Summary
介绍了肝酒精脱氢酶SNS针质钴（II）模型复合物的制备情况。复合物可以通过用CoCl2+6H2O对配体前体进行反应来制备，然后通过允许二苯醚缓慢扩散到含有钴复合物的醋酸酯溶液中来重新结晶。
Abstract
化学模型复合物准备代表酶的活性位点。在此协议中，一系列三叉针粘结剂配体前体（每个具有两硫和一个氮体供体原子功能 （SNS）， 并基于二乙二氮-乙酰氨基酮或二分三氮化合物） 用 CoCl2[6H2O] 金属化，以提供三叉星 SNS 针质钴 （II） 复合物。制备肝酒精脱氢酶的钴（II）模型复合物是容易的。基于将 CoCl2+6H2O 添加到含有配体前体的醋酸酯溶液时的快速颜色变化，复杂形状迅速。金属复合物的形成在允许溶液通宵回流后完成。这些钴（II）复合物作为肝酒精脱氢酶（LADH）中锌活性位点的模型。该复合物采用单晶X射线衍射、电喷质谱、紫外线可见光谱和元素分析进行特征分析。为了准确确定复合物的结构，必须确定其单晶结构。然后，通过二甲醚的缓慢蒸汽扩散，将适合X射线衍射的复合物的单晶体生长成含有钴（II）复合物的醋酸酯溶液。对于高品质的晶体，重新结晶通常发生在 1 周或更长时间内。该方法可应用于其他模型协调复合物的制备，并可用于本科教学实验室。最后，相信其他人可能会发现这种再结晶方法，以获得单晶有利于他们的研究。
Introduction
该方法的目的是制备LADH的小分子类似物，以进一步了解金属酶的催化活性。LADH是一种含共量结合域和含锌（II）金属催化域1的二聚基酶。LADH，在共同因子NADH的存在，可以减少酮和醛到各自的酒精衍生物2。在NAD+的存在下，LADH可以对酮和醛2的酒精氧化进行反向催化。LADH活性位点的晶体结构表明，其锌（II）金属中心与一个氮原子结合，由一个石氨酸侧链和两个硫原子提供，由两个半胱氨酸配体3提供。进一步研究表明，锌金属中心与一个阴唇水分子连接，导致金属中心周围出现伪四面体几何形状4。
我们之前已经报告和利用SNS针质配体前体，以及金属化的配体前体与ZnCl2形成Zn（II）复合体，其中包含三叉体配体前体5，6，7。6,75这些配体前体如图1所示。这些锌（II）复合物表现出对电子贫乏醛的化学测量还原活性，因此是LADH的模型复合物。随后，对一系列含有SNS配体前体的铜（I）和铜（II）复合体的合成和表征报告为8、9、10。,9,10
虽然LADH是一种锌（II）酶，但我们有兴趣制备LADH的钴（II）模型复合物，以便获得有关LADH钴（II）模拟物的更多光谱信息。钴（II）复合体为彩色，而锌（II）复合体为白色。由于钴（II）复合物是彩色的，因此可以获取复合物的紫外线可见光谱，从而还可以收集钴（II）复合物中配体场强度的信息。利用高斯计算资料和实验获得的紫紫可见光谱，可以推断出配体场强度的信息。钴（II）是锌（II）的良好替代品，因为两个离子具有相似的离子半径和类似的刘易斯酸度11，12。11,
该方法涉及对模型复合物进行合成和特征化，试图模仿LADH55、66的自然催化行为。此前，我们曾用ZnCl2对一系列配体前体进行金属化，形成LADH的锌（II）模型复合物，对LADH4中锌活性位点的结构及反应进行建模。通过多次实验，这些针脚配体已被证明在不同的环境条件下是健壮的，并且通过各种附加R组来保持稳定。5，6
三联配体比单体配体更可取，因为由于三叉体配体的强切酸作用，它们在金属化方面更为成功。这种观察是由于与单体配体13相比，三叉针配体形成更受青睐的熵。此外，三叉针固定体可能防止金属复合物的二化，这是值得青睐的，因为二氧化二化可能会减缓复合14的催化活性。因此，在制备催化活性强复合物方面，使用三叉针固定体配体已被证明在有机金属化学方面是成功的。SNS针尖复合物的研究比其他针尖系统少，因为针刺复合体通常包含第二排和第三排过渡金属15。
这种对金属酶的研究有助于进一步了解它们的酶活性，这可应用于生物学的其他领域。与替代方法（合成LADH的整个蛋白质）相比，这种合成模型复合物的方法有很多原因。第一个优点是模型复合物的分子质量低，仍然能够准确表示天然酶活性位点的催化活性和环境条件。其次，模型复合体更易于使用和生成可靠且可比较的数据。
本稿描述了LADH两个钴（II）针脚模型复合物的合成制备和表征。这两种复合物均具有含有硫、氮和硫供体原子的针质配体。第一个复合体 （4） 基于一种乙酰氨基酮前体，第二个 （5） 基于三甲酮前体。这些复合物显示了在氢体捐赠者存在的情况下减少电子贫乏醛的气动性反应。这些反应结果将在后续手稿中报告。
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Protocol
1. 合成氯（n33-S，S，N）-2，6-bis（N-isopropyl-N'-甲苯胺酮-2-硫酮）丙氨酸_钴（II）四氯钴酸盐[4]
- 要制备复合4，在100mL圆形底部烧瓶中加入0.121克（3.12 x 10-4 mol）2，6-bis（N-isopropyl-N'-甲苯甲酰胺）丙氨酸（C19H25N5S2）6至15 mL的醋酸酯。6接下来，在此解决方案中，添加0.0851克（3.58 x 10-4 mol）氯化钴（II）六甲水合物（CoCl2+6H2O）。添加钴（II）氯化六氟化水合物后，反应溶液应立即将颜色从浅黄色变为祖母绿。
- 在烧瓶中加入搅拌棒。回流并搅拌20小时的反应，以确保完全反应。在减压下使用旋转剂去除溶剂。
2. 氯（n 3-S，S，N）-2，6-双比（N-isopropyl-N'-亚甲酰甲酮-2-硫酮）的再结晶，通过慢蒸气扩散实现四氯钴酸盐[4]3
- 将溶质溶解在醋酸酯（7.5 mL）中，过滤溶液，并将溶液均匀地放入 1 个 dram 小瓶中。用1.5 mL的醋酸溶液填充每个小瓶。
- 加入棉盖小瓶，允许缓慢的蒸汽扩散。将棉质紧贴在小瓶顶部的开口中。
- 将小瓶放入含有 50 mL 二乙醚的 240 mL 罐子中。用帽子合上罐子。
- 让晶体在1周内生长。
注：再结晶可能需要超过 1 天的时间。
3. 合成氯（n33-S，S，N）-2，6-bis（N-isopropyl-N'-二甲酰三烯三甲酮）丙氨酸_钴（II）四氯钴酸盐[5]
- 要制备复合5，在100mL圆形底部烧瓶中加入0.183克（4.70 x 10-4 mol）2，6-bis（N-isopropyl-N'-二甲苯三甲酰三烯酰二甲苯三甲酸酯）的丙酮（C17H23N7S2）6至15 mL的醋酸酯。6在此解决方案中，添加0.223克（9.37 x 10-4 mol）氯化钴六甲水合物（CoCl2+6H2O）。添加钴（II）氯化六氟化水合物后，反应溶液应立即将颜色从浅黄色变为皇家蓝色。
- 在烧瓶中加入搅拌棒。回流并搅拌20小时的反应，以确保完全反应。在减压下使用旋转剂去除溶剂。
4. 氯（n 3-S，S，N）-_2，6-双比（N-isopropyl-N-二甲酰三烯三甲酮）的再结晶-硫化[II）四氯钴酸盐[5]通过慢蒸气扩散3
- 将溶质溶解在醋酸酯（9.0 mL）中，过滤溶液，并将溶液均匀地放入 1 个 dram 小瓶中。用1.5 mL的醋酸溶液填充每个小瓶。
- 加入棉盖小瓶，允许缓慢的蒸汽扩散。将棉质紧贴在小瓶顶部的开口中。
- 将小瓶放入装有 50 mL 二乙醚的罐子中。用帽子关闭小瓶。
- 让晶体在1周内生长。
注：再结晶可能需要超过 1 天的时间。
5. X射线晶体学
- 将4的晶体安装在尼龙循环上。收集里加库牛津衍射衍射仪上的数据。在这里，X射线衍射数据收集在173（2）K.使用Olex216和ShelXT17结构解决方案程序使用17直接方法解决晶体结构。使用使用最小平方的 SlXL18优化包优化结构。
- 将5的晶体安装在尼龙循环上。收集里加库牛津衍射仪上的X射线衍射数据。在这里，X射线衍射数据收集在173（2）K.使用Olex216和ShelXT17结构解决方案程序使用17直接方法解决晶体结构。使用使用最小平方的 SlXL18优化包优化结构。
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Representative Results
合成
复合物4和5的合成通过反应含有二氧二体二体体素的前体与钴（II）氯化物六氧水合物（图2）的乙酰二醇溶液得以成功实施。这种反应发生在空气的回流温度下。一般来说，复合物4和5被观察到可溶于乙酰甲酸酯、二甲基亚硫酸盐、二氯甲烷和甲醇。复合4的颜色为绿色，复合5为蓝色。复合4和5的百分比产量是定量的。
X射线晶体学
复合4和5的单晶是通过慢蒸气扩散方法获得的，其中化合物溶解在醋酸酯中，二乙醚蒸蒸气可缓慢扩散到每个溶液中。这种再结晶方法是为难以结晶的样品生长单晶的绝佳方法。表 1显示了两个复合物的优化数据，图 3和图 4显示了单个晶体结构。基于单晶结构，每个单元单元单元包含两个钴（II）SNS针质阳离子和一个[CoCl4]2-反离子。阳离子和离子中的钴离子氧化状态为Co2+。复合物4和5的晶体结构已沉积在剑桥结构数据库中（沉积号1946448和1946449）。
两个复合体都显示关于钴（II）金属中心的伪四面体几何形状，与金属中心协调一个氮原子和两个硫体原子。此外，这两种复合物均具有四氯化物反甲苯。复合4和5的共 N 和 Co-S 粘结长度在价值上几乎相同。Co-N 债券长度为 2.084（3） * 4和 2.0763（16） * 5。4中的 Co-S 债券长度为 2.2927（12） * 和 2.3386（11） *。同样，5中的 Co-S 债券长度为 2.3180（6） * 和 2.3227（6） *。对于复合体4和5，粘结长度与先前报告的19。Co-Cl 债券长度为 2.2256（13） * 4和 2.2116（6） * 在5中。
碳-硫键长度为 1.710（4） * 和 1.714（4） * 在4和 1.693（2） * 和 1.698（2） * 在5中是相似的两个复合体和通常观察到的 C-S 单键 （1.83 +） 和 C= S 双键 （1.61 +）20.
如前所述，复合物4和5都含有四氯化二苯甲酸二甲。4的反向阴合 Cl 债券长度为 2.2709（12） *、2.2709（12） *、2.2949（11） * 和 2.2950（11） *。这些与复杂5的相似，即 2.2737（6） *、2.2737（6） *、2.2956（6） * 和 2.2956（6） * 。4 和5中的共N 和 Co-S 键长度与肝酒精脱氢酶的钴（II）替代模拟中的共 N（西丁）和共 S（半胱氨酸）键长度良好一致。在此酶中，钴-N（西丁）键长度为2.04°，钴-S（半胱氨酸）键长为2.29°和2.33×2121
在复杂4中，N-Co-S 粘结角度为 108.77（10）° 和 114.03（10）°，而在复合型5中，N-Co-S 粘结角度为 112.58（5）° 和 114.15（5）°。N-Co-S 粘结角度彼此接近，任何差异都可能是由于两个复合体不同的电子器件造成的。4和5中的 N-Co-Cl 粘结角度分别为 107.91（10）° 和 107.59（5）°。S-Co-S 角度被测量为 99.79（5）° 4 4 和 102.78（3）° 为5。最后，4的 S-Co-Cl 粘结角度为 117.98（5）° 和 108.43（5）°，5 的 S-Co-Cl 粘结角度为 111.76（3）° 和 107.93（3）°。 5
tau-4 参数也被确定为复合体4和5。复合4的tau-4参数为0.907，复合5的tau-4参数为0.94522。与方形平面几何体相比，tau-4 参数与钴中心的四面体几何更一致。四面体复合体的 tau-4 参数等于 1，方形平面复合体的 tau-4 参数等于零。
元素分析
为了研究4和5的体积纯度，重新结晶的复合体进行了元素分析。结果在表2中汇总。这里的数据表明，复合物4和5是纯的，因为计算的碳、氢和氮的百分比与碳、氢和氮的发现百分比极一致。
电喷雾质谱仪
复合物4和5的制备也证实了使用电喷雾质谱。电喷质谱是使用直接流量喷射收集的。注射量为5μL。这些数据是在正负ion模式下在安捷伦QTOF仪器上收集的。优化条件如下：毛细管 = 3000 kV，锥体 = 10 V，源温度 = 120 °C。对于复杂4，在正ion模式下，分子ion在m/z = 481.0631处被观察到。在负电位模式下，在 m/z 163.8433 处观察到 [CoCl3]-电子。对于复合5，在正ion模式下，分子ion在m/z 483.0503处被观察到。在负电位模式下，在 m/z 163.8413 处观察到 [CoCl3]-电子。
紫外线可见光谱
利用紫外线可见光谱对复合体4和5进行了分析，以进一步深入了解该复合物的电子环境。复合物4和5溶解在乙酰甲酸酯中，形成单独的溶液。复合4的浓度为1.0 x10-4 M，复合5为9.2 x10-4 M。复杂4在680nm（±1300M-1厘米-1）、632-1nm（+1100M-1厘米-1）和589nm（±1200M-1厘米-1）处在可见区域显示三个峰值。复杂5在682 nm（±1300M-1厘米-1）、613-1nm（+850M-1cm-1）、588nm（+790M-1cm-1）和573 nm（+820M-1cm-1）处显示了可见区域的四个峰值。
图1：以前使用的SNS针质配体前体。基于双子乙酰胺酮和二分二甲苯的利康前体。（A） R = iPr， （B） R = 新pentyl， （C） R = N-丁基.请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：复合物 4 和 5 的合成。合成方案，准备复合物4和5。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：复杂 4 的固态结构。固态单晶结构复合4。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：复杂 5 的固态结构。固态单晶结构复合5。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：复合4的超紫色可见光谱。复合4（1.0 x10-4 M）的超紫色可见光谱在醋酸酯中。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：复合5的超紫色可见光谱。复合5（9.15 x10-4 M）的超紫色可见光谱在醋酸酯中。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 4 | 5 | |
| */* | 90 | 90 |
| */* | 97.2252(19) | 90.770(2) |
| */* | 90 | 90 |
| 卷/+3 | 5462.6(2) | 4852.0(2) |
| Z | 4 | 4 |
| μcalcg/cm3 | 1.516 | 1.6 |
| μ/mm 1 | 11.526 | 1.56 |
| F（000） | 2556 | 2380 |
| 水晶尺寸/mm3 | 0.24 × 0.22 × 0.06 | 0.28 × 0.08 × 0.06 |
| 辐射 | 库克 （+ = 1.54184） | MoK+（+ = 0.71073） |
| 2°数据收集范围/* | 7.39 到 142.76 | 6.596 到 65.254 |
| 索引范围 | -26 × h = 29，-8 × k = 8，-39 × l = 31 | -27 × h = 28，-17 × k = 13，-33 × l = 32 |
| 收集的反射 | 10233 | 21514 |
| 独立反射 | 5235 [林特 = 0.0565，Rsigma = 0.0739] | 8079 [林特 = 0.0262，Rsigma = 0.0315] |
| 数据/约束/参数 | 5235/0/312 | 8079/0/289 |
| F2 上的贴合良好 | 0.978 | 1.035 |
| 最终 R 索引 [I>=2] （I）] | R1 = 0.0529，wR2 = 0.1246 | R1 = 0.0398，wR2 = 0.0845 |
| 最终 R 索引 [所有数据] | R1 = 0.0758，wR2 = 0.1361 | R1 = 0.0610，wR2 = 0.0964 |
| 最大差异峰值/孔 / e +3 | 0.99/-0.55 | 0.59/-0.46 |
表 1：复合体 4 和 5 的表格优化数据。复合4和5的X射线细化和收集数据。
| 复杂 | 卡路里 % C | 找到 % C | 卡路里 % H | 找到 % H | 卡路里 % N | 找到 % N |
| 4、 [C38H50Cl2Co2N10S4[CoCl4[2]CH3CN] | 40.46 | 40.26 | 4.53 | 4.39 | 13.48 | 13.17 |
| 5、 [C34H46Cl2Co2N14S4][CoCl4][CH3CN] | 35.75 | 36.20 | 4.08 | 4.20 | 17.37 | 17.40 |
表 2：复合物 4 和 5 的元素分析结果。元素分析复合物 4 和 5 的碳、氢和氮百分比结果。
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Discussion
复合体4和5的制备是方便的。关键步骤是将固体 CoCl2+6H2O 添加到包含相应配体前体的醋酸酯溶液中。在添加 CoCl2+6H2O 后，该解决方案在几秒钟内变为深绿色，形成复合4。加入 CoCl 2 +6H2O2后，该解决方案变为明亮的蓝色，形成复合5。为确保完全反应，溶液在回流上过夜。
要生长复合物4和5的单晶，需要浓缩含有复合物4或5的乙酰甲酸酯溶液。复合物必须溶解在最小数量的乙酰二角质中，以产生尽可能浓缩的复合物的解决方案。通过添加含有复杂4或5到 1 dram 小瓶的醋酸溶液，生长了4和5的单个晶体。这 1 个 dram 小瓶包含复杂4 或 5的溶液，放置在包含二乙醚的封闭罐子中。为了减缓二甲醚扩散到醋酸酯溶液的速度，每个 1 dram 小瓶中添加一个棉球。棉球必须非常舒适，以减缓扩散速度。使用棉花减缓二甲醚的扩散，其他人可以利用它种植单晶，用于坚硬的样品。
如果用于再结晶的醋酸酯中的金属复合物浓度不够强，单晶就不会形成。重新结晶尝试后的产品可能是油性残留物。研究人员需要确保金属复合物具有足够高的浓度，使单晶形成。
据我们所知，文献中没有发表过肝酒精脱氢酶的其他钴（II）替代模型复合物。今后的工作将侧重于将实验获得的紫外可见光谱与高斯计算预测的光谱进行比较，以确定针质结块的配体场强度。Miecznikowski实验室目前的工作重点是制备不含[CoCl4]2-作为反阴子的肝酒精脱氢酶的钴替代模型复合物。这些复合物目前正在筛选，以减少电子贫乏的醛和酮。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
约翰·米奇尼科夫斯基获得以下项目的财政支助：康涅狄格州航天局空间赠款联盟（编号为P-1168），费尔菲尔德大学科学研究所，艺术与科学学院出版基金，费尔菲尔德大学教师暑期研究津贴，以及国家科学基金会-主要研究仪器计划（授予编号CHE-1827854），用于资金购买400兆赫NMR光谱仪。他还感谢特伦斯·吴（耶鲁大学）在获取电喷质谱方面给予的帮助。杰里·贾辛斯基承认国家科学基金会-主要研究仪器计划（授予编号CHE-1039027）用于购买X射线衍射仪的资金。希拉·博尼塔蒂布斯、埃米尔斯·阿尔曼扎、拉米·哈尔布赫和萨曼莎·齐格蒙特承认哈迪曼学者计划提供了他们的暑期研究津贴。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL Round Bottomed Flask | Chem Glass | CG150691 | 100mL Single Neck Round Bottomed Flask, 19/22 Outer Joint |
| Acetonitrile | Fisher | HB9823-4 | HPLC Grade |
| Chiller for roto-vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Cobalt Chloride hexahydrate | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Diethyl Ether | Fisher | E-138-1 | Diethyl Ether Anhydorus |
| graduated cylinder | Fisher | S63456 | 25 mL graduated cylinder |
| hotplate | Fisher | 11-100-49SH | Isotemp Basic Stirring Hotplate |
| jars | Fisher | 05-719-481 | 250 mL jars |
| Ligand | ----- | ----- | Synthezied previously by Professor Miecznikowski |
| medium cotton balls | Fisher | 22-456-80 | medium cotton balls |
| one dram vials | Fisher | 03-339 | one dram vials with TFE Lined Cap |
| pipet | Fisher | 13-678-20B | 5.75 inch pipets |
| pipet bulbs | Fisher | 03-448-21 | Fisher Brand Latex Bulb for pipet |
| recrystallizing dish for sand bath | Fisher | 08-741 D | 325 mL recrystallizing dish for sand bath |
| reflux condensor | Chem Glass | CG-1218-A-22 | Condenser with 19/22 inner joint |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Heidolph Collegiate Rotary Evaporator with Heidolph WB eco bath Heidolph Rotary Evaporator |
| sea sand for sandbath | Acros Organics | 612355000 | washed sea sand for sand bath |
| Stir bar | Fisher | 07-910-23 | Egg-Shaped Magnetic Stir Bar |
| Vacum grease | Fisher | 14-635-5D | Dow Corning High Vacuum Grease |
| vacuum pump for rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Heidolph Rotovac Valve Control |
References
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