Summary
핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.
Abstract
Meiosis는 성적인 재생산을 위한 haploid gametes를 만드는 데 필요한 중요한 셀룰러 프로세스입니다. 모형 유기체는 적당한 염색체 분리를 지키는 페어링, 시냅스 및 재조합 사건을 포함하여 meiotic prophase 도중 일어나는 염색체 사건을 이해하는 중요한 역할을 했습니다. 마우스가 이 프로세스의 근본적인 분자 기계장치를 이해하기 위한 중요한 모형이 되는 동안, 이 시스템의 모든 meiotic 사건은 인간 적인 사람 막이오시스와 유사하지 않습니다. 우리는 최근에 인간 정자 발생의 모형으로 zebrafish의 흥미진진한 잠재력을 설명했습니다. 여기에서 우리는 염색체 퍼짐 준비에 있는 meiotic 염색체 그리고 관련있는 단백질을 구상하는 우리의 방법을, 상세히 기술합니다. 이러한 제제는 염색체 구조의 고분해능 분석을 허용하는 장점이 있다. 첫째, 우리는 성인 얼룩말에서 고환을 해부하는 절차를 설명하고, 그 다음에 세포 해리, 용해 및 염색체의 확산을 설명합니다. 다음으로, 우리는 마이오성 색소 단백질의 국소화, 면역 형광 검출 및 핵산 서열, 사이투 혼성화 (FISH)의 형광에 의해 국소화를 검출하는 절차를 설명합니다. 이러한 기술은 제브라피시 시스템에서 메오틱 크로마틴 아키텍처의 세포학적 분석을 위한 유용한 도구 세트를 포함한다. zebrafish 지역 사회에 있는 연구원은 이 기술을 빨리 마스터하고 생식 기능의 그들의 표준 분석에 통합할 수 있어야 합니다.
Introduction
성적인 재생산은 두 개의 haploid gametes의 조합을 통해 진행, 각각 체세포세포의 염색체 보완의 절반을 들고. Meiosis는 DNA 복제의 1 개의 라운드 및 염색체 분리의 2개의 연속적인 라운드를 통해 haploid gametes를 생성하는 전문화한 세포 분열입니다. prophase I에서 상동 염색체 (homologs)는 페어링, 재조합 및 시냅시스를 거쳐야하며, 후자는 횡 필라멘트에 의해 브리지 된 두 개의 상동 축을 포함하는 시냅톤 복합체의 형성을 특징으로하는 Sycp1(그림 1A,B). 이러한 프로세스를 제대로 실행하지 못하면 인간1의유산의 주요 원인인 이수성 게임의 생산으로 이어질 수 있습니다. 페어링, 재조합 및 시냅시스 사이의 조정에 대한 우리의 지식은 효모, C. 예쁜꼬마선충,마우스 및 초파리와같은 광범위한 유기체에 대한 연구에 의해 촉진되었습니다2. 상동 염색체 쌍과 분리의 일반적인 과정은 잘 보존되는 동안, 재결합 및 시냅증에 대한 의존성과 이러한 이벤트의 순서는 다양합니다.
상동 재조합을 개시하는 Meiotic 이중 가닥 휴식 (DSB) 형성은 렙토텐 동안 꽃다발에 클러스터된 텔로미어 근처에서 발생하며 시냅스는3,4직후에 계속됩니다. 이러한 DSB 형성 및 시냅스 개시의 구성은 또한 마우스5,6,7,8에서남성 남성 남성 만기증의 특징이며, 제브라피쉬가 인간 정자 발생을 위한 모델로 작용할 수 있음을 시사한다. 또한 제브라피시 인자해를 연구하는 몇 가지 실용적인 이점이 있습니다. 남성과 여성 모두 성인기 동안 gametogenesis을 겪고, 그들의 생식선쉽게 접근 할 수 있으며, 자손의 수백은 하나의 십자가에서 생성됩니다. 부가적으로, 배아는 투명하고 외부적으로 개발되며, 이는 이수엽 게임테스3,9로인한 배아 발달에서 수차의 조기 발견을 용이하게 한다. 제브라피시를 사용하는 단점은 성숙도(~60일)에 도달하는 속도가 느리며 핵 표면 확산에 필요한 물질의 양은 크기에 따라 ~10-20마리의 성인 동물로부터 수집되어야 한다는 것입니다.
meiotic 염색체 퍼짐 준비는 meiotic 염색체 역학의 중요한 서명이 조사될 수 있기 때문에, 모든 모형 유기체에 걸쳐 염색체 역학을 공부하기 위한 중요한 공구입니다. 제브라피시에서, 메오피시 프로그램 및 핵 조직의 진행의 주요 측면은 핵 표면 스프레드를 조사하여 해부되었으며, 여기서 는 염색체 스프레드로 지칭되며, FISH3,4,9,10,11,12에의한 단백질 및/또는 핵산의 면역형광 검출을 위한 항체와 함께 있다. 실제로, 꽃다발내의 군집된 텔로미어의 편광 국소화는 스프레드 제제에서 보존될 수있다(도 1C). 최근에는 형광 검출 방법 및 초고해상도 현미경 검사법과 함께 제브라피쉬 정자 염색체 스프레드를 사용하여 제브라피쉬 텔로미어 역학, 상동성 염색체 페어링, 이중 가닥 파손 국소화 및 시냅스의 상세한 진행을 해명하여 주요 meiotic 전환에서3. 여기에서 우리는 제브라피쉬 고환의 정자 세포에서 염색체 스프레드를 준비하고 그 후에 염색체 관련 단백질의 반복된 텔로미어 서열 및 면역 형광 검출에 형광 펩티드 핵산 (PNA) 탐사기로 그(것)들을 얼룩하는 방법을 제시합니다.
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Protocol
제브라피시와 관련된 모든 방법은 UC 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 윤리적 기준을 사용하여 수행되었습니다.
1. 염색체 확산 절차
참고: 다음 프로토콜은 슬라이드당 수백 개의 확산 된 meiotic 핵과 함께 4-6 슬라이드를 만들도록 설계되었습니다. 사용되는 고환의 수는 물고기의 크기에 따라 달라집니다. ~60일 후 수정 후(dpf) 및 15마리의 동물을 ~6개월 후 수정 후(mpf)에서 20마리의 동물을 사용할 것으로 예상됩니다. 큰 제브라피시(예를 들어, 12 mpf)의 경우 10마리의 동물로 충분해야 한다. 일부 meiotic 돌연변이체 (예를 들어, spo11-/-)의고환은 다소 작을 것이라는 점에 유의하십시오3. 이 프로토콜에서는 하나의 고환 풀이 단일 샘플로 간주됩니다. 4개 이하의 샘플을 병렬로 준비하는 것이 좋습니다.
- 확산 절차를 시작하기 전에 다음 해결 방법 확인
참고: 향후 확산 실험에 사용하도록 지정된 수량으로 다음 솔루션을 준비하는 것이 편리합니다.- 증류수 100 mL에 3.42 g의 자당을 용해시켜 0.1 M 수크로오스 용액을 준비합니다. 또한 pH 8에 있는 1 M Tris-HCl을 사용하여 자당 용액을 pH 8로 가져옵니다. 그런 다음 자당 용액을 걸멸시합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 증류수 1.8L에서 10x 인산완충식염수(PBS) 스톡 용액을 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 및 27.6 mMKH2PO4의 최종 농도로 만듭니다. 녹을 때까지 저은 다음 NaOH와 오토클레이브를 사용하여 pH를 7.3으로 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 멸균 증류수에서 400 μg/mL DNase I 용액을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. 이 용액의 5 mL을 준비한 다음 100 μL aliquots로 저장하는 것이 좋습니다.
- 확산 프로토콜 당일에 다음 솔루션을 만듭니다.
참고: 시간 효율성을 위해, 모든 고환을 해부한 직후에 콜라게나아제 용액을 만들고 샘플이 콜라게나아제에서 처리되는 동안 트립신과 트립신 억제제 용액을 만드는 것이 가장 좋습니다.- 200 μL의 덜베코 의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)에 콜라게나아제 4 mg을 용해시다 (2 % w / v 콜라게나아제 최종 농도). 필요할 때까지 얼음을 유지하십시오. 콜라게나아제는 고환을 해리합니다.
- 샘플 당 DMEM 의 200 μL에 트립신 1.4 mg을 용해 (0.7% w / v 트립신 최종 농도). 필요할 때까지 얼음을 유지하십시오. 트립신은 세포를 해리하는 데 도움이됩니다.
- 샘플 당 DMEM 500 μL에 트립신 억제제 10 mg을 용해하십시오 (2% w /v 트립신 억제제 최종 농도). 필요할 때까지 얼음을 유지하십시오. 트립신 억제제는 트립신이 세포를 저하시키는 것을 방지합니다.
- 멸균 증류수에서 0.15% Triton X-100으로 1% 포름알데히드 용액(16% 미리 만들어진 용액)을 준비합니다. 필요할 때까지 얼음을 유지하십시오. 1% 포름알데히드는 고환이 트립신 및 DNase I(즉, 확산 절차의 1.4.7 단계 동안)으로 처리되는 동안 제조될 수 있다.
주의: 포름알데히드는 위험합니다.
- 성인 남성 얼룩말에서 고환의 해부
- 얼음물에 담그어 수컷 제브라피시(> 60 dpf)를 안락사시한다. 물고기는 해부 할 준비가 될 때까지 얼음 물에 보관 할 수 있지만 가능한 한 빨리 해부해야합니다.
참고 : 야생 형 변형 AB는이 절차에 사용되지만 다른 야생 형 균주도 의무가 있어야합니다. 해부하기 전에 얼음물에 물고기를 보관한 가장 긴 시간은 프로토콜에 눈에 띄는 영향없이 3 시간입니다. - 작은 가위로 한 번에 한 마리의 물고기를 참수한 다음 마이크로 가위를 사용하여 복부 중간선을 따라 잘라 신체 구멍을 노출시하십시오.
- 현미경으로 1.65배 배율로 집게(재료 표참조)를 사용하여 고환을 해부합니다. 1x PBS의 얕은 풀로 덮여 실리콘 코팅 페트리 접시에 해부를 수행합니다.
참고 : 고환은 수영 방광과 창자 사이에 위치하며 근육 조직보다 가볍게 나타납니다(그림 2A). 고환은 제브라피시에서 제거할 때 2개의 로브가 있어야합니다(그림 2B). - 고환에서 가능한 한 많은 지방과 주변 조직을 제거하십시오. 그런 다음 해부된 각 고환을 DMEM 2mL가 있는 5 mL 튜브에 직접 넣고 얼음위에 보관하십시오.
참고: 1.3.3 단계와 1.3.4 단계는 실험을 수행하기 전에 마스터해야 합니다.
- 얼음물에 담그어 수컷 제브라피시(> 60 dpf)를 안락사시한다. 물고기는 해부 할 준비가 될 때까지 얼음 물에 보관 할 수 있지만 가능한 한 빨리 해부해야합니다.
- 고환 세포의 해리
- 37°C에 0.1 M 수크로오스 용액의 100 mL를 미리 따뜻하게.
- 고환이 있는 5 mL 튜브에 콜라게나아제 용액 200 μL을 추가합니다. 용액을 여러 번 반전시켜 혼합합니다.
- DMEM이 흐리고 고환이 작은 덩어리가 될 때까지 50 분에서 1 시간 동안 32 °C에서 100rpm에서 100rpm에서 수평으로 인큐베이터 셰이커에서 고환을 부드럽게 흔들어 줍니다. 해리를 용이하게하기 위해 10 분마다 튜브를 빠르게 반전시다.
- 콜라게나제를 씻어내려면 DMEM을 최종 5 mL 부피에 추가하고 튜브를 몇 번 반전시다. 실온에서 3 분 동안 ~ 200 x g에서 고환을 펠렛. 2mL만 남게 되도록 상급기의 3 mL를 제거합니다.
참고 : DMEM의 추가, 제거 및 전달은 염색체 확산 절차 의 전체에 대한 플라스틱 전달 파이펫으로 수행됩니다. - 총 3개의 DMEM 세차량에 대해 1.4.4단계를 두 번 더 반복합니다. DMEM 세안 사이에 펠릿을 다시 일시 중단하지 마십시오. 마지막 DMEM 세척 후, 1 mL만 유지되도록 상급의 4 mL을 제거하십시오.
- 총 부피 2 mL에 대해 1 mL의 DMEM을 추가하고 트립신 용액의 200 μL과 DNase I 용액의 20 μL을 추가합니다. 용액을 혼합하기 위해 튜브를 몇 번 반전시다.
- DMEM 용액에 몇 덩어리만 포함될 때까지 튜브를 100 rpm에서 5-15 분 동안 32 °C에서 수평으로 흔들어 줍니다. 신속하게 해리를 용이하게하기 위해 5 분마다 튜브를 반전.
참고: 흔들림 후 덩어리가 상당히 작아야 합니다. - 트립신 억제제 용액의 500 μL과 DNase I 용액의 50 μL을 첨가합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞은 다음 실온에서 3 분 동안 ~ 200 x g에서 짧게 회전하여 튜브 캡이나 튜브 측면에 부착 할 수있는 액체 또는 덩어리를 제거하십시오.
- 튜브를 얼음 위에 놓고 플라스틱 이송 파이펫으로 2분 동안 반복적으로 파이펫팅하여 셀 현탁액을 다시 일시 중단하여 남은 덩어리의 해리를 용이하게 합니다. 셀 서스펜션이 이송 파이펫의 전구로 들어가지 않도록 하십시오. 2분 후, 현탁액을 다시 5 mL 튜브로 피펫한다.
- DMEM으로 100 μm 세포 스트레이너를 미리 적시고 얼음 위에 50 mL 튜브 위에 놓습니다.
- 플라스틱 전사 파이펫을 사용하여 한 번에 한 방울의 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 옮니다. 셀 서스펜션이 이송 파이펫의 전구로 들어가지 않도록 하십시오.
- 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 여과액을 새로운 5mL 튜브로 옮기고 최종 부피 인 5 mL에 DMEM을 추가합니다. 깨끗한 플라스틱 전달 파이펫으로 필터 밑면에 부착 된 풀셀을 수집해야합니다. 실온에서 5 분 동안 ~ 200 x g에서 세포를 펠렛.
- 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상급자를 제거하십시오.
- DNase I 용액 5 μL을 펠릿에 직접 넣습니다. 그런 다음 빈 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브 랙을 따라 튜브의 외부 바닥을 4-5회 부드럽게 긁어 내어 DNase I 용액과 펠릿을 혼합한다. 너무 가혹하게 긁으면 복구된 스프레드가 감소할 수 있습니다.
- 최종 부피 5mL에 DMEM을 추가하고 튜브를 여러 번 반전시켜 용액을 혼합합니다. 덩어리가 첫 번째 DNase I 치료 후에도 여전히 존재하는 것이 일반적입니다.
- 실온에서 2 분 동안 ~ 200 x g에서 세포 현탁액을 펠렛.
- 1.4.13-1.4.16 단계를 다시 일시 중단된 펠릿이 DMEM을 첨가할 때 뭉치지 않을 때까지 1-3회 추가로 반복합니다. 마지막 스핀 후, 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상급자를 제거하십시오.
참고 : 모든 DNase I 치료와 펠릿 크기의 감소를 기대; 총 4DNase를 초과하면 세포가 현저한 손실을 초래할 수 있습니다. DNase I 치료 단계 후에 펠릿이 보이지 않으면 절차를 진행하지 마십시오. 사용하지 않은 DNase I은 폐기합니다. - 1x PBS 의 1 mL을 추가하고 빈 1.5 mL 튜브 랙을 따라 튜브의 외부 바닥을 부드럽게 긁어 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 5 분 동안 ~ 200 x g의 세포 현탁액을 펠렛한 다음 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상급자를 제거하십시오.
- 200 μL 파이펫 팁의 끝에서 ~ 3mm를 잘라 조리개를 넓게하고 절단 파이펫 팁으로 위아래로 파이펫팅하여 0.1 M 수크로오스 용액의 ~ 80 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 셀 서스펜션을 실온에서 3분 동안 놓습니다.
- 유리 슬라이드에 염색체 확산
- 1% 포름알데히드 100 μL로 1개의 슬라이드를 0.15% 트리톤 X-100으로 피펫 팁의 측면으로 코팅합니다. 그런 다음 긴 가장자리에 수직으로 직선으로 슬라이드의 중심에 자당 세포 현탁액의 18 μL을 추가합니다. 슬라이드를 앞뒤로 기울여(~60°) 모든 모서리에 셀 서스펜션이 쉽게 퍼지도록 합니다.
- 미름알데히드 용액이 건조되는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 약간 금이 간 열린 습도 챔버에 평평하게 놓습니다(그림3). 습도 챔버를 어두운 서랍에 밤새 놓습니다.
- 습도 챔버에서 뚜껑을 제거하고 슬라이드가 완전히 건조되도록 하십시오.
- 코플린 항아리에 슬라이드를 넣고 코플린 항아리에 증류수를 채우고 실온에서 부드럽게 흔들어 5 분 동안 배양하십시오.
참고: 슬라이드는 코플린 항아리당 슬라이드 수를 최대화하기 위해 지그재그 패턴으로 코플린 병에 배치할 수 있습니다. 액체가 모든 슬라이드 사이에 통과할 수 있는 공간이 있는지 확인합니다. - 물을 붓고 항아리에 1:250 습윤제(재료 표참조)를 채웁니다. 실온에서 부드럽게 흔들면서 5분 동안 2회 씻으시고.
- 슬라이드가 완전히 건조되고 얼룩이 될 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
참고 : 염색체의 눈에 띄는 저하없이 슬라이드를 저장 한 가장 긴 ~ 2 개월입니다.
2. 텔로미어 PNA 프로브 염색
참고: 텔로미어 반복은 플루오로포폴레 컨쥬게이트 텔로미어 PNA 프로브를 사용하여 염색할 수 있으며, 이는 선도적인 말단 소미어 반복(CCCTAA)으로 혼성화됩니다. PNA 프로브에는 중성 백본이 있어 음전하 DNA에 대한 혼성화 친화도를 증가시켜 배경이 거의 또는 전혀 없습니다. 텔로미어 프로빙 단계는 선택 사항입니다. 항체 염색을 진행하려면 단계 2.2.2에 표시된 대로 1x PBS에서 슬라이드를 재수화한 다음 "1차 항체 염색"으로 직접 진행합니다.
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텔로미어 염색을 시작하기 전에 PNA 프로브 시약을 만드십시오.
참고: 향후 실험에 사용할 수 있도록 지정된 수량으로 다음 솔루션을 준비하는 것이 편리합니다. 보관 조건은 아래에 설명되어 있습니다.- 3M NaCl 및 0.3 M 구연산나트륨의 최종 농도로 20x 식염수 구연산염(SSC) 용액 2L를 준비합니다. 오토클레이브를 하고 실온에서 보관하십시오.
- 50 mL의 전혼성 화 액을 50% 포마미드, 5x SSC, 50 μg/mL 헤파린, 500 μg/mL 전달 RNA, 0.1% 트웬 20의 최종 농도로 전달하고 pH ~6에 용액을 가져오기 위해 460 μL을 추가합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
주의: 포르마미드는 위험합니다. 용액을 연기 후드에 준비합니다. - 전사 RNA를 추가하지 않고 단계 2.1.2와 동일한 방식으로 제조된 50 mL의 사전 혼성화 솔루션을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오.
- PNA 텔로미어 프로브 TelC-Cy3 및 TelC-Alexa647은 제조업체의 지침에 따라 포르마미드에 50 μM 주식으로 제조됩니다. PNA 프로브를 -80°C에서 8 μL aliquots로 저장합니다.
- 소 혈청 알부민 (BSA)의 100 mg / mL 재고 용액의 적어도 1 mL을 멸균 증류수로 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. 재고 BSA의 1 mL 이상을 준비하는 경우, 1 mL aliquots로 솔루션을 저장합니다.
- 2 mL 튜브를 사용하여 2mL의 혼성화 용액을 100 mg/mL BSA 의 27 μL및 50 μM PNA 프로브의 8 μL을 전달 RNA를 포함하는 프리 혼성화 용액의 1.965 mL에 첨가하여 혼성화 용액의 2 mL을 준비합니다. -20 °C에서 어둠 속에서 보관하십시오.
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PNA 텔로미어 프로브 염색
- 혼성 화 오븐을 82 °C로 예열합니다.
- 실온에서 습도 챔버에서 5분 동안 슬라이드당 500 μL의 1x PBS로 다시 수화슬라이드를 사용할 수 있습니다. 종이 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 PBS를 제거합니다.
- 가열된 혼성화 오븐에서 금속 표면에 혼성화 용액을 함유하는 슬라이드와 2 mL 튜브를 2분 동안 가열한다.
- 슬라이드를 금속 표면에 유지하면서 슬라이드당 하이브리드화 용액을 100 μL 더한 다음 플라스틱 커버슬립(~25mm x 75mm)으로 슬라이드를 덮어 오토클레이브 백에서 모양을 만듭니다. 슬라이드를 82°C에서 10-12분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 16-24 시간 동안 37 °C에서 어둠 속에서 습도 챔버에 놓습니다. 이 시점부터 1 차 및 이차 항체 염색을 위해, 슬라이드는 형광 신호의 광표백을 피하기 위하여 어둠 속에서 유지되어야 합니다. 잠복기 후, 항체 염색을 위한 시약은 2.2.9단계 동안 제조될 수 있다.
- 파이펫 팁으로 커버슬립을 제거합니다.
참고: 커버슬립의 제거를 용이하게 하기 위해, 전달 RNA가 없는 혼성화 용액의 ~50-100 μL은 커버슬립이 들어올릴 때 슬라이드와 커버슬립 사이에 부드럽게 분배될 수 있습니다. - 각 슬라이드에 RNA전달없이 사전 혼성화 용액의 파이펫 500 μL및 실온에서 15 분 동안 습도 챔버에 슬라이드를 배치합니다. 용지 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 용액을 제거합니다.
참고: RNA 전달이 없는 사전 혼성화 용액은 각 슬라이드에 추가되기 전에 미리 가열되지 않습니다. - 피펫 500 μL 의 50% 사전 혼성화 용액은 각 슬라이드에 1x PBS에 RNA를 전달하지 않고 실온에서 15 분 동안 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 용지 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 용액을 제거합니다.
- 슬라이드를 코플린 항아리에 옮기고 실온에서 1회 15분 동안 부드럽게 흔들어 1x PBS로 3회 세척합니다.
- 코플린 병에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 여분의 PBS를 제거합니다. 이어서 3.2단계 "1차 항체 염색"을 진행한다.
3. 항체 염색
참고: 알려진 메오틱 단백질로 올려진 항체는 확산 염색체 제제에서 면역형광 검출에 사용될 수 있다. 상이한 형광단에 공액된 이차 항체는 1차 항체가 다른 동물에서 제기된 경우에, 다중 단백질이 동시에 염색될 수 있게 합니다.
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1차 및 2차 항체 염색 당일에 다음과 같은 해결책을 만듭니다.
- 1x PBS로 PBT 1L을 만들고 증류수에 희석된 트리톤 X-100을 0.1% 만드세요. 실온에서 보관하십시오. 이것은 미래의 확산 실험을 위해 미리 그리고 대량으로 준비 될 수 있습니다.
- BSA의 2 mg/mL 및 PBT에서 2% 염소 혈청의 최종 농도로 슬라이드당 항체 블록 500 μL을 준비합니다.
- 슬라이드당 1차 또는 이차 항체 혼합물을 100 μL로 만들려면 적절한 항체를 올바른 농도로 추가합니다(재료 표참조).
참고: 항체 농도는 경험적으로 결정될 필요가 있습니다. 토론에서, 우리는 우리가 성공으로 시도 한 항체의 목록을 포함 (희석 / 농도) 우리는 성공하지 않고 시도 한 사람들.
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1 차적인 항체 염색
참고: 토끼 항인간 SCP3 및 닭 안티 제브라피쉬 Sycp1은 일반적으로 1차 항체 염색에 사용된다.- 슬라이드에서 과도한 PBS를 제거한 후 슬라이드당 500 μL의 항체 블록을 추가하고 슬라이드를 실온에서 최소 20분 동안 습도 챔버에 놓습니다.
- 종이 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 항체 블록을 제거합니다.
- 슬라이드 당 항체 블록에 100 μL의 100 μL을 추가하고 오토 클레이브 백으로 만든 플라스틱 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 슬라이드를 4°C에서 밤새 습도 챔버에 놓습니다.
- 피펫 팁으로 커버슬립을 제거하고 실온에서 부드럽게 흔들어 코플린 병에 1x PBS로 슬라이드를 최소 5분 동안 2회 세척합니다.
- 종이 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 PBS를 제거합니다.
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이차 항체 염색
참고 : 다른 형광에 공액 염소 항 토끼 및 안티 닭 항체는 1 :1000 농도에서 염색에 사용됩니다.- 슬라이드당 500 μL의 항체 블록을 추가하고 슬라이드를 실온에서 최소 5분 동안 습도 챔버에 놓습니다.
- 종이 타월에 슬라이드의 측면을 눌러 항체 블록을 제거합니다.
- 슬라이드 당 항체 블록에 100 μL의 이차 항체 혼합물을 추가하고 오토 클레이브 백으로 만든 플라스틱 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 슬라이드를 37°C에서 1시간 동안 습도 챔버에 놓습니다.
- 피펫 팁으로 커버슬립을 제거하고 실온에서 부드럽게 흔들어 코플린 병에 1x PBS로 슬라이드를 최소 5분 동안 3회 세척합니다.
- 실온에서 부드럽게 흔들면서 코플린 항아리에 증류수로 최소 2분 동안 슬라이드를 한 번 헹구십시오.
- 건조를 용이하게하기 위해 기울인 슬라이드를 공기 건조.
- DAPI(재료 표참조)의 유무에 관계없이 20 μL의 페이드 방지 마운트를 유리 커버슬립(24mm x 60mm)에 균등하게 간격을 둔 도트 3개로 배치합니다.
- 슬라이드를 유리 커버에 아래로 향하게 한 다음 슬라이드의 서리가 내린 끝과 겹치는 가장자리에 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
- 이미징준비가 될 때까지 준비된 슬라이드를 4°C에서 보관합니다.
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Representative Results
우리는 제브라피쉬 정자 세포 확산 제제를 준비하고 시각화하는 방법을 설명했습니다. 올바르게 수행하면, 우리의 절차는 잘 확산, 비 겹치는 핵을 산출한다. 이러한 핵을 회복하려면, 트립신에서 충분한 시간 동안 고환을 치료하고 적절한 수의 DNase I 처리를 개시 물질(즉, 고환)의 적절한 양을 가지는 것이 중요하다. 이러한 스프레드는 프로페이즈 I. 도 1 동안 메오틱 진행을 연구하기 위해 텔로미어 및 meiotic 단백질에 대해 염색될 수 있습니다.
도 1: PNA 및 항체 프로브로 염색된 염색체 확산 제제의 대표적인 초고해상도 영상. (A)시냅톤 복합체의 회로도. (B)염색체 축 단백질 Sycp3(녹색), 가로 필라멘트 단백질 Sycp1(적색), DNA(청색)를 100배 목적을 이용하여 구조적 조명 현미경(SIM)으로 이미지화한 시냅스 쌍의 상동체. 스케일 막대 = 1 μm.(C)왼쪽의 패널은 meiotic prophase의 세 단계를 보여줍니다: 렙토텐 (위), 초기-zygotene (중간) 및 파치틴 (아래). 스케일 막대 = 5 μm. 오른쪽: 각 스테이지에 텔로미어(마젠타)가 포함된 대표적인 이미지. 스케일 바 = 1 μm. 수치는 블로키나 외3에서적응됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제브라피쉬 고환의 예(~7개월 후 수정). (A)이미지는 제브라피시 내의 고환의 상대적 위치를 나타낸다. 고환은 수영 방광과 창자 사이에 있습니다. (B)고환의 길이입니다. 어린 제브라피쉬는 더 작은 고환을 갖게 됩니다. 염색체 스프레드의 경우, 고환에서 가능한 한 많은 지방과 주변 조직을 제거하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 슬라이드용 습도 챔버. 우리의 습도 챔버는 전기 화 큐벳을 발송하도록 설계된 폴리스티렌 폼 박스 (21cm x 19cm x 6cm)를 사용하여 만들어집니다. 우리는 젖은 얇은 조직 와이프 (재료 표참조)를 다른 모든 홈에 삽입했습니다. 슬라이드는 젖은 물티슈를 건드리지 않고 능선 위에 평평하게 놓습니다. 상업용 습도 챔버도 사용할 수 있습니다(재료 표참조). 우리는 능선과 홈이 장착 된 모든 폴리스티렌 폼 박스 (예 : 유리 파이펫13사용)를 사용할 수 있다고 구상합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 불충분한 DNase I 치료로 인한 품질 이불량 스프레드의 예. Sim이 20배 의 목표를 사용하여 이미지화한 Sycp3에 대해 염색된 Meiotic 염색체. 불충분 한 DNase I 치료는 슬라이드에 제대로 확산에서 세포를 방지 점성 자당 세포 현탁액으로 인해 중첩 핵으로 이어질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 염색체의 예는 대체 방법11을사용하여 퍼짐. Sycp3 (녹색) 및 Sycp1 (빨간색)에 대 한 염색 된 Meiotic 염색체. 염색체 스프레드는 산삼 및 페자11에의해 설명된 바와 같이 제조되었다. 이 방법은 프로토콜에 필요한 여러 제브라피시 대신 개별 제브라피시를 사용하여 수행할 수 있습니다. 우리의 손에는 잘 퍼지지 않는 염색체를 보는 것이 일반적입니다. 또한 염색체 확산 절차 도중 슬라이드에 남아 있는 파편에서 유래하는 배경 얼룩에 있는 눈에 띄는 증가가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 제브라피시 고환에서 분리된 정자 세포에서 핵 표면에 있는 텔로미어 및 염색체 관련 단백질의 위치를 탐구하는 방법을 기술합니다. 우리는 이 방법이 고환의 크기에 조정을 가진 그밖 teleost 종에 있는 정액 세포의 분석을 위해 적용될 것이라는 점을 기대합니다.
소수의 항체만이 제브라피쉬 메오틱 단백질로 제기되었지만, 우리는 인간(h) 또는 마우스(m) 단백질로 기르는 다음 항체를 사용하여 성공을 거두었습니다. 우리 실험실은 시냅톤 복합체 (SC)에 대한 신뢰할 수있는 마커역할을한 닭의 제브라피쉬 Sycp1 단백질 (zfSycp1)에 대한 항체를 제기했지만,이 단백질은 염색체가 완전히 시냅스 될 때 초기 zygotene에서 늦은 파키틴까지만 존재합니다. 토끼 항-hSYCP3 항체는 렙토틴으로부터 후기 파키텐에서 SC의 용해까지 메오틱 염색체 축을 검출하는 데 매우 신뢰할 수있다(도 1B,C). 특히, 우리는 Sycp3에 의해 정의 된 전체 길이 축과 Sycp1의 부재와 고전적인 디플롯 단계를 관찰하지 않은, 마우스와는 달리, 축은 파키텐3에서종료 후 저하 될 수 있음을 시사 . 긍정적인 결과를 준 m, h 또는 zf meiotic 단백질에 대한 다른 상업적으로 이용 가능한 항체는 또한 DNA 재조합/복제 토끼 항-hRAD51 및 토끼 항-hRPA를 포함한다. 사용되는 각 항체및 희석의 공급원은 재료표에기재되어 있다. 우리가 적어도 3개의 다른 희석을 사용하여 성공하지 않고 시도한 사람들은 염소 안티 hDMC1, 마우스 anti-hMlh1, 마우스 안티 햄스터 Sycp3, 마우스 anti-hRPA를 포함한다.
염색체 퍼짐 절차의 3개의 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 정확한 양의 재료를 수집하는 것입니다. 15 개의 손상되지 않은 고환은 ~ 6 mpf 남성에 대한 확산 프로토콜에 충분해야하며,이 숫자는 동물의 크기에 따라 위 또는 아래로 조정할 수 있습니다. 일부 meiotic 돌연변이는 더 작은 고환이 있을 것이라는 점을 명심하십시오, 그래서 2 추가 동물은 이용되어야 합니다. 두 번째 중요한 단계는 세포의 해리입니다. 트립신 소화 중, 고환이 작은 덩어리로 해리하지 않는 경우, 너무 적은 세포가 확산 절차에서 회복 될 가능성이 높습니다. 세 번째 주요 단계는 DNase I 치료 후 눈에 보이는 펠릿의 존재. 펠릿이 보이지 않으면 확산 절차가 핵을 거의 또는 전혀 얻을 수 없을 가능성이 높습니다. 너무 적은 동물을 사용 하거나 너무 많은 DNase I 와신을 수행 하는 경우 펠 릿의 손실 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 너무 적은 DNase I 처리는 슬라이드에 퍼지는 세포를 방지할 것이다 viscid 자당 세포 현탁액귀착될 수 있습니다(그림 4). DMEM을 첨가할 때 덩어리가 더 이상 존재하지 않는 경우(최대 4가지 치료) DNase I 트리트먼트를 계속 수행하는 것이 중요합니다.
제시된 염색체 퍼짐 기술은 슬라이드 당 잘 퍼지는 핵의 수백을 산출합니다. 이 절차를 사용하여, 우리는 초고해상도 현미경 검사법3를사용하여 제브라피쉬 정자 발생 시 주요 사건에 대한 상세한 분석을 제공 할 수있었습니다. 우리의 손에, 이 프로토콜은 더 나은 확산 염색체를 생성했다, 슬라이드에 적은 파편, 적은 배경 염색 Moens14 와 산삼과 페자11에 의해 설명 된 단일 동물을 사용하여 빠른 방법에 비해(그림 5). 이러한 차이는 우리의 프로토콜에 콜라게나제, 트립신 및 DNase 치료의 사용으로 인해 발생할 수 있습니다. 우리의 기술의 2개의 제한은 10-20명의 성인 얼룩말 물고기 수컷및 더 힘든 효소 처리 및 세척 단계를 사용하는 필요조건입니다. 초고해상도 검출이 필요하지 않은 경우, 제브라피쉬 물질이 제한되어 있거나, 또는 두 개 이상의 조건이 병렬로 시험되는 경우, 더 빠른 방법은 더 적합한대안(14,15,16)일수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 제브라피쉬 meiocytes에서 염색체를 확산하고 염색하는 방법을 최적화하는 데 도움 원고와 응우옌에 대한 의견에 대한 트렌트 뉴먼과 마스다 샤리피 에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 GM079115에 의해 지원되었다 S.M.B에 수여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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