Software erstellt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: Architektur und Rotation eines 2D-Tumorzellclusters, wie er durch konfokale Mikroskopie visualisiert wird. Architektur und Rotation eines 2D-Clusters. Konfokale Bilder von Zellclustern wurden am 7. Tag der Melanom-Zell-Einzelkultur aufgenommen. Der Scanbereich wurde unter einem 10-fachen Objektiv ermittelt. Der Scan beginnt von unten bis oben im Sphäroid bei einem 1-m-Z-Schritt. Der 2D-Cluster-Rotationsfilm wurde mit Fidschi-Software erstellt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 5: Bewegung von 3D-Sphäroiden. Die 3D-Sphäroide wurden im Kulturmedium aufgehängt und hielten sich nicht an das Kulturgericht/Gut. Als noch mittlere in der Zellkultur brunnen durch sanfte Pipetten gestört wurde, bewegten sich die aufgehängten 3D-Sphäroide. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 6: Standfestigkeit von 2D-Tumorzellclustern. Der 2D-Tumorzellhaufen wurde trotz Störung des Kulturmediums auf der Kulturplatte verankert und unbeweglich. Ein paar einzelne tote Zellen waren mobil. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Discussion
In-vitro-3D-Zellkulturtechniken werden seit Jahrzehnten in der Krebsforschung eingesetzt. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Zellkultursystemen rekapituliert die 3D-Mikroumgebung die Zellzell- und/oder Zellmatrix-Wechselwirkungen und ermöglicht die Nachahmung der in Tumorgewebe beobachteten echten Bedingungen. Ein 3D-System, das nur aus Krebszellen und homotypischen Zell-Zell-Wechselwirkungen gebildet wird, berücksichtigt jedoch nicht die Bedeutung des heterotypischen Cross-Talks und kann ungenaue Ergebnisse in der Forschung liefern. Wir haben vor kurzem ein neuartiges 3D-System entwickelt, das Krebszellen und CAF kombiniert, um heterogene Tumor-Mikroumgebungen in vivo und ihre native und steife desmoplastische Reaktion besser nachzuahmen.
Fibroblasten sind wichtige Bestandteile von Tumorstroma. CAF sind an der Regulierung der Tumorprogression beteiligt, indem sie lösliche Faktoren, ECM/Remodeling-Enzyme10,11und Exosomen hervorruft. Darüber hinaus spielen CAF eine Rolle bei der Arzneimittelresistenz und Tumorrezidiv16,17. Unser multizelluläres 3D-Sphäroidsystem kann genutzt werden, um molekulare Mechanismen tumor-stromaler Wechselwirkungen zu erforschen und die Arzneimittelresistenz und Tumorrezidive zu adressieren. CAF werden in erster Linie von aktivierten lokalen Stillfibroblasten und rekrutierten zirkulierenden Knochenmark MSC abgeleitet, die in situ Differenzierung in CAF im Tumorgewebe37,38,39. In der aktuellen Studie verwendeten wir Haut-Fibroblasten, um ein mehrzelliges 3D-Sphäroidmodell zu erstellen. Andere Arten von Fibroblasten (z.B. MSC-DF) wirken jedoch ähnlich wie Hautfibroblasten, um die Tumorzell-3D-Sphäroidbildung34zu regulieren. MSC-DF kann aus dem murinen Knochenmark MSC erzeugt werden, das durch die Kultivierung von Knochenmarkmononuklezellen im MSC-Zellkulturmedium für etwa 10 Tage mit periodischen Mittelveränderungen alle 3 Tage angereichert wird. Diese MSC sind als CD73+/CD105+/Lin-gekennzeichnet. Um MSC in Fibroblasten zu differenzieren, wird MSC anschließend für weitere 2 Wochen mit vollständiger DMEM kultiviert. MSC-DF sind gekennzeichnet als s-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ Zellen36. MSC-DF kann wichtige Tumorregulatoren sein. Da ein Bruchteil von CAF in vielen Arten von soliden Tumoren von rekrutierten zirkulierenden MSC aus Knochenmark36freigesetzt unterschieden werden, kann MSC-DF vielversprechende Behandlungsziele sein. Sie sind auch viel leichter therapeutisch manipuliert oder gezielt, bevor sie zu Tumorgewebe rekrutiert und in CAF differenziert werden. Somit bietet unser 3D-Modell ein ideales System, um nicht nur Krebszellen, sondern auch verschiedene Fraktionen oder Subpopulationen von CAF zu untersuchen und zu testen. Die Methode zur 3D-Sphäroidbildung ist einfach. Zu den kritischen Schritten gehören die Verwendung von serumfreiem Medium für die Kokultur, die Anwendung des richtigen Verhältnisses von Fibroblasten auf Tumorzellen und die Verwendung der richtigen Kulturplatten für die Kokultur. Die mögliche Einschränkung unserer Methode ist, dass die Bildung von 3D-Sphäroiden weitgehend krebszelllinienabhängig ist. Unser Sphäroid-Bildungsprotokoll kann eine Optimierung des Verhältnisses zwischen Fibroblasten und Krebszellen erfordern, wenn verschiedene Krebszelllinien verwendet werden. Es sollte beachtet werden, dass wir ein menschliches Melanom-Zell- und Maus-Fibroblasten-Zell-Kokulturmodell für die Bildung von 3D-Sphäroiden verwendet haben, da es viel einfacher ist, GOF- oder LOF-Zellen in Maus-Fibroblasten für die Untersuchung der Rolle eines Moleküls oder Signalwegs bei der Regulierung der Tumorsphäroidbildung zu erstellen. Die Fähigkeit menschlicher Melanomzellen und Maus-Fibroblasten, Sphäroide zu bilden, zeigt an, dass Moleküle, die für die Zell-Zell-Kommunikation benötigt werden, speziesübergreifend wirken. Wir haben vor kurzem Kokultur von menschlichen Fibroblasten mit menschlichen Melanomzellen getestet und festgestellt, dass menschliche Fibroblasten auch menschliche Melanomzellen regulieren können, um 3D-Sphäroide zu bilden.
Wir verwendeten menschliche metastasierende Melanomzellen, C8161, in unserem multizellulären 3D-Sphäroid-Modell. Wir testeten auch andere menschliche Melanomzellen, zum Beispiel 1205Lu32, die dieBRAF-V600E-Mutation trägt, und MeWo, das hohe Konzentrationen von CDK4/Kit (ATCC HTB-65) ausdrückt, und fanden heraus, dass sie auch in der Lage sind, 3D-Sphäroide in der Cokultur zu bilden. Dies deutet darauf hin, dass die Bildung von 3D-Sphäroiden durch Tumorzellen unabhängig von den Arten von onkogenen Mutationen ist. Obwohl wir nicht getestet haben, ob andere Arten von Nicht-Melanom-Tumorzellen in der Lage sind, 3D-Sphäroide mit Fibroblasten zu bilden, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Bildung von 3D-Sphäroiden nicht auf eine Melanom-Zelllinie beschränkt ist und möglicherweise nicht von einer bestimmten Krebszelllinie abhängt.
Wir zeigten zwei Beispiele für praktische Anwendungen unseres 3D-Sphäroidmodells. Ein Beispiel war die Aufklärung der intrazellulären Notch Signalsignalsignalsignalaktivität bei der Regulierung des Krebsstamms/initiierenden Zellphänotyps und der 3D-Sphäroidbildung. Wir haben gezeigt, dass der intrazelluläre Notch-Signalweg in CAF ein molekularer Schalter ist, der den Phänotyp von Krebsstamm-/initiierenden Zellen mit diesem 3D-Sphäroidmodell steuert. Unsere Ergebnisse decken nicht nur einen molekularen Mechanismus auf, der der stromalen Regulation von Krebsstamm/initiierenden Zellen und Krebsheterogenität zugrunde liegt, sondern zeigen auch, dass der Notch-Signalweg in CAF ein kritisches Ziel für Melanom-Therapeutika ist. Dieses Beispiel zeigt, dass unser 3D-Sphäroidmodell sehr nützlich ist, um die Mechanismen für krebszellstromale Fibroblasten-Wechselwirkungen zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Ein weiteres Beispiel war die Prüfung der arzneimittelen Reaktion von Krebsstamm/anitiierenden Zellen in Gegenwart von CAF. Es ist allgemein bekannt, dass die medikamentöse Reaktion von Krebszellen, einschließlich Krebsstamm/anitiierende Zellen, in Gegenwart und Abwesenheit von CAF variiert. Die Anwesenheit von CAF in diesem In-vitro-System macht dieses Modell klinisch relevanter und generierte Testergebnisse zuverlässiger. Darüber hinaus ist unser 3D-Sphäroidsystem vielseitig einsetzbar. Es kann für verschiedene Zwecke verwendet werden. Zum Beispiel, wenn medikamentenresistente Krebszellen in diesem 3D-Modell verwendet werden, kann es geändert werden, um Die Arzneimittelresistenz und vielleicht Tumorrezidiv e.B. zu adressieren. Es kann auch modifiziert werden, um Medikamente zu testen oder zu untersuchen, die in erster Linie CAF für die Krebsbehandlung zielen. CAF sind in letzter Zeit vielversprechende therapeutische Ziele geworden. Die Ausrichtung auf CAF bietet Vorteile. Erstens, im Vergleich zu Tumorzellen, die abnormal (oft mit genetischen Veränderungen) und intelligent (leicht gewinnen Resistenz gegen Chemo- und Radiotherapien), CAF im Tumorgewebe sind normale Zellen und genetisch stabiler, so dass sie weniger wahrscheinlich Resistenzen gegen die Behandlungen zu entwickeln. Zweitens hängt die Ausrichtung von CAF nicht von der Art der onkogenen Mutationen in den Tumorzellen ab. Drittens kann das Targeting von CAF durch Fibroblasten-abhängige Antitumor-, Anti-Angiogenese und/oder die modulierende Krebsimmunantwort mehrere Treffereffekte erzielen. Unser 3D-Sphäroid-Modell ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Entdeckung verschiedener Krebstherapiestrategien.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Omaida C. Velazquez (University of Miami) für die hilfreiche Zusammenarbeit, Beratung und Diskussion; Dr. Jie Li (University of Miami) für die Bereitstellung von MeWo-Zellen; und Dr. Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) für die Versorgung aller anderen Melanomzellen. Wir danken auch Dr. Marcia Boulina, Direktorin der Analytical Imaging Core Facility, University of Miami, für die bildgebende Analyse. Zhao-Jun Liu wurde durch Stipendien des Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award Nr. 09BN-11), der Women es Cancer Association (das53. jährliche Stipendium) und interne Mittel der University of Miami unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
| Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
| CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
| DakoCytomation | Dako | x0909 | |
| DAPI | |||
| Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
| Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
| IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
| IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
| Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
| MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
| Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
| Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
| Olymupus CellSens | Olympus | ||
| PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
| Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |
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