Summary
En ny tre-dimensionel sfænode model baseret på den heterotypic interaktion af tumorceller og stromale fibroblaster er etableret. Her præsenterer vi coculture af tumorceller og stromale fibroblaster, time-lapse imaging, og konfokal mikroskopi til at visualisere dannelsen af sfæller. Denne tre-dimensionelle model tilbyder en relevant platform til at studere tumor-stroma interaktioner og teste kræft terapeutiske.
Abstract
Tumor-stroma interaktioner spiller en vigtig rolle i kræft progression. Tre-dimensionelle (3D) tumor sfænoide modeller er de mest udbredte in vitro model i studiet af kræft stamceller / indlede celler, præklinisk kræft forskning, og narkotika screening. 3D sfænoide modeller er bedre end konventionelle tumor celle kultur og gengive nogle vigtige tegn på reelle solide tumorer. Men, konventionelle 3D tumor sfænoider består udelukkende af tumorceller. De mangler deltagelse af tumor stromale celler og har utilstrækkelig ekstracellulær matrix (ECM) deposition, således kun delvist efterligne in vivo betingelser for tumorvæv. Vi etablerede en ny multicellulær 3D sfærisk model bestående af tumorceller og stromale fibroblaster, der bedre efterligner in vivo heterogene tumor mikromiljø og dens indfødte desmoplasi. Dannelsen af sfæroider er strengt reguleret af tumor stromale fibroblaster og bestemmes af aktiviteten af visse afgørende intracellulære signalering veje (f.eks Notch signalering) i stromale fibroblaster. I denne artikel præsenterer vi teknikker ne til samkultur af tumorceller-stromale fibroblaster, time-lapse billeddannelse for at visualisere cellecelleinteraktioner og konfokale mikroskopi for at vise 3D-arkitektoniske træk ved sfællerne. Vi viser også to eksempler på den praktiske anvendelse af denne 3D sfænode model. Denne nye multicellulære 3D sfærisk e-model tilbyder en nyttig platform for at studere tumor-stroma interaktion, belyse, hvordan stromale fibroblaster regulere kræft stamceller / indlede celler, som bestemmer tumor progression og aggressivitet, og udforske inddragelse af stromale reaktion i kræft narkotika følsomhed og resistens. Denne platform kan også være en relevant in vitro model for narkotika opdagelse.
Introduction
Solide tumorer repræsenterer komplekse væv bestående af neoplastiske celler og et stort udvalg af stromale celler1,2,3,4. Stromal fibroblaster, eller kræft-associerede fibroblaster (CAF), er en af de fremtrædende stromale cellepopulationer i de fleste typer af faste tumorer. De er kritisk involveret i reguleringen af tumorvækst, stængelitet, metastase, angiogenese, og resistens gennem produktion af vækstfaktorer, cytokiner / chemokiner, syntese af ECM og remodeling enzymer (f.eks kollagen, fibronectin, og matrix metalloproteases), frigivelse af exosomer, og direkte heterotypic cellecelle interaktion5,6,7,8,9,10 11,11 . CAF deltager også i fastsættelsen af kræft organspecifikke metastase ved at forhåndsvælge en delmængde af tumor kloner fra heterogene tumor celle populationer i den primære læsion og fremme disse udvalgte kloner, der skal primes for metastase til en bestemt fjern organ, hvis mikromiljø er optimal til genkolonisering af udvalgte kloner12. Desuden fibroblaster og deres udskillede opløselige faktorer og ECM deltage i graduering af tumor angiogenese13,14, anti-tumor immunrespons15,og er endda involveret i resistens over for lægemidler og tumor gentagelse16,17.
In vitro 3D tumor sfænoide modeller er blevet udviklet og brugt i kræftforskning som en mellemliggende model mellem in vitro kræft celle kulturer og in vivo tumor modeller18,19,20,21. 3D tumor sfænoide modeller har vundet popularitet i kræft stamcelleforskning, præklinisk kræft forskning, og narkotika screening, fordi disse modeller reproducere nogle vigtige funktioner i reelle tumorer, der er fraværende i traditionelle 2D monolag22. Mange eksisterende 3D tumor sfænoide modeller er udelukkende består af tumorceller og mangler deltagelse af tumor stromale celler. Dette resulterer ofte i tumor sfænoider har utilstrækkelig ECM deposition og fravær af heterotypic celle-celle interaktioner. Konventionelle 3D sfænoider dannet udelukkende af kræftceller og enslypisk celle-celle vedhæftning kan kun delvist efterligne in vivo betingelser for tumorvæv. For at overvinde nogle af disse begrænsninger, efterforskere har foreslået at indarbejde flere typer af stromale celler i 3D cocultures og udviklet flere heterotype 3D tumor sfænode modeller23,24,25,26,27. Desuden har efterforskere ansat udefrakommende 3D matricer, herunder naturlige hydrogels eller syntetiske polymerer såsom polyethylen glycol, poly (lactide-co-glycolide), og poly (N-isopropylacrylamid), at integrere monocellulære og flercellede sfænode modeller, skabe en celle-støttende miljø og reproducere celle-matrix interaktioner28,29, hvilket gør disse systemer mere biologisk relevante30. Men inkorporering af visse typer af stromale celler, såsom endotelceller, i 3D-cokulturer medfører yderligere kompleksitet for et in vitro-system og gør det vanskeligt at studere heterotypic cellecelle interaktioner mellem to specifikke typer af celler, såsom kræft celle-fibroblast interaktioner. Desuden, endotelceller i virkelige væv ikke altid direkte interagere med kræftceller og andre stromale celler, fordi der er et lag af kælderen membran indpakket uden for kapillærer, der forhindrer endotelceller fra direkte interagere med kræftceller og andre stromale celler. I disse 3D sfæroide modeller, indarbejdet endotelceller faktisk ikke danner blodkar, men interagerer direkte med kræftceller og andre stromale celler, noget, der sjældent forekommer in vivo. Tilsvarende, udefrakommende matricer ansat i nogle af de 3D sfænode modeller er ikke identiske med ECM i reelle tumorvæv med hensyn til struktur og sammensætning. Alle disse kunstige tilstande kan resultere i vildledende data.
Vi har for nylig skabt en ny multicellulær 3D sfænode model bestående af tumorceller og CAF. I vores model, dannelsen af 3D tumor sfænoider er helt bestemt af CAF. CAF fremkalde og regulere fænotype af tumor stamceller / indlede celler. Den ECM produceret af CAF er naturligt og gør det muligt for desmoplastiske struktur til bedre at efterligne in vivo tumor mikromiljø. Denne nye 3D-model kan være et nyttigt redskab til kræft stof screening og tilbyder en unik platform til at studere tumor-stroma interaktion, belyse, hvordan CAF regulere kræft stamceller / indlede celler, og udforske inddragelsen af stromale interaktioner i kræft narkotika følsomhed og resistens.
Protocol
1. Dyrkning melanom celler og hud fibroblaster
- Dyrkning af humane melanomceller
- Kultur menneskelige melanom celler, C816131 under konventionelle klæbende cellekultur betingelser i komplet W489 medium (se trin 1,2) i en 37 °C inkubator forsynet med 5% CO2 som beskrevet tidligere32. Opdel cellerne ved et 1:5-forhold, når de når ~90% sammenløb.
- Melanom celle kultur medium (W489)
- For komplet W489 medium, brug 80% MCDB153 medium, 20% L-15 medium (se Tabel over materialer),2% føtal kvæg serum (FBS), 5 μg/ml insulin, 1,68 mM CaCl2, og 0,11% natriumbikarbonat. For coculture, tilsæt ikke FBS, insulin, og CaCl2.
- Mus hud fibroblast isolation
- Skær et 1 cm x 1 cm hudfragment fra en mus i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og bestemmelser i institutionens Udvalg for Dyrepleje og -Anvendelse (IACUC).
- Huden fordøjes ved dispase (se Materialetabellen)ved 4 °C natten over. Strip dermis fra epidermis og yderligere fordøje med kollagen (1 mg/ml i DMEM, se Tabel over materialer)ved stuetemperatur (RT) natten over.
- Mus hud fibroblast dyrkning
- Vævspillerne vaskes med PBS og kultur dem i DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i 37 °C/5% CO2. Opdel cellerne ved et 1:2-forhold, når de når ~90% sammenløb.
- Transduce huden fibroblaster med GFP / lentivirus ved hjælp af standard metoder før coculture.
- Karakterisering af musehud fibroblaster ved immunfarvning
- Celleforberedelse til farvning
- Frø huden fibroblaster i 24 godt plade ved en tæthed på 2 x 104 celler / godt. På dag 2 vaskes cellerne med PBS 2x og fastgør dem i 2% neutral buffered formalin i 10 min. Fjern formalin og vask de faste celler med PBS to gange.
- Immunfarvning
- Der tilsættes 200 μL blokeringsopløsning til hver brønd og inkuberpladen i 30 min ved RT, tilsæt derefter mus anti-α-SMA fortyndet ved 1:200 og inkuberes ved 37 °C i 1 time. Vask med PBS 3x, 5 min hver.
- Tilsæt Alex Fluor 488 gede anti-mus IgG på 1:400 fortynding og inkubere på RT i 1 time. Vask antistofferne 3x med PBS, 5 min hver.
- Tilsæt 1 μg/mL DAPI og inkuber estorer ved RT i 2 min. Fjern DAPI-opløsningen, og der tilsættes 500 μL PBS i hver brønd.
- Overhold cellerne og tag billeder ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop.
- Celleforberedelse til farvning
- Formærkning fibroblaster og melanom celler
- Frø fibroblaster i en 100 mm fad på dag 1, således at cellen sammenløb når ~ 60% den næste dag. På dag 2 fjernes dyrkningsmediet og tilsættes GFP/lentivirus (~1:3-1:5 fortyndet fra lager) til almindeligt kulturmedium med 4 μg/ml polybrene. Inkuberceller i en 37 °C-inkubator i 6 timer, fjern mediet og udskift med frisk almindeligt kulturmedium. Efter 2 dage skal du observere GFP-signalet fra cellerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Transduce C8161 celler med DSRed/lentivirus under lignende forhold. Protokollerne til fremstilling af GFP/lentivirus og DsRed/lentivirus er beskrevet tidligere14,34.
2. Cellecokultur
- Frø C8161-fibroblast coculture.
- På dag 0 i sfæroide dannelse assay, løsrive både C8161 og huden fibroblaster ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA. Spin ned cellerne ved 250 g i 5 min på RT og vask en gang med PBS.
- Opslæm cellerne i cellecokulturmedium (serumfrit, insulinfrit og calciumfrit W489 medium blandet med serumfri DMEM ved et 1:1-forhold). Cellekoncentrationen justeres til 2 x 104 celler/ml.
- Bland C8161-cellerne med fibroblasterne ved et 1:1-forhold, og tilsæt 2 ml af celleblandingerne til hver brønd af en 24 brøndplade. Hver brønd skal indeholde 2 x 104 af hver type celler. Hver betingelse skal ske i treeksemplarer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge en ikke-vævskulturbehandlet plade (se Tabel over materialer). Ellers vil cellerne kraftigt knytte til en plade og være ude af stand til at fra at suspendere sfænoider.
- Inkuberceller ved 37 °C i 4 timer, indtil cellerne tillægger pladen, og udfør derefter tidsforskydningsscanning eller konfokalscanning ved de angivne tidspunkter for hver analyse.
3. Live Cell Time-lapse Imaging
- Før samkultur skal du tænde for tidsforskydningsbilledsystemet (se Materialetabellen)efter fabrikantens anvisninger og lade rugemaskinen nå 37 °C og 5% CO2. Det tager normalt 1 time for systemet at nå ligevægt. Anbring forsigtigt kulturpladen på mikroskopets fase inde i rugemaskinen, og lås døren sikkert.
- Åbn softwaren til time-lapse imaging system (se Tabel over materialer)og vælg pladetype og producent, så mikroskopet kan finde scanningsområdet præcist. Vælg brønde af interesse og en 10x objektivlinse. Vælg indstillingerne for scanningsområdet, intervaltiden mellem scanningerne og en start tid samt en sluttidspunkt. I denne protokol er det maksimale formatnummer for scanningsområdet for 1 brønd 36, og intervaltiden er 1 time.
- Optag tidsforskydninger fra 4-52 timer.
BEMÆRK: Starttidspunktet, sluttidspunktet og varigheden skal optimeres efter celletype og forsøgets formål. - Når du fuldfører billedoptagelsen, skal du bruge systemsoftwaren til timelapse-billedbehandling til at hente dataene og eksportere videoer eller billedsæt.
4. Konfokal mikroskopi og 3D-film
- Placer cellekokpladen på scenen af et omvendt fluorescensmikroskop (se Materialetabel)og brug røde og grønne laserstråler. Overhold cellerne under en 5x eller 10x objektiv og vælg en sfænode at begynde at scanne.
- Brug et 1 μm z-trin til at scanne fra bunden til toppen af sfællende. Behandl dataene ved hjælp af billedbehandlingssoftware (se Tabel over materialer)for at rekonstruere et 3D-billede, der kan roteres yderligere og gemmes som en 3D-film.
5. Solo Kultur af melanom celler og dannelse af 2D-klynger / aggregater
- Frø 2 x 104 C8161 melanom celler i hver brønd af en 24 godt plade som beskrevet i afsnit 2.1. Kultur cellerne i 7-10 dage og fotografere dem ved hjælp af en omvendt fluorescens mikroskop.
6. Kontrol af, om 3D Spheroids og 2D-celleklynger/aggregater er ophængt i mediet eller fastgjort til pladerne
- For cellecokultur skal du kontrollere de 3D-sfænoider, der dannes på dag 7. For enkeltcellekultur skal du kontrollere de 2D-klynger/aggregater, der dannes på dag 10.
- Sæt cellekulturplader på platformen af et omvendt fluorescensmikroskop. Sæt en bøjet nål med en sprøjte i en brønd og forsigtigt aspirekulturmediet ind og ud for at forstyrre kulturmediet i brøndene. Optag denne proces ved hjælp af filmtilstanden i filmsoftwaren (se Materialetabel). 3D sfænoider vil være mobile, men 2D celle klynger / aggregater vil forblive standhaftige.
7. Konfokale Billede af 3D Spheroids
BEMÆRK: Cocultured celler begynder at danne sfæroider fra 48-72 h afhængigt af typen af fibroblaster anvendes. Generelt, sfæroider forstørre gradvist med tiden. Små sfænoider kan smelte til at danne større sfænoider indtil dag 7. Efter sfænoider er stabiliseret i størrelse, kan de vare mere end 10 dage. Efter at sfæroider ofte løsrive sig fra bunden af kulturpladen og samles i midten af brøndene. Under udvidelsen af sfænoider, cellerne i centrum normalt dør på grund af utilstrækkelig ernæring og / eller en giftig mikromiljø. Derfor bør toppen af 3D sfæroide dannelse og timing til billedet de modne sfænoider optimeres ved hjælp af piloteksperimenter. For denne protokol, konfokal mikroskopi blev udført omkring dag 7, når sfænoider var modne og cellerne i midten af sfænoider var stadig i live i henhold til fluorescens og morfologi af cellerne i midten.
- For at gøre konfokale mikroskopi, bruge en grøn og rød laser til at scanne sfænoider. Bestem scanningsområdet under et 10x mål, og flyt fra bunden til toppen af sfællende med et 1 μm z-trin.
- Generer 3D-spheroiddannelses- og rotationsvideoerne ved hjælp af 3D-projektionsfunktionen i billedbehandlingssoftwaren (f.eks. ImageJ).
8. Intracellulære Notch1 Signalering Pathway Aktivitet i fastsættelsen stromal regulering af kræft stamceller / indlede celler
- Isolation og karakterisering af hudfibroblaster fra gain- og tab-of-funktion Notch1 mus
- Isoler hudfibroblaster fra to par genetisk modificerede mus: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus versus deres modstykkekontrol (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus og Tab-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) mus versus deres modstykke kontrol (LOFctrl: FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) mus31. Isolere og karakterisere hudfibroblaster ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i afsnit 1.3-1.5.
- Transduce musen hud fibroblaster med GFP / lentivirus.
- Se afsnit 1 for at få metoden til at transducecellerne med den lentivirale vektor.
- Cokultur af fibroblaster og melanom celler
- Udfør cellekokeksperimentet som beskrevet i afsnit 2.
- Vurdering af effekten af intracellulære Notch1 vej aktivitet i fibroblaster på bestemmelse af stromale regulering af kræft stamceller / indlede celler ved at måle størrelsen af 3D sfæller
- Udfør kvantificeringen af sfæroide dannelse under hver betingelse ved at fotografere sfællerne på det tidspunkt, hvor sfænoider er modne (angivet ved stop af vækst omkring dag 5-7 afhængigt af de typer af fibroblaster). Mål størrelsen på 3D-sfænoiderne ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren.
9. Test af Drug Response af Kræft Stem / indlede celler ved hjælp af 3D Spheroid Assay
BEMÆRK: CAF kan regulere kræft heteroegenhed og fremkalde fænotype af kræft stamceller / indlede celler. CAF støtter også kræft stamceller / indlede celler til at udholde kliniske behandlinger. Kræft stamceller har vist sig at være ansvarlig for resistens over for lægemidler. Derfor brugte vi denne 3D sfænoide model til at evaluere lægemiddelrespons af kræft stamceller / indlede celler. Resultatet kan vurdere potentielle kliniske effekt af anti-cancer medicin godt.
- Administration af lægemidler
- Lige efter at have samlet cellerne i en 24 brøndplade, forberedes lægemidlerne i en seriel fortynding i kulturmedium for at nå 5x af et ønsket koncentrationsområde baseret på pilotforsøg (dvs. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM og 25 nM).
Tilføj 0,5 ml tilsvarende lægemiddelløsninger til hver brønd af de cokulturuerede celler. Behandl kontrolgruppen med regelmæssige coculture-medier som nævnt ovenfor. - BEMÆRK: MEK-hæmmer er opløselig i cellekulturmedier. Derfor er blindkontrol 2,5 ml cellekulturmedium. Men hvis lægemidlet ikke er opløseligt i vandig opløsning og kræver opløsningsmidler såsom DMSO, så cellekultur medier med samme koncentration af DMSO bør anvendes på kontrolgruppen.
- Lige efter at have samlet cellerne i en 24 brøndplade, forberedes lægemidlerne i en seriel fortynding i kulturmedium for at nå 5x af et ønsket koncentrationsområde baseret på pilotforsøg (dvs. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM og 25 nM).
- Kvantificering af lægemiddelrespons ved at tælle sfæroider
- Overhold de behandlede celler og ubehandlede celler ved hjælp af et fluorescensmikroskop, og fotografer cellerne hver dag. Kvantificer sfænoide formation i de forskellige eksperimentelle grupper og sammenligne sfæroide-dannende evne cellekulturer under forskellige lægemiddelkoncentrationer.
BEMÆRK: Sfænoiderne har tendens til at blive vist ~5−7 dage efter samkulturen. Narkotikavirkningerne vil blive mærkbare på det tidspunkt. - Brug fluorescensmikroskop til at afbilde/fotografere sfællerne og cellerne i brøndene, og brug derefter billedsoftwaren til at beregne den gennemsnitlige størrelse af sfællerne og antallet af sfænoider, der dannes pr. lavt strømfelt (LPF x 4) i hver behandlingsgruppe over tid.
BEMÆRK: Celler, der modtager effektiv lægemiddelbehandling, bør danne færre eller ingen sfæroider sammenlignet med kontrolgruppen. Dette er en indikation af det testede lægemiddels effektivitet på at undertrykke kræftstamceller.
- Overhold de behandlede celler og ubehandlede celler ved hjælp af et fluorescensmikroskop, og fotografer cellerne hver dag. Kvantificer sfænoide formation i de forskellige eksperimentelle grupper og sammenligne sfæroide-dannende evne cellekulturer under forskellige lægemiddelkoncentrationer.
Representative Results
Vi udviklede en ny metode til at generere 3D sfæroider med en in vitro heterotypic celle coculture system, der efterligner in vivo tumor mikromiljø. Fibroblaster er afledt af musen hud fibroblaster. Hudfibroblaster blev genereret som beskrevet ovenfor og blev karakteriseret som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler. Humane metastatiske melanomceller (C8161) blev dyrket i W489 medium som beskrevet32. At visualisere og skelne fibroblaster fra tumorceller, fibroblaster og melanom celler blev prætransduceret med GFP / lentivirus og DsRed / lentivirus, henholdsvis34,36, før celle coculture.
Figur 1 viser et eksempel på flercellede 3D-sfæller dannet ved at sammenblande melanomceller og fibroblaster. Melanom celler dyrket i mangel af fibroblaster ikke danne typiske 3D sfæroider, selv om nogle melanom celler danner 2D klynger / aggregater med den udvidede kultur. Den gennemsnitlige størrelse af sfænoider var ca. 170-360 μm i diameter (gennemsnit = 275, SD = 37) på dag ~5−7. Ved hjælp af time-lapse imaging, bemærkede vi, at fibroblaster og tumorceller interagerede i coculture og begyndte at danne 3D sfænoider på omkring 36 timer af coculture som vist i Video 1. Time-lapse imaging registreres den dynamiske proces med celle-celle interaktion og den indledende fase af sfænode dannelse på ~ 4-52 h af coculture. Toppen af 3D sfæroide dannelse opstod omkring dag ~ 5−7. De dannede 3D sfæroider var sammensat af fibroblaster og melanom celler, hvor de fleste (~ 80%) tumorceller. Video 2 viser den dynamiske proces med enkeltkulterede melanomceller (DsRed+/C8161) i dannelsen af celleklynge/aggregater fra ~4-52 h i en enkelt kultur. Dannelsen af 2D-klynger/aggregater toppede omkring dag ~7-10. Video 3 og Video 4 viser strukturerne i en 3D sfænode og en 2D tumor celle klynge visualiseret af konfokale mikroskopi, henholdsvis. 3D sfæroide og 2D tumor celle klynger blev undersøgt af konfokal mikroskopi på dag 7 af celle coculture. Video 5 viser, at 3D sfænoider blev suspenderet i kulturmediet og mobilen, mens Video 6 viser, at 2D tumorcelleklyngen var knyttet til kulturpladen og immobile. Suspension i mediet er en funktion af 3D sfæroider, der adskiller dem fra 2D-klynger. Når mediet i cellekulturskålen eller brønden forstyrres af enten at tabe eller forsigtigt pipettere kulturmediet, bevæger de suspenderede 3D-sfæider sig, mens 2D-celleklynger er immobile. Kun få døde celler er mobile.
Figur 2A viser et eksempel på denne 3D-model, der tjener som en unik platform til at studere tumor-stroma interaktioner og til at belyse, hvordan intracellulære Notch1 signalering vej aktivitet i CAF regulerer kræft stamceller / indlede celler og sfærode dannelse. To par fibroblaster (Fb) isoleret fra huden af Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus versus deres modstykkekontrol (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) mus og Tab-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) mus versus deres modstykke kontrol (LOFctrl: FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) mus35,hhv. Alle fibroblaster blev transduceret af GFP/lentivirus og cocultured med C8161 melanomceller prætransduced med DSRed/lentivirus. Time-lapse imaging viser, at Fb-GOFNotch1 stoppede C8161 melanom celler fra danner 3D sfæroider i forhold til Fb-GOFctrl i løbet af de første ~ 4-52 h af celle coculture. I modsætning hertil forfremmet Fb-LOFNotch1 dannelsen af 3D-sfæller af C8161 melanomceller sammenlignet med Fb-LOFctrl. Figur 2B, top, viser repræsentative billeder af 3D sfænoider dannet på dag 7 af celle coculture med forskellige fibroblaster udfører varierede Notch pathway aktiviteter. Figur 2B, nederst, viser de kvantitative data om den gennemsnitlige størrelse af 3D sfæller dannet på dag 7 af celle samkultur med forskellige fibroblaster transporterer varieret Notch vej aktiviteter.
Figur 3 viser et eksempel på, at denne 3D-model bruges til at teste lægemiddelresponsen af kræftstamceller/initiatingsceller. Kræft stamceller / indlede celler har vist sig at være ansvarlig for resistens over for lægemidler og kræft tilbagefald. Derfor, evaluere lægemiddelrespons ved hjælp af denne 3D-model kan bedre afsløre et potentielt lægemiddel kliniskeffekt til kræftbehandling. C8161 melanomceller er afhængige af aktiv MAPK signalering for cellevækst og invasion. De udtrykker også høje niveauer af CDK4/Kit, men bærer ikke en BRAF-mutation. For at teste lægemiddelresponsen af kræftstamceller/initierende celler mod MAPK-hæmmeren ved hjælp af denne 3D-model, vi cocultured C8161 melanom celler og fibroblaster i 24 godt plader. PD0325901 (se Tabel over materialer),en MAPK-hæmmer, blev fremstillet i en seriel fortynding ved en række koncentrationer fra 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM og 25 nM. PD0325901 blev tilføjet til cellecokulturerne, da celleblandinger blev belagt. Ubehandlede cokulturerede celler blev brugt som kontrol. Vi evaluerede cellens sfænoide evne under forskellige lægemiddelkoncentrationer og sammenlignede den med den ubehandlede kontrol. Figur 3A viser repræsentative billeder af 3D sfæller dannet på dag 5 af celle coculture under forskellige lægemiddelkoncentrationer. Figur 3B er de kvantitative data for den gennemsnitlige størrelse pr. sfænode og antallet af 3D-sfæller dannet pr. lavt effektfelt (LPF x 4) på dag 5 af cellekokik under forskellige lægemiddelkoncentrationer.
Figur 1: Dannelse af 3D-sfænoider og 2D-klynger. (A) Repræsentativt billede af 3D sfænoider dannet af coculture af humane C8161 melanom celler og mus hud fibroblaster. 3D sfænoider blev fotograferet på dag 7 af coculture af melanom celler og fibroblaster. De gennemsnitlige størrelser af sfænoider var ~ 170-360 μm i diameter (gennemsnit = 275, SD = 37) på dag ~ 5−7. Det gennemsnitlige antal sfænoider var 18-26 (20,5 ± 3,6) pr. lavt effektfelt (LPF x4). (B) Repræsentativt billede af 2D tumorcelleklynger dannet af en enkelt kultur af C8161 melanomceller. De 2D melanom celle klynger blev fotograferet på dag 7 af en enkelt kultur af melanom celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Belysning af den rolle, som intracellulære Notch1 signalering vej aktivitet i CAF i reguleringen af kræft stamceller / indlede celler ved hjælp af 3D sfænode model. (A) Intracellulære Notch1 signalering vej aktivitet i CAF bestemmes dannelsen af sfænoider ved melanom celler i celle cokultur. Time-lapse video viser, at Fb-GOFNotch1 stoppede dannelsen af 3D sfæller af C8161 melanom celler, mens Fb-LOFNotch1 fremmes dannelsen af flere 3D sfæller af C8161 melanom celler i løbet af de første 4-52 h af celle cokultur. (B) Top: Repræsentative billeder af 3D sfænoider dannet på dag 7 af celle coculture med forskellige fibroblaster transporterer varieret Notch vej funktioner. Bund: De kvantitative data for den gennemsnitlige størrelse (diameter [μm]/sfælle) af de 3D-sfæller, der dannes på dag 7 af cellekokik med forskellige fibroblaster, der transporterer forskellige Notch pathway aktiviteter. Den to-hale studerendes t-test blev brugt til statistisk analyse. Data udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af lægemiddelrespons af kræftstamceller/initierende celler ved hjælp af 3D-sfælloidmodellen. (A) Repræsentative billeder af 3D sfænoider dannet på dag 5 af celle coculture under forskellige stofkoncentrationer. (B) De kvantitative data for gennemsnitsstørrelsen (diameter [μm]/sfænode) og antallet af 3D-sfæller pr. lavt effektfelt (LPF x 4), der dannes på dag 5 af cellekokik under forskellige lægemiddelkoncentrationer. Kvantitative data udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Dynamisk dannelsesproces af 3D-sfænoider i den tidlige fase af cellekok. Time-lapse imaging viser dynamiske cellecelle interaktioner mellem fibroblaster og tumorceller i cokultur og dannelse af 3D sfænoider i løbet af de første ~ 4-52 h af celle coculture. Cellerne begyndte at danne 3D sfænoider omkring 48 timer efter starten af coculture. Toppen af 3D sfænode dannelse forekom på dag ~ 5−7 (ikke vises her). 3D-sfænoiderne bestod af fibroblaster og melanomceller, hvor størstedelen (~80%) tumorceller. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Dynamisk dannelsesproces af 2D-klynger i den tidlige fase af cellekokkultur. Time-lapse imaging viser den dynamiske proces med 2D-klynger dannet af C8161melanoma celler i enkelt kultur. Dannelsen af 2D-klynger fandt sted omkring dag ~7-10. Time-lapse imaging registrerer perioden på ~ 4-52 h i enkelt kultur af DsRed+/ C8161 melanom celler. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Arkitektur og rotation af en 3D sfærisk som visualiseret af konfokal mikroskopi. Arkitektur og rotation af en 3D sfærisk. Grønne og røde lasere blev brugt til at scanne sfænoider dannet på dag 7 i celle coculture. Scanningsområdet blev fastsat under et 10x mål. Scanningen starter fra bunden til toppen af sfællende ved et 1 μm z-trin. 3D sfænoide rotation film blev oprettet ved hjælp af Fiji software. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: Arkitektur og rotation en 2D tumor celle klynge som visualiseret af konfokal mikroskopi. Arkitektur og rotation af en 2D-klynge. Konfokale billeder af celleklynger blev taget på dag 7 af melanom celle enkelt kultur. Scanningsområdet blev fastsat under et 10x mål. Scanningen starter fra bunden til toppen af sfællende ved et 1 μm z-trin. 2D klynge rotation film blev oprettet ved hjælp af Fiji software. Klik her for at downloade denne video.
Video 5: Flytning af 3D sfænoider. 3D sfænoider blev suspenderet i kulturmediet og overholdt ikke kulturskålen/brønden. Når stadig medium i cellekulturen godt blev forstyrret af blid pipetting, de suspenderede 3D sfænoider flyttet. Klik her for at downloade denne video.
Video 6: Standhaftighed af 2D tumor celle klynger. 2D tumor celle klynge var forankret til kulturplade og immobile på trods af forstyrrelse af kulturmediet. Et par døde celler var mobile. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
In vitro 3D celle kultur teknikker har været meget anvendt i årtier i kræftforskning. Sammenlignet med konventionelle 2D celle kultursystemer, 3D mikromiljø opsummerer celle-celle og / eller celle-matrix interaktioner og gør det muligt efterligne de ægte betingelser observeret i tumorvæv. Men, et 3D-system dannet kun af kræftceller og enslydecelle-celle interaktioner tager ikke hensyn til betydningen af heterotypic cross talk og kan give unøjagtige resultater i forskning. Vi har for nylig udviklet et nyt 3D-system, der kombinerer kræftceller og CAF til bedre at efterligne in vivo heterogene tumor mikromiljø og dens indfødte og stive desmoplastiske reaktion.
Fibroblaster er vigtige komponenter i tumor stroma. CAF er involveret i reguleringen af tumor progression ved at fremkalde opløselige faktorer, ECM / remodeling enzymer10,11,og exosomer. Derudover, CAF spiller en rolle i resistens over for lægemidler og tumor tilbagefald16,17. Vores multicellulære 3D sfærode system kan udnyttes til at udforske molekylære mekanismer af tumor-stromale interaktioner og til at løse resistens over for lægemidler og tumor gentagelse. CAF er primært afledt af aktiverede lokale quiescent fibroblaster og rekrutteret cirkulerende knoglemarv MSC, som gennemgår in situ differentiering i CAF i tumorvæv37,38,39. I den nuværende undersøgelse, vi brugte hud fibroblaster til at skabe en multicellulær 3D sfænode model. Men, anden type fibroblaster (f.eks MSC-DF), også arbejde på en meget lignende måde som hud fibroblaster til at regulere tumorcelle 3D sfænode dannelse34. MSC-DF kan genereres fra murine knoglemarv MSC, som er beriget med dyrkning knoglemarvmononukleare celler i MSC celle kultur medium for omkring 10 dage med periodiske medium ændringer hver 3 dage. Disse MSC er karakteriseret som CD73+/CD105+/Lin-. For at differentiere MSC i fibroblaster, MSC er efterfølgende dyrket med komplet DMEM i yderligere 2 uger. MSC-DF er karakteriseret som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler36. MSC-DF kan være vigtige tumor regulatorer. Fordi en brøkdel af CAF i mange typer af faste tumorer er differentieret fra rekrutteret cirkulerende MSC frigivet fra knoglemarv36,MSC-DF kan være lovende behandlingsmål. De er også meget lettere terapeutisk manipuleret eller målrettet, før de rekrutteres til tumorvæv og differentieret i CAF. Således tilbyder vores 3D-model et ideelt system til at studere og teste ikke kun kræftceller, men også forskellige fraktioner eller delpopulationer af CAF. Metoden til 3D sfærode dannelse er ligetil. De kritiske trin omfatter brug af serum fri medium for coculture, anvende det rigtige forhold mellem fibroblaster til tumorceller, og ved hjælp af de rigtige kulturplader til coculture. Den potentielle begrænsning af vores metode er, at dannelsen af 3D sfæroider er stort set kræft celle linje-afhængige. Vores sfænode dannelse protokol kan kræve optimering af forholdet mellem fibroblaster og kræftceller, hvis forskellige kræft cellelinjer er ansat. Det skal bemærkes, at vi brugte en menneskelig melanom celle og mus fibroblast celle coculture model til dannelsen af 3D sfænoider, fordi det er meget lettere at skabe GOF eller LOF celler i mus fibroblaster til undersøgelse af den rolle, et molekyle eller signalering vej i reguleringen tumor sfænode dannelse. Evnen af menneskelige melanom celler og mus fibroblaster til at danne sfæroider indikerer, at molekyler, der kræves for celle-celle kommunikation arbejde på tværs af arter. Vi har for nylig testet cokultur af menneskelige fibroblaster med menneskelige melanom celler og fandt, at menneskelige fibroblaster også kan regulere menneskelige melanom celler til at danne 3D sfænoider.
Vi anvendte humane metastatiske melanomceller, C8161, i vores multicellulære 3D sfænode model. Vi har også testet andre humane melanom celler, for eksempel, 1205Lu32, som bærer BRAFV600E mutation, og MeWo, som udtrykker høje niveauer af CDK4/ Kit (ATCC HTB-65), og fandt, at de også er i stand til at danne 3D sfænoider i coculture. Dette indikerer, at dannelsen af 3D sfænoider af tumorceller er uafhængig af de typer af onkogenmutationer. Selv om vi ikke har testet, om andre typer af ikke-melanom tumorceller er i stand til at danne 3D sfænoider med fibroblaster, vores resultater viser, at dannelsen af 3D sfænoider ikke er begrænset til en melanom cellelinje og kan ikke afhænge af en bestemt kræft cellelinje.
Vi viste to eksempler på praktiske anvendelser af vores 3D sfænode model. Et eksempel var at belyse den intracellulære Notch signalering vej aktivitet i reguleringen af kræft stilken / indlede celle fænotype og 3D sfænode dannelse. Vi viste, at den intracellulære Notch signalering vej i CAF er en molekylær switch, der styrer fænotype af kræft stamceller / indlede celler ved hjælp af denne 3D sfænode model. Vores resultater ikke kun afdække en molekylær mekanisme underliggende stromal regulering af kræft stamceller / indlede celler og kræft heterogenicity, men også fremhæve, at Notch vej i CAF er et kritisk mål for melanom terapeutiske. Dette eksempel viser, at vores 3D sfærode model er meget nyttigt at studere mekanismerne for kræft celle-stromale fibroblast interaktioner og identificere potentielle terapeutiske mål. Et andet eksempel var at teste lægemiddelrespons af kræft stamceller / indlede celler i overværelse af CAF. Det er velkendt, at lægemiddelrespons af kræftceller, herunder kræft stamceller / indlede celler, varierer i nærvær og fravær af CAF. Tilstedeværelsen af CAF i dette in vitro-system gør denne model mere klinisk relevant og genererede testresultater mere pålidelige. Desuden er vores 3D-sfænode system alsidigt. Det kan bruges til forskellige formål. For eksempel, hvis resistente kræftceller er ansat i denne 3D-model, Det kan ændres til at løse resistens over for lægemidler og måske tumor recidiv. Det kan også ændres til at teste eller screene lægemidler, der primært målrette CAF for kræftbehandling. CAF er for nylig blevet lovende terapeutiske mål. Der er fordele ved at målrette CAF. For det første, sammenlignet med tumorceller, der er unormale (ofte med genetiske ændringer) og smart (let få resistens over for kemo- og strålebehandlinger), CAF i tumorvæv er normale celler og genetisk mere stabil, så de er mindre tilbøjelige til at udvikle resistens over for behandlingerne. For det andet, målretning CAF afhænger ikke af typen af onkogenmutationer i tumorcellerne. For det tredje, målretning CAF kan opnå flere hit effekter gennem fibroblaster-afhængige anti-tumor, anti-angiogenese, og / eller modulerende kræft immunrespons. Vores 3D sfænode model er et kraftfuldt værktøj til opdagelse af forskellige sæt af kræft terapeutiske strategier.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Omaida C. Velazquez (University of Miami) for nyttigt samarbejde, høring og diskussion; Dr. Jie Li (University of Miami) for at give MeWo celler; og Dr. Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) for at give alle andre melanom celler. Vi takker også Dr. Marcia Boulina, direktør for Analytical Imaging Core Facility, University of Miami, for billeddannelse analyse. Zhao-Jun Liu blev støttet af tilskud fra Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women's Cancer Association (den 53rd årlige tilskud) og interne midler fra University of Miami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
| Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
| CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
| DakoCytomation | Dako | x0909 | |
| DAPI | |||
| Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
| Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
| IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
| IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
| Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
| MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
| Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
| Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
| Olymupus CellSens | Olympus | ||
| PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
| Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |
References
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).
- Anton, K., Glod, J. Targeting the tumor stroma in cancer therapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Lynch, C. C., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation. 70, 561-573 (2002).
- Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).
- Olumi, A. F., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Luga, V., et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration. Cell. 151, 1542-1556 (2012).
- Zhang, X. H., et al. Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma. Cell. 154, 1060-1073 (2013).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Shao, H., et al. Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1. Oncogene. 30, 4316 (2011).
- Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontier in Immunology. 9, 414 (2018).
- Kraman, M., et al. Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha. Science. 330, 827-830 (2010).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).
- Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. Melanocytes: from morphology to application. Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling melanoma in vitro and in vivo. Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17, 1-15 (2015).
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).
- Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids. Scientific Reports. 7, 16645 (2017).
- Lazzari, G., et al. Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity. Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Gu, L., Mooney, D. J. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).
- Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment. Advanced Biosystems. 1, (2017).
- Welch, D. R., et al. Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line. International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).
- Balint, K., et al. Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression. Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).
- Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).
- Du, Y., et al. Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells. Stem Cells. 37, 865-875 (2019).
- Shao, H., et al. Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion. PLoS One. 10, 0142815 (2015).
- Shao, H., et al. Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis. Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).
- Kalluri, R., Neilson, E. G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).
- Price, J. E. Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models. Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).
- Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4, 4992 (2009).
