Summary
We presenteren een methode die membraan eiwit zuivering en reconstitutie in peptidiscs combineert in een enkele chromatografische stap. Biotinyated steigers worden gebruikt voor directe oppervlakte bevestiging en meting van eiwit-ligand interacties via biolayer interferometrie.
Abstract
Membraan eiwitten, waaronder vervoerders, kanalen en receptoren, vormen bijna een vierde van het cellulaire Proteoom en meer dan de helft van de huidige geneesmiddel doelen. Toch is een belangrijke barrière voor hun karakterisering en uitbuiting in academische of industriële instellingen dat de meeste biochemische, biofysische en drugs screening strategieën vereisen dat deze eiwitten in een in water oplosbare toestand verkeren. Ons laboratorium heeft onlangs de peptidisc ontwikkeld, een membraan mimetische met een "one-size-fits-all" aanpak van het probleem van membraan proteïne oplosbaarheid. We presenteren hier een gestroomlijnd protocol dat eiwit zuivering en peptidisc reconstitutie combineert in een enkele chromatografische stap. Deze workflow, genaamd PeptiQuick, zorgt voor het omzeilen van dialyse en incubatie met polystyreen kralen, waardoor de blootstelling aan detergens, eiwit denaturatie en monsterverlies sterk wordt verminderd. Wanneer peptiquick wordt uitgevoerd met biotinyleerd steigers, kan de bereiding direct worden bevestigd aan streptavidine gecoate oppervlakken. Er is geen behoefte aan biotinylaat of wijzigen van het membraan eiwit doelwit. PeptiQuick wordt hier tentoongesteld met de membraan receptor FhuA en antimicrobiële ligand colicin M, met behulp van biolayer interferometrie om te bepalen van de precieze kinetiek van hun interactie. Geconcludeerd wordt dat PeptiQuick is een handige manier om te bereiden en analyseren van membraan eiwit-ligand interacties binnen één dag in een detergens-vrije omgeving.
Introduction
Membraan eiwitten zijn vaak uitgesloten van drugs-of antilichaam Discovery onderzoeksprogramma's vanwege de neiging van membraan eiwitten om te aggregeren buiten de lipide-dubbelgelaagde omgeving, vooral in de aanwezigheid van detergenten1. Daarom zijn in de afgelopen jaren verschillende membraan-mimetica (zogenaamde scaffolds) ontwikkeld om de isolatie en ondervraging van membraan eiwitten in een volledig reinigingsmiddel vrije omgeving (d.w.z. nano schijven, SMALPs, amphipols, enz.) te vergemakkelijken. 2,3,4,5,6. Echter, reconstitutie van membraan eiwitten in deze mimetica vereist vaak uitgebreide optimalisatie, wat tijdrovend is en in het algemeen gepaard gaat met verlies van eiwit terugwinning7,8. Om deze beperkingen te overwinnen, heeft ons laboratorium onlangs een "one-size-fits-all" formulering ontwikkeld die bekend staat als de peptidisc9. De peptidisc wordt gevormd wanneer meerdere exemplaren van een ontwerper 4,5 kDa amphipathisch bihelical peptide binden aan het hydrofobe oppervlak van een doel membraan proteïne. Stabiele reconstitutie in peptidisc treedt op bij het verwijderen van detergens, het verankeren van zowel endogene lipiden als opgeloste membraan eiwitten in in water oplosbare deeltjes. Deze gestabiliseerde deeltjes zijn nu vatbaar voor talrijke downstreamtoepassingen.
De peptidisc methode biedt verschillende voordelen; bijvoorbeeld, reconstitutie is eenvoudig, omdat de binding van de peptidisc-steiger op het doelwit wordt geleid door het eiwit sjabloon zelf9,10. De peptide stoichiometrie is ook zelf bepaald, en toevoeging van exogene lipiden is niet nodig. Peptidisc vorming vindt plaats door eenvoudige reinigingsmiddel verdunning, een belangrijk voordeel ten opzichte van dialyse of adsorptie aan polystyreen kralen, die vaak resulteren in een lage eiwitopbrengst als gevolg van niet-specifieke oppervlakte associatie en aggregatie11,12 ,13. Het laatste peptischijfje is zeer thermostabiel en onveranderlijk oplosbaar in verschillende buffers of in de aanwezigheid van divalente kationen (bijv. ni2 +). De zuiverheid en structurele homogeniteit van de steiger is ook hoog (bijv. endotoxine-vrij), en de peptide kan worden aangepast met functionele groepen geplaatst op verschillende posities.
We presenteren hier een laboratoriumwerk stroom genaamd PeptiQuick, ook bekend als on-Beads reconstitutie9. Dit protocol combineert membraan proteïne zuivering en peptidisc reconstitutie in één stap en op dezelfde chromatografische ondersteuning. Zoals de naam al aangeeft, is PeptiQuick snel in vergelijking met andere reconstitutie methoden, en het vermindert ook de blootstellingstijd tot wasmiddel. Negatieve wasmiddel effecten zoals het ontvouwen van eiwitten en aggregatie treden vaak op een tijdafhankelijke manier op; Daarom is het minimaliseren van de blootstelling aan wasmiddelen essentieel om de inheemse eiwit conformatie14,15te behouden. Dit is van cruciaal belang voor de nauwkeurigheid van methoden die rapporteren over eiwit interacties en ligand bindende verwantschappen.
Bij het ontwikkelen van dit protocol presenteren we de roman biotinyleerd versie van de peptidisc Scaffold, genaamd bio-peptidisc. De functionele groepen van biotine maken het mogelijk om het doel membraan-eiwit op streptavidine gecoate oppervlakken aan te laten. Aangezien Biotine labeling beperkt is tot de steiger, blijven bindende plaatsen op het doel membraan eiwit ongewijzigd. Met behulp van bio-Peptidisc, de bindende kinetiek van de bacteriële membraan receptor FhuA en antimicrobiële peptide colicin M (ColM) worden bepaald16. Deze affiniteit wordt gemeten via biolayer interferometrie (BLI), die interacties in real-time analyseert op basis van witte licht interferentie patronen die worden weerspiegeld door een sensortip.
Door dit protocol te gebruiken, wordt de behoefte aan detergenten tijdens BLI-analyse geëlimineerd, wat een belangrijke ontwikkeling is, omdat detergenten interacties kunnen verstoren. Bindende affiniteiten kunnen snel worden gemeten met deze methode, en de resultaten zijn vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd met behulp van nano schijven en isothermische titratie calorimetrie (ITC)16. De kritieke stappen in de PeptiQuick workflow worden getoond en besproken, zoals eiwit voorbereiding, reinigingsmiddel verdunning, peptide toevoeging, en reconstitutie, samen met tips voor het oplossen van de binding van ligand en analyt in de BLI-assay. Met behulp van de PeptiQuick workflow, wordt geconstateerd dat membraan eiwitten kunnen worden gevangen in peptidiscs en hun interacties gemeten binnen een dag.
Protocol
1. bereiding en solubilisatie van membraan receptor FhuA
- Uitdrukken zijn6-Tagged fhua in Escherichia coli stam AW740. Kweekcellen voor 18 uur bij 37 °C in M9 media (tabel 1). Zie Mills et al.16 voor een gedetailleerd expressie protocol.
- Oogst cellen door centrifugeren (5.000 x g, 10 min, 4 °c) en respenderen ze in 50 ml tris-Salt-GLYCEROL (TSG) buffer (tabel 1). Dounce de geresuspendeerde cellen en voeg fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) toe aan een eindconcentratie van 1 mM vlak vóór lysis.
Let op: PMSF is giftig en corrosief. - Lyse de cellen met behulp van een microfluidizer (drie passages) op 15.000 psi of een Franse pers (drie passages) bij 8.000 psi. Pellet de ongelyseerde cellen en ander onoplosbaar materiaal door centrifugatie met lage snelheid (5.000 x g, 10 min, 4 °c).
- Ultracentrifuge het supernatant (200.000 x g, 40 min, 4 °c) om de ruwe membraan breuk te isoleren. Gooi het supernatant weg, regeer de membraan pellet in een minimale hoeveelheid TSG-buffer en dounce met behulp van een glas of metaal douncer-apparaat om homogeniteit te waarborgen.
- Voer een Bradford-test uit om de eiwitconcentratie van het geresuspendeerde ruwe membraan te controleren. Verdun het ruwe membraan tot een eindconcentratie van 3 mg/mL met behulp van een TSG-buffer voorafgaand aan solubilization.
- Voeg detergent Triton X-100 toe aan een uiteindelijke concentratie van 1% (v/v) om het bacteriële binnenmembraan selectief te oploseren voor 1 uur bij 4 °C met zachte schommelen. Pellet het onoplosbare materiaal (buitenste membraan breuk) door ultracentrifugatie (200.000 x g, 40 min, 4 °c).
- Gooi het supernatant met het opgeloste membraan weg en regeer de pellet in TSG tot een eindconcentratie van 3 mg/mL. Voeg lauryldimethylamine oxide (LDAO) toe aan een concentratie van 1% (v/v) aan de geresuspendeerde buitenste membraan Fractie en solubilize voor 1 uur bij 4 °C met zachte schommelen.
- Voer een uiteindelijke Centrifugeer stap uit tot pellet alle onoplosbare stoffen (200.000 x g, 40 min, 4 °c).
Opmerking: de resulterende supernatant bevat de opgeloste buitenste membraan eiwitten, met inbegrip van het doelwit zijn-Tagged FhuA.
2. zuivering en reconstitutie van FhuA met behulp van de PeptiQuick workflow
- Pre-equilibreren een voorverpakte ni-NTA kolom (5 mL harsvolume) met twee kolom volumes van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (IMAC) Wash buffer (tabel 1).
- Verdun het opgeloste buitenste membraan van 1% LDAO tot 0,04% LDAO met behulp van TSG. Voeg vervolgens imidazol toe aan een eindconcentratie van 5 mM.
Let op: imidazol is giftig en corrosief. - Laad de opgeloste buitenste membraan eiwitten op de ni-NTA hars en verzamel de flowthrough. Herlaad de flowthrough op de hars om de hars binding van FhuA te verhogen en de secundaire flowthrough te verzamelen.
Let op: Houd een aliquot van 20 μL oplosmiddel als referentie voor latere natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) analyse. - Was de hars met 250 mL IMAC Wash buffer en verzamel de eerste 50 mL eluaat. Giet de reinigings buffer af op de hoogte van het hars bedvolume en sluit de kraantje op de kolom.
- Voeg 1 mL geconcentreerde 10 mg/mL bio-Peptischijpeptide oplossing (tabel 1) toe aan de kolom. Voeg 50 mL verdunde bio-Peptischijpeptide oplossing van 1 mg/mL in TSG toe en roer de hars met een glazen staaf om de parels in TSG te hervatten.
- Laat de hars na het overvullen van peptischijsen de overmaat 1 mg/mL bio-Peptidisc oplossing door de hars aftappen.
- Was de met ni-NTA bevestigde peptischijpartikels met 50 mL GTS. Elueer de peptischijpartikels met 15 mL IMAC-elasonbuffer (tabel 1) met 600 mm imidazol in TSG. Verzamel 1 mL fracties en voeg onmiddellijk 10 μL van 0,5 M EDTA toe om geleide nikkel-ionen te cheleren.
Let op: EDTA is een irriterend.
3. evaluatie van de PeptiQuick reconstitutie
- SDS-pagina analyse
- Laad 10 μL aliquots van het startmateriaal, flowthrough, Wash (ES) en geëlueerde fracties uit de PeptiQuick reconstitutie op een 12% SDS-denaturerende gel en elektroforese gedurende 30 minuten bij een constante stroom van 60 mA.
- Vlek de gel met Coomassie Blue Dye, laat de gel en visualiseer op een scanner.
- Grootte-uitsluitings chromatografie (SEC)
- Op basis van de 12% SDS-PAGE analyse van de PeptiQuick reconstitutie, isoleren en bundelen de relevante fracties, en concentreren ze met behulp van een 30 kDa cut-off centrifugale concentrator.
Opmerking: in de begeleidende video worden fracties F3 – F7 samengevoegd en geconcentreerd onder 1 mL (het volume van de injectie lus op het SEC-instrument). - Injecteer ~ 1 mL van de samengevoegde IMAC-elutie fracties op een gel filtratie S200 (300/10)-kolom met een debiet van 0,25 mL/min in TSG-buffer. Verzamel 1 mL fracties en voer ze uit op een 12% SDS gel om te bepalen welke SEC fracties u wilt bundelen en concentreren.
Opmerking: de geeleerde PeptiQuick fracties kunnen zonder concentratie worden samengevoegd en een aliquot kan op de SEC worden geïnjecteerd om de kwaliteit van de reconstitutie te controleren. Dit is een belangrijke controle voor membraan eiwitten die mogelijk gevoelig zijn voor aggregatie tijdens de centrifugale concentratie.
- Op basis van de 12% SDS-PAGE analyse van de PeptiQuick reconstitutie, isoleren en bundelen de relevante fracties, en concentreren ze met behulp van een 30 kDa cut-off centrifugale concentrator.
4. biolayer interferometrie
- BLI experimentele Setup
- Zet de 96 goed plaat met de hand.
NB: alle putjes zijn gevuld tot een eindvolume van 200 μL. - In kolom 1, rijen A − E, laadt u 200 μL van de kinetiek-buffer zodat de uiteinden kunnen worden geëerd en een basis signaal worden vorm.
- Verdun de ligand (FhuA in bio-Peptidisc) tot een concentratie van 2,5 μg/mL in de kinetiek buffer (tabel 1). Laad 200 μL van deze verdunning in de rijen A − D in kolom 2.
- Voeg 200 μL kinetiek buffer alleen toe aan E2 (de referentie sensor).
- Voeg 200 μL kinetiek buffer toe aan kolom 3, rijen A − E om overtollig FhuA van de punt te wassen.
- Voer in kolom 4 twee-voudige seriële verdunningen van de analyt (ColM) door de plaat van A4 naar D4. Begin met 28 nM (8 * KD) van A4 tot 3,5 nM (1 * KD) in D4.
- Voeg 28 nM ColM toe aan E4 om te meten voor niet-specifieke binding (de hoogste ColM concentratie gebruikt).
- Voeg 200 μL kinetiek buffer toe aan kolom 5, rijen A − E.
Let op: hier zal de ColM van de punt dissociëren en wordt de dissociatie gemeten. - Plaats de instel plaat in het BLI-instrument.
- Plaats de sensortip tray in het BLI-instrument.
- Open de BLI-software voor gegevensverzameling en selecteer Nieuw kinetiek-experiment in de wizard software.
- Gebruik het tabblad Plate definition om de layout van de 96 well plate in de software in te voeren.
Opmerking: de putjes met de ligand, FhuA worden ingevoerd als de "belasting". Putten met buffer alleen worden ingevoerd als de "buffer". Putten met de analyt, ColM, worden ingevoerd als het "monster". - Gebruik het tabblad assay definition om de tijdsduur en de rotatiesnelheid van de platen voor elke stap in het experiment te definiëren.
Opmerking: de experimentele stappen zijn ingesteld als: 1) Baseline: 60 s; 2) het laden: 250 s; 3) basislijn2:300 s; 4) vereniging: 450 s; en 5) Dissociatie: 900 s. laat de schud snelheid als standaard (1.000 rpm). De bovenstaande stappen worden individueel toegewezen aan elke kolom in de 96 well plate door de gewenste stap te selecteren en met de rechtermuisknop op elke kolom een test stap toevoegen te klikken. - Wijs de eerste stap toe door met de rechtermuisknop op de eerste kolom te klikken en vervolgens nieuwe test startente selecteren. Zorg ervoor dat de basislijn stap correct is toegewezen met behulp van het venster rechtsonder en wijzig indien nodig met het vervolgkeuzemenu.
- Wijs de volgende stappen toe aan elke kolom door rechts te klikken langs de plaat en te selecteren test stap toevoegen. Wijs deze toe aan de juiste kolom, zoals ingesteld in stap 4.1.13.
- Gebruik het tabblad sensor toewijzing om ervoor te zorgen dat het octet-instrument BLI-pennen gebruikt vanaf de juiste locatie in de sensor lade.
Opmerking: op het tabblad sensor toewijzing moet alleen a1 − E1 blauw worden gemarkeerd. Zorg ervoor dat er een sensortip aanwezig is op deze locaties in de sensor lade en zorg ervoor dat de F1 − H1 leeg is. - Markeer F1 − H1 op het scherm, klik met de rechtermuisknop en selecteer verwijderen om deze als leeg te markeren. Vink sensoren vervangen in lade na gebruik om de gebruikte sensoren te behouden.
- In de Review experiment tabblad, die een definitief overzicht van het experiment voorafgaand aan de uitvoering biedt, gaat u over de experimentele stappen om ervoor te zorgen dat de volledige installatie correct is.
- Selecteer in het tabblad experiment uitvoeren een bestandslocatie om de methode bestanden op te slaan.
- Verander de plaat temperatuur naar de kamertemperatuur.
- Selecteer Ga om het experiment uit te voeren.
- Zet de 96 goed plaat met de hand.
- BLI data-analyse
- Open de software octet BLI Data Analysis.
- Gebruik het tabblad gegevensselectie om het experiment te zoeken en de experimentele samenvatting te controleren. Importeer het projectbestand vanaf de opslaglocatie die is gedefinieerd tijdens stap 4.1.19.
- Voer de concentraties van de analyt (hier, ColM) in door de sensorinformatie voor elk experiment te selecteren.
- Wijs de tip in E1 toe als referentiepunt.
- Gebruik het tabblad processing om het referentiesignaal (E1) af te trekken van de experimentele gegevens. Controleer de onbewerkte gegevens van de referentiepunt voor een niet-specifieke analyt binding. Als er geen wordt waargenomen, gaat u verder.
Opmerking: dit is een belangrijke negatieve controle. Als niet-specifieke binding wordt waargenomen, wordt dit verwerkt in stap 4.2.7. - Lijn de y-as uit tot de tweede basislijn stap. Vink de interstep-verbinding niet aan. Selecteer Savitzky-Golay filtering. Selecteer procesgegevens!.
- Selecteer in het tabblad analyse de experimentele gegevens in de tabel onder het plot om de associatie-en dissociatie curven te zien met het signaal van de referentie sensor die wordt afgetrokken.
- Selecteer het binding model 1:1 en selecteer een gedeeltelijke curve-pasvorm. Selecteer fit curves!.
- Analyseer de rest weergave plot om de fitting van de curve te controleren.
- Blader door de tabel om de berekende Kdte zien.
- Selecteer rapport opslaan... als u een werkbladdocument wilt opslaan met gedetailleerde informatie over de instellingen, grafieken van de onbewerkte en geanalyseerde gegevens en de berekende dissociatieconstanten.
Representative Results
De membraan receptor FhuA wordt uitgedrukt in een laboratorium E. coli stam. De buitenste membraan fractie wordt geoogst door centrifugeren, en eiwitten worden gesolubiliseerd met behulp van een twee-stappen reinigingsmiddel extractie. De ontbindend membraan eiwitten worden geladen op ni-NTA agarose kralen verpakt in een plastic kolom, gevolgd door de peptiquick workflow zoals gepresenteerd in het protocol. Na een kwaliteitscontrole met behulp van grootte-uitsluitings chromatografie, worden de bio-Peptischijpartikels geïmmobiliseerd op streptavidin-gecoate pinnen. De BLI-analyse wordt uitgevoerd om kinetiek van de interacties tussen FhuA en ColM te meten. Het schematische overzicht van dit experiment wordt weergegeven in Figuur 1.
Er wordt een SDS-gel uitgevoerd om de kwaliteit van reconstitutie te bepalen na elutie van FhuA bio-Peptischijpartikels uit de IMAC-kolom (Figuur 2). Aliquots van de fracties die corresponderen met start, flowthrough, washes en elutie fracties worden op de SDS-gel geladen om het succes van de peptiquick methode te evalueren. De uitputting van FhuA in de doorstroom fractie is gecorreleerd met een verrijking in de elutie fracties, wat aangeeft dat de zuivering van het eiwit effectief is geweest. Kleine verontreiniging eiwit banden worden waargenomen in de geeleerde fracties. De SDS-gel-analyse wordt gebruikt om te bepalen welke fracties vóór de SEC-analyse moeten worden samengevoegd. Een inheemse gel van de geeleerde FhuA bio-Peptischijpartikels wordt ook uitgevoerd om de FhuA-oplosbaarheid te bevestigen (aanvullend figuur 1). Migratie van het gereconstitueerde eiwit in de inheemse gel geeft eiwit oplosbaarheid in een detergens-vrije omgeving.
De SEC-analyse wordt uitgevoerd om de oplosbaarheid van de peptischijpartikels te beoordelen. Het chromatogram dat in Figuur 3a wordt weergegeven, toont een enkelvoudige, symmetrische piek die op ongeveer 14 ml (6 ml voorbij het leegte volume van 8,0 ml op de gelfiltratie S200 10/300-kolom) wordt weergegeven. De positie van deze piek, voorbij het leegte volume, bevestigt de oplosbaarheid van de FhuA bio-Peptischijpartikels. Ter referentie illustreert Figuur 3b een theoretisch suboptimaal preparaat van peptidisc. In dit geval vertoont het chromatogram een grotere proteïne piek op het lege volume, wat de aanwezigheid van eiwit aggregaten aangeeft. De kleinere piek die net voorbij de belangrijkste peptidisc piek ligt, komt overeen met overtollige peptidisk peptides.
De interactie van FhuA met de analyt ColM wordt bepaald na bevestiging van de peptidiscs aan streptavidine gecoate sensoren. De sensor uiteinden worden eerst geëventariseerd in de kinetiek buffer en vervolgens overgebracht naar de buffer met de FhuA bio-Peptidiscs. De concentratie van de FhuA bio-Peptischijven en de tijdsduur waarvoor zij met de punt worden geïnineerd, wordt vóór dit experiment geoptimaliseerd (aanvullend figuur 1). Na de laad-en wasstappen meet de koppelings stap de interacties tussen de geladen tips en vier verschillende concentraties van colicin M. De daaropvolgende beweging van de tips terug in de buffer resulteert in dissociatie, die wordt gemeten door de golflengte verschuiving van wit licht reflecterend van de tip.
Fig. 4a geeft de onbewerkte data sensorgram-uitvoer van dit experiment weer. Alle traceringen lijken uniform in de laden en basislijn stappen, afgezien van de referentie-trace in geel. De referentiepunt heeft geen ligand geladen, maar wordt blootgesteld aan de analyt om te assay voor niet-specifieke binding, wat een belangrijke negatieve controle is. Voor een gedetailleerdere analyse van de resultaten wordt het signaal van de referentiepunt afgetrokken van de sporen voor de experimentele tips om rekening te maken voor niet-specifieke binding. De gegevens worden uitgelijnd met het begin van de koppelings stap om een directe visuele vergelijking mogelijk te maken, zoals weergegeven in figuur 4b. Deze vergelijking toont een toename van de golflengte verschuiving voor het verhogen van de concentraties van colicin M. De curve is geschikt voor de data en vertoont een klassiek 1:1 binding model.
De rest weergave plot (figuur 4b, onder), waarin de verschillen tussen de fitting en de experimentele gegevens worden beschreven, toont de fitting voor de hoogste concentratie van ColM (28 nm) is slecht in vergelijking met de drie lagere concentraties. Het profiel van de curve zelf mist de binding curve plateau, die kenmerkend is voor binding site verzadiging in een typische bindende experiment. Het gebrek aan plateau suggereert heterogene binding, wat waarschijnlijk een artefact is van de hoge ColM concentratie. Deze hoogste ColM concentratie wordt daarom verdisconteerd uit de analyse en de andere drie concentraties worden gebruikt om de dissociatieconstante te bepalen (Figuur 4C, D). Een tweezijdige Student t-toets, met een betrouwbaarheidsniveau van 95%, ontdekte dat de waargenomen dissociatieconstante van dit experiment niet significant verschilt van de waarden die zijn verkregen met behulp van verschillende technieken (figuur 4e)16.
Afbeelding 1: overzicht voor de PeptiQuick workflow met behulp van bio-Peptidiscs en BLI-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: SDS-gel-analyse (12%) van start, flowthrough, Wash en elutie fracties verzameld via de peptiquick workflow. Ongeveer 10 μL monster werd in elke rijstrook geladen en gedurende 30 minuten uitgevoerd bij een constante stroom van 60 ma. De gel werd gekleurd met Coomassie Blue, ontkleurde en gevisualiseerd op een gelscanner. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: experimentele en theoretische SEC-profielen die respectievelijk optimale en suboptimale reconstituties vertegenwoordigen. A) experimenteel SEC-Profiel van PeptiQuick gereconstitueerde fhua (~ 82 kDa) in bio-Peptidiscs. Een IMAC-elutie fracties F3 − F7 werden samengevoegd en geconcentreerd met een 30 kDa centrifugale concentrator tot ongeveer 1 mL. Dit geconcentreerde monster werd geïnjecteerd met 0,25 mL/min op een gel filtratie S200 (10/300) kolom in TSG-buffer. B) theoretisch SEC-Profiel van een suboptimale PeptiQuick reconstitutie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: onderzoeken van ColM interacties met FhuA gereconstitueerd in bio-Peptidiscs. (A) RAW data-sensorgram met referentie sensor-trace in geel. (B, C) Boven: associatie en dissociatie stappen met gedeeltelijke 1:1 binding curve fitting. Bodem: rest weergaven die het verschil tussen experimentele gegevens en computationele fitting afbeelden. C) opnieuw plotten van (B) met uitsluiting van de hoogste concentratie van ColM. D) waargenomen associatie-en dissociatie percentages (respectievelijk kop en kuit) en de dissociatieconstanten (kD). E) vergelijking van fhua-ColM dissociatieconstanten verkregen door peptidisc en bli (in dit experiment), peptidisc en micro schaal thermophorese (Saville, ongepubliceerde gegevens) en nano schijf en isothermische titratie calorimetrie16. Foutbalken vertegenwoordigen één SD van onzekerheid, terwijl n.s. geen significant verschil op het betrouwbaarheidsniveau van 95% aangeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| M9 media (per liter) |
| 200 mL M9 zout |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% glucose |
| 80 μL 1 M CaCl2 |
| 2,5 mL 1 M MgSO4 |
| 300 μL 15 mg/mL thiamine |
| TSG-buffer |
| 50 mM tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glycerol |
| IMAC-reinigings buffer |
| 50 mM tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glycerol |
| 0,04% LDAO |
| 5 mM imidazool |
| Bio-Peptidisc oplossing |
| Los de kant-en-klare bio-Peptischijf (> 95% zuiverheid) op in steriele dH2O. De concentratie en het volume van de peptide oplossing is afhankelijk van de stap in het reconstitutie proces. |
| 50 mM tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| Opmerking: deze bio-Peptidisc peptide kolf is stabiel bij 4 °C gedurende meer dan een maand. |
| IMAC-elutie buffer |
| 50 mM tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glycerol |
| 600 mM imidazool |
| Kinetiek-buffer |
| 50 mM tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 0,002% tween-20 |
| 0,1% BSA |
Tabel 1: recepten voor de voorbereiding van media en oplossingen.
Aanvullend figuur 1:4% – 16% duidelijke inheemse gelanalyse van de elutie fracties verzameld uit de PeptiQuick workflow. Ongeveer 10 μL monster werd in elke rijstrook geladen en gedurende 40 minuten uitgevoerd bij een constante stroom van 30 mA. De gel werd gekleurd met Coomassie Blue, ontkleurde en gevisualiseerd op een scanner. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend figuur 2: ligand concentratie-optimalisatie met behulp van een enkele pincode. A) de zes verschillende concentraties fhua in bio-Peptischijf getest voor binding aan een enkele streptavidine gecoate pin. Dit werd ingesteld in een 96 putplaat met buffer in de putjes tussen ligand concentraties (Zie aanvullend bestand 1 voor Setup Protocol). (B) RAW data sensorgram voor het ligand Optimization experiment. De pin geeft de grootste respons en bereikt bovendien verzadiging bij concentratie nummer 4 (of 2,5 μg/mL). Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Discussion
Terwijl detergenten de eenvoudigste methode blijven om membraan eiwitten te extraheren en te zuiveren, kunnen deze oppervlakteactieve stoffen veel ongewenste effecten hebben op de stabiliteit van eiwitten, de functie en de downstream-analyses1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Deze moeilijkheden hebben de ontwikkeling van membraan-mimetica gemotiveerd, die ernaar streven de aanwezigheid van detergenten te minimaliseren en de inheemse membraan omgeving zo veel mogelijk te repliceren2,3,4 ,5,6. Het merendeel van de reconstitutie methoden vereist echter een aanzienlijke optimalisering van de reconstitutie condities en vereist vaak extra zuiveringsstappen, die de uiteindelijke opbrengst van7,8verlagen. De peptidisc past zich spontaan aan het doel membraan eiwit aan en vereist relatief weinig optimalisatie en downstream zuivering9,10. In dit protocol wordt PeptiQuick gepresenteerd als een eenvoudig middel om het reconstitutie protocol voor downstream eiwit-eiwit interactie analyse te stroomlijnen.
Hoewel ongecompliceerd, zijn er verschillende experimentele waarschuwingen die kunnen leiden tot mislukte reconstitutie. Onder deze, de meest voorkomende is te wijten aan eiwit aggregatie. Het is daarom van cruciaal belang om de grootte uitsluitings chromatografie uit te voeren om het reconstitutie proces te bewaken. Bijvoorbeeld, een grootte uitsluiting piek eluering op het lege volume is indicatief voor eiwit aggregaten (Figuur 3b)17,18. Membraan eiwit aggregaten vormen meestal bij langdurige blootstelling aan suboptimale reinigingsmiddelen vóór reconstitutie. In het bijzonder is gebleken dat membraan eiwitten in detergens de neiging hebben om aggregaten te vormen wanneer ze worden geconcentreerd door ultrafiltratie op centrifugale apparaten. In dit geval kunnen gevoelige membraan eiwitten geconcentreerd worden met behulp van vacuüm ultrafiltratie, een zachtere en meer homogene methode van concentratie, omdat de adsorptie van eiwitten aan het filter wordt verminderd.
In het algemeen, om de eiwitconcentratie te vermijden, moeten de geeleerde IMAC-fracties worden samengevoegd en een aliquot worden geïnjecteerd op een uitsluitings kolom voor grootte om de reconstitutie kwaliteit te controleren. Opgemerkt moet worden dat de vrije peptide, net na de belangrijkste peptidisc piek (Figuur 3b). De vrije steiger belemmert niet noodzakelijkerwijs de downstream-experimenten. Echter, indien nodig, kan dit overschot worden verwijderd door de grootte uitsluitings chromatografie. Als alternatief is het verhogen van het wasvolume tijdens de reconstitutie en voorafgaand aan elutie van de IMAC Resin voldoende om het grootste deel van het gratis peptidisc peptide effectief te verwijderen. Daarom wordt de grootte exclusie chromatografie aanbevolen als een snelle en eenvoudige manier om de kwaliteit van de reconstitutie te controleren.
Het BLI-experiment vereist zorgvuldige optimalisering van zowel ligand als analyt concentraties. Ligand binding moet voldoende zijn om een duidelijk signaal te verkrijgen, maar overbelasting zal de signaal verzadiging veroorzaken, wat resulteert in gegevensartefacten van overbevolking en sterische hinder op het punt oppervlak. Daarom moet zowel de concentratie van de ligand als de tijdsduur van de tip in de ligand-oplossing worden geoptimaliseerd voor elk eiwit monster (aanvullend figuur 2). De concentratie van de analyt moet ook worden geoptimaliseerd. Als de dissociatieconstante bekend is, wordt deze stap gemakkelijker, omdat het concentratiebereik kan worden benaderd. Een goed uitgangspunt voor deze analyse is het gebruik van eiwit concentraties tussen 0,1-en 20-voudige van de verwachte KD19.
Na het verzamelen van BLI-gegevens moet zorgvuldige gegevensanalyse worden uitgevoerd om verkeerde interpretatie te voorkomen. De berekening van de dissociatieconstante is afhankelijk van de pasvorm van een bindings curve. Tenzij de binding stoichiometrie al bekend is, moet een klassiek 1:1 bimoleculair interactiemodel worden gebruikt voor de initiële fitting. Opgemerkt moet worden dat een heterogene bindings curve vaak het resultaat is van artefacten en niet-ideaal gedrag veroorzaakt door een hoge analyt concentratie, die verkeerd geïnterpreteerd kan worden als een complex bindend model. Daarom, het verlagen van de analyt concentratie tot het sensorgram profiel geeft 1:1 binding stoichiometrie kan helpen onderscheid heterogene binding van complexere interacties. Alle resterende heterogene bindingsgegevens worden vervolgens verdisconteerd zoals weergegeven in Figuur 420.
In dit rapport wordt een dissociatieconstante van 2,28 ± 0,74 nM voor de interactie met FhuA-ColM gemeten. Deze waarde is consistent met de dissociatieconstante die voorheen in onze groep met nano schijf of peptidisc werd bepaald met behulp van ITC of MST, respectievelijk (figuur 4e)16. Deze consistentie biedt vertrouwen over de reconstitutie van peptidisc en BLI-analyse als middel om interactie kinetiek te bepalen. Belangrijk, opgemerkt moet worden dat eiwitten meestal worden geïmmobiliseerd op streptavidine biosensoren hetzij via Biotine chemische cross-linking of site-specifieke toevoeging met behulp van de E. coli Biotine ligase BirA21. Het is duidelijk dat biotinylating de peptidisc-steiger, in plaats van het doel membraan-eiwit, veel voordelen heeft. Scaffold biotinylation bespaart tijd en minimaliseert het potentieel om belangrijke eiwitbinding sites te verstoren. We hebben ook geconstateerd dat PeptiQuick toepasbaar is op een breed scala aan proteïne-doel klassen, waaronder G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), ionenkanalen en β-vaten membraan eiwitten. In het algemeen moet worden opgemerkt dat het initiële reinigingsmiddel extract van membraan eiwitten in een geaggregeerde vrije toestand essentieel is en dat onmiddellijke reconstitutie in peptidisc de downstream aggregatie problemen vermindert. Gezien de eenvoud, het is voor ogen dat PeptiQuick zal worden uitgebreid naar andere streptavidine gebaseerde bindende assays, zoals oppervlakte Plasmon resonantie (SPR), ELISA assays, en affiniteit pull-downs met behulp van streptavidine kralen.
Disclosures
FD is oprichter van peptidisc Biotech om peptidisc peptiden te distribueren naar de academische gemeenschap. Peptidisc Biotech werkt ook samen met industriële biotech-en Pharma-bedrijven om peptidisc te implementeren in hun Discovery-workflows. Open Access publicatie van dit artikel werd gesponsord door FortéBio.
Acknowledgments
We bedanken de Raad voor Natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek van Canada. JS bezit een CGS-M CIHR-beurs. LT werd gesteund door de Onderzoekraad biotechnologie en biologische wetenschappen-gefinancierd South West Biosciences Doctoraatsopleiding Partnership [opleiding subsidie referentie BB/M009122/1]. FD is een Tier II Canada Research Chair.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
- Rawlings, A. E. Membrane proteins: always an insoluble problem. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).
- Popot, J. L. Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions. Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).
- Lee, S. C., et al. A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment. Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).
- Frauenfeld, J., et al. A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins. Nature Methods. 13, 345-351 (2016).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs. Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins. Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).
- Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins. Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).
- Carlson, M. L., et al. The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution. eLife. 7, 34085 (2018).
- Carlson, M. L., et al. Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries. eLife. 8, 46615 (2019).
- Serdakowski, A., et al. A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal. International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).
- Smith, S. M. Strategies for the Purification of Membrane Proteins. Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics. Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).
- Montigny, C., et al. Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics. PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).
- Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).
- FortéBio. Octet System Data Acquisition User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf (2014).
- FortéBio. Octet System Data Analysis User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf (2011).
- Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research. 8, 135 (2019).
