Summary
כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.
Abstract
Meiosis הוא תהליך הסלולר המפתח הנדרש כדי ליצור מגיים פלואידי עבור רבייה מינית. אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי הבנת האירועים כרומוזום כי מתרחשים במהלך proiotic, כולל הזיווג, synapsis, ושילוב מחדש אירועים המבטיחים הפרדה כרומוזום נכון. בזמן שהעכבר היה מודל חשוב להבנת המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס תהליכים אלה, לא כל האירועים המיוטיים במערכת זו הינם מקבילה למיוזיס אנושי. לאחרונה הדגמנו את הפוטנציאל המרגש של דג הזיברפיש כמודל של זרע-בראשית אנושי. כאן אנו מתארים, בפרוטרוט, שיטות שלנו להמחיש כרומוזומים מיוטיים וחלבונים הקשורים ההכנות כרומוזום התפשטות. ההכנות הללו יש את היתרון של מתן ברזולוציה גבוהה ניתוח של מבנים כרומוזום. ראשית, אנו מתארים את ההליך לבתר את האשכים של מבוגרים zebrafish, ואחריו הדיסוציאציה תא, הליזה, והפצת הכרומוזומים. לאחר מכן, אנו מתארים את ההליך לגילוי הלוקליזציה של חלבונים כרומוזום meiotic, על ידי זיהוי אימונוofor, ו חומצות גרעין רצפים, על ידי היברידיזציה באתרו (דג). טכניקות אלה מהווים ערכה שימושית של כלים לניתוח ציטולוגי של אדריכלות כרומטין מיוטית במערכת הדגים. חוקרים בקהילה דג זברה צריך להיות מסוגל במהירות לשלוט בטכניקות אלה ולשלב אותם לניתוח הסטנדרטי שלהם של תפקוד הרבייה.
Introduction
רבייה מינית ההכנסות באמצעות שילוב של שני מגיים פלואידי, כל אחד סוחב חצי כרומוזום משלים של תא סומאטיק. Meiosis היא חלוקת תאים מיוחדים המייצרת את גמטות מגיים דרך סיבוב אחד של שכפול DNA ושני סיבובים רצופים של הפרדה כרומוזום. ב-prophase I, כרומוזומים הומוולוגי (הומוולוג) חייבים לעבור זיווג, שילוב מחדש וsynapsis, האחרון שמאופיין בהיווצרות הקומפלקס הsynaptonemal המורכב משני צירי הומולוג הגושרים על ידי החוט הרוחבי, Sycp1 (איור 1A, B). אי כראוי לבצע תהליכים אלה יכול להוביל לייצור של מגיים aneuploid, אשר הם הגורם המוביל של הפלות בבני אדם1. הידע שלנו על הקואורדינציה בין זיווג, שילוב מחדש וsynapsis הונחה על ידי מחקרים במגוון רחב של אורגניזמים, כגון שמרים,כגון העכבר, ודרוסופילה, בין השאר2. בעוד התהליך הכללי של שיוך כרומוזום הומוולוגי ואחריו הפרדה היא שמירה היטב, התלות שלה על שילוב מחדש ו synapsis ואת סדר האירועים האלה משתנה.
Meiotic הפסקה כפולה (dsb) היווצרות, אשר יוזם שילוב הומוולוגי, מתרחשת ליד טלומרים באשכולות הזר במהלך לפטוטנא ו synapsis תפתח זמן קצר לאחר3,4. תצורה זו של היווצרות dsb ו synapsis חניכה היא גם מאפיין של המיוזיס גברי בבני אדם, אבל לא בעכבר5,6,7,8, מציע כי דג זברה יכול לשמש כמודל הזרע האנושי. ישנם גם מספר יתרונות מעשיים של הלומדים מיוזיס. שני הזכרים והנקבות עוברים במהלך הבגרות, הגונדות שלהם נגישים בקלות, ומאות צאצאים מופקים מצלב אחד. בנוסף, העוברים שקופים ולפתח חיצונית, אשר מקלה על גילוי מוקדם של סטיות בהתפתחות העובריים בשל מגיים aneuploid3,9. החסרונות של השימוש דג זברה הם כי הם איטיים להגיע בגרות מינית (~ 60 ימים) ואת כמות החומר הדרוש עבור כפולות משטח גרעיני יש לאסוף מ-~ 10-20 בעלי חיים למבוגרים, בהתאם לגודלם.
ההכנות התפשטות כרומוזום מיוטית הם כלי חיוני עבור לימוד דינמיקה כרומוזום בכל האורגניזמים המודל, מאז חתימות מפתח של דינמיקה כרומוזום meiotic יכול להיות נחקר. ב zebrafish, היבטים מרכזיים של ההתקדמות של התוכנית meiotic והארגון הגרעיני כבר גזור דרך בודק כפולות משטח גרעיני, המכונה כאן כמו כרומוזום מתפשט, עם נוגדנים לזיהוי אימונוofor, חלבונים ו/או חומצות גרעין על ידי דגים3,4,9,10,11,12. ואכן, ניתן לשמור על ההתאמה המקוטלת של טלומרים באשכולות בפרחים בהכנה לכפולה (איור 1C). לאחרונה, השתמשנו בכרומוזום הספרציט spermatocyte מתפשט יחד עם שיטות זיהוי של הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ סופר ברזולוציה כדי להבהיר את ההתקדמות המפורטת של הדינמיקה של ההומופיש, שיוך כרומוזום הומוולוגי, לוקליזציה של כפול סטרנד, ו synapsis ב מעברים meiotic מפתח3. כאן אנו מציגים שיטות כדי להכין כרומוזום כפולות מן הזרע של האשכים דג זברה ולאחר מכן כתם אותם עם חומצות הגרעין של הפלורסנט פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות חוזרות ונשנות רצפי ו מimmunofluorescence זיהוי של חלבונים הקשורים בכרומוזום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות הכרוכות בצדגים בוצעו באמצעות תקנים אתיים שאושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשימוש ב-UC דיוויס.
1. הליך התפשטות כרומוזום
הערה: הפרוטוקול הבא נועד ליצור 4-6 שקופיות, עם מאות גרעינים מיוטיים מתפשטים לכל שקופית. מספר האשכים המשמשים יהיה תלוי בגודל של הדג. צפו להשתמש 20 בעלי חיים ב ~ 60 ימים הפריה פוסט (dpf) ו 15 בעלי חיים ~ 6 חודשי הפריה פוסט (mpf). עבור דג גדול (למשל, 12 mpf) 10 בעלי חיים צריך להספיק. שים לב כי האשכים של כמה מוטציות מיוטיות (למשל, spo11-/-) יהיה קטן במקצת3. בפרוטוקול זה, מאגר האשכים אחד נחשב כמדגם אחד. מומלץ שלא יותר מ -4 דגימות מוכנות במקביל.
- בצע את הפתרונות הבאים לפני תחילת הליך ההתפשטות
הערה: נוח להכין את הפתרונות הבאים בכמויות שנקבעו לשימוש בניסויים עתידיים בהפצת.- הכינו את הפתרון ה0.1 של סוכרוז באמצעות המסת 3.42 גרם של סוכות ב 100 מ ל של מים מזוקקים. להביא את הפתרון סוכות ל-pH 8 באמצעות 1 M Tris-HCl כי הוא גם ב-pH 8. לאחר מכן מסננים לעקר את הפתרון הסוכרוז. . חנות בטמפרטורת החדר
- להפוך מלוחים 10x פוספט באגירה (PBS) פתרון מניות לריכוז הסופי של 1.37 M הנאל, 27 מ"מ KCl, 73 mM Na2hpo4 ו 27.6 mm KH2פו4 ב 1.8 L של מים מזוקקים. מערבבים עד התפרקה, ולאחר מכן להתאים את ה-pH ל 7.3 באמצעות NaOH ו החיטוי. . חנות בטמפרטורת החדר
- לעשות 400 μg/mL DNase I פתרון במים מזוקקים סטרילי. חנות ב-20 ° c. מומלץ להכין 5 מ ל של פתרון זה ולאחר מכן לאחסן כמו 100 μL ali, ts.
- בצע את הפתרונות הבאים ביום הפרוטוקול המתפשט
הערה: ליעילות הזמן, עדיף לעשות את הפתרון הקולגן מיד לאחר מנתח את כל האשכים ולאחר מכן להפוך את טריפסין וטריפסין פתרונות מעכבי במהלך הזמן כי הדגימות מטופלות בקולגן.- התמוססות 4 מ ג של הקולגן בשנת 200 μL של מדיום הנשר של דולבקה שונה (DMEM) לכל מדגם (2% w/v קולגן הריכוז הסופי). . שמור על הקרח עד שיהיה צורך . הקולגן לא מנתק את האשכים
- התמוססות 1.4 מ ג של טריפסין ב 200 μL של DMEM לכל מדגם (0.7% w/v טריפסין ריכוז סופי). . שמור על הקרח עד שיהיה צורך . הטריפסין יעזרו לנתק את התאים
- התמוססות 10 מ ג של טריפסין מעכבי ב 500 μL של DMEM לדוגמה (2% w/v טריפסין מעכב ריכוז סופי). . שמור על הקרח עד שיהיה צורך מניעת טריפסין מונעת מטריפסין לפגוע בתאים.
- להכין פתרון פורמלדהיד 1% (מ 16% מראש הפתרון) עם 0.15% טריטון X-100 במים מזוקקים סטרילי. . שמור על הקרח עד שיהיה צורך 1% פורמלדהיד יכול להיות מוכן בעוד האשכים מטופלים עם טריפסין ו DNase I (כלומר, במהלך שלב 1.4.7 של הליך התפשטות).
התראה: פורמלדהיד הוא מסוכן.
- חיתוך אשכים מן הגבר המבוגר
- המתת חסד זכר דג זברה (> 60 dpf) על ידי מיזוג אותם במים קרח. הדגים ניתן לשמור במים קרח עד מוכנים לנתח, עם זאת יש לגזור בהקדם האפשרי.
הערה: זן סוג פראי AB משמש עבור הליך זה, אבל זנים אחרים סוג פראי צריך גם להיות מוכן. הזמן הארוך ביותר ששמרנו דגים בתוך מי קרח לפני הניתוח הוא 3 h ללא כל השפעה ניכרת על הפרוטוקול. - הוא ערוף דג אחד בכל פעם עם מספריים קטנים ולאחר מכן להשתמש מספריים מיקרו לחתוך לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף את חלל הגוף.
- באמצעות מלקחיים (ראו טבלת חומרים) ב1.65 x הגדלה תחת מיקרוסקופ. בצע את הניתוח בצלחת פטרי מצופה סיליקון עם מכוסה על ידי בריכה רדודה של 1x PBS.
הערה: הבעיים ממוקם בין שלפוחית השתן והמעי וייראה בהיר יותר מרקמת השריר (איור 2א). הפיתיון צריך להיות 2 האונות כאשר הוסרו מן הדגים (איור 2ב). - להסיר את השומן הרבה והרקמה המקיפה מתוך התוך ההעיד ככל האפשר. לאחר מכן להוסיף כל הראש לגזור ישירות לתוך שפופרת 5 מ ל עם 2 מ ל DMEM ולשמור על קרח.
הערה: שלבים 1.3.3 ו-1.3.4 צריכים להיות שולטים לפני ביצוע ניסויים כלשהם.
- המתת חסד זכר דג זברה (> 60 dpf) על ידי מיזוג אותם במים קרח. הדגים ניתן לשמור במים קרח עד מוכנים לנתח, עם זאת יש לגזור בהקדם האפשרי.
- דיסוציאציה של תאים האשכים
- מחמם לפני החום 100 מ ל של 0.1 מ ' סוכות פתרון ל 37 ° c.
- הוסף 200 μL של התמיסה הקולגן לצינור 5 מ ל עם האשכים. לערבב את הפתרון על ידי היפוך זה מספר פעמים.
- לנער בעדינות את האשכים בתוך שייקר חממה אופקית ב 100 סל ד ב 32 ° צ' עבור 50 דקות עד שעה עד DMEM זיכרון מעונן, האשכים הם בגושים קטנים. במהירות להפוך את הצינור כל 10 דקות כדי להקל על הדיסוציאציה.
- כדי לשטוף את הקולגן, להוסיף DMEM לנפח הסופי 5 mL ולהפוך את הצינור כמה פעמים. גלולה האשכים ב ~ 200 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו 3 מ ל של סופרנטאנט כך שרק 2 מ ל נותרו.
הערה: הוספה, הסרה, והעברה של DMEM תבצע עם פיפטות להעביר פלסטיק עבור כולו של הליך התפשטות כרומוזום. - חזור על השלב 1.4.4 פעמיים עבור סך של 3 שוטף Dמאמ. אל להשעות את הגלולה בין שוטף Dמאמ. לאחר השטיפה האחרונה DMEM, להסיר 4 mL של supernatant כך רק 1 mL נשאר.
- הוסף 1 mL של DMEM עבור נפח כולל של 2 מ ל ולהוסיף 200 μL של פתרון טריפסין ו 20 μL של הפתרון הראשון של DNase. היפוך הצינור כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון.
- הרעד האופקי של הצינור ב-32 ° c עבור 5-15 דקות ב-100 rpm עד שהפתרון DMEM מכיל רק כמה גושים. במהירות להפוך את הצינור כל 5 דקות כדי להקל על הדיסוציאציה.
הערה: על המקבצים להיות קטנים במידה ניכרת לאחר הטלטול. - הוסף 500 μL של פתרון המעכב טריפסין ו 50 μL של פתרון DNase I. היפוך הצינור כמה פעמים כדי לערבב, ולאחר מכן בקצרה לסובב בתוך ~ 200 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר נוזל או גושים שעשויים לדבוק כובע הצינור או בצד של הצינור.
- מניחים את השפופרת על הקרח ומחדש את ההשעיה התא על ידי מפיג שוב ושוב למעלה ולמטה עם מעבר פלסטיק העברת הצנרת עבור 2 דקות כדי להקל על הדיסוציאציה של כל הגושים הנותרים. אל תתנו השעיית תא להיכנס הנורה של פיפטה העברה. אחרי 2 דקות, מנקז את ההשעיה חזרה לתוך הצינור 5 מ ל.
- טרום רטוב 100 יקרומטר תא מסננת עם dmem ומניחים אותו על גבי שפופרת 50 mL על קרח.
- העברת ההשעיה התא דרך מסננת טיפה אחת בכל פעם באמצעות פיפטה העברה פלסטיק. ודא שההשעיה של התא אינה נכנסת לתוך הנורה של הפיפטה העברה.
- להעביר את פילטרט באמצעות מעבר פלסטיק העברה צנרת לצינור חדש 5 מ ל ולהוסיף dmem לנפח הסופי של 5 מ ל. הקפד לאסוף את התאים הנמצאים במאגר מצורף התחתון של המסנן עם העברה נקייה פלסטיק להעביר. גלולה התאים ב ~ 200 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר כמות גדולה ככל האפשר. מבלי להפריע לגלולה
- הוסף 5 μL של פתרון DNase I ישירות לתוך הגלולה. ואז לערבב את הגלולה עם פתרון DNase I על ידי מגרד בעדינות את החלק התחתון של הצינור 4-5 פעמים לאורך ריק 1.5 mL מתלה שפופרת מיקרוצנטריפוגה. מגרד בחומרה יותר מדי יכול לגרום להפחתת התפשטות התאושש.
- הוסף DMEM לנפח סופי של 5 מ"ל ולערבב את הפתרון על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. מקובל שמקבצים עדיין יהיו נוכחים אחרי הטיפול הראשון DNase I.
- גלולה ההשעיה התא ב ~ 200 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 1.4.13-1.4.16 נוספים 1-3 פעמים עד שגלולה שהושהתה מחדש אינה מנובעת בתוספת של DMEM. לאחר הספין האחרון, להסיר את הכמות הרבה ככל האפשר מבלי להפריע את הגלולה.
הערה: מצפה להפחתה בגודל גלולה עם כל DNase I טיפול; מעל 4 סך DNase I שוטף עלול לגרום לאובדן משמעותי של תאים. אם שום גלולה נראית לאחר DNase אני טיפולים צעדים, לא להמשיך עם ההליך. בטל כל DNase שאינו בשימוש. - הוסיפו 1 מ ל של 1x PBS והשהה מחדש את הגלולה על ידי גירוד בעדינות את החלק התחתון של הצינור לאורך מתלה שפופרת ריק 1.5 mL.
- גלולה ההשעיה התא ב ~ 200 x g עבור 5 דקות ולאחר מכן להסיר supernatant הרבה ככל האפשר מבלי להפריע את הגלולה.
- גזור ~ 3 מ"מ מסופו של הטיפ 200 μL להרחיב את הצמצם והשהה מחדש את הגלולה ב ~ 80 μL של 0.1 M בפתרון התמיסה על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם הקצה החתוך את הצנרת. תן להשעיה של התא לשבת בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
- הפצת כרומוזומים על מגלשות זכוכית
- מעיל אחד שקופית עם 100 μL של 1% פורמלדהיד עם 0.15% טריטון X-100 עם צד של קצה של פיפטה. לאחר מכן להוסיף 18 μL של השעיית תא של סוכרוז על מרכז השקופית בקו ישר בניצב לקצה הארוך. הטה את השקופית הלוך ושוב (~ 60 °) כדי להקל על הפצת ההשעיה של התא לכל הפינות.
- מניחים את השקופיות למטה בחדר לחות במקצת סדוק לפתוח (איור 3) כדי למנוע את פתרון פורמלדהיד מייבוש. מניחים את תא הלחות במגירה חשוכה בלילה.
- הסירו את המכסה מחדר הלחות והניחו לשקופיות להתייבש במלואה.
- מניחים את השקופיות בצנצנת Coplin ולאחר מכן למלא את הצנצנת Coplin עם מים מזוקקים ו דגירה עבור 5 דקות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להציב את השקופיות בצנצנת הקופלין בתבנית זיגזג כדי למקסם את מספר השקופיות לכל צנצנת של Coplin. ודא שיש מקום לנוזלים לעבור בין כל השקופיות. - יוצקים את המים וממלאים את הצנצנת עם 1:250 סוכן הרטבה (ראה לוח חומרים). רוחצים 2 פעמים עבור 5 דקות כל אחד עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- אפשר לשקופיות להתייבש במלואו ולאחסן ב-20 ° c עד שהן מוכתמות.
הערה: הארוך ביותר יש לנו שקופיות מאוחסן ללא כל השפלה ניכרת של כרומוזומים הוא ~ 2 חודשים.
2. לבדוק כתמים של הרשות הפלסטינית
הערה: טלומר חוזר יכול להיות מוכתם באמצעות fluorophore-מעלה מעלה הרשות הפלסטינית בדיקה כי hybridize להוביל טלומר מובילים חוזר (CCCTAA). בדיקות של הרשות הפלסטינית יש עמוד שדרה נייטרלי, אשר מגביר את הזיקה הכלאה ל-DNA טעונה שלילית, והתוצאה היא מעט ללא רקע. שלב הבדיקה של טלומר הוא אופציונלי. כדי להמשיך להכתים נוגדנים, מימה מחדש שקופיות ב-1x PBS כפי שמצוין בשלב 2.2.2., ולאחר מכן להמשיך ישירות "מכתים נוגדן ראשוני".
-
להפוך את הרשות הפלסטינית בדיקה ריאגנטים לפני התחלת הצביעת טלומר
הערה: נוח להכין את הפתרונות הבאים בכמויות המפורטות לשימוש בניסויים עתידיים. תנאי האחסון המפורטים להלן.- הכינו 2 ליטר של תמיסת מלח-נתרן ציטראט עם ריכוז סופי של 3 מטר ו0.3 מ נתרן ציטראט. לאוטוקלב ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- הפוך 50 mL של פתרון טרום היברידיזציה המכילה RNA העברה לריכוז הסופי של 50% הטופסולמיד, 5x למטה, 50 μg/mL הפרין, 500 העברה μg/mL, 0.1% רצף 20 ולהוסיף 460 μL של חומצת לימון 1 M כדי להביא את הפתרון ל-pH ~ 6. חנות ב-20 ° c.
התראה: הטופסאחר הוא מסוכן. . הכן את התמיסה בתוך מכסה המנוע - להפוך 50 mL של פתרון טרום היברידיזציה מוכן באותו אופן כמו בשלב 2.1.2 מבלי להוסיף RNA העברה. חנות ב-20 ° c.
- הרשות הפלסטינית החוקרת TelC-Cy3 ו-TelC-Alexa647 מוכנים כ-50 μM מניות במסגרת הוראות היצרן. אחסנו את הבדיקות של הרשות הפלסטינית כ-8 μL ב80 ° c.
- לעשות לפחות 1 מ ל של 100 mg/mL פתרון מלאי של סרום שור (BSA) במים מזוקקים סטרילי. חנות ב-20 ° c. אם הכנת יותר מ-1 מ ל של מלאי BSA, אחסן את הפתרון כ-1 mL.
- באמצעות שפופרת 2 מ ל, להכין 2 מ ל של פתרון הכלאה על ידי הוספת 27 μL של 100 mg/mL BSA ו 8 μL של 50 μM הפלסטינית בדיקה כדי 1.965 mL של פתרון טרום הכלאה המכיל להעביר RNA. חנות בחושך ב-20 ° c.
-
הרשות הפלסטינית מכתים בדיקה
- מחממים תנור הכלאה ל 82 ° c.
- מייבשים מחדש שקופיות עם 500 μL של 1x PBS לכל שקופית עבור 5 דקות בתא לחות בטמפרטורת החדר. הסר את ה-PBS על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר.
- מחממים את השקופיות ואת שפופרת 2 מ ל המכילים את הפתרון הכלאה ישירות על משטח מתכת בתנור הכלאה מחומם עבור 2 דקות.
- בעוד שמירה על השקופיות על פני השטח מתכת, להוסיף 100 μL של הפתרון הכלאה לכל שקופית ולאחר מכן לכסות את השקופיות עם שמיכות פלסטיק (~ 25 מ"מ x 75 מ"מ) לגזור את הצורה של תיק לחיטוי. ניתן לשקופיות לשבת 82 ° c עבור 10-12 דקות.
- מניחים את השקופיות בתא לחות בחושך בשעה 37 ° c עבור 16-24 h. מנקודה זו והלאה ולשם מכתים את הנוגדן העיקרי והמשני, יש לשמור על השקופיות בחשכה כדי למנוע הלבנת שידור של אות הזריחה. לאחר תקופת הדגירה, הריאגנטים לצביעת נוגדנים יכול להיות מוכן במהלך שלב 2.2.9.
- הסר את הכיסויים. עם קצה הפיפטה
הערה: כדי להקל על ההסרה של שמיכות, ~ 50-100 μL של פתרון הכלאה ללא RNA העברה ניתן להעביר בעדינות בין השקופית ואת coverslip כמו coverslip מוסר. - פיפטה 500 μL של פתרון טרום היברידיזציה ללא RNA העברה על כל שקופית ומניחים את השקופיות בתא הלחות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר.
הערה: הפתרון טרום היברידיזציה ללא RNA העברה אינו מחומם מראש לפני הוספתם על כל שקופית. - פיפטה 500 μL של 50% טרום הכלאה פתרון ללא RNA העברה ב-1x PBS לכל שקופית ולמקם את השקופיות בתא לחות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר.
- העבר את השקופיות אל צנצנת Coplin ולשטוף 3 פעמים ב-1x PBS עם טלטול עדין עבור 15 דקות לשטוף בטמפרטורת החדר.
- הסר את השקופיות מצנצנת הקופלין והסר את ה-PBS העודף על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר. ואז המשך לשלב 3.2 "מכתים נוגדן ראשוני".
3. מכתים את הנוגדן
הערה: נוגדנים הגדלים חלבונים meiotic ידוע ניתן להשתמש לזיהוי immunofluorescence ההכנות כרומוזום התפשטות. נוגדנים משנית מבותמים fluorophores שונים מאפשר חלבונים מרובים להיות מוכתם בו זמנית, אם הנוגדנים העיקריים גדלו בעלי חיים שונים.
-
בצע את הפתרונות הבאים ביום של מכתים הנוגדן הראשי והמשני
- לעשות 1 L של PBT עם 1x PBS ו 0.1% טריטון X-100 מדולל במים מזוקקים. . חנות בטמפרטורת החדר זה יכול להיות מוכן לפני הזמן בכמויות גדולות לניסויים עתידיים התפשטות.
- הכינו 500 μL של בלוק נוגדן לכל שקופית לריכוז הסופי של 2 מ"ג/mL של BSA ו 2% סרום עז ב PBT.
- כדי להפוך 100 μL של ערבוב הנוגדן הראשי או המשני לכל שקופית, הוסף את הנוגדנים המתאימים בריכוז הנכון (ראה טבלת חומרים) לתוך בלוק הנוגדן.
הערה: ייתכן שיהיה צורך לקבוע ריכוז באמצעות נוגדן. בדיון, אנו כוללים רשימה של נוגדנים שניסינו עם הצלחה (עם דילול/ריכוזים) ואלה שניסינו ללא הצלחה.
-
מכתים נוגדנים ראשוני
הערה: ארנב נגד אדם SCP3 ועוף נגד zebrafish Sycp1 משמשים בדרך כלל עבור כתמים הנוגדן העיקרי.- לאחר הסרת העודפים PBS מהשקופיות, להוסיף 500 μL של בלוק נוגדן לכל שקופית ולמקם את השקופיות בתא לחות בטמפרטורת החדר למינימום של 20 דקות.
- הסר את בלוק הנוגדן על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר.
- הוסף 100 μL של שילוב הנוגדן העיקרי בבלוק נוגדנים לשקופית לכסות את השקופיות עם שמיכות פלסטיק עשוי שקית החיטוי. מניחים את השקופיות בתא לחות ללילה ב -4 ° c.
- הסר את הכיסויים עם טיפ פיפטה ושטוף את השקופיות 2 פעמים למינימום של 5 דקות כל אחד עם 1 x PBS בצנצנת Coplin עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- הסר את ה-PBS על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר.
-
מכתים נוגדנים משני
הערה: עז מצומדת נגד ארנבת ונוגדנים אנטי עוף fluorophores שונים משמשים לצביעת בריכוז 1:1000.- הוסף 500 μL של בלוק נוגדן לכל שקופית ומניחים את השקופיות בתא הלחות בטמפרטורת החדר למינימום של 5 דקות.
- הסר את בלוק הנוגדן על-ידי הקשה על צד השקופית על מגבת נייר.
- הוסף 100 μL של שילוב נוגדן משני בבלוק נוגדן לכל שקופית ולכסות את השקופיות עם שמיכות פלסטיק עשוי שקית החיטוי. הניחו את השקופיות בתא לחות ב-1 h ב-37 ° c.
- הסר את הכיסויים עם טיפ פיפטה ושטוף את השקופיות 3 פעמים עבור מינימום של 5 דקות כל אחד עם 1 x PBS בצנצנת Coplin עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- שטפו את השקופיות פעם אחת למינימום של 2 דקות עם מים מזוקקים בצנצנת Coplin עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- האוויר מתייבש את השקופיות, כדי להקל על הייבוש.
- מקום 20 μL של אנטי התפוגגות השוטר עם או בלי DAPI (ראה טבלת חומרים) כמו 3 נקודות מרווח באופן שווה על שמיכות זכוכית (24 מ"מ x 60 מ"מ).
- מניחים את השקופיות עם הפנים למטה על כיסוי זכוכית ולאחר מכן לאטום את שמיכות עם לק ציפורניים על הקצה חופפים את הקצה של השקופית.
- אחסן את השקופיות המוכנות ב-4 ° צ' עד שתהיה מוכן להדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש לנו מתווה שיטה כדי להכין ולהמחיש הדמיה של ההכנות התפשטות הזרע. כאשר מבוצעת בצורה נכונה, ההליך שלנו מניב היטב, גרעינים לא חופפים. כדי לשחזר את הגרעינים האלה, חשוב לקבל את הכמות המתאימה של חומר ההתחלה (כלומר, האשכים), לטפל באשכים למשך זמן מספיק בטריפסין ומספר הולם של טיפול DNase I. ממרחים אלה יכולים להיות מוכתם עבור טלומרים וחלבונים meiotic ללמוד התקדמות meiotic במהלך prophase I. איור 1 מתאר דוגמאות של ההכנות התפשטות מוכתם תכונות כרומוזום בשלבים שונים של prophase i. איור 4 ממחיש דוגמה של גרעיני התפשטות גרוע.
איור 1: מייצגים של תמונות ברזולוציה סופר של כרומוזום ההכנות להתפשט עם הרשות הפלסטינית ובבדיקות נוגדנים. (א) סכמטי של הקומפלקס הsynaptonemal. (ב) זוג synapsed של יומני הומופינים המציגים את החלבון ציר הכרומוזום Sycp3 (ירוק), החלבון הפילמנט הרוחבי Sycp1 (אדום), ו-DNA (כחול) התמונה על ידי מיקרוסקופ תאורה מבניים (SIM) באמצעות מטרה 100x. סרגל בקנה מידה = 1 μm. (ג) לוחות בצד שמאל להראות שלושה שלבים proiotic: לפטון (למעלה), מוקדם-זיטנא (באמצע) ו pachytene (למטה). סרגל קנה המידה = 5 μm. מימין: תמונות מייצגות המכילות טלומרים (מגנטה) לכל שלב. סרגל קנה המידה = 1 μm. הדמויות מותאמים מ-Blokhina ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה של האשכים דג זברה (~ 7 חודשים הפריה הפוסט). (א) תמונה מראה את המיקום היחסי של הבראות בתוך הדג. המעיים יושבים בין שלפוחית. השתן לבין המעי הגס (ב) אורך של בנות. לדגים הצעירים יותר. יהיו אשכים קטנים יותר לכפולות של כרומוזום, להסיר כמו שומן הרבה רקמות שמסביב ככל האפשר מן הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חדר לחות לשקופיות. חדר הלחות שלנו מורכב משימוש בקופסת פוליסטירן מוקצף (21 ס"מ x 19 ס מ) המיועדים למשלוח כימיקלים אלקטרופורציה. העברנו מגבונים לחים ברקמה דקה (ראו טבלת חומרים) בכל חריץ אחר. השקופיות ממוקמות שטוחות מעל הרכסים מבלי לגעת במגבונים הרטובים. חדר לחות מסחרי זמין גם הוא (ראה שולחן חומרים). אנו מצפים כי כל קופסת פוליסטירן מוקצף מצויד רכסים וחריצים (למשל, באמצעות פיפטות זכוכית13) ניתן להשתמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמאות לכפולות באיכות ירודה עקב טיפולים מספיקים של DNase I. כרומוזומים מיוטיים ויטראז עבור Sycp3 התמונה על ידי ה-SIM באמצעות מטרה 20x. מספיק DNase I טיפולים מוביל גרעינים חופפים עקב ההשעיה הצמיג הצמיגי מונע התאים מתפשט כראוי על השקופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמאות לכפולות של כרומוזום בשיטה חלופית11. כרומוזומים מיוטיים ויטראז לSycp3 (ירוק) ו-Sycp1 (אדום). כרומוזום מתפשט הוכנו כפי שמתואר על ידי Sansam ו-Pezza11. שיטה זו ניתן לבצע באמצעות דג בודד במקום מספר דג זברה הנדרש עבור הפרוטוקול שלנו. בידינו, מקובל לראות כרומוזומים שאינם מתפשטים היטב. יש גם עלייה ניכרת בצביעת הרקע כי התוצאה של פסולת כי הוא השאיר על השקופיות במהלך הניתוח התפשטות הכרומוזום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטות כדי לחקור את המיקום של טלומרים ו כרומוזום הקשורים חלבונים בפני שטח גרעיני כפולות מבודד spermatocytes מתוך האשכים דג זברה. אנו מצפים כי שיטות אלה יחולו על ניתוח של ספרציטים במינים אחרים של teleost עם הסתגלות לגודל של בדיקת.
בעוד רק כמה נוגדנים הועלו כדי להשתמש בחלבונים meiotic הדגים, יש לנו הצלחה באמצעות נוגדנים הבאים העלה האדם (ח) או העכבר (m) חלבונים. המעבדה שלנו העלה נוגדנים Sycp1 חלבון דג זברה (zfSycp1) בעוף ששימש כסמן אמין עבור synaptonemal קומפלקס (SC), עם זאת, חלבון זה הנוכחי רק מ זיטנא מוקדם כדי pachytene מאוחר, כאשר כרומוזומים הם synapsed מלא. הארנב anti-hSYCP3 נוגדן כבר אמין מאוד לזהות צירים כרומוזום meiotic מ לפטון עד פירוק של SC ב pachytene מאוחר (איור 1B, ג). בעיקר, לא צפינו בשלב דיפלוין קלאסי עם צירים באורך מלא מוגדר על ידי Sycp3 והעדר Sycp1, הרומז כי, בניגוד לעכבר, הצירים עשויים להיות מושפל לאחר היציאה מ pachytene3. אחרים נוגדנים הזמינים מסחרית ל-m, h או החלבונים meiotic שניתנו תוצאות חיוביות כוללות גם DNA שילוב/שכפול ארנב anti-hRAD51 ו ארנב anti-hRPA. המקור של כל נוגדן והדילול בשימוש מופיע בטבלת החומרים. אלה שניסינו ללא הצלחה באמצעות שלושה מדלל לפחות שונים כוללים עז anti-hDMC1, העכבר anti-hMlh1, העכבר נגד אוגרים Sycp3, העכבר anti-hRPA.
ישנם שלושה בשלבים קריטיים של הליך התפשטות כרומוזום. הראשון הוא איסוף כמות החומר הנכון. 15 האשכים שלמים צריך להיות מספיק עבור פרוטוקול התפשטות של ~ 6 הזכרים אמ, ומספר זה יכול להיות מותאם למעלה או למטה בהתאם לגודל של בעלי החיים. זכור כי כמה מוטציות meiotic יהיו האשכים קטנים יותר, כך 2 בעלי חיים נוספים יש להשתמש. הצעד החשוב השני הוא הדיסוציאציה של תאים. במהלך העיכול, אם האשכים לא לנתק לתוך גושים קטנים, סביר להניח כי התאים מעטים מדי יהיה התאושש מהליך התפשטות. צעד מפתח שלישי הוא הנוכחות של גלולה נראה אחרי הטיפולים DNase I. אם גלולה אינה גלויה, סביר להניח כי הליך התפשטות תניב מעט גרעיני. אובדן של גלולה עלול להתעורר אם מעטים מדי בעלי חיים משמשים או אם יותר מדי שוטף של DNase אני מתבצעות. מצד שני, מעטים מדי טיפולים DNase יכול לגרום השעיה תא מעיים, אשר תמנע התאים מתפשטת על השקופית (איור 4). חשוב להמשיך לבצע טיפולים DNase I (לכל היותר 4 טיפולים) עד שמקבצים אינם נוכחים עוד בעת הוספת Dזכור.
כרומוזום הציג התפשטות הטכניקה מניב מאות גרעינים התפשטה היטב לכל שקופית. באמצעות הליך זה, היינו מסוגלים לספק ניתוח מפורט של אירועים מרכזיים במהלך הזרע שימוש במיקרוסקופ סופר ברזולוציה3. בידינו, פרוטוקול זה יצר כרומוזומים התפשטות טוב יותר, עם פחות פסולת על השקופית, ופחות מכתים הרקע לעומת שיטות מהירות יותר באמצעות חיות בודדות שתוארו על ידי Moens14 ו Sansam ו pezza11 (איור 5). הבדלים אלה עשויים לנבוע מהשימוש בקולאז, טריפסין ובטיפולים DNase בפרוטוקול שלנו. שתי מגבלות של הטכניקה שלנו הם הדרישה של שימוש 10-20 מבוגרים בזכרים דג זברה ואת הטיפולים האנזים מפרך יותר ושטיפת שלבים. אם אין צורך בזיהוי ברזולוציה סופר, אם חומר ה-דג זברה מוגבל, או יותר משני תנאים נבדקים במקביל, שיטות מהירות יותר עשויות להיות חלופות מתאימות יותר14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים טרנט ניומן ומאסדה שריפי על הערות על כתב היד ו נגוין על סיוע לייעל את השיטות למריחה ולצביעת כרומוזומים מן הדגים מייציטים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM079115 הוענק S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
