Cancer Research

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Published: February 28, 2020 doi: 10.3791/60660

Hongwei Shao¹, Mecker Moller¹, Dazhi Wang¹, Albert Ting¹, Marcia Boulina², Zhao-Jun Liu¹

¹Department of Surgery, University of Miami School of Medicine, ²Analytical Imaging Core Facility, University of Miami School of Medicine

Summary

המודל הרומן תלת מימדי המבוסס על האינטראקציה הטרולימית של תאי הגידול והריטרותקיעות מסטרומה. כאן, אנו מציגים התרבות הcoculture של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה של הזמן, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להמחיש את היווצרות של spheroids. זה מודל תלת מימדי מציע פלטפורמה רלוונטית ללמוד אינטראקציות הגידול משתית ולבדוק therapeutics סרטן.

Abstract

הגידול-משתית אינטראקציות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן. תלת מימדי (3D) מודלים הגידול ספרואיד הם הנפוצים ביותר במודל מבחנה במחקר של סרטן גזע/ייזום תאים, טרום קלינית לחקר הסרטן, והקרנת סמים. 3D מודלים ספרואיד הם מעולים על התרבות הקונבנציונלית תאים סרטניים ולשכפל כמה תווים חשובים של גידולים מוצק אמיתי. עם זאת, קונבנציונאלי 3D הגידול מורכב באופן בלעדי של תאים סרטניים. הם חסרי השתתפות של תאים סטרומה הגידול ואין להם מספיק מטריצה החילוץ (ECM) התצהיר, ובכך רק חלקית מחקה את התנאים vivo של רקמות הגידול. הקמנו מודל חדש מדור 3D ספרואיד מורכב מתאי הגידול סטרומה פיברותקיעות כי טוב יותר מחקה את הvivo הגידול הטרוגנית מיקרוסביבה הdesmoplasia שלה יליד. היווצרות של spheroids מוסדר באופן מוחלט על ידי מסטרומה הגידול פיברותקיעות והוא נקבע על ידי הפעילות של מסלולים מסוימים המכריע מאוד תאיים (למשל, איתות חריץ) ב פיברוביטים מסטרומה. במאמר זה, אנו מציגים את הטכניקות של התרבות התאית של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה זמן לשגות כדי להמחיש אינטראקציה תא תאים, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להציג את התכונות האדריכליות 3d של spheroids. אנו מראים גם שתי דוגמאות של היישום המעשי של מודל זה ספרואיד תלת-ממד. מודל זה הרומן מסחר 3D ספרואיד מציעה פלטפורמה שימושית ללימוד הגידול משתית, להבהיר כיצד סטרומה לווסת סרטן גזע/ייזום תאים, אשר קובעים את התקדמות הגידול ותוקפנות, ולחקור מעורבות של תגובת סטרומה ברגישות לתרופות בסרטן והתנגדות. הפלטפורמה הזאת יכולה להיות גם. מודל מתורבת לגילוי סמים

Introduction

גידולים מוצקים לייצג רקמות מורכבות המורכב מתאים נאופלסטיים ומגוון גדול של תאים סטרומה¹^,²^,³^,⁴. סטרומה פיברותקיעות, או סרטן הקשורים פיברותקיעות (קפה), הם אחד האוכלוסיות הבולטות של תאים סטרומה ברוב סוגי גידולים מוצקים. הם מעורבים אנושות בוויסות צמיחת הגידול, סטדיות, גרורות, אנגיוגנזה, ועמידות בפני סמים באמצעות ייצור גורמי גדילה, ציטוקינים/נוגדנים, סינתזה של ecm ואנזימים שיפוץ (למשל, קולגן, פיברוטין, ומטריקס מטאלופרוטסיס), שחרור אקסוזומים, ואינטראקציה ישירה של תא לתא הטרוטיפקס⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. קפה גם לקחת חלק בקביעת גרורות האיבר הספציפי לסרטן ידי מראש בחירת תת קבוצה של שיבוטים הגידול מאוכלוסיות הטרוגנית תאים סרטניים בנגע העיקרי וטיפוח אלה שיבוטים שנבחרו להיות מוכן גרורות לאיבר מרוחק ספציפי אשר מיקרוסביבה אופטימלית לצביעה מפני השיבוטים של שיבוטים שנבחרו¹². יתר על כן, פיברותקיעות וגורמים מסיסים המופרשים שלהם ecm להשתתף באפנון של אנגיוגנזה הגידול¹³^,¹⁴, נגד הגידול התגובה החיסונית¹⁵, והם מעורבים גם התנגדות לסמים והגידול מהישנות¹⁶^,¹⁷.

בשנת מתורבת 3d הגידול מודלים ספרואיד פותחו ומשמש מחקר הסרטן כמודל ביניים בין תרביות תאים מבחנה בסרטן ובדגמי גידול vivo¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. מודלים 3D הגידול ספרואיד זכו לפופולריות במחקר תאי גזע סרטן, טרום קלינית לחקר הסרטן, והקרנת סמים משום שמודלים אלה לשכפל כמה תכונות חשובות של גידולים אמיתיים שנעדרים ב-2D מסורתית מונאולאיירס²². רבים קיימים 3D הגידול מודלים ספרואיד היוו אך ורק של תאים סרטניים וחוסר השתתפות של תאים סטרומה הגידול. זה לעתים קרובות תוצאות spheroids הגידול נתקל לא מספיק התצהיר ECM והיעדר אינטראקציות תא תאים הטרוטיפקס. קונבנציונאלי 3D spheroids נוצר באופן בלעדי על ידי תאים סרטניים הומוטיפקס תא התא הדבקה עשוי רק חלקית לחקות את התנאים vivo של רקמות הגידול. כדי להתגבר על חלק ממגבלות אלה, החוקרים הציעו לשלב סוגים מרובים של תאים סטרומה בתרבויות 3d ופיתח מספר הטרוטיפ 3d גידול ספרואיד מודלים²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷. בנוסף, החוקרים המועסקים מטריצות 3d אקסוגני, כולל הידרוג'לים טבעיים או פולימרים סינתטיים כגון פוליאתילן גליקול, פולי (lactide-co-גליקולדה), ו פולי (N-איזוקטילאמילאמיד), להטביע מודלים מונותאיים ומרב הספרואיד, יצירה של סביבה תומכת בתאים ומשחזר אינטראקציות תאים מטריצות²⁸^,²⁹, ובכך להפוך את המערכות ה עם זאת, שילוב של סוגים מסוימים של תאים סטרומה, כגון תאים אנדותל, בתרבויות 3D מביא על מורכבות נוספת עבור מערכת מבחנה ומקשה על ללמוד אינטראקציות תא תאים הטרוטיפקס בין שני סוגים ספציפיים של תאים, כגון אינטראקציות תאים סרטניים הפיצוץ. יתר על כן, תאים אנדותל ברקמות אמיתי לא תמיד אינטראקציה ישירה עם תאים סרטניים ותאים אחרים סטרומה כי יש שכבה של קרום המרתף עטוף מחוץ נימים המונע תאים אנדותל מאינטראקציה ישירה עם תאים סרטניים ותאים אחרים סטרומה. במודלים ספרואיד תלת-ממדיים, משולבים בתאי האנדותל, אינם יוצרים בעצם כלי דם, אך מתקשרים ישירות עם תאים סרטניים ותאי סטרומה אחרים, דבר שלעיתים נדירות מתרחש בvivo. באופן דומה, מטריצות אקסודוגני המועסקים בכמה מודלים ספרואיד תלת-ממד אינם זהים ECM ברקמות הגידול האמיתי במונחים של מבנה וקומפוזיציה. כל התנאים המלאכותית האלה עלולים לגרום לנתונים מטעים.

לאחרונה יצרנו מודל חדש של 3D ספרואיד מגוון מורכב של תאים סרטניים ו-בית קפה. במודל שלנו, היווצרות spheroids הגידול 3D נקבע לחלוטין על ידי קפה. קפה לגרום ולווסת את הפנוטיפ של גזע הגידול/מתחיל תאים. ECM המיוצר על ידי קפה הוא טבעי ומאפשר את המבנה desmoplastic כדי לחקות טוב יותר את vivo הגידול בסביבת מיקרו. זה מודל 3D הרומן יכול להיות כלי שימושי עבור הקרנת תרופות לסרטן ומציעה פלטפורמה ייחודית ללמוד אינטראקציה הגידול משתית, להבהיר כיצד לווסת את הסרטן גזע/ייזום תאים, ולחקור את המעורבות של אינטראקציות סטרומה בסרטן רגישות לתרופות והתנגדות.

Protocol

1. בתאי מלנומה culturing ועור פיברותקיעות

מלנומה בתאים אנושיים
1. תרבות תאים מלנומה האדם, C8161³¹ תחת התנאים המקובלים בתרבות התא בינונית W489 מלאה (ראה שלב 1.2) ב 37 ° c החממה שסופקו עם 5% CO₂ כפי שמתואר בעבר³². פצל את התאים ביחס 1:5 כאשר הם מגיעים ל-~ 90% השטף.
תרבות תא מלנומה בינונית (W489)
1. עבור W489 בינוני מלא, השימוש 80% MCDB153 בינונית, 20% L-15 בינוני (ראה טבלת חומרים), 2% סרום בקר עוברי (fbs), 5 μg/mL אינסולין, 1.68 MM cacl₂, ו 0.11% נתרן ביקרבונט. עבור תרבות החברה, אל תוסיף FBS, אינסולין ו-CaCl₂.
בידוד עור לעכבר
1. גזור קטע עור בגודל 1 ס מ מעכבר בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בוועדה (IACUC).
2. מעכלים את העור על-ידי הגיאז (ראו טבלת חומרים) ב -4 ° c בלילה. להסיר את דרמיס מן האפידרמיס ועוד לעכל עם הקולגן (1 מ"ג/mL ב dmem ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר (RT) לילה.
עור העכבר פיברוהפיצוץ מקולף
1. לשטוף את כדורי הרקמה עם PBS ותרבות אותם DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 ° צ'/5% CO₂. פצל את התאים ביחס 1:2 כאשר הם מגיעים ל-~ 90% השטף.
2. באמצעות שיטות סטנדרטיות לפני התרבות הבין-משתמשים בשיטות העור הרגילות.
אפיון של עור העכבר פיברותקיעות על ידי כתמים חיסוני
1. הכנה לצביעת תאים
  1. הזרע העור פיברותקיעות 24 צלחת הבאר בצפיפות של 2 x 10⁴ תאים/גם. ביום 2, לשטוף את התאים עם PBS 2x ולתקן אותם 2% המאגר ניטרלי באגירה עבור 10 דקות. הסר את פורמלין ולשטוף את התאים קבוע עם pbs פעמיים.
2. כתמים חיסוני
  1. הוסף 200 μL של פתרון חסימה לכל טוב ומעכלת את הצלחת 30 דקות ב RT, ואז להוסיף העכבר anti-α-SMA מדולל ב 1:200 ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1 h. לשטוף עם PBS 3x, 5 דקות כל אחד.
  2. הוסף אלכס Fluor 488 עז אנטי עכבר IgG ב 1:400 דילול ו-דגירה ב RT עבור 1 h. שטוף את הנוגדנים 3x עם PBS, 5 דקות כל אחד.
  3. הוסף 1 μg/mL DAPI ו-דגירה ב-RT עבור 2 דקות. הסר פתרון DAPI והוסף 500 μL של PBS לתוך כל טוב.
  4. להתבונן בתאים ולצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית.
התוויות המקדימות ותאי מלנומה
1. זרעי הזרע לתוך צלחת 100 מ"מ ביום 1, כך ששטף התא מגיע ~ 60% למחרת היום. ביום 2, להסיר את בינונית התרבות ולהוסיף GFP/הנגיף (~ 1:3 – 1:5 מדולל מהמלאי) לתוך בינונית תרבות רגילה עם 4 μg/mL של polybrene. התאים הדגירה בחממה 37 ° c עבור 6 h, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום התרבות הרגילה טריים. לאחר יומיים, שימו לב לאות GFP מהתאים בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטית. מC8161 תאים עם DsRed/הנגיף בתנאים דומים. פרוטוקולים להכנת הנגיף gfp/הנגיף ו-dsred/לנטיטווירוס תוארו בעבר¹⁴^,³⁴.

2. מתאים לתרבות

הזרע את התרבות הC8161-פיברובלסט.
1. ביום 0 של שיטת היווצרות הספרואיד, יש לנתק הן את הC8161 והן את העור בעזרת 0.25% טריפסין-EDTA. לסובב את התאים ב 250 g עבור 5 דקות ב RT ולשטוף פעם אחת עם PBS.
2. השהה מחדש את התאים בתווך התא coculture (סרום חינם, אינסולין חינם, וסידן חינם W489 בינוני מעורבב עם סרום חינם DMEM ביחס 1:1). כוונן את ריכוז התא ל-2 x 10⁴ תאים/mL.
3. מערבבים את התאים C8161 עם הפיברופיצוצים ביחס 1:1 ומוסיפים 2 מ ל של תערובות התא לכל טוב של הצלחת 24 הבאר. כל טוב צריך להכיל 2 x 10⁴ של כל סוג של תאים. כל תנאי צריך להיעשות בטרילקאט.
  הערה: חשוב להשתמש בצלחת הטיפול בתרבות שאינה רקמה (ראה טבלת חומרים). אחרת, התאים מתחברים בחוזקה לצלחת ואינם יכולים לקבל השעיית spheroids.
מודקת תאים ב 37 ° c עבור 4 h עד התאים לצרף את הצלחת, ולאחר מכן לבצע הדמיה זמן, או סריקה קונפוקלית וקד בנקודות הזמן המצוין עבור כל שיטת.

3. לחיות תא זמן הדמיה

לפני התרבות, הפעל את מערכת ההדמיה הזמן (ראה טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן ולתת החממה להגיע 37 ° צ' ו 5% CO₂. זה בדרך כלל לוקח 1 h כדי שהמערכת תגיע לשיווי משקל. הניחו בזהירות את לוחית התרבות על הבמה של המיקרוסקופ בתוך החממה ונעלו את הדלת בצורה מאובטחת.
פתח את התוכנה של מערכת הדמיה הזמן לפקיעה (ראה טבלת חומרים) ולבחור את סוג הצלחת והיצרן כך המיקרוסקופ יכול לאתר את אזור הסריקה במדויק. בחר את הבארות של עניין עדשת האובייקטיבי 10x. בחר את ההגדרות עבור אזור הסריקה, את זמן המרווח בין הסריקות, לבין התחלה, כמו גם זמן סיום. בפרוטוקול זה, מספר התבנית המירבי עבור אזור הסריקה עבור 1 היטב הוא 36 והזמן המרווח הוא 1 h.
שיא הדמיה בזמן ההדמיה מ-4 – 52 h.
הערה: זמן ההתחלה, זמן הסיום והמשך צריכים להיות ממוטבים לפי סוג תא ומטרת הניסוי.
בעת השלמת הקלטת התמונה, השתמש בתוכנת מערכת הדמיה של הזמן לאחזור הנתונים וייצוא סרטי וידאו או ערכות תמונות.

4. מיקרוסקופיה קונפוקלית וסרטים תלת ממדיים

מניחים את צלחת התרבות התא על הבמה של מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים) ולהשתמש בקרני לייזר אדום וירוק. להתבונן בתאים תחת עדשת המטרה 5x או 10x ובחר ספרואיד להתחיל סריקה.
השתמש בצעד אחד יקרומטר z כדי לסרוק מהחלק התחתון לחלק העליון של הספרואיד. עיבוד הנתונים באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים) כדי לשחזר תמונה תלת-ממדית שניתן לסובב עוד ולשמור כסרט תלת-ממדי.

5. תרבות סולו של תאים מלנומה והיווצרות אשכולות 2D/אגרגטים

זרע 2 x 10⁴ C8161 מלנומה תאים לתוך כל טוב של הצלחת 24 היטב כמתואר בסעיף 2.1. תרבות התאים 7 – 10 ימים ולצלם אותם באמצעות מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית.

6. בדיקה אם תלת-ממד הספרואידים ואשכולות תא 2D/אגרגטים מושעים במדיום או מוצמד ללוחות

לתרבית תאים, בדוק את הspheroids התלת-ממדיים שנוצרו ביום 7. עבור תרבות תא בודדת, בדוק את האשכולות 2D/אגרגטים שנוצרו ביום 10.
הגדר צלחות של תרבות התא על מצע של מיקרוסקופ פלואורסצנטית הפוך. לשים מחט מכופף עם מזרק לתוך הבאר ובעדינות מכניס את מדיום התרבות פנימה והחוצה כדי להפריע מדיום התרבות בבארות. הקלט תהליך זה באמצעות מצב הסרט של תוכנת הסרט (ראה טבלת חומרים). הספרואידים תלת-ממדיים יהיו ניידים, אך אשכולות התא 2D/אגרגטים יישארו איתנה.

7. תמונה קונמוקד של הספרואידים תלת-ממדיים

הערה: תאים מתורשים מתחילים ליצור spheroids מ 48-72 h בהתאם לסוג של הפיברותקיעות בשימוש. בדרך כלל, הספרואידים מתרחבות בהדרגה עם הזמן. מיורואידים קטנים יכולים להיות מסוגלים ליצור מזהים גדולים יותר עד יום 7. לאחר ייצוב הספרואידים בגודל, הם יכולים להימשך יותר מ -10 ימים. לאחר מכן, הספרואידים לעתים קרובות להתנתק מהחלק התחתון של לוחית התרבות ומתאספים במרכז הבארות. במהלך התרחבות הספרואידים, התאים במרכז מתים בדרך כלל בשל תזונה לא מספקת ו/או מיקרואקולוגיה רעילה. מכאן, השיא של היווצרות 3D ספרואיד והעיתוי התמונה הספרואידים הבשיל צריך להיות ממוטב באמצעות ניסויים פיילוט. עבור פרוטוקול זה, המיקרוסקופיה בוצעה בסביבות יום 7 כאשר הרוהרואידים היו בוגרים והתאים במרכז הספרואידים עדיין בחיים על פי הקרינה הפלואורסצנטית והמבנה של התאים במרכז.

כדי לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית, השתמשו בלייזר ירוק ואדום כדי לסרוק את הספרואידים. לקבוע את אזור הסריקה תחת מטרה 10x ולעבור מהחלק התחתון לראש הספרואיד עם 1 יקרומטר z-step.
צור את היווצרות וידאו תלת-ממדי וסרטוני סיבוב באמצעות פונקציית ההטלה תלת-ממדית של תוכנת עיבוד התמונה (לדוגמה, ImageJ).

8. Notch1 תאיים פעילות מסלול איתות בקביעת רגולציה סטרומה של סרטן גזע/ייזום תאים

בידוד ואפיון של העור פיברותקיעות מתוך הפסד ואובדן פונקציה Notch1 עכברים
1. לבודד פיברותקיעות עור משני זוגות של עכברים מהונדסים גנטית: הרווח של פונקציה Notch1 (GOF^Notch1: Fsp1.יצור^+/-; העכברים^{של רוזה LSL-N1IC +/+}) לעומת השליטה המקבילה שלהם (gof^ctrl : FSP1. יצור^-/-; ^N1IC+/+) עכברים ואובדן הפונקציה Notch1 (lof^Notch1: Fsp1.יצור^+/-; Notch1^loxp/loxp+/+) עכברים לעומת השליטה המקבילה שלהם (lof^ctrl : FSP1. יצור^-/-; Notch1^loxp/loxp+/+) עכברים³¹, בהתאמה. בידוד ואפיון של העור באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיפים 1.3-1.5.
העבר את העור של העכבר. עם הוירוס הגfp
1. ראה סעיף 1 עבור השיטה שבאמצעותה יש להתאים את התאים באמצעות הווקטור הנגיפי.
התרבות הקונומה של תאי הסרטן ומלנומה
1. התנהלות הניסוי התאי בתרבית כמתואר בסעיף 2.
הערכת ההשפעה של פעילות מסלול Notch1 תאיים בפיברותקיעות על קביעת הרגולציה סטרומה של סרטן גזע/ייזום תאים על ידי מדידת הגדלים של הספרואידים 3D
1. ביצוע הכמת של היווצרות הספרואיד תחת כל מצב על ידי צילום הספרואידים בזמן כאשר spheroids הם בוגרים (מצוין על ידי עצירת הצמיחה סביב יום 5 – 7 בהתאם לסוגי הפיברומות). למדוד את הגדלים של spheroids 3D באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.

9. בדיקת תגובת התרופה לסרטן הגזע/ייזום תאים באמצעות שיטת התלת-ממד התלת-ממדית

הערה: קפה יכול לווסת הטרוגניות של הסרטן ולגרום פניטיפ של סרטן גזע/ייזום תאים. קפה גם תומך בגזע הסרטן/ייזום תאים לסבול טיפולים קליניים. תאים גזע סרטן הוכחו להיות אחראי על התנגדות לסמים. לכן, השתמשנו במודל ספרואיד תלת-ממדי זה כדי להעריך את תגובת התרופה של סרטן גזע/ייזום תאים. התוצאה יכולה להעריך את היעילות הקלינית הפוטנציאלית של תרופות נגד סרטן היטב.

מינהל התרופות
1. מיד לאחר coculturing את התאים בצלחת 24 טוב, להכין את התרופות בדילול סדרתי בתווך התרבות כדי להגיע 5x של מגוון הרצוי של ריכוזי מבוסס על ניסויים פיילוט (כלומר, 1 ננומטר, 2.5 nM, 5 ננומטר, 10 ננומטר, ו 25 ננומטר).
  הוסף 0.5 mL של פתרונות התרופות המתאימות לכל טוב של התאים המתורגיים. התייחס לקבוצת הבקרה באמצעות מדיה רגילה של החברה כפי שהוזכר לעיל.
2. הערה: מעכבי מק ו מסיסים במדיה של תרבות התא. לכן, פקדים ריקים הם 2.5 mL של מדיום תרבות התא. עם זאת, אם הסם אינו מסיס בתמיסה מימית ודורש ממיסים כגון DMSO, לאחר מכן מדיה לתרבות התא עם ריכוז זהה של DMSO יש להחיל על קבוצת הביקורת.
הכמת של תגובת הסמים על ידי ספירת מספרי כמות
1. שימו לב לתאים המתייחסים ולתאים שאינם מטופלים בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטית ומצלמים את התאים מדי יום. לכמת את היווצרות ספרואיד בקבוצות ניסיוני שונים ולהשוות את היכולת היווצרות ספרואיד של תרבויות התא תחת ריכוזי סמים שונים.
  הערה: הספרואידים נוטים להופיע ~ 5-7 ימים לאחר התרבות הקוקולאידית. אפקטי התרופה יהפכו להיות מורגש באותה נקודה.
2. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית לתמונה/צילום הspheroids ותאים בבארות ולאחר מכן להשתמש בתוכנת התמונה כדי לחשב את הגודל הממוצע של spheroids ואת מספר spheroids הוקמה לפי שדה כוח נמוך (LPF x 4) בכל קבוצת טיפול לאורך זמן.
  הערה: תאים המקבלים טיפול יעיל בסמים צריכים ליצור פחות או ללא מזהי מספר בהשוואה לקבוצת הביקורת. זהו אינדיקציה לאפקטיביות של הסם נבדק על דיכוי תאי גזע סרטניים.

Representative Results

פיתחנו שיטה הרומן כדי ליצור spheroids תלת-ממד עם מערכת הטרוטיפקס תא מבחנה הטרוסקסואלים שמחקה את vivo מיקרוסביבה גידול. פיברותקיעות נגזרת מעור העכבר פיברותקיעות. העור פיברותקיעות נוצרו כמתואר לעיל היו מאופיינים כα-SMA⁺/vimentin⁺/vimentin⁺ תאים. תאים מלנומה גרורתית האדם (C8161) היו מתורבתים במדיום W489 כמתואר³². כדי להמחיש ולהבחין בפיברוהכדורים מתאי הגידול, פיברותקיעות ותאי מלנומה התעברו מראש עם gfp/הנגיף ו-dsred/הנגיף, בהתאמה³⁴,³⁶, לפני התרבות^{coculture תאים}.

איור 1 מציג דוגמה של מטבעות 3d spheroids הנוצר על ידי תאי מלנומה coculturing ופיברופיצוצים. מלנומה תאים תרבותיים בהעדר פיברופיצוצים לא הטופס האופייני spheroids 3D, למרות כמה תאים מלנומה טופס אשכולות 2D/אגרגטים עם התרבות המורחבת. הגודל הממוצע של spheroids היה כ 170 – 360 יקרומטר בקוטר (ממוצע = 275, SD = 37) ביום ~ 5-7. באמצעות הדמיה בזמן ההדמיה, הבחנו כי גידולים בתאי הגידול המגע בתרבות coculture החלה ליצור spheroids 3D בסביבות 36 h של התרבות הcoculture כפי שמוצג בווידאו 1. הדמיה זמן לפקיעה הקליט את התהליך הדינמי של אינטראקציה תא התא ואת השלב ההתחלתי של היווצרות ספרואיד ב ~ 4-52 h של התרבות הקובית. השיא של מבנה ספרואיד תלת-ממדי התרחש בסביבות יום ~ 5-7. Spheroids שנוצרו 3D היו מורכבים מסרטן התאים ומלנומה, שם הרוב (~ 80%) היו תאי גידול וידאו 2 מראה את התהליך הדינמי של תאים מלנומה בודדת תרבותית (dsred⁺/c8161) בהקמת אשכולות תא/אגרגטים החל מ ~ 4 – 52 h בתרבות אחת. היווצרות אשכולות 2D/אגרגטים לשיאה בסביבות יום ~ 7 – 10. וידאו 3 ו- video 4 הצג את המבנים של ספרואיד תלת-ממד ואת האשכול תא הגידול 2d דמיינו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, בהתאמה. 3D ספרואיד ואשכולות תא הגידול 2D נבדקו על ידי המיקרוסקופיה מיקוד ביום 7 של תרבות התאים. וידאו 5 מראה כי spheroids 3d הושעו במדיום התרבות וניידים, בעוד וידאו 6 מראה כי האשכול תא הגידול 2d היה מצורף לצלחת התרבות משותק. השעיה במדיום היא תכונה של spheroids 3D המבדיל אותם מאשכולות 2D. כאשר המדיום בצלחת תרבות התא או היטב מופרע על ידי שחרור או בעדינות ללטף את מדיום התרבות, להעביר את התלת-ממד מושעה 3d, ואילו אשכולות תא 2d הם משותק. רק כמה תאים מתים. בודדים ניידים

איור 2מראה דוגמא של דגם תלת-ממד זה המשמש כפלטפורמה ייחודית לחקר אינטראקציות הגידול משתית וכדי להבהיר כיצד Notch1 מסלול הפעילות המסלול בבית קפה מווסת גזע הסרטן/ייזום תאים והיווצרות ספרואיד. שני זוגות של פיברותקיעות (פנסיון מלא) מבודדים מן העור של רווח הפונקציה Notch1 (GOF^Notch1: Fsp1.היצור^+/-; העכברים^{של רוזה LSL-N1IC +/+}) לעומת השליטה המקבילה שלהם (gof^ctrl : FSP1. יצור^-/-; ^N1IC+/+) עכברים ואובדן הפונקציה Notch1 (lof^Notch1: Fsp1.יצור^+/-; Notch1^loxp/loxp+/+) עכברים לעומת השליטה המקבילה שלהם (lof^ctrl : FSP1. יצור^-/-; Notch1^loxp/loxp+/+) עכברים³⁵, בהתאמה. כל פיברוהפיצוצים התעברו על ידי GFP/לנטיגוירוס ו cocultured תרבית עם תאי מלנומה C8161 מראש עם DsRed/הנגיף. זמן הדמיה מראה כי Fb-GOF^Notch1 עצר C8161 תאים מלנומה מיצירת 3d spheroids לעומת FB-gof^ctrl במהלך הראשון ~ 4-52 h של התרבות הסלולרית. לעומת זאת, Fb-LOF^Notch1 היווצרות קידם של 3d spheroids על ידי C8161 תאים מלנומה לעומת FB-lof^ctrl. איור 2B, טופ, מציג תמונות מייצגות של Spheroids 3d שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם שונים בעלי שונות ביצוע פעילויות מסלול מגוונות. איור 2B, למטה, מציג את הנתונים הכמותיים על הגודל הממוצע של 3d spheroids שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם שונים בגידולים שנושאים מגוון פעילויות מסלול.

איור 3 מראה דוגמה של דגם תלת-ממד זה המשמש כדי לבדוק את תגובת התרופה של הסרטן גזע/מתחיל תאים. סרטן גזע/ליזום תאים הוכחו להיות אחראי על עמידות לסמים וסרטן הישנות. לכן, הערכת תגובת התרופה באמצעות דגם תלת-ממד זה יכול לחשוף טוב יותר את היעילות הקלינית של התרופה לטיפול בסרטן. התאים מלנומה C8161 להסתמך על איתות MAPK פעיל עבור צמיחת תאים ופלישה. הם גם מבטאים רמות גבוהות של CDK4/Kit, אבל לא לשאת מוטציה BRAF. כדי לבדוק את תגובת התרופה של סרטן גזע/ליזום תאים כלפי מעכבי MAPK באמצעות מודל זה 3D, אנו מC8161 תאים מלנומה ופיברופיצוצים ב 24 לוחות טוב. PD0325901 (ראה טבלת חומרים), מעכב mapk, הוכן בדילול סדרתי בטווח של ריכוזים מ-1 ננומטר, 2.5 nm, 5 ננומטר, 10 ננומטר, ו 25 ננומטר. הPD0325901 התווסף לתרביות התא כאשר תערובות תאים מצופה. תאים שאינם מטופלות בשימוש שימשו כשליטה. אנו העריכו את היכולת היווצרות ספרואיד של התרבויות התא תחת ריכוזי סמים שונים והשווה אותו עם שליטה ללא טיפול. איור 3מראה תמונות מייצגות של Spheroids 3d שנוצרו ביום 5 של התרבות התא תחת ריכוזי סמים שונים. איור 3ב הוא נתונים כמותיים של הגודל הממוצע לבין ספרואיד ומספרים של Spheroids תלת-ממד שנוצרו לפי שדה כוח נמוך (lpf x 4) ביום 5 של התרבות התאית בתוך ריכוזי סמים שונים.

איור 1: היווצרות הספרואידים תלת-ממדיים ואשכולות דו-ממדיים. (A) דמות מייצגת של spheroids 3d נוצר על ידי התרבות האנושית של תאים מלנומה C8161 האדם והעור העכבר פיברותקיעות. Spheroids 3D צולמו ביום 7 של התרבות הקומדית של תאים מלנומה ופיברופיצוצים. הגדלים הממוצעים של הספרואידים היו ~ 170 – 360 יקרומטר בקוטר (ממוצע = 275, SD = 37) ביום ~ 5-7. המספר הממוצע של spheroids היה 18-26 (20.5 ± 3.6) לכל שדה כוח נמוך (LPF x4). (ב) דמות מייצגת של אשכולות תא הגידול 2d שנוצרו על ידי תרבות אחת של תאים מלנומה C8161. האשכולות תא מלנומה 2D צולמו ביום 7 של תרבות אחת של תאים מלנומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ההסבר של התפקיד של פעילות Notch1 מסלול איתות בקפה בתוך ויסות הסרטן גזע/ייזום תאים באמצעות מודל 3D ספרוoid. (A) תאיים Notch1 איתות פעילות מסלול בבית קפה נקבע את היווצרות של spheroids על ידי תאים מלנומה בתרבית התא. זמן פקיעה וידאו מראה כי Fb-GOF^Notch1 עצר את היווצרות של 3d spheroids על ידי תאים מלנומה C8161, בעוד FB-Lof^Notch1 קידם את היווצרות של יותר 3d spheroids על ידי מלנומה C8161 תאים במהלך הראשון 4-52 h של התרבות התאית. (ב) למעלה: תמונות מייצגות של spheroids תלת-ממדיים שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם בריפומות שונים הנושאים מגוון פונקציות מסלול חריץ. למטה: הנתונים הכמותיים של הגודל הממוצע (קוטר [μm]/ספרואיד) של 3D spheroids שנוצרו ביום 7 של התרבות התאית עם פיברופיצוצים שונים הנושאים פעילויות מסלול מגוונות. מבחן ה-t של סטודנט דו-זנבי שימש לניתוח סטטיסטי. הנתונים מבוטאים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הערכת תגובת התרופה של הסרטן גזע/ייזום תאים באמצעות מודל ספרואיד תלת-ממד. (א) דמויות מייצגות של spheroids תלת-ממדיים שנוצרו ביום 5 של התרבות התא בריכוזים שונים של סמים. (ב) הנתונים הכמותיים של הגודל הממוצע (קוטר [μm]/ספרואיד) ומספר התלת-ממד של spheroids לכל שדה כוח נמוך (lpf x 4) נוצר ביום 5 של התרבות התאית בריכוזים של תרופות שונות. נתונים כמותיים מבוטאים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Screenshot 1
וידאו 1: תהליך דינמי של היווצרות spheroids 3D בשלב המוקדם של התרבות התאית. זמן הדמיה ההדמיה מראה אינטראקציה תא תא דינמי בין תאים סרטניים ותאי הגידול בתרבות coculture היווצרות של 3D spheroids במהלך הראשון ~ 4-52 h של התרבות coculture. התאים החלו ליצור spheroids 3D סביב 48 h לאחר תחילת התרבות הקומדית. השיא של מבנה ספרואיד תלת-ממדי התרחש ביום ~ 5-7 (לא מוצג כאן). Spheroids תלת-ממד היו מורכבים בתאי הסרטן מלנומה, שם רוב (~ 80%) היו תאי גידול אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Screenshot 2
וידאו 2: תהליך דינמי של היווצרות אשכולות 2D בשלב המוקדם של התרבות התאית. הדמיה של הזמן מראה את התהליך הדינמי של אשכולות דו-ממדיים שנוצרו על ידי C8161melanoma תאים בתרבות אחת. היווצרות אשכולות דו-ממדיים התרחשו בסביבות יום ~ 7 – 10. הדמיה זמן ההדמיה רשומות את התקופה של ~ 4 – 52 h בתרבות אחת של DsRed⁺/C8161 תאים מלנומה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Screenshot 3
וידאו 3: אדריכלות וסיבוב של 3d ספרואיד כפי דמיינו על ידי קונפוקלית יקרוסקופיה. ארכיטקטורה וסיבוב של 3D ספרואיד. לייזרים ירוקים ואדומים שימשו כדי לסרוק את הספרואידים שנוצרו ביום 7 בתרבית תאים. אזור הסריקה נקבע תחת מטרה 10x. הסריקה מתחילה מלמטה לחלק העליון של הספרואיד ב-1 יקרומטר z-step. הסרט סיבוב 3D שספרואיד נוצר באמצעות תוכנת פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Screenshot 4
וידאו 4: אדריכלות וסיבוב תא הגידול 2d אשכול כפי שדמיינו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. ארכיטקטורה וסיבוב של אשכול דו-ממדי. תמונות confocal וקד של אשכולות התא נלקחו ביום 7 של התרבות היחידה של מלנומה תא. אזור הסריקה נקבע תחת מטרה 10x. הסריקה מתחילה מלמטה לחלק העליון של הספרואיד ב-1 יקרומטר z-step. הסרט סיבוב האשכול הדו נוצר באמצעות תוכנת פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Screenshot 5
וידאו 5: התנועה של 3D spheroids. הספרואידים התלת-ממדיים הושעו במדיום התרבותי ואינם דבקים בכלי התרבות. כאשר עדיין בינוני בתרבות התאים היטב היה מופרע על ידי ליטוף עדין, את הspheroids מושעה 3D זז. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Screenshot 6
וידאו 6: יציבות של אשכולות תא הגידול 2D. אשכול תא הגידול 2D היה מעוגן ללוח התרבות ו משותק למרות הפרעה של מדיום התרבות. כמה תאים מתים. בודדים היו ניידים אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

בשנת מתורבת 3D טכניקות תרבות תאים המועסקים באופן נרחב במשך עשורים במחקר סרטן. בהשוואה למערכות התרבות הרגילות של תאים דו-ממדיים, המיקרו-סביבה התלת-ממדית מאפשר לחקות את תאי התא ו/או את האינטראקציות של מטריצת התאים ומאפשרת חיקוי של התנאים המקוריים שנצפו ברקמות הגידול. עם זאת, מערכת תלת-ממד שהוקמה רק על-ידי תאים סרטניים ואינטראקציות תא הומותאיות לא לקחת בחשבון את החשיבות של דיבור הטרוטיפקס והוא עשוי לספק תוצאות לא מדויקות במחקר. פיתחנו לאחרונה מערכת 3D הרומן שילוב תאים סרטניים ו-בית קפה כדי לחקות טוב יותר מיקרוסביבה vivo הטרוגנית הגידול ותגובה desmoplastic מקורית ונוקשה שלה.

פיברותקיעות הם מרכיבים עיקריים של משתית גידולים. קפה מעורבים בוויסות התקדמות הגידול על ידי מעורר גורמים מסיסים, ECM/שיפוץ אנזימים¹⁰^,¹¹, אקסוזומים. בנוסף, קפה לשחק חלק בהתנגדות לסמים ולהישנות הגידול¹⁶^,¹⁷. מערכת 3D שלנו ספרואיד מדור שלנו יכול להיות מנוצל כדי לחקור מנגנונים מולקולרית של אינטראקציות הגידול סטרומה וכדי לטפל בהתנגדות לסמים ולהישנות הגידול. קפה מופק בעיקר מתוך מופעל השקט המקומי פיברוהתקיעות ו מגויס מח עצם העצמות MSC, אשר עוברים בידול באתרו לתוך הסרטן ברקמות הגידול³⁷^,³⁸^,³⁹. במחקר הנוכחי, השתמשנו בפיברוטימיט עור כדי ליצור מודל 3D ספרואיד מגוון. עם זאת, סוג אחר של פיברותקיעות (למשל, MSC-DF), גם לעבוד בצורה דומה מאוד כמו העור פיברותקיעות כדי לווסת את תא הגידול 3D ספרואיד היווצרות³⁴. MSC-DF יכול להיווצר מח עצם מוריין MSC, אשר מועשר על ידי מח עצם culturing ברור תאים בינונית התרבות של הגוף MSC במשך כ 10 ימים עם שינויים בינוניים תקופתיים כל 3 ימים. MSC אלה מאופיינים כ-CD73⁺/cd105⁺/Lin^-. כדי להבדיל את MSC לתוך פיברוהפיצוצים, MSC הם מתורבתים לאחר מכן עם DMEM להשלים 2 שבועות נוספים. MSC-DF מאופיינים α-SMA⁺/vimentin⁺/vimentin⁺ תאים³⁶. MSC-DF יכול להיות הרגולטורים הגידול חשוב. מכיוון שבריר של קפה בסוגים רבים של גידולים מוצקים מובחנים מ-MSC מגויס במחזור שוחרר מח עצם³⁶, MSC-DF יכול להיות מבטיח מטרות הטיפול. הם גם הרבה יותר בקלות מניפולציות מבחינה רפואית או ממוקד לפני שהם גויסו רקמות הגידול והבדיל לתוך קפה. כך, מודל תלת-ממד שלנו מציע מערכת אידיאלית ללמוד ולבדוק לא רק תאים סרטניים, אלא גם שברים שונים או תת אוכלוסיות של קפה. השיטה עבור היווצרות 3D ספרואיד היא פשוטה. השלבים הקריטיים כוללים שימוש בסרום חינם לתרבות החברה, ומיישם את היחס הנכון של הפיברותקיעות לתאי גידול, ובאמצעות לוחות התרבות הנכונים לתרבות החברה. המגבלה הפוטנציאלית של השיטה שלנו היא כי היווצרות של spheroids 3D הוא תא סרטן ברובו תלוי קו. פרוטוקול היווצרות הספרואיד שלנו עשוי לדרוש אופטימיזציה של היחס בין פיברותקיעות ותאי סרטן אם שונים תאים סרטניים מועסקים. יש לציין כי השתמשנו תא מלנומה של האדם והעכבר פיברוההדף מודל coculture פיצוץ המודל עבור היווצרות של 3D spheroids, כי זה הרבה יותר קל ליצור GOF או LOF תאים בתוך העכבר פיברותקיעות לחקר התפקיד של מולקולה או מסלול איתות בוויסות היווצרות הגידול ספרואיד. היכולת של תאים מלנומה אנושית והעכבר פיברותקיעות לטופס spheroids מציין כי מולקולות הדרושות עבור תקשורת תא תא עבודה לחצות מינים. יש לנו נבדק לאחרונה התרבות coculture האדם עם תאים מלנומה האדם ומצאו כי הגידול האנושי יכול גם לווסת תאים מלנומה אנושית כדי ליצור spheroids 3D.

אנו המועסקים תאים מלנומה גרורתית האדם, C8161, במודל שלנו 3D ספרוoid שלנו. בדקנו גם תאים אחרים מלנומה אנושית, למשל, 1205Lu³², אשר נושאת את^V600E braf מוטציה, ו mewo, אשר מבטא רמות גבוהות של CDK4/קיט (atcc htb-65), ומצא כי הם גם מסוגלים ליצור Spheroids 3d ב-coculture. זה מצביע על היווצרות של spheroids 3D על ידי תאים סרטניים אינו תלוי בסוגים של מוטציות אונגניים. למרות שאנחנו לא בדקנו אם סוגים אחרים של תאים סרטניים שאינם מלנומה מסוגלים להרכיב spheroids 3D עם פיברותקיעות, הממצאים שלנו מצביעים על כך היווצרות של 3D spheroids לא מוגבל לקו תא מלנומה ואולי לא תלוי קו תאים מסוים הסרטן.

הראנו שתי דוגמאות של יישומים מעשיים של המודל התלת-מימדי שלנו. דוגמא אחת הייתה להבהיר את פעילות המסלול הבין-תאיים העולה בוויסות מבנה הסרטן/הייזום של תאי התאים והיווצרות תלת-ממד. הדגמנו את מסלול האיתות התאיים העולה בקפה הוא מתג מולקולרי השולט בפנוטיפ של הגזע הסרטני/היוזם תאים באמצעות מודל זה ספרואיד תלת-ממדי. הממצאים שלנו לא רק לחשוף מנגנון מולקולרי הבסיס מסטרומה רגולציה של סרטן גזע/ייזום תאים סרטן הטרוגניות, אבל גם להדגיש כי מסלול חריץ ב-בית קפה הוא יעד קריטי עבור therapeutics מלנומה. דוגמה זו מציינת כי המודל שלנו 3D ספרואיד שימושי מאוד כדי ללמוד את המנגנונים עבור הסרטן מסטרומה תאים הטיפול בפיברופיצוץ ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. דוגמה נוספת הייתה לבדוק את תגובת התרופה של סרטן גזע/מתחיל תאים בנוכחות של קפה. ידוע היטב כי תגובת התרופה של תאים סרטניים, כולל סרטן גזע/ייזום תאים, משתנה בנוכחות והעדר של קפה. נוכחות של קפה זה במערכת החוץ גופית עושה את המודל הזה יותר קליני רלוונטי תוצאות הבדיקה אמין יותר. יתר על כן, המערכת שלנו 3D ספרוoid הוא צדדי. ניתן להשתמש בו למטרות שונות. לדוגמה, אם תאים סרטניים עמידים בפני תרופות מועסקים במודל תלת-ממד זה, ניתן לשנות את הטיפול בהתנגדות לסמים ואולי להישנות הגידול. זה יכול גם להיות שונה כדי לבדוק או המסך תרופות המיועד בעיקר קפה לטיפול בסרטן. קפה הפכה לאחרונה למטרות טיפוליות מבטיחות. יש יתרונות למיקוד בקפה. ראשון, לעומת התאים הסרטניים כי הם חריגים (לעתים קרובות עם שינויים גנטיים) וחכם (בקלות לקבל עמידות כימותרפיה-רדיותרפיות), קפה ברקמת הגידול הם תאים נורמליים ויציבה יותר גנטית, כך הם פחות סביר לפתח עמידות לטיפולים. שנית, מיקוד בקפה אינו תלוי בסוג של מוטציות אונגניים בתאי הגידול. השלישי, מיקוד בקפה עשוי להשיג תופעות להיט מרובים באמצעות אנטי הגידול התלוי בגידולים, אנטי אנגיוגנזה, ו/או התגובה החיסונית של סרטן מודליטינג. מודל 3D ספרואיד שלנו הוא כלי רב עוצמה עבור גילוי של קבוצות מגוונות של אסטרטגיות טיפוליות לסרטן.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לד ר אואידה ג. ולאסקז (אונ' מיאמי) לשיתוף פעולה, ייעוץ ודיון מועילים; ד ר ג'אי לי (אוניברסיטת מיאמי) לאספקת תאים MeWo; וד ר Meenhard הרלין (מכון Wistar) עבור מתן כל תאי מלנומה אחרים. אנו מודים גם ד ר מרשה בובינה, מנהל מתקן ליבת הדמיה אנליטית, אוניברסיטת מיאמי, לניתוח דימות. ז'או-ג'ון ליו נתמך על ידי מענקים מתוכנית המחקר לסרטן בנקהד-Coley (פרס 09BN 11), האגודה לסרטן נשים (המענק^{השנתי 53} ) וקרנות פנימיות מאוניברסיטת מיאמי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-253-CI
24-well plate	Corning	351147	Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technology	A21202
CaCl2 1.5 M	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Collagenase, Type 1A	Sigma-Aldrich	C-2674	500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.
DakoCytomation	Dako	x0909
DAPI
Dispase Grade II	Roche Diagnostics	165859
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	VMR	97068-085	Premium Grade
Fiji (ImageJ)	NIH		Free for downloading, no license needed.
IncuCyte Zoom 2016A	Essen Bioscience
IncuCyte Zoom System	Essen Bioscience
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L1518
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope	Leica
MCDB 153 Medium	Sigma-Aldrich	M7403-10X1L
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone	Abcam	ab18640
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX51
Olymupus CellSens	Olympus
PD0325901	Selleckchem Chemicals	S1036
Penicillin Streptomycin Solution	Corning	30-002- CI	100 X
Sodium Bicarbonate 7.5%	Corning	25-035-CI