Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse

Published: February 28, 2020 doi: 10.3791/60660
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Surgery, University of Miami School of Medicine, 2Analytical Imaging Core Facility, University of Miami School of Medicine

Summary

En ny tredimensjonal sfæroid modell basert på heterotypisk interaksjon av tumorceller og stromal fibroblaster er etablert. Her presenterer vi kokultur av tumorceller og stromal fibroblaster, time-lapse imaging, og confocal mikroskopi for å visualisere dannelsen av sfæroider. Denne tredimensjonale modellen tilbyr en relevant plattform for å studere tumor-stroma interaksjoner og teste kreft terapeutiske midler.

Abstract

Tumor-stroma interaksjoner spiller en viktig rolle i kreftprogresjon. Tredimensjonale (3D) tumorsfæroidmodeller er den mest brukte in vitro-modellen i studien av kreftstamme/initierende celler, preklinisk kreftforskning og legemiddelscreening. 3D-sfæroidmodellene er bedre enn konvensjonell tumorcellekultur og reproduserer noen viktige tegn av ekte solide svulster. Imidlertid består konvensjonelle 3D-tumorsfæroider utelukkende av tumorceller. De mangler deltakelse av tumorstromale celler og har utilstrekkelig ekstracellulær matrise (ECM) deponering, og dermed bare delvis etterligne in vivo forhold av tumorvev. Vi etablerte en ny flercellet 3D-sfæroidmodell bestående av tumorceller og stromal fibroblaster som bedre etterligner in vivo heterogene tumor mikromiljø og dens innfødte desmoplasia. Dannelsen av sfæroider er strengt regulert av tumorstromal fibroblaster og bestemmes av aktiviteten til visse avgjørende intracellulære signalveier (f.eks. hakksignalering) i stromal fibroblaster. I denne artikkelen presenterer vi teknikkene for kokultur av tumorceller-stromal fibroblaster, time-lapse imaging for å visualisere cellecelleinteraksjoner, og konfokal mikroskopi for å vise 3D arkitektoniske funksjoner i sfæroider. Vi viser også to eksempler på praktisk anvendelse av denne 3D-sfæroidmodellen. Denne nye multicellulære 3D-sfæroidmodellen tilbyr en nyttig plattform for å studere tumor-stroma interaksjon, belyse hvordan stromal fibroblaster regulerer kreftstammen / initierende celler, som bestemmer tumorprogresjon og aggressivitet, og utforsker involvering av stromal reaksjon i kreft medikamentell følsomhet og resistens. Denne plattformen kan også være en relevant in vitro modell for narkotika oppdagelse.

Introduction

Solide svulster representerer komplekse vev bestående av neoplastiske celler og et stort utvalg av stromale celler1,2,3,4. Stromal fibroblaster, eller kreftrelaterte fibroblaster (CAF), er en av de fremtredende stromalcellepopulasjonene i de fleste typer solide svulster. De er kritisk involvert i å regulere tumorvekst, stemness, metastase, angiogenese og legemiddelresistens gjennom produksjon av vekstfaktorer, cytokiner/chemokiner, syntese av ECM og remodeling enzymer (f.eks. kollagen, fibronectin, og matrise metalloproteaser), frigjøring av eksosomer, og direkte heterotypic celle-celle interaksjon5,6 ,7,8,9,101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 , 101 ,101,10 . CAF deltar også i å bestemme kreft organspesifikk metastase ved å forhåndsvelge en undergruppe av tumorkloner fra heterogene tumorcellepopulasjoner i den primære lesjonen og fremme disse utvalgte klonene som skal primes for metastase til et bestemt fjernt organ hvis mikromiljø er optimalt for rekolonisering av utvalgte kloner12. Videre fibroblaster og deres utskillelige løselige faktorer og ECM delta i modulering av tumor angiogenese13,14, anti-tumor immunrespons15,og er selv involvert i resistens og tumor tilbakefall16,17.

In vitro 3D tumor sfæroid modeller har blitt utviklet og brukt i kreftforskning som en mellomliggende modell mellom in vitro kreft celle kulturer og in vivo tumor modeller18,19,20,21. 3D tumor sfæroid modeller har fått popularitet i kreft stamcelleforskning, preklinisk kreft forskning, og narkotika screening fordi disse modellene reprodusere noen viktige funksjoner i virkelige svulster som er fraværende i tradisjonelle 2D monolayers22. Mange eksisterende 3D tumor sfæroid modeller er utelukkende sammensatt av tumorceller og mangler deltakelse av tumor stromal celler. Dette resulterer ofte i at tumorsfæroider har utilstrekkelig ECM-deponering og fravær av heterotylske cellecelleinteraksjoner. Konvensjonelle 3D-sfæroider dannet utelukkende av kreftceller og homotypisk cellecellevedheking kan bare delvis etterligne in vivo-forholdene i tumorvev. For å overvinne noen av disse begrensningene, har etterforskerne foreslått å innlemme flere typer stromal celler i 3D cocultures og utviklet flere heterotype 3D tumor sfæroid modeller23,24,25,26,27. I tillegg forskere har ansatt eksogene 3D matriser, inkludert naturlige hydrogeler eller syntetiske polymerer som polyetylenglykol, poly(lactide-co-glycolide), og poly(N-isopropylacrylamide), for å bygge inn monocellulære og flercellet sfæroidmodeller, skape et cellestøttende miljø og reprodusere cellematriseinteraksjoner28,29, og dermed gjøre disse systemene mer biologisk relevante30. Imidlertid fører inkorporering av visse typer stromale celler, for eksempel endotelceller, i 3D-kokulturer til ytterligere kompleksitet for et in vitro-system og gjør det vanskelig å studere heterotypisk cellecelleinteraksjoner mellom to spesifikke typer celler, for eksempel kreftcellefibroblastinteraksjoner. Videre, endotelceller i ekte vev ikke alltid direkte samhandle med kreftceller og andre stromal celler fordi det er et lag av kjellermembran innpakket utenfor kapillærene som hindrer endotelceller fra direkte samspill med kreftceller og andre stromal celler. I disse 3D-sfæroidmodeller, innlemmet endotelceller faktisk ikke danner blodkar, men samhandle direkte med kreftceller og andre stromal celler, noe som sjelden forekommer i vivo. Tilsvarende, exogenous matriser ansatt i noen av 3D sfæroid modeller er ikke identiske med ECM i ekte tumorvev i form av struktur og sammensetning. Alle disse kunstige forholdene kan føre til villedende data.

Vi har nylig opprettet en ny multicellulær 3D-sfæroidmodell bestående av tumorceller og CAF. I vår modell er dannelsen av 3D-tumorfæroider helt bestemt av CAF. CAF induserer og regulerer fenotypen av tumorstammen/initierende celler. ECM produsert av CAF er naturlig og gjør at desmoplastisk struktur bedre kan etterligne in vivo tumor mikromiljøet. Denne nye 3D-modellen kan være et nyttig verktøy for kreftnarkotikascreening og tilbyr en unik plattform for å studere tumor-stroma interaksjon, belyse hvordan CAF regulerer kreft stammen / initierende celler, og utforske involvering av stromal interaksjoner i kreft narkotika følsomhet og resistens.

Protocol

1. Culturing Melanom celler og hud fibroblaster

  1. Culturing humane melanomceller
    1. Kultur humane melanomceller, C816131 under konvensjonelle tilhengercellekulturforhold i fullstendig W489 medium (se trinn 1.2) i en 37 °C inkubator levert med 5% CO2 som beskrevet tidligere32. Del cellene med et 1:5-forhold når de når ~ 90% samflyt.
  2. Melanom cellekultur medium (W489)
    1. For komplett W489 medium, bruk 80% MCDB153 medium, 20% L-15 medium (se Materialtabell),2% føtal storfe serum (FBS), 5 μg/ml insulin, 1,68 mM CaCl2,og 0,11% natriumbikarbonat. For coculture, ikke legg til FBS, insulin og CaCl2.
  3. Mus hud fibroblast isolasjon
    1. Klipp et 1 cm x 1 cm hudfragment fra en mus i samsvar med de relevante retningslinjene og forskriftene til institusjonens Animal Care and Use Committee (IACUC).
    2. Fordøye huden ved dispase (se Materialtabell) ved 4 °C over natten. Fjern dermis fra epidermis og videre fordøye med kollagennase (1 mg/ml i DMEM, se Materialtabell) ved romtemperatur (RT) over natten.
  4. Mus hud fibroblast kulturing
    1. Vask vevpellets med PBS og kultur dem i DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i 37 °C/5% CO2. Del cellene med et 1:2-forhold når de når ~ 90% samflyt.
    2. Overfør hudfibroblaster med GFP/lentivirus ved hjelp av standardmetoder før samtidig kultur.
  5. Karakterisering av mus hud fibroblaster ved immunstaining
    1. Celleforberedelse for farging
      1. Frø huden fibroblaster i 24 brønnplate med en tetthet på 2 x 104 celler / brønn. På dag 2, vask cellene med PBS 2x og fikse dem i 2% nøytral bufret formalin i 10 min. Fjern formalin og vask de faste cellene med PBS to ganger.
    2. Immunbeisering
      1. Tilsett 200 μL blokkeringsoppløsning til hver brønn og inkuber platen i 30 min ved RT, og tilsett deretter musen anti-α-SMA fortynnet ved 1:200 og inkuber ved 37 °C i 1 t. Vask med PBS 3x, 5 min hver.
      2. Legg Alex Fluor 488 geit anti-mus IgG på 1:400 fortynning og inkubator ved RT i 1 t. Vask ut antistoffene 3x med PBS, 5 min hver.
      3. Tilsett 1 μg/ml DAPI og inkuber ved RT i 2 min. Fjern DAPI-oppløsningen og tilsett 500 μL PBS i hver brønn.
      4. Observer cellene og ta bilder ved hjelp av et omvendt fluorescensmikroskop.
  6. Prelabelling fibroblaster og melanomceller
    1. Frø fibroblaster i en 100 mm tallerken på dag 1 slik at cellen samløpet når ~ 60% neste dag. På dag 2, fjern kulturmediet og legg til GFP / lentivirus (~ 1:3-1:5 fortynnet fra lager) til vanlig kulturmedium med 4 μg / ml polybren. Inkuber celler i en 37 °C inkubator i 6 timer, fjern mediet og erstatt med friskt vanlig kulturmedium. Etter 2 dager må du observere GFP-signalet fra cellene ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Transduce C8161 celler med DsRed/lentivirus under lignende forhold. Protokoller for utarbeidelse av GFP/lentivirus og DsRed/lentivirus er beskrevet tidligere14,34.

2. Cellecoculture

  1. Frø C8161-fibroblast coculture.
    1. På dag 0 av sfæroid formasjonanalysen, løsne både C8161 og huden fibroblaster ved hjelp av 0,25% trypsin-EDTA. Spinn ned cellene ved 250 g i 5 min på RT og vask en gang med PBS.
    2. Resuspender cellene i cellekokulturmedium (serumfritt, insulinfritt og kalsiumfritt W489 medium blandet med serumfri DMEM med et 1:1-forhold). Juster cellekonsentrasjonen til 2 x 104 celler/ml.
    3. Bland C8161-cellene med fibroblastene med et 1:1-forhold og tilsett 2 ml celleblandinger til hver brønn av en 24-brønnplate. Hver brønn skal inneholde 2 x 104 av hver type celler. Hver tilstand bør gjøres i triplicate.
      MERK: Det er viktig å bruke en ikke-vevskultur behandlet plate (se Tabell av materialer). Ellers vil cellene sterkt feste seg til en plate og være ute av stand til å fra å suspendere sfæroider.
  2. Inkuber celler ved 37 °C i 4 timer til cellene festes til platen, og deretter utføre tidsforløpsavbildning eller konfokal skanning ved de angitte tidspunktene for hver analyse.

3. Live Cell Time-lapse Imaging

  1. Før coculture, slå på time-lapse bildesystemet (se Tabell over materialer)etter produsentens instruksjoner og la inkubatoren nå 37 °C og 5% CO2. Det tar vanligvis 1 t for systemet å nå likevekt. Plasser kulturplaten forsiktig på mikroskopets stadium inne i inkubatoren og lås døren på en sikker måte.
  2. Åpne programvaren for time-lapse bildesystem (se Tabell over materialer) og velg platetype og produsent slik at mikroskopet kan finne skanneområdet nøyaktig. Velg brønnene av interesse og en 10x objektiv. Velg innstillingene for skanneområdet, intervalltiden mellom skanningene og en start- og sluttidspunkt. I denne protokollen er det maksimale formatnummeret for skanneområdet for 1 brønn 36 og intervalltiden er 1 t.
  3. Rekordtidsforløp bildebehandling fra 4-52 h.
    MERK: Starttidspunktet, sluttidspunktet og varigheten skal optimaliseres etter celletype og formålet med eksperimentet.
  4. Når du fullfører bildeopptaket, kan du bruke programvaren for tidsforløpsbildesystem til å hente dataene og eksportere videoer eller bildesett.

4. Konfokal mikroskopi og 3D-filmer

  1. Plasser cellekokulturplaten på scenen til et omvendt fluorescensmikroskop (se Materialtabell)og bruk røde og grønne laserstråler. Vær oppmerksom på cellene under en 5x eller 10x objektiv linse og velg en sfæroid for å begynne å skanne.
  2. Bruk en 1 μm z-trinn for å skanne fra bunnen til toppen av sfæroid. Behandle dataene ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (se Materialtabell) for å rekonstruere et 3D-bilde som kan roteres og lagres ytterligere som en 3D-film.

5. Solo kultur av melanom celler og dannelse av 2D klynger / aggregater

  1. Frø 2 x 104 C8161 melanomceller i hver brønn av en 24 brønnplate som beskrevet i pkt. 2.1. Kultur cellene i 7-10 dager og fotografer dem ved hjelp av et omvendt fluorescensmikroskop.

6. Kontroll av om 3D-sfæroider og 2D-celleklynger/aggregater er suspendert i mediet eller festet til platene

  1. For cellecoculture, sjekk 3D-sfæroider dannet på dag 7. For enkeltcellekultur, sjekk 2D-klynger/aggregater som dannes på dag 10.
  2. Sett cellekulturplater på plattformen til et omvendt fluorescensmikroskop. Sett en bøyd nål med en sprøyte i en brønn og forsiktig aspirer kulturmediet inn og ut for å forstyrre kulturmediet i brønnene. Ta opp denne prosessen ved hjelp av filmmodusen for filmprogramvaren (se Materialtabell). 3D-sfæroider vil være mobile, men 2D-celleklynger / aggregater vil forbli standhaftige.

7. Confocal Bilde av 3D-sfæroider

MERK: Cocultured celler begynner å danne sfæroider fra 48-72 h avhengig av typen fibroblaster som brukes. Generelt forstørrer sfæroider gradvis med tiden. Små sfæroider kan smelte for å danne større sfæroider til dag 7. Etter at sfheroider er stabilisert i størrelse, kan de vare mer enn 10 dager. Etter det løsner sfæroidene ofte fra bunnen av kulturplaten og samles i midten av brønnene. Under utvidelsen av sfæroider dør cellene i senteret vanligvis på grunn av utilstrekkelig ernæring og / eller et giftig mikromiljø. Derfor bør toppen av 3D-sfæroiddannelse og timing for å bilde de modne sfæroidene optimaliseres ved hjelp av piloteksperimenter. For denne protokollen ble konfokal mikroskopi utført rundt dag 7 da sfæroidene var modne og cellene i midten av sfæroider var fortsatt i live i henhold til fluorescens og morfologi av cellene i midten.

  1. For å gjøre confocal mikroskopi, bruk en grønn og rød laser for å skanne sfæroider. Bestem skanneområdet under et 10x mål og flytt fra bunnen til toppen av sfæroiden med en 1 μm z-trinn.
  2. Generer 3D-sfæroiddannelse og rotasjonsvideoer ved hjelp av 3D-projeksjonsfunksjonen til bildebehandlingsprogramvaren (f.eks. ImageJ).

8. Intracellulær Hakk1 Signalpathway aktivitet i fastsettelse stromal regulering av kreft stammen / initiering celler

  1. Isolasjon og karakterisering av hudfibroblaster fra gain- og loss-of-function Notch1 mus
    1. Isolere hudfibroblaster fra to par genmodifiserte mus: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus versus motpartkontrollen (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus og loss-of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Hakk1LoxP/LoxP+/+) mus versus motpartkontrollen (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Hakk 1LoxP/LoxP+/+) mus31, henholdsvis. Isolere og karakterisere hudfibroblaster ved hjelp av protokollen som er beskrevet i avsnitt 1.3-1.5.
  2. Overfør mushudenfibroblaster med GFP/lentivirus.
    1. Se avsnitt 1 for metoden for å overføre cellene med lentiviral vektor.
  3. Samtidig kultur av fibroblaster og melanomceller
    1. Utfør cellekokultureksperimentet som beskrevet i avsnitt 2.
  4. Vurdere effekten av intracellulær Notch1-veiaktivitet i fibroblastene ved fastsettelse av stromale reguleringer av kreftstammen/initiering av celler ved å måle størrelsene på 3D-spheroidene
    1. Utfør kvantifisering av sfæroiddannelse under hver tilstand ved å fotografere sfæroider på den tiden da sfheroider er modne (indikert ved stopp av vekst rundt dag 5-7 avhengig av hvilke typer fibroblaster). Mål størrelsenpå 3D-sfæroidene ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren.

9. Teste stoffet respons av kreft stem / initierende celler ved hjelp av 3D Spheroid Analyse

MERK: CAF kan regulere kreftheterogenitet og indusere fenotype av kreftstamme/initierende celler. CAF støtter også kreftstammen/initierende celler for å utholde kliniske behandlinger. Kreft stamceller har vist seg å være ansvarlig for narkotikaresistens. Derfor brukte vi denne 3D-sfæroidmodellen for å evaluere legemiddelresponsen til kreftstammen/initierende celler. Resultatet kan vurdere potensiell klinisk effekt av kreftmedisiner godt.

  1. Administrasjon av narkotika
    1. Rett etter å ha coculturing cellene i en 24 brønnplate, forberede narkotika i en seriell fortynning i kulturmedium for å nå 5x av et ønsket utvalg av konsentrasjoner basert på piloteksperimenter (dvs. 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, og 25 nM).
      Legg til 0,5 ml tilsvarende legemiddelløsninger til hver brønn i de kokulturerte cellene. Behandle kontrollgruppen med vanlige coculture media som nevnt ovenfor.
    2. MERK: MEK-hemmer er løselig i cellekulturmedier. Derfor er tomme kontroller 2,5 ml cellekulturmedium. Men hvis stoffet ikke er løselig i vandig løsning og krever løsemidler som DMSO, bør cellekulturmedier med samme konsentrasjon av DMSO brukes på kontrollgruppen.
  2. Kvantifisering av legemiddelrespons ved å telle sfæroider
    1. Vær oppmerksom på de behandlede cellene og ubehandlede cellene ved hjelp av et fluorescensmikroskop og fotografer cellene hver dag. Kvantifiser sfæroidformasjonen i de forskjellige eksperimentelle gruppene og sammenlign cellekulturenes sfæroiddannende evne under ulike legemiddelkonsentrasjoner.
      MERK: Sfæroidene har en tendens til å vises ~ 5-7 dager etter coculture. Legemiddeleffektene vil bli merkbare på det tidspunktet.
    2. Bruk fluorescensmikroskop til å bilde/fotografere sfæroider og celler i brønnene, og bruk deretter bildeprogramvaren til å beregne den gjennomsnittlige størrelsen på sfæroidene og antall sfæroider dannet per lavt strømfelt (LPF x 4) i hver behandlingsgruppe over tid.
      MERK: Celler som får effektiv medikamentell behandling bør danne færre eller ingen sfæroider sammenlignet med kontrollgruppen. Dette er en indikasjon på det testede stoffets effektivitet på å undertrykke kreftstamceller.

Representative Results

Vi utviklet en ny metode for å generere 3D-sfæroider med et in vitro heterotypic cellekokultursystem som etterligner in vivo tumor mikromiljøet. Fibroblaster er avledet fra mus hud fibroblaster. Hudfibroblaster ble generert som beskrevet ovenfor og ble karakterisert som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler. Humane metastatiske melanomceller (C8161) ble dyrket i W489 medium som beskrevet32. For å visualisere og skille fibroblaster fra tumorceller, ble fibroblaster og melanomceller pretransduced med GFP / lentivirus og DsRed / lentivirus, henholdsvis34,36, før cellekokultur.

Figur 1 viser et eksempel på flercellet 3D-spheroider dannet ved å coculturing melanomceller og fibroblaster. Melanomceller dyrket i fravær av fibroblaster dannet ikke typiske 3D-sfæroider, selv om noen melanomceller danner 2D-klynger / aggregater med den utvidede kulturen. Den gjennomsnittlige størrelsen på sfæroider var ca 170-360 μm i diameter (gjennomsnitt = 275, SD = 37) på dag ~ 5-7. Ved hjelp av time-lapse imaging observerte vi at fibroblaster og tumorceller samhandlet i coculture og begynte å danne 3D-sfæroider på rundt 36 h coculture som vist i Video 1. Time-lapse imaging registrert den dynamiske prosessen med celle-celle interaksjon og den innledende fasen av sfæroid formasjon på ~ 4-52 h av coculture. Toppen av 3D-sfæroiddannelse skjedde rundt dag ~5−7. De dannede 3D-sfæroidene var sammensatt av fibroblaster og melanomceller, hvor flertallet (~ 80%) var tumorceller. Video 2 viser den dynamiske prosessen med enkeltkultiverte melanomceller (DsRed+/C8161) i dannelsen av celleklynge/aggregater fra ~4–52 h i enkeltkultur. Dannelsen av 2D-klynger/aggregater toppet seg rundt dagen ~7-10. Video 3 og Video 4 viser strukturene til en 3D-sfæroid og en 2D-tumorcelleklynge visualisert ved henholdsvis konfokal mikroskopi. 3D-sfæroid og 2D tumorcelleklynger ble undersøkt av konfokal mikroskopi på dag 7 av cellekokultur. Video 5 viser at 3D-sfæroidene ble suspendert i kulturmediet og mobilen, mens Video 6 viser at 2D-tumorcelleklyngen var festet til kulturplaten og immobile. Suspensjon i mediet er en funksjon av 3D-sfæroider som skiller dem fra 2D-klynger. Når mediet i cellekulturretten eller brønnen forstyrres ved enten å slippe eller forsiktig pipettere kulturmediet, beveger de suspenderte 3D-sfæroidene seg, mens 2D-celleklynger er immobile. Bare noen få enkelt døde celler er mobile.

Figur 2A viser et eksempel på denne 3D-modellen som fungerer som en unik plattform for å studere tumor-stroma interaksjoner og å belyse hvordan intracellulær Notch1 signalveiaktivitet i CAF regulerer kreft stammen / initiering celler og sfæroid dannelse. To par fibroblaster (Fb) isolert fra huden av Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus versus motpartkontrollen (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus og loss-of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Hakk1LoxP/LoxP+/+) mus versus motpartkontrollen (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Hakk 1LoxP/LoxP+/+) mus35, henholdsvis. Alle fibroblaster ble transduced av GFP /lentivirus og kokulturert med C8161 melanomceller pretransduced med DsRed /lentivirus. Time-lapse bildebehandling viser at Fb-GOFNotch1 stoppet C8161 melanom celler fra forming 3D sfæroider sammenlignet med Fb-GOFctrl under den første ~ 4-52 h av cellecoculture. I motsetning, Fb-LOFNotch1 fremmet dannelsen av 3D-sfæroider av C8161 melanom celler sammenlignet med Fb-LOFctrl. Figur 2B, topp, viser representative bilder av 3D-sfæroider dannet på dag 7 av cellecoculture med forskjellige fibroblaster som utfører varierte Notch pathway aktiviteter. Figur 2B, bunn, viser kvantitative data om den gjennomsnittlige størrelsen på 3D-sfæroider dannet på dag 7 av cellecoculture med forskjellige fibroblaster som bærer varierte Notch pathway aktiviteter.

Figur 3 viser et eksempel på at denne 3D-modellen brukes til å teste legemiddelresponsen til kreftstammen/initierende celler. Kreftstamceller/initierende celler har vist seg å være ansvarlig for legemiddelresistens og tilbakefall av kreft. Derfor kan evaluering av legemiddelrespons ved hjelp av denne 3D-modellen bedre avsløre et potensielt legemiddelklinisk effekt for kreftbehandling. C8161 melanomcellene er avhengige av aktiv MAPK-signalering for cellevekst og invasjon. De uttrykker også høye nivåer av CDK4/Kit, men har ikke en BRAF-mutasjon. For å teste legemiddelresponsen av kreftstammen/initierende celler mot MAPK-hemmeren ved hjelp av denne 3D-modellen, kokulturerte vi C8161 melanomceller og fibroblaster i 24 brønnplater. PD0325901 (se Materialtabell), en MAPK-hemmer, ble utarbeidet i en seriefortynning med en rekke konsentrasjoner fra 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM og 25 nM. PD0325901 ble lagt til cellekokulturene da celleblandinger ble belagt. Ubehandlede kokulturerte celler ble brukt som kontroll. Vi evaluerte den sfæroiddannende evnen til cellekokulturer under forskjellige legemiddelkonsentrasjoner og sammenlignet den med ubehandlet kontroll. Figur 3A viser representative bilder av 3D-sfæroider dannet på dag 5 av cellekokultur under forskjellige legemiddelkonsentrasjoner. Figur 3B er kvantitative data av gjennomsnittlig størrelse per sfæroid og antall 3D-sfæroider dannet per lavt strømfelt (LPF x 4) på dag 5 av cellekokultur under forskjellige legemiddelkonsentrasjoner.

Figure 1
Figur 1: Dannelse av 3D-sfæroider og 2D-klynger. (A) Representativt bilde av 3D-sfæroider dannet av coculture av humane C8161 melanomceller og mus hud fibroblaster. 3D-sfæroider ble fotografert på dag 7 av coculture av melanomceller og fibroblaster. De gjennomsnittlige størrelsene på sfæroidene var ~ 170–360 μm i diameter (gjennomsnitt = 275, SD = 37) på dag ~5−7. Gjennomsnittlig antall sfæroider var 18–26 (20,5 ± 3,6) per lavt strømfelt (LPF x4). (B) Representativt bilde av 2D tumorcelleklynger dannet av enkeltkultur av C8161 melanomceller. De 2D melanom celleklynger ble fotografert på dag 7 av enkelt kultur av melanom celler. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Belyse rollen til intracellulær Hakk1 signalveiaktivitet i CAF i regulering av kreftstammen/initierende celler ved hjelp av 3D-sfæroidmodellen. (A) Intracellulær Hakk1 signalveiaktivitet i CAF fastslått dannelsen av sfæroider av melanomceller i cellekokultur. Time-lapse video viser at Fb-GOFNotch1 stoppet dannelsen av 3D-sfæroider av C8161 melanomceller, mens Fb-LOFNotch1 fremmet dannelsen av flere 3D-sfæroider av C8161 melanomceller under de første 4-52 h cellekokultur. (B) Topp: Representative bilder av 3D-sfæroider dannet på dag 7 av cellecoculture med forskjellige fibroblaster som bærer varierte Notch pathway funksjoner. Bunn: De kvantitative dataene av gjennomsnittlig størrelse (diameter [μm]/ffheroid) av 3D-sfæroider dannet på dag 7 av cellekokultur med forskjellige fibroblaster som bærer varierte Notch pathway aktiviteter. To-tail studentens t-test ble brukt til statistisk analyse. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av legemiddelrespons av kreftstammen/initierende celler ved bruk av 3D-sfæroidmodellen. (A)Representative bilder av 3D-sfæroider dannet på dag 5 av cellekokultur under ulike legemiddelkonsentrasjoner. (B) De kvantitative dataene i gjennomsnittsstørrelsen (diameter [μm]/sfheroid) og antall 3D-sfæroider per lavt strømfelt (LPF x 4) dannet på dag 5 av cellekokultur under forskjellige legemiddelkonsentrasjoner. Kvantitative data uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Screenshot 1
Video 1: Dynamisk prosess for dannelse av 3D-sfæroider i den tidlige fasen av cellekokultur. Time-lapse bildebehandling viser dynamiske celle-celle interaksjoner mellom fibroblaster og tumorceller i coculture og dannelse av 3D-sfæroider i løpet av den første ~ 4-52 h av cellekokultur. Cellene begynte å danne 3D-sfæroider rundt 48 timer etter starten av coculture. Toppen av 3D-sfæroiddannelse skjedde på dag ~5−7 (vises ikke her). 3D-sfæroider var sammensatt av fibroblaster og melanomceller, hvor flertallet (~ 80%) var tumorceller. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Screenshot 2
Video 2: Dynamisk dannelsesprosess av 2D-klynger i den tidlige fasen av cellekokultur. Time-lapse bildebehandling viser den dynamiske prosessen med 2D-klynger dannet av C8161melanoma celler i enkelt kultur. Dannelsen av 2D-klynger skjedde rundt dag ~7-10. Time-lapse imaging registrerer perioden på ~ 4-52 h i enkelt kultur av DsRed+/ C8161 melanom celler. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Screenshot 3
Video 3: Arkitektur og rotasjon av en 3D-sfæroid som visualisert av konfokal mikroskopi. Arkitektur og rotasjon av en 3D-sfæroid. Grønne og røde lasere ble brukt til å skanne sfæroider dannet på dag 7 i cellecoculture. Skanneområdet ble bestemt under et 10x-mål. Skanningen starter fra bunnen til toppen av sfæroiden ved et 1 μm z-trinn. 3D-sfæroid rotasjonfilmen ble opprettet ved hjelp av Fiji-programvare. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Screenshot 4
Video 4: Arkitektur og rotasjon en 2D tumorcelleklynge som visualisert av konfokal mikroskopi. Arkitektur og rotasjon av en 2D-klynge. Konfokale bilder av celleklynger ble tatt på dag 7 av melanomcelle enkeltkultur. Skanneområdet ble bestemt under et 10x-mål. Skanningen starter fra bunnen til toppen av sfæroiden ved et 1 μm z-trinn. 2D-klyngerotasjonsfilmen ble opprettet ved hjelp av Fiji-programvare. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Screenshot 5
Video 5: Bevegelse av 3D-sfæroider. 3D-sfæroider ble suspendert i kulturmediet og holdt seg ikke til kulturretten / brønnen. Når fortsatt medium i cellekulturen godt ble forstyrret av mild pipettering, suspendert 3D-sfæroider flyttet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Screenshot 6
Video 6: Standhaftighet av 2D tumorcelleklynger. 2D-tumorcelleklyngen var forankret til kulturplaten og immobile til tross for forstyrrelse av kulturmediet. Noen få døde celler var mobile. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

In vitro 3D cellekultur teknikker har vært mye ansatt i flere tiår i kreftforskning. Sammenlignet med konvensjonelle 2D-cellekultursystemer, rekapitulerer 3D-mikromiljøet cellecelle- og/eller cellematriseinteraksjonene og gjør det mulig å etterligne de ekte forholdene observert i tumorvev. Imidlertid tar et 3D-system dannet bare av kreftceller og homotypic celle-celle interaksjoner ikke ta hensyn til viktigheten av heterotypisk krysssnakk og kan gi unøyaktige resultater i forskning. Vi har nylig utviklet et nytt 3D-system som kombinerer kreftceller og CAF for bedre å etterligne i vivo heterogen tumor mikromiljø og dens innfødte og stive desmoplastisk reaksjon.

Fibroblaster er hovedkomponenter i tumorstroma. CAF er involvert i å regulere tumorprogresjon ved å fremkalle løselige faktorer, ECM/ remodeling enzymer10,11og eksosomer. I tillegg spiller CAF en rolle i resistens og tumortilbakefall16,17. Vårt flercellulære 3D-sfæroidsystem kan brukes til å utforske molekylære mekanismer for tumor-stromal interaksjoner og for å adressere legemiddelresistens og tumortilbakefall. CAF er hovedsakelig avledet fra aktiverte lokale quiescent fibroblaster og rekruttert sirkulerende benmarg MSC, som gjennomgår in situ differensiering i CAF i tumorvev37,38,39. I den nåværende studien brukte vi hudfibroblaster for å lage en flercellet 3D-sfæroidmodell. Imidlertid fungerer andre typer fibroblaster (f.eks. MSC-DF), også på en svært lik måte som hudfibroblaster for å regulere tumorcelle 3D-sfæroiddannelse34. MSC-DF kan genereres fra murine benmarg MSC, som beriket ved å kulturing benmargmonukleære celler i MSC cellekultur medium i ca 10 dager med periodiske medium endringer hver 3 dager. Disse MSC er karakterisert som CD73+/CD105+/Lin-. For å skille MSC inn i fibroblaster, blir MSC deretter dyrket med komplett DMEM i ytterligere 2 uker. MSC-DF er karakterisert som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler36. MSC-DF kan være viktige tumorregulatorer. Fordi en brøkdel av CAF i mange typer solide svulster er differensiert fra rekruttert sirkulerende MSC utgitt fra benmarg36,kan MSC-DF være lovende behandlingsmål. De er også mye lettere terapeutisk manipulert eller målrettet før de blir rekruttert til tumorvev og differensiert til CAF. Dermed tilbyr vår 3D-modell et ideelt system for å studere og teste ikke bare kreftceller, men også forskjellige fraksjoner eller underpopulasjoner av CAF. Metoden for 3D-sfæroiddannelse er enkel. De kritiske trinnene inkluderer bruk av serumfritt medium for coculture, bruk av riktig forhold mellom fibroblaster til tumorceller, og bruk av de riktige kulturplatene for coculture. Den potensielle begrensningen av vår metode er at dannelsen av 3D-sfæroider i stor grad er kreftcellelinjeavhengig. Vår sfæroid formasjonprotokollen kan kreve optimalisering av forholdet mellom fibroblaster og kreftceller hvis ulike kreftcellelinjer er ansatt. Det bør bemerkes at vi brukte en menneskelig melanomcelle og mus fibroblast celle kokultur modell for dannelsen av 3D sfæroider, fordi det er mye lettere å lage GOF eller LOF celler i mus fibroblaster for studiet av rollen som et molekyl eller signalvei i å regulere tumor færoid dannelse. Evnen til menneskelige melanomceller og musfibroblaster for å danne sfæroider indikerer at molekyler som kreves for cellecellekommunikasjon, fungerer på tvers av arter. Vi har nylig testet coculture av menneskelige fibroblaster med humane melanomceller og funnet at menneskelige fibroblaster også kan regulere menneskelige melanomceller for å danne 3D-sfæroider.

Vi brukte humane metastatiske melanomceller, C8161, i vår flercellet 3D-sfæroidmodell. Vi testet også andre humane melanomceller, for eksempel 1205Lu32, som bærer BRAFV600E mutasjon, og MeWo, som uttrykker høye nivåer av CDK4 / Kit (ATCC HTB-65), og fant at de også er i stand til å danne 3D-sfæroider i coculture. Dette indikerer at dannelsen av 3D-sfæroider av tumorceller er uavhengig av hvilke typer onkogene mutasjoner. Selv om vi ikke har testet om andre typer ikke-melanom tumorceller er i stand til å danne 3D-sfæroider med fibroblaster, indikerer våre funn at dannelse av 3D-sfæroider ikke er begrenset til en melanomcellelinje og kan ikke avhenge av en bestemt kreftcellelinje.

Vi viste to eksempler på praktiske anvendelser av vår 3D-sfæroidmodell. Et eksempel var å belyse intracellulær Hakk signalveiaktivitet i å regulere kreftstammen / initiere celle fenotype og 3D færoid dannelse. Vi viste at den intracellulære Notch signalveien i CAF er en molekylær bryter som kontrollerer fenotypen av kreftstammen / initierende celler ved hjelp av denne 3D-sfæroidmodellen. Våre funn avdekker ikke bare en molekylær mekanisme underliggende stromal regulering av kreftstammen / initiering av celler og kreftheterogenitet, men understreker også at Notch-banen i CAF er et kritisk mål for melanomterapeutiske midler. Dette eksemplet indikerer at vår 3D-sfæroid modell er svært nyttig for å studere mekanismene for kreft celle-stromal fibroblast interaksjoner og identifisere potensielle terapeutiske mål. Et annet eksempel var å teste legemiddelresponsen av kreftstammen/initierende celler i nærvær av CAF. Det er velkjent at legemiddelresponsen til kreftceller, inkludert kreftstammen/initierende celler, varierer i nærvær og fravær av CAF. Tilstedeværelse av CAF i dette in vitro-systemet gjør denne modellen mer klinisk relevant og genererttestresultater mer pålitelig. Videre er vårt 3D-sfæroidsystem allsidig. Den kan brukes til ulike formål. For eksempel, hvis resistente kreftceller er ansatt i denne 3D-modellen, kan det endres for å adressere legemiddelresistens og kanskje tumortilbakefall. Det kan også endres for å teste eller screene legemidler som primært er rettet mot CAF for kreftbehandling. CAF har nylig blitt lovende terapeutiske mål. Det er fordeler med å målrette CAF. Først, sammenlignet med tumorceller som er unormale (ofte med genetiske endringer) og smart (lett få motstand mot kjemo- og radioterapi), CAF i tumorvev er normale celler og genetisk mer stabil, så de er mindre sannsynlig å utvikle motstand mot behandlingene. For det andre er målretting av CAF ikke avhengig av typen onkogene mutasjoner i tumorcellene. Tredje, målretting CAF kan oppnå flere treff effekter gjennom fibroblaster-avhengig anti-tumor, anti-angiogenese, og / eller modulerende kreft immunrespons. Vår 3D sfæroid modell er et kraftig verktøy for oppdagelse av ulike sett av kreft terapeutiske strategier.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Omaida C. Velazquez (University of Miami) for nyttig samarbeid, konsultasjon og diskusjon; Dr. Jie Li (University of Miami) for å gi MeWo celler; og Dr. Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) for å gi alle andre melanomceller. Vi takker også Dr. Marcia Boulina, direktør for Analytical Imaging Core Facility, University of Miami, for bildeanalyse. Zhao-Jun Liu ble støttet av tilskudd fra Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women's Cancer Association (53rd årlige tilskudd) og interne midler fra University of Miami.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Corning 25-253-CI
24-well plate Corning 351147 Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technology A21202
CaCl2 1.5 M Sigma-Aldrich C5670-500G
Collagenase, Type 1A Sigma-Aldrich C-2674 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.
DakoCytomation Dako x0909
DAPI
Dispase Grade II Roche Diagnostics 165859
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum VMR 97068-085 Premium Grade
Fiji (ImageJ) NIH Free for downloading, no license needed.
IncuCyte Zoom 2016A Essen Bioscience
IncuCyte Zoom System Essen Bioscience
Insulin Sigma-Aldrich I1882
L-15 Medium (Leibovitz) Sigma-Aldrich L1518
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope Leica
MCDB 153 Medium Sigma-Aldrich M7403-10X1L
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone Abcam ab18640
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX51
Olymupus CellSens Olympus
PD0325901 Selleckchem Chemicals S1036
Penicillin Streptomycin Solution Corning 30-002- CI 100 X
Sodium Bicarbonate 7.5% Corning 25-035-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).
  2. Anton, K., Glod, J. Targeting the tumor stroma in cancer therapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  4. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  5. Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
  6. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  7. Lynch, C. C., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation. 70, 561-573 (2002).
  8. Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).
  9. Olumi, A. F., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).
  10. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  11. Luga, V., et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration. Cell. 151, 1542-1556 (2012).
  12. Zhang, X. H., et al. Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma. Cell. 154, 1060-1073 (2013).
  13. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
  14. Shao, H., et al. Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1. Oncogene. 30, 4316 (2011).
  15. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontier in Immunology. 9, 414 (2018).
  16. Kraman, M., et al. Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha. Science. 330, 827-830 (2010).
  17. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
  18. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).
  19. Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. Melanocytes: from morphology to application. Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).
  20. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling melanoma in vitro and in vivo. Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).
  21. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
  22. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17, 1-15 (2015).
  23. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).
  24. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).
  25. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).
  26. Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids. Scientific Reports. 7, 16645 (2017).
  27. Lazzari, G., et al. Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity. Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).
  28. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  29. Gu, L., Mooney, D. J. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).
  30. Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment. Advanced Biosystems. 1, (2017).
  31. Welch, D. R., et al. Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line. International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).
  32. Balint, K., et al. Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression. Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).
  33. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).
  34. Du, Y., et al. Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells. Stem Cells. 37, 865-875 (2019).
  35. Shao, H., et al. Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion. PLoS One. 10, 0142815 (2015).
  36. Shao, H., et al. Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis. Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).
  37. Kalluri, R., Neilson, E. G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).
  38. Price, J. E. Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models. Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).
  39. Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4, 4992 (2009).

Tags

Kreftforskning Utgave 156 3D tumor sfæroid modell tumor sfæroider multicellulære 3D-sfæroider tumorstamceller melanom initierende celler (MIC) kreftassosiertfibroblaster (CAF) tumorstromal fibroblaster tumor-stromal interaksjon tumor mikromiljø (TME)
En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shao, H., Moller, M., Wang, D.,… More

Shao, H., Moller, M., Wang, D., Ting, A., Boulina, M., Liu, Z. J. A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery. J. Vis. Exp. (156), e60660, doi:10.3791/60660 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter