Summary
该协议描述了一个实验过程，以产生高蒂特传染性病毒伪型颗粒（pp），包络糖蛋白从两个流感A毒株，以及如何确定其传染性。该协议具有很强的适应性，可开发具有不同包络糖蛋白的任何其他类型的包络病毒的pps。
Abstract
H5N1型禽流感病毒（H5N1）和H7N9偶尔直接传染给人类及其杀伤力，是严重的公共卫生问题，表明有可能发生疫情。然而，我们对病毒的分子理解还很原始，有必要研究其包络蛋白作为治疗靶点的生物特性，并制定控制感染的策略。我们开发了一个固体病毒伪型颗粒（pp）平台来研究禽流感病毒，包括其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）包络糖蛋白的功能分析，HA和NA的重组特性，受体，营养，中和抗体，诊断，感染，用于药物开发和疫苗设计。在这里，我们描述了一个实验程序，以建立从两种甲型流感菌株（HAPI H5N1和2013年禽流感H7N9）的包络糖蛋白（HA，NA）的pps。他们的一代是基于一些病毒的能力，如鼠白血病病毒（MLV），将包络糖蛋白纳入一个pp。此外，我们还详细介绍了这些 pps 如何用 RT-qPCR 进行量化，以及根据 HA 和 NA 的来源对原生病毒和不匹配病毒 pp 的感染性检测。该系统是高度灵活和适应性强，可用于建立病毒pps与包络糖蛋白，可以纳入任何其他类型的包络病毒。因此，该病毒粒子平台可用于研究野生病毒的许多研究。
Introduction
病毒粒子的使命是将其基因组从受感染的宿主细胞输送到未受感染的宿主细胞，并将其以具有复制能力的形式1的形式输送到细胞质或细胞核中。这个过程最初由结合到宿主细胞受体触发，然后是病毒和细胞膜的融合。对于包络病毒，如流感病毒，尖峰糖蛋白负责受体结合和融合1，2。病毒包络糖蛋白（例如，热原、抗原）涉及许多重要特性和事件，如病毒生命周期启动（结合和融合）、病毒发病机制、免疫原性、宿主细胞凋亡和细胞代谢、细胞内分泌途径以及物种间传播和重组1、3、4、5、6、7。研究病毒包络糖蛋白将有助于我们了解病毒感染过程的许多方面。伪型病毒粒子（pp），也称为伪病毒或伪粒子，可以通过伪打字技术8，9，10生成。这项技术已用于开发多种病毒的伪型颗粒，包括丙型肝炎11、12、乙型肝炎13、脉体口腔炎病毒（VSV）14、15和流感病毒16、17、18、19。该技术基于慢病毒或其他逆转录病毒的Gag-Pol蛋白。
假型病毒颗粒可以通过将病毒包络糖蛋白表达质粒、缺少包络基因的抗逆转录病毒包装质粒和单独的报告质粒转化为pp生产者细胞，从而获得三质粒系统。逆转录病毒由Gag蛋白组装而成，它从表达病毒包络蛋白1的受感染细胞膜中发芽。因此，利用逆转录病毒Gag蛋白在表达流感HA和NA的细胞膜上产生芽是可能的。在我们以前的研究中，所有组合中的HAs/NA都是功能性的，能够在病毒生命周期16、17、18、20、21中执行相应的功能。这些pps用于研究流感生物特性，包括血凝、神经氨酸酶活性、HA受体结合对流和传染性。由于HA和NA都是病毒生命周期中重要的表面功能蛋白，从不同流感毒株衍生的不匹配的HA和NA可以部分地证明它们之间的重组。在这里，我们通过使用三个质粒伪型粒系统组合两个HA和两个NA（源自HPAI H5N1病毒株和H7N9染色）来生成八种类型的流感pps。这八种类型的pps包括两个原生pps，H5N1pp，H7N9pp;两个不匹配的 pps，（H5_N9）pp，（H7+N1）pp;和4pps只含有单糖蛋白（HA或NA），H5pp，N1pp，H7pp，N9pp。所有野生流感病毒株的研究都应在生物安全3级（BSL-3）实验室进行。伪型病毒颗粒技术可用于在生物安全级别 2 （BSL-2） 设置中包装人工病毒。因此，pps 是研究流感病毒过程的一个更安全和有用的工具，具体取决于其两种主要糖蛋白：血凝素 （HA） 和神经氨酸酶 （NA）。
该协议描述了这些pps的生成与三质粒共转染策略（在图1概述），如何量化pps和感染性检测。pp生产涉及三种质粒（图1）。编码逆转录病毒Gag-Pol蛋白的gag-pol基因从逆转录病毒包装试剂盒中克隆，并插入pcDNA 3.1质粒，并命名为pcDNA-Gag-Pol。编码绿色荧光蛋白的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因从pTRE-EGFP载体克隆，插入pcDNA 3.1质粒，称为pcDNA-GFP。在克隆过程中，通过引信添加包装信号（*）序列。HA和NA基因被克隆成pVRC质粒，分别命名为pVRC-HA和pVRC-NA。最后一个质粒编码融合蛋白，可以替换为任何其他感兴趣的融合蛋白。我们的伪打字平台包括两个糖蛋白表达质粒：pVRC-HA和pVRC-NA。这可以简化在BSL-2设置中不同病毒株之间的重新分类研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 第1天：细胞培养和播种
- 在 60 mm 培养的 60 mm 培养皿中培养人类胚胎肾 （HEK） 293T/17 细胞，使用 Dulbeco 的改性必需介质 （DMEM） 辅以 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 100 U/mL 青霉素-链霉素 （DMEM 完整介质， DCM） 在 37°C， 5% 二氧化碳 （CO2） 培养箱中，直到约 80% 的汇合。
注：建议使用HEK 293T/17低通道单元。 - 用5 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x小心清洗细胞。
注：HEK 293T/17 单元的手动处理必须非常温和，因为它们很容易分离。 - 去除PBS，用1mL 0.25%胰蛋白酶-乙烯二乙胺四乙酸（EDTA）溶液分离细胞。将培养皿置于37°C、5%CO2培养箱中不超过5分钟，直到细胞分离。
- 通过添加 5 mL 的 DCM 来停用胰蛋白酶。通过上下多次移液，将细胞分散到单细胞悬浮液中。
- 将细胞悬浮液转移到预冷却的15 mL离心管中。在4°C下以250 x g离心收集细胞5分钟。
- 尽可能多地去上清。用 6 mL 的 DCM 培养基重新悬浮细胞颗粒并计数细胞。使用 DCM 培养基将细胞稀释至 1 x 106细胞/mL。
- 将细胞播种到6孔板中，每孔细胞悬浮液为1 mL。轻轻拍打板，均匀地分配细胞。在37°C，5%CO2培养箱中孵育板过夜（14-16小时）。
2. 第2天：利波菲特介导的四粒体共发性
- 在倒置光显微镜下检查细胞形态和密度。理想情况下，细胞在转染时应约85%的结对。用每孔1mL无血清DMEM培养基替换培养基，然后将板放回培养箱。
注：HEK 293T/17 单元的手动处理必须非常温和，因为它们很容易分离。 - 对于要转染的每个培养细胞，将转染试剂的8μL稀释至150μL的体积，并带有减少血清介质（管1）。在室温（RT，约20°C）下轻轻混合并孵育5分钟。
注：对于每个转染样品，准备两个编号为1和2的1.5 mL微离心管。 - 在管2中，将2.5μg的质粒DNA稀释成150μL的减量血清培养基。
注：在管2中，稀释每个质粒DNA，如表1所示。质粒编码囊泡性口腔炎病毒（VSV）G糖蛋白（质粒pLP-VSVG）被用作阳性对照，因为VSV能够感染广泛的细胞范围。缺乏流感包络糖蛋白（μenv pps）的阴性控制颗粒是使用pcDNA-Gag-Pol和pcDNA-GFP质粒产生的。 - 孵化5分钟后，将稀释后的DNA与稀释的转染试剂结合。轻轻混合，在RT再孵育15分钟。
- 将DNA-脂质复合物添加到含有细胞和无血清培养基的相应井中。通过来回摇动板轻轻混合。
- 在37°C、5%CO2培养箱中孵育4~6小时后，取出培养基，用2 mL的DMEM代替。在37°C，5%CO2培养箱中孵育另外36~48小时。
注：替换为无血清和无抗体的DMEM。在此协议中，可以使用两个 HA 和两个 NA 生成八种类型的 pps（如表 1所示）。
3. 第3天：易感细胞播种
- 对于感染性测定，在96孔盘中，将每种类型的易感细胞分1×104细胞。
注：使用两种类型的靶细胞执行本文中的感染性测定：阿尔韦拉尔衍生的人类细胞系（A549细胞）和马丁-达比白条肾（MDCK）细胞。MDCK细胞广泛用于流感研究，可以很好地控制。此步骤是灵活的。可根据研究要求使用任何其他目标细胞系。 - 在37°C，5%CO2培养箱中孵育板过夜（14-16小时）。
4. 第4天：伪型病毒颗粒收集、定量和感染性测定
- 伪型病毒粒子集合
- 检查介质的颜色。理想情况下，它应该是浅粉色或略橙色。在 440–460 nm 下使用倒置荧光生物显微镜检查细胞。
- 在36~48h转染后，通过0.45 μm聚烯酰胺（PVDF）膜过滤器，通过消除细胞碎片来收获pps。
- 将 pps 划分为小体积等分。
- 将 pps 储存在 -80 °C。
注： 可以在此处暂停该协议。然而，这是不鼓励的，因为在冷冻和解冻后，pps的传染性将急剧下降。
- 伪型病毒颗粒定量
- 将 20 μL 的纯化 pps 转移到 1.5 mL 无核糖核酸 （RNase） 的微离心管中。
- 加入1 μL 0.24 U/mL苯甲酸酶。在37°C孵育1小时，消除任何DNA和RNA污染。
注：靶RNA，通常降调控的巨细胞病毒（CMV）-GFPRNA，包装在pps中，可以避免苯甲酸酶核酸化降解。 - 将样品冷冻在-70°C，使苯酶核酸酶灭活。
- 加入2μL蛋白酶K.在50°C孵育30分钟，以消化包络蛋白并释放CMV-GFPRNA。在100°C处使蛋白酶K灭活3分钟。
- 使用通用探头一步式RT-qPCR套件，使用前引物5'-AACAAAGCTGGCTCTTTT-3'、反向引物5'-GGGTCTCAGATGATATAC-3'和探头，通过实时定量逆转录（qRT）-PCR量化pps5'-FAM-CCCCCAAAAAAAGACACACAC-TAM-3'，在实时PCR热循环器上。在感染前使RNA拷贝数的pps正常化。
- 感染性测定
- 根据 qRT-PCR 数据将每种类型的 pps 稀释到 4 x 105个副本/mL（pp 规范化）。
- 将托西-苯丙氨酸氯甲基-酮（TPCK）-胰蛋白酶添加到含有H7N9 HA的pps中，最终浓度为40微克/mL。在37°C孵育1小时，形成其功能亚单位HA1和HA2。
注： 没有必要用TPCK-胰蛋白酶处理含有H5的pps，因为它们在HA1-HA2裂解部位有多个精氨酸和裂解残留物。这个多基本裂解位点可以通过无处不在的细胞蛋白酶切割。 - 以 1：1 的比例（体积/体积）将标准化 pp 与 DMEM 培养基（无血清）混合。
- 将含有易感细胞的板带到生物安全柜。
- 吸出上清液，用0.1 mL的预预热PBS清洗细胞一次。
- 将 0.1 mL 的 pps-DMEM 混合物添加到一口井中。将每种类型的pps的感染性测试三次到一个易感细胞系（图2概述）。
- 在 37°C、5% CO2培养箱中孵育 96 孔板 4~6 小时。
- 吸气上清液，用 0.1 mL 的 DCM 替换。
- 在 37°C、5% CO2培养箱中孵育 96 孔板，再育成 24-36 小时。
5. 第5天或第6天：感染性检测
- 将 96 孔板带到生物安全柜中。
- 吸出上清液，用0.2 mL的预预热PBS清洗细胞1x。
- 用0.1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液去除PBS并分离细胞。
- 将培养皿置于37°C，5%CO2培养箱中3分钟，直到细胞分离。
注意：避免孵育超过5分钟，因为这将导致细胞结块。 - 通过添加 0.4 mL 的 DCM 来停用胰蛋白酶。
- 通过上下移液几次，将细胞分散到单细胞悬浮液中。
- 将细胞悬浮液转移到冷冻的1.5 mL微离心管中。
- 使用荧光活化细胞分拣 （FACS） 确定 GFP 报告报阳性细胞。
注：要确定GFP报告阳性靶细胞的比例，请使用对照样本（pps-未经处理的A549细胞或MDCK细胞）设置流细胞仪门，然后计算每个样本10，000个细胞的GFP报告阳性细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
根据上述一般程序，我们生成了 10 种类型的 pps，结合两组 HA/NA 或 VSV-G 糖蛋白或无包络糖蛋白（如表 1所示）。其中七种具有传染性。含有无包络糖蛋白或仅含有NA的pps在这里没有表现出任何感染力。图1概述了流感pp的生产工艺。pps的透射电子显微图（例如，H5N1pp）如图3所示。这些pps的传染性测定结果如图4所示。七种类型的pps的传染性被评估在基因组副本每个细胞（GCP）[类似于感染的多重性（MOI）]值20。在含有H5的pps组中，H5N1（H5+N9）和H5的传染性分别为90.05±4.05%、17.78±1.58%、10.15~2.85%，细胞系A549和40.37=4.92%、5.24~1.32%、4.88~0.27%。在H7的pps组中，H7N9（H7+N1）和H7的传染性分别为10.45~2.35%、6.75±1.37%、1.23~0.33%，细胞系A549和7.61=1.04%、4.12~1.29%、1.08~0.02%。对于pps的传染性检测，特别是HApp（H5pp，H7pp），未添加外源性神经氨酸酶。在本次感染性测定中，MDCK细胞也被用作对照细胞系，以测试pps的感染性。VSVGpp对A549的感染率为20.9±2.00%，MDCK细胞的感染率为16.02 ±2.41%。在我们的研究中，三角洲包络糖蛋白pp（μenv pp）没有传染性。这些数据还表明，来自不同病毒株的HAs/NA能够成功地产生传染性病毒颗粒。综合起来，我们的伪打字平台可以开发用于流感研究的传染性伪型病毒颗粒。
图1：流感pp生产过程概述。（A） 包装质粒 pcDNA-Gag-pol、报告质粒 pcDNA-GFP 和包络糖蛋白表达质粒 pVRC-HA 和 pVRC-NA 被共同转化为产生PP的HEK 293/17细胞。（B） 在HEK 293/17细胞中，Gag-Pol多蛋白通过未知的机制合成并输送到细胞膜。糖蛋白HA和NA通过分泌途径输送到细胞膜上并固定。报告质粒 pcDNA-GFP 被转录到单链 + GFP 基因组RNA 中。（C） 在运输过程中或运输后，Gag-Pol 蛋白通过psi-RNA封装信号吸收单链α-GFP基因组RNA，从而形成预发胶。（D） 组装的Gag-pol-α-RNA复合物诱导膜曲率，导致芽的形成。在萌芽期间，病毒包络糖蛋白HAs/NA被合并到新生的颗粒中。当颗粒从细胞膜上夹下来时，萌芽完成。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：感染性测定的总体安排。对每种类型的pps对一个易感细胞系的感染性测试以三重形式进行测量。阿尔韦拉尔衍生的人体细胞A549和MDCK被用作易感细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：pps的透射电子显微图。未浓缩（左）和浓缩（右）上清液。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：规范化pps的传染性。感染性以受感染细胞（n = 3）的平均 = 标准偏差 （SD） 百分比表示。pps的感染率在A549和MDCK细胞的两个细胞系中被评估。七种类型的pps在两个目标细胞中显示不同的感染性配置文件。此处未显示仅包含 NA 的 Pp，因为它们未表现出任何感染性。在我们的研究中，含有无包络糖蛋白（μenv）的Pps也没有表现出任何感染性。感染率百分比表示每个样本中 10，000 个细胞中 GFP 报告者阳性细胞的比率。请点击此处查看此图的较大版本。
| 质粒制剂 | ||||||||||
| 质粒 （μL， 0.1 μg/μL） | H5N1 | （H5+N9） | H7N9 | （H7+N1） | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | 恩切夫 |
| pcDNA-Gag-pol | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pcDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
表1：H5N1和H7N9病毒中提取的HA和NA蛋白的组合，以及6孔板一井转染所需的质粒DNA数量（体积）。根据质粒制剂的浓度，计算每个质粒DNA所需的体积。一口井的质粒DNA总含量为2.5微克。为了获得最高的转染效率和最低的非特异性效果，我们通过改变质粒DNA和转染试剂浓度来优化转染条件。优化后，将四个质粒数量的比例设置为16：16：1：1。在6孔板的一口孔转染中使用的转染试剂体积为8μL（未在表中显示）。来自 H5N1 和 H7N9 病毒的两种 HA 和两个 NA 可用于生成八种类型的 pps：H5N1pp、（H5 + N9）pp、H5pp、N1pp、H7N9pp、（H7 + N1）pp、H7pp 和 N9pp。在我们的研究中，含有无包络糖蛋白（μenv）或仅含有NA糖蛋白的pps没有传染性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在此协议中，我们描述了在BSL-2设置下产生流感病毒伪型颗粒（pp）的方法。报告员质粒 pcDNA-GFP 被合并到 pps 中，可用于在感染性测定中通过 FACS 对 pps 进行量化。我们选择了两种类型的易感细胞系，因为它们在流感研究中被广泛使用。MDCK细胞将很好地控制这些研究中使用的可变永生的人类细胞。
该协议基于逆转录病毒MLV，它可以合并GFP报告器，并在细胞膜上产生芽。这项技术已被广泛开发用于包装流感病毒颗粒4，22，23，24。其他一些系统是基于慢病毒HIV-1伪打字系统19，25，26或巴古病毒-昆虫细胞表达系统27，28，29。许多其他报告基因也被用于伪粒子生产，如荧光素酶（发光）30，31，32，33，β-gal/LacZ（通过色度测定）34，35和分泌碱性磷酸酶36，37。小米等人使用荧光素酶测定来量化冠状病毒伪型颗粒33的传染性。与荧光素相比，使用倒置荧光生物显微镜可轻松观察到GFP的绿色荧光。这是检查转染和感染效率的便捷方法。在这项研究中，可以通过检测FACS的GFP阳性细胞直接确定感染性。
在此方法中，几个步骤会严重影响结果。优化的细胞密度是成功转染的关键因素。在该协议中，发现80-90%的细胞密度对流感病毒pp生产是最佳选择。细胞密度越高或更低会导致转染效率降低。生产细胞良好的生理状态对高颗粒生产也非常重要。这就是为什么建议低细胞通道HEK 293T/17细胞在该协议中产生pps。此外，转染试剂的体积和四个质粒数量的比例也会影响转染效率。为了获得最高的转染效率，建议通过改变和测试这些因素来优化这些因素。我们将四个质粒数量的比例设置为16：16：1：1，转染试剂的体积为8μL，用于6孔盘中的一口井转染。另一个问题是单元格的处理。HEK 293T/17生产者细胞粘附性低，因此手动处理细胞必须非常温和。利波菲克可导致细胞渗透性增加，而介质中的血清和抗体可能会增加细胞毒性。最好使用无血清和无抗体的DMEM培养转染后HEK 293T/17细胞。此外，收集时间也很重要。在36-48h转染后，必须检查细胞上清液的颜色，以确保它是粉红色或橙色粉红色之前pp收集。黄色上清液表示该介质酸性过高，无法支持细胞生长，通常会导致低发量。
我们在6孔盘中进行了转染测定。为了获得更多的pp体积，可以增加转染井的数量，并且可以汇集包含相同pps的上生子。或者，其他一些容器可用于提高pp产量。例如，18 μL转染试剂和5.5μg质粒DNA可用于在一个60毫米盘中用2.2 x 106个细胞进行转染。同样，传染性测定可以在24孔板中进行。
这项技术的成功可能受许多因素的影响。因此，应针对不同类型病毒的颗粒包装进行优化。
在该协议中，产生了H5N1和H7N9的伪型病毒颗粒及其再排序物。在这种方法中，我们使用GFP-RNA的qRT-PCR在单细胞水平的感染性测定（作为每个细胞的基因组拷贝），而不是组织培养感染剂量50（TCID50）或传统的MOI 23，38，39。病毒感染性滴定方法基于斑块测定或TCID50测定，既耗时又耗费人力。这两种检测都依赖于对细胞系病毒感染引起的可见细胞病变效应（CPE）的测量，因此可能很难对低传染性病毒进行定子（即本研究中的H7pp）。我们认为，用流感pps中所含的GFPRNA的qRT-PCR对pps进行规范化是一种方便、有效、快速的方法。
总之，我们的技术是安全和适应性强，可用于研究包络病毒，包括其受体，代谢，包络糖蛋白功能，中和抗体，杀毒药物开发，诊断，和疫苗设计，评价。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了浙江省医药卫生科技计划（授权号，2017KY538）、杭州市医药卫生科技计划（授权号，OO20190070）、杭州医药科学与技术重点项目（授权号，2014Z11）和杭州市社会发展与科学研究自主应用项目（授权号，20191203B134）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
