Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

Published: March 3, 2020 doi: 10.3791/60671
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis, 2Integrative Genetics and Genomics Graduate Group, University of California, Davis

Summary

ينتشر السطح النووي هي أداة لا غنى عنها لدراسة الأحداث الكروموسومية أثناء الداء الميوي. هنا نُظهر طريقة لإعداد وتصور الكروموسومات الميوتيكية خلال المرحلة الأولى من الحيوانات المنوية من سمك حمار وحشي.

Abstract

Meiosis هو العملية الخلوية الرئيسية المطلوبة لإنشاء gametes haploid للتكاثر الجنسي. وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في فهم أحداث الكروموسوم التي تحدث خلال المرحلة المتوسطة، بما في ذلك الاقتران، وتشبج الاشتباك العصبي، والأحداث إعادة التركيب التي تضمن الفصل الكروموسومي السليم. في حين أن الماوس كان نموذجا هاما لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات ، وليس كل الأحداث meiotic في هذا النظام هي مماثلة لmeiosis الإنسان. لقد أظهرنا مؤخرًا الإمكانات المثيرة لسمك الحمار الوحشي كنموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. هنا نصف، بالتفصيل، أساليبنا لتصور الكروموسومات ميوتيك والبروتينات المرتبطة بها في الاستعدادات انتشار الكروموسوم. هذه الاستعدادات لديها ميزة السماح تحليل عالية الدقة من هياكل الكروموسوم. أولاً، نصف إجراء تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي البالغ، يليه انفصام الخلايا، تحلل، وانتشار الكروموسومات. بعد ذلك ، نصف إجراء الكشف عن توطين بروتينات الكروموسومات المتوسطة ، عن طريق الكشف عن الفلور المناعي ، وتسلسل الحمض النووي ، عن طريق التهجين في الموقع (FISH). وتشمل هذه التقنيات مجموعة مفيدة من الأدوات للتحليل الخلوي لبنية الكروماتين ميوتيكية في نظام حمار وحشي. وينبغي أن يكون الباحثون في مجتمع سمك الحمار الوحشي قادرين على إتقان هذه التقنيات بسرعة ودمجها في تحليلاتهم القياسية للوظيفة الإنجابية.

Introduction

الإنجاب الجنسي يستمر من خلال الجمع بين اثنين من الملة haploid، كل تحمل نصف الكروموسوم تكملة خلية جسدية. Meiosis هو قسم الخلايا المتخصصة التي تنتج الملة haploid من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي وجولتين متتاليتين من الفصل الكروموسوم. في المرحلة الأولى ، يجب أن تخضع الكروموسومات المتجانسة (homologs) للاقتران وإعادة التركيب والمشبك ، ويتميز هذا الأخير بتكوين مجمع synaptonemal الذي يتكون من محورين متجانسين يتم جسرهما بواسطة خيوط العرضية ، Sycp1(الشكل 1A ، B). الفشل في تنفيذ هذه العمليات بشكل صحيح يمكن أن يؤدي إلى إنتاج gametes aneuploid ، والتي هي السبب الرئيسي للإجهاض في البشر1. وقد تم تسهيل معرفتنا بالتنسيق بين الاقتران وإعادة التركيب والمشبك من خلال الدراسات في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، مثل الخميرة ، C. elegans، الماوس ، وDrosophila، من بين أمور أخرى2. في حين أن العملية العامة لاقتران الكروموسوم المتجانس تليها العزل يتم الحفاظ عليها بشكل جيد ، فإن اعتمادها على إعادة التركيب والمشبك ويختلف ترتيب هذه الأحداث.

Meiotic كسر حبلا مزدوجة (DSB) تشكيل، الذي يبدأ إعادة تركيب متجانسة، يحدث بالقرب من التيلوميرات تتجمع في باقة خلال اللبتوتين ومتشابك الاشتباك العصبي تستتبعه بعد وقت قصيرمن 3،4. هذا التكوين من تشكيل DSB وبدء المشبك هو أيضا سمة من سمات meiosis الذكور في البشر ولكن ليس في الماوس5،6،7،8، مما يشير إلى أن حمار وحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. وهناك أيضا العديد من المزايا العملية لدراسة الحمار الوحشي meiosis. يخضع كل من الذكور والإناث لتولد الخلايا في مرحلة البلوغ، ويمكن الوصول إلى الغدد التناسلية بسهولة، ويتم توليد المئات من النسل من صليب واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الأجنة شفافة وتتطور خارجيًا ، مما يسهل الكشف المبكر عن الانحرافات في النمو الجنيني بسبب الملة الأنيوبلويد3،9. مساوئ استخدام حمار وحشي هي أنها بطيئة للوصول إلى النضج الجنسي (~ 60 يوما) ويجب جمع كمية المواد اللازمة لينتشر السطح النووي من الحيوانات البالغة ~ 10-20 ، اعتمادا على حجمها.

تعد مستحضرات انتشار الكروموسوم اتّهات أداة حيوية لدراسة ديناميكيات الكروموسوم عبر جميع الكائنات الحية النموذجية، حيث يمكن استكشاف التواقيع الرئيسية لديناميكيات الكروموسومات المتوسطة. في حمار وحشي ، تم تشريح الجوانب الرئيسية لتطور البرنامج meiotic والمنظمة النووية من خلال استكشاف ينتشر السطح النووي ، ويشار إليه هنا باسم ينتشر الكروموسوم ، مع الأجسام المضادة للكشف عن الفلور المناعي للبروتينات و / أو الأحماض النووية من قبل FISH3،4،9،10،11،12. في الواقع ، يمكن الحفاظ على توطين الاستقطاب من التيلوميرات المجمعة في باقة في إعداد انتشار(الشكل 1C). في الآونة الأخيرة ، استخدمنا كروموسوم الحيوانات المنوية الحمار الوحشي ينتشر جنبا إلى جنب مع طرق الكشف عن الفلورسوووإكسينس والمجهر الفائق الدقة لتوضيح التقدم التفصيلي لديناميكيات تيلومير حمار وحشي ، اقتران كروموسوم متجانس ، توطين كسر حبلا مزدوج ، وتشابك الاشتباك العصبي في التحولات الرئيسية meiotic3. هنا نقدم طرق لإعداد ينتشر الكروموسوم من الحيوانات المنوية من الخصيتين حمار وحشي ووصمها في وقت لاحق مع الفلورسنت الببتيد النووي (السلطة الوطنية الفلسطينية) تحقيقات لتسلسل التيلومير المتكرروالكشف عن الفلوروسوم البروتينات المرتبطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الأساليب التي تنطوي على حمار وحشي باستخدام المعايير الأخلاقية المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة كاليفورنيا في ديفيس.

1. إجراء انتشار الكروموسوم

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لإنشاء 4-6 شرائح، مع مئات من النوى ميوتيك انتشار لكل شريحة. وستتوقف أعداد الخصيات المستخدمة على حجم السمك. نتوقع استخدام 20 الحيوانات في ~ 60 يوما بعد الإخصاب (dpf) و 15 الحيوانات في ~ 6 أشهر بعد الإخصاب (mpf). بالنسبة لسمك الحمار الوحشي الكبير (على سبيل المثال، 12 مليون متر فف) يجب أن تكون 10 الحيوانات كافية. كن على علم بأن الخصيات من بعض المسوخ meiotic (على سبيل المثال، spo11-/-)ستكون أصغر إلى حد ما3. في هذا البروتوكول، يعتبر تجمع واحد من الخصيتين كعينة واحدة. من المستحسن ألا يتم إعداد أكثر من 4 عينات بالتوازي.

  1. جعل الحلول التالية قبل البدء في إجراء الانتشار
    ملاحظة: من المناسب إعداد الحلول التالية في الكميات المحددة للاستخدام في تجارب الانتشار المستقبلية.
    1. إعداد محلول السكروز 0.1 M عن طريق حل 3.42 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر. جلب محلول السكروز إلى درجة الحموضة 8 باستخدام 1 M Tris-HCl الذي هو أيضا في درجة الحموضة 8. ثم تصفية تعقيم محلول السكروز. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    2. جعل 10x الفوسفات المخزنة على محلول المحلول المالح (PBS) إلى تركيز نهائي من 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 و 27.6 m KH2PO4 في 1.8 لتر من الماء المقطر. يُحرّك المزيج حتى يذوب، ثم يُعدّل درجة الحموضة إلى 7.3 باستخدام NaOH والأوتوكلاف. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. جعل 400 ميكروغرام / مل DNase I الحل في الماء المقطر المعقم. تخزين في -20 درجة مئوية. من المستحسن إعداد 5 مل من هذا الحل ثم تخزينها ك100 ميكرولتر aliquots.
  2. تقديم الحلول التالية في يوم بروتوكول الانتشار
    ملاحظة: لكفاءة الوقت، فمن الأفضل لجعل محلول الكولاجين فورا بعد تشريح جميع الخصيتين ومن ثم جعل المحاليل التربسين والتربسين المانع خلال الوقت الذي يتم علاج العينات في الكولاجين.
    1. حل 4 ملغ من الكولاجين في 200 ميكرولتر من متوسط النسر المعدل ة Dulbecco (DMEM) لكل عينة (2٪ ث / v تركيز الكولاجين النهائي). الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. سوف الكولاجين فصل الخصيات.
    2. حل 1.4 ملغ من التربسين في 200 ميكرولتر من DMEM لكل عينة (0.7٪ ث / ث تريبسين التركيز النهائي). الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. وسوف يساعد التربسين فصل الخلايا.
    3. حل 10 ملغ من مثبطات التربسين في 500 ميكرولتر من DMEM لكل عينة (2٪ ث / ث مثبط التربسين التركيز النهائي). الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. مثبط التربسين يمنع التربسين من تدهور الخلايا.
    4. إعداد محلول الفورمالديهايد بنسبة 1٪ (من محلول مسبق الصنع بنسبة 16٪) مع 0.15٪ تريتون X-100 في الماء المقطر المعقم. الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. يمكن إعداد الفورمالديهايد بنسبة 1٪ أثناء معالجة الخصيتين بالتريبسين وDNase I (أي خلال الخطوة 1.4.7 من إجراء الانتشار).
      تنبيه: الفورمالديهايد خطر.
  3. تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي الذكور البالغين
    1. القتل الرحيم سمك الحمار الوحشي الذكور (> 60 dpf) عن طريق غمرها في الماء المثلج. يمكن الاحتفاظ بالأسماك في الماء المثلج حتى تصبح جاهزة للتشريح ، ولكن يجب تشريحها في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: يتم استخدام سلالة AB من النوع البري لهذا الإجراء، ولكن يجب أن تكون السلالات البرية الأخرى قابلة أيضاً. أطول وقت لدينا حفظ الأسماك في الماء المثلج قبل تشريح هو 3 ح دون أي تأثير ملحوظ على البروتوكول.
    2. قطع رأس سمكة واحدة في وقت واحد مع مقص صغير ومن ثم استخدام مقص صغير لقطع على طول خط الوسط البطني لفضح تجويف الجسم.
    3. تشريح testis باستخدام ملقط (انظر جدول المواد)في التكبير 1.65x تحت المجهر. تنفيذ تشريح في طبق بيتري المغلفة بالسيليكون مع تغطيتها من قبل بركة ضحلة من 1x PBS.
      ملاحظة: يقع الخصية بين المثانة السباحة والأمعاء وسوف تظهر أخف وزنا من الأنسجة العضلية(الشكل 2A). يجب أن يكون الخصية 2 فصوص عند إزالتها من حمار وحشي(الشكل 2B).
    4. إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والأنسجة المحيطة بها من الخصية. ثم إضافة كل testis تشريح مباشرة في أنبوب 5 مل مع 2 مل من DMEM والحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: يجب إتقان الخطوات 1.3.3 و 1.3.4 قبل إجراء أي تجارب.
  4. انفصال خلايا الخصيات
    1. ما قبل الحارة 100 مل من 0.1 M محلول السكروز إلى 37 درجة مئوية.
    2. أضف 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين إلى أنبوب 5 مل مع الخصية. خلط الحل عن طريق عكس ذلك عدة مرات.
    3. هز الخصيتين برفق في حاضنة شاكر أفقيا في 100 دورة في الدقيقة في 32 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة إلى ساعة حتى DMEM غائم والخصيتين في قطع صغيرة. عكس بسرعة أنبوب كل 10 دقيقة لتسهيل التفكك.
    4. لغسل الكولاجين، إضافة DMEM إلى حجم 5 مل النهائي وعكس الأنبوب عدة مرات. بيليه الخصيتين في ~ 200 × ز لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة 3 مل من supernatant بحيث يبقى فقط 2 مل.
      ملاحظة: تتم إضافة وإزالة ونقل DMEM مع ماصة نقل البلاستيك لكامل إجراء انتشار الكروموسوم.
    5. كرر الخطوة 1.4.4 مرتين أكثر لما مجموعه 3 مهابDM. لا إعادة تعليق بيليه بين DMEM washes. بعد غسل DMEM الماضي، وإزالة 4 مل من supernatant بحيث يبقى فقط 1 مل.
    6. أضف 1 مل من DMEM لحجم إجمالي قدره 2 مل وإضافة 200 ميكرولتر من محلول التربسين و 20 ميكرولتر من محلول DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط الحل.
    7. هز الأنبوب أفقياً عند 32 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة عند 100 دورة في الدقيقة حتى يحتوي حل DMEM على كتل قليلة فقط. عكس بسرعة أنبوب كل 5 دقيقة لتسهيل التفكك.
      ملاحظة: يجب أن تكون الكتل أصغر بكثير بعد الاهتزاز.
    8. إضافة 500 ميكرولتر من محلول مثبط التربسين و 50 ميكرولتر من حل DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط، ثم تدور لفترة وجيزة إلى أسفل في ~ 200 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل أو الكتل التي قد تلتزم غطاء أنبوب أو جانب الأنبوب.
    9. وضع أنبوب على الجليد وإعادة تعليق تعليق الخلية عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا مع ماصة نقل البلاستيك لمدة 2 دقيقة لتسهيل التفكك من أي كتل المتبقية. لا تدع تعليق الخلية تذهب إلى لمبة من ماصة النقل. بعد 2 دقيقة, ماصة التعليق مرة أخرى إلى أنبوب 5 مل.
    10. قبل الرطب مصفاة خلية 100 ميكرومتر مع DMEM ووضعها على رأس أنبوب 50 مل على الجليد.
    11. نقل تعليق الخلية من خلال مصفاة قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة نقل البلاستيك. تأكد من أن تعليق الخلية لا يذهب إلى لمبة ماصة النقل.
    12. نقل filtrate باستخدام ماصة نقل البلاستيك إلى أنبوب جديد 5 مل وإضافة DMEM إلى حجم نهائي من 5 مل. تأكد من جمع الخلايا المجمعة المرفقة بالجانب السفلي من الفلتر مع ماصة نقل بلاستيكية نظيفة. بيليه الخلايا في ~ 200 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    13. إزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه.
    14. إضافة 5 ميكرولتر من DNase I الحل مباشرة في بيليه. ثم خلط بيليه مع الحل DNase الأول عن طريق كشط بلطف الجزء السفلي الخارجي من أنبوب 4-5 مرات على طول فارغة 1.5 مل رف أنبوب الطرد المركزي الدقيق. يمكن أن يؤدي الكشط بقسوة شديدة إلى تقليل فروق الأسعار المستردة.
    15. إضافة DMEM إلى حجم نهائي من 5 مل وخلط الحل عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. من الشائع أن تظل الكتل موجودة بعد أول علاج DNase I.
    16. بيليه تعليق الخلية في ~ 200 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    17. كرر الخطوات 1.4.13-1.4.16 1-3 مرات إضافية حتى بيليه إعادة تعليق لا تتجمع عند إضافة DMEM. بعد الدوران الأخير، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الخارقة دون إزعاج الكريات.
      ملاحظة: نتوقع انخفاضا في حجم بيليه مع كل علاج DNase الأول; تجاوز 4 DNase مجموع أنا washes قد يؤدي إلى فقدان كبير للخلايا. إذا لم يكن هناك بيليه مرئي بعد خطوات علاجات DNase I ، فلا تمضي في الإجراء. تجاهل أي DNase I غير المستخدمة.
    18. إضافة 1 مل من 1x PBS وإعادة تعليق بيليه عن طريق كشط بلطف الجزء السفلي الخارجي من الأنبوب على طول رف أنبوب فارغة 1.5 مل.
    19. بيليه تعليق الخلية في ~ 200 × ز لمدة 5 دقيقة ثم إزالة أكبر قدر من supernatant ممكن دون إزعاج بيليه.
    20. قطع ~ 3 ملم من نهاية تلميح ماصة 200 ميكرولتر لتوسيع الفتحة وإعادة تعليق بيليه في ~ 80 ميكرولتر من 0.1 M محلول السكروز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع تلميح ماصة قطع. السماح لتعليق الخلية الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقيقة.
  5. انتشار الكروموسومات على الشرائح الزجاجية
    1. معطف شريحة واحدة مع 100 ميكرولتر من 1٪ الفورمالديهايد مع 0.15٪ تريتون X-100 مع الجانب من تلميح ماصة. ثم أضف 18 ميكرولتر من تعليق خلية السكروز إلى مركز الشريحة في خط مستقيم عمودي على الحافة الطويلة. إمالة الشريحة ذهابا وإيابا (~ 60 درجة) لتسهيل انتشار تعليق الخلية إلى جميع الزوايا.
    2. ضع الشرائح مسطحة لأسفل في غرفة رطوبة مفتوحة متصدعة قليلاً(الشكل 3)لمنع محلول الفورمالديهايد من التجفيف. ضع غرفة الرطوبة في درج مظلم بين عشية وضحاها.
    3. أزل الغطاء من غرفة الرطوبة واترك الشرائح جافة تمامًا.
    4. ضع الشرائح في جرة كوبلين ثم ملء جرة كوبلين بالماء المقطر واحتضان لمدة 5 دقيقة مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن وضع الشرائح في جرة كوبلين في نمط متعرج لزيادة عدد الشرائح لكل جرة كوبلين. تأكد من وجود مساحة للسائل لتمرير بين جميع الشرائح.
    5. صب الماء وملء جرة مع 1:250 وكيل التبول (انظر جدول المواد). اغسل مرتين لمدة 5 دقيقة مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    6. السماح للشرائح لتجف تماما وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى يتم تلطيخها.
      ملاحظة: أطول لدينا الشرائح المخزنة دون أي تدهور ملحوظ من الكروموسومات هو ~ 2 أشهر.

2. Telomere السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق تلطيخ

ملاحظة: يمكن تلطيخ يكرر التيلومير باستخدام تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية المترافقة الفلوروفورية التي تهجين إلى تكرار التيلومير حبلا (CCCTAA). تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية لديها العمود الفقري محايدة، مما يزيد من تقارب التهجين إلى الحمض النووي المشحون ة سلبا، مما أدى إلى القليل من الخلفية أو لا. خطوة التحقيق التيلومير اختيارية. للشروع في تلطيخ الأجسام المضادة ، وإعادة ترطيب الشرائح في 1x PBS كما هو مبين في الخطوة 2.2.2.، ثم انتقل مباشرة إلى "تلطيخ الأجسام المضادة الأولية".

  1. جعل الكواشف التحقيق السلطة الوطنية الفلسطينية قبل البدء في تلطيخ التيلومير
    ملاحظة: من المناسب إعداد الحلول التالية في الكميات المحددة للاستخدام في التجارب المستقبلية. وترد أدناه ملاحظة ظروف التخزين.
    1. إعداد 2 لتر من محلول سترات الصوديوم المالحة 20x (SSC) مع تركيز نهائي قدره 3 م NaCl و 0.3 M سترات الصوديوم. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    2. جعل 50 مل من محلول ما قبل التهجين التي تحتوي على نقل الحمض النووي الريبي إلى تركيز نهائي من 50٪ formamide، 5x SSC، 50 ميكروغرام/مل الهيبارين، 500 ميكروغرام/مل نقل الجيش الملكي النيبالي، 0.1٪ توين 20 وإضافة 460 ميكرولتر من 1 M حمض الستريك لجلب الحل إلى درجة الحموضة ~ 6. تخزين في -20 درجة مئوية.
      تنبيه: فورماميد خطير. إعداد الحل في غطاء الدخان.
    3. جعل 50 مل من حل ما قبل التهجين أعدت بنفس الطريقة كما هو الحال في الخطوة 2.1.2 دون إضافة نقل الجيش الملكي النيبالي. تخزين في -20 درجة مئوية.
    4. يتم إعداد مسابير telC-Cy3 و TelC-Alexa647 كمخزون 50 ميكرومتر في formamide حسب تعليمات الشركة المصنعة. تخزين تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية كما 8 μL aliquots في -80 درجة مئوية.
    5. جعل ما لا يقل عن 1 مل من 100 ملغ / مل حل الأسهم من الزلال مصل البقر (BSA) في الماء المقطر المعقم. تخزين في -20 درجة مئوية. إذا كان إعداد أكثر من 1 مل من المخزون BSA، وتخزين الحل كما 1 مل aliquots.
    6. باستخدام أنبوب 2 مل، قم بإعداد 2 مل من محلول التهجين بإضافة 27 ميكرولتر من 100 ملغم/مل BSA و8 ميكرولتر من مسبار 50 ميكرومتر من السلطة الوطنية الفلسطينية إلى 1.965 مل من محلول ما قبل التهجين الذي يحتوي على نقل الحمض النووي الريبي. تخزين في الظلام في -20 درجة مئوية.
  2. السلطة الوطنية الفلسطينية telomere التحقيق تلطيخ
    1. سخني الفرن الهجين إلى 82 درجة مئوية.
    2. إعادة الشرائح هيدرات مع 500 ميكرولتر من 1x PBS لكل شريحة لمدة 5 دقيقة في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    3. سخني الشرائح وأنبوب 2 مل الذي يحتوي على محلول التهجين مباشرة على سطح معدني في فرن التهجين الساخن لمدة دقيقتين.
    4. مع الحفاظ على الشرائح على السطح المعدني، أضف 100 ميكرولتر من محلول التهجين لكل شريحة ثم قم بتغطية الشرائح بقسائم تغطية بلاستيكية (~ 25 مم × 75 مم) لقطع الشكل من كيس الأوتوكلاف. السماح للشرائح الجلوس في 82 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة.
    5. ضع الشرائح في غرفة رطوبة في الظلام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة. من هذه النقطة إلى الأمام وتلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، يجب أن تبقى الشرائح في الظلام لتجنب التبييض الضوئي لإشارة الفلورية. بعد فترة الحضانة ، يمكن إعداد الكواشف لتلطيخ الأجسام المضادة خلال الخطوة 2.2.9.
    6. قم بإزالة قسائم التغطي اتّصال بطرف ماصة.
      ملاحظة: لتسهيل إزالة قسيمة الغطاء، يمكن الاستغناء عن 50-100 ميكرولتر من محلول التهجين بدون نقل الحمض النووي الريبي بلطف بين الشريحة وقسيمة الغطاء أثناء رفع قسيمة التغطي.
    7. ماسيت 500 ميكرولتر من محلول ما قبل التهجين مع عدم نقل الحمض النووي الريبي على كل شريحة ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
      ملاحظة: حل ما قبل التهجين مع عدم نقل RNA لا يتم تسخينها مسبقاً قبل إضافتها على كل شريحة.
    8. ماسيت 500 ميكرولتر من 50٪ حل ما قبل التهجين مع عدم نقل الجيش الملكي النيبالي في 1x PBS إلى كل شريحة ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    9. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين وغسل 3 مرات في 1x PBS مع اهتزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسل في درجة حرارة الغرفة.
    10. إزالة الشرائح من جرة كوبلين وإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية. ثم انتقل إلى الخطوة 3.2 "تلطيخ الأجسام المضادة الأولية".

3. تلطيخ الأجسام المضادة

ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة التي أثيرت إلى البروتينات المتوسطة المعروفة للكشف عن الفلورالمناعي في الاستعدادات كروموسوم انتشار. تسمح الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفوريات المختلفة بتلطخ بروتينات متعددة في وقت واحد ، إذا كانت الأجسام المضادة الأولية قد أثيرت في الحيوانات المختلفة.

  1. جعل الحلول التالية في يوم تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية
    1. جعل 1 لتر من PBT مع 1x PBS و 0.1٪ تريتون X-100 المخفف في الماء المقطر. تخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويمكن إعداد ذلك في وقت مقبل وبكميات كبيرة لإجراء تجارب الانتشار في المستقبل.
    2. إعداد 500 ميكرولتر من كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة إلى تركيز نهائي من 2 ملغ / مل من BSA و 2٪ مصل الماعز في PBT.
    3. لجعل 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية لكل شريحة، إضافة الأجسام المضادة المناسبة في التركيز الصحيح (انظر جدول المواد)في كتلة الأجسام المضادة.
      ملاحظة: قد يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى تحديد تجريبي. في المناقشة ، ونحن ندرج قائمة من الأجسام المضادة حاولنا بنجاح (مع تخفيف / تركيزات) وتلك التي حاولنا دون نجاح.
  2. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية
    ملاحظة: أرنب المضادة للإنسان SCP3 والدجاج المضادة للحمار الوحشي Sycp1 وعادة ما تستخدم لتلطيخ الأجسام المضادة الأولية.
    1. بعد إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من الشرائح، إضافة 500 ميكرولتر من كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.
    2. إزالة كتلة الأجسام المضادة عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    3. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية في كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة وقم بتغطية الشرائح بقسيمة غلاف بلاستيكية مصنوعة من كيس الأوتوكلاف. ضع الشرائح في غرفة رطوبة بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    4. قم بإزالة القسائم بطرف ماصة واغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق كحد أدنى مع 1x PBS في جرة كوبلين مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    5. قم بإزالة برنامج تلفزيوني عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
  3. تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية
    ملاحظة: تستخدم الماعز المترافق المضادة للأرانب والأجسام المضادة للدجاج لمختلف الفلوروفوريات للتلطيخ عند تركيز 1:1000.
    1. أضف 500 ميكرولتر من كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة وضع الشرائح في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 5 دقيقة.
    2. قم بإزالة كتلة الأجسام المضادة عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    3. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية في كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة وقم بتغطية الشرائح بقسيمة غلاف بلاستيكية مصنوعة من كيس الأوتوكلاف. ضع الشرائح في غرفة رطوبة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة القسائم بطرف ماصة واغسل الشرائح 3 مرات لمدة لا تقل عن 5 دقيقة مع 1x PBS في جرة كوبلين مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    5. شطف الشرائح مرة واحدة لمدة لا تقل عن 2 دقيقة مع الماء المقطر في جرة كوبلين مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    6. الهواء الجاف الشرائح يميل، لتسهيل التجفيف.
    7. ضع 20 ميكرولتر من الجانب المضاد للتلاشي مع أو بدون DAPI (انظر جدول المواد)كـ 3 نقاط متباعدة بالتساوي على قسائم التغطيات الزجاجية (24 مم × 60 مم).
    8. ضع الشرائح على الشرائح أسفل القسائم الزجاجية ثم ختم القسائم مع طلاء الأظافر على حافة متداخلة نهاية متجمد من الشريحة.
    9. تخزين الشرائح المعدة في 4 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد حددنا طريقة لإعداد وتصور حمار وحشي الحيوانات المنوية الاستعدادات انتشار. عندما يؤديها بشكل صحيح، لدينا إجراءات تسفر عن انتشار جيد، والنوى غير متداخلة. لاستعادة هذه النوى ، من المهم أن يكون المبلغ المناسب من المواد بدءا (أي الخصيتين) ، وعلاج الخصيتين لفترة كافية من الوقت في التربسين وعدد كاف من العلاجات DNase الأول. ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه السبريدات ملطخة بالتيلوميرات والبروتينات الميوتيكلدراسة تطور الميوتي خلال المرحلة الأولية I. يصور الشكل 1 أمثلة لمستحضرات الانتشار الملطخة بخصائص الكروموسومات في مراحل مختلفة من المرحلة الأولية I. يوضح الشكل 4 مثالاً على سوء انتشار النوى.

Figure 1
الشكل 1: صور تمثيلية فائقة الدقة لتحضيرات الانتشار الكروموسومي الملطخة بتحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية والأجسام المضادة. (أ)التخطيطي للمجمع synaptonemal. (ب)زوج ممشمن المتماثلات تظهر بروتين محور الكروموسوم Sycp3 (الأخضر)، وبروتين خيوط عرضية Sycp1 (أحمر)، والحمض النووي (الأزرق) تصويرها المجهر الإضاءة الهيكلية (SIM) باستخدام هدف 100x. شريط المقياس = 1 μm.(C)تظهر الألواح على اليسار ثلاث مراحل من المرحلة الأولية المتوسطة: اللبتوتين (أعلى) ، أوائل الزيجوتين (الأوسط) وpachytene (أسفل). شريط المقياس = 5 ميكرون. اليمين: صور تمثيلية تحتوي على التيلوميرات (أرجواني) لكل مرحلة. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مثال على الخصيات حمار وحشي (~ 7 أشهر بعد الإخصاب). (أ)صورة يظهر الموقع النسبي للtestis داخل حمار وحشي. الخصية تقع بين المثانة السباحة والأمعاء. (ب)طول الخصية. أصغر حمار وحشي سيكون لها خصيأصغر. بالنسبة لينتشر الكروموسوم، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والأنسجة المحيطة بها من الخصية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: غرفة الرطوبة للشرائح. يرصد لدينا غرفة الرطوبة باستخدام مربع رغوة البوليسترين (21 سم × 19 سم × 6 سم) مصممة لشحن البوات الكهربائي. أدخلنا مناديل الأنسجة الرقيقة الرطبة (انظر جدول المواد)في كل أخدود آخر. يتم وضع الشرائح مسطحة على قمة التلال دون لمس المناديل الرطبة. كما تتوفر غرفة رطوبة تجارية (انظر جدول المواد). ونحن نتصور أن أي مربع رغوة البوليسترين مزودة التلال والأخاج (على سبيل المثال، باستخدام ماصة الزجاج13)يمكن استخدامها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة على فروق الأسعار ذات النوعية الرديئة بسبب عدم كفاية علاجات DNase I. الكروموسومات Meiotic ملطخة لSycp3 التي تم وضعها بواسطة SIM باستخدام هدف 20x. غير كافية DNase I العلاجات يؤدي إلى تداخل النوى بسبب تعليق خلية السكروز لزجة التي تمنع الخلايا من الانتشار بشكل صحيح على الشريحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: أمثلة على انتشار الكروموسوم باستخدام طريقة بديلة11. الكروموسومات Meiotic ملطخة لSycp3 (الأخضر) وSycp1 (الأحمر). تم إعداد ينتشر الكروموسوم كما وصفها سانسام وبيزا11. يمكن تنفيذ هذه الطريقة باستخدام سمك الحمار الوحشي الفردي بدلاً من العديد من سمك الحمار الوحشي المطلوب لبروتوكولنا. في أيدينا، من الشائع أن نرى الكروموسومات التي ليست منتشرة بشكل جيد. هناك أيضا زيادة ملحوظة في تلطيخ الخلفية التي تنتج عن الحطام الذي يترك على الشرائح أثناء إجراء انتشار الكروموسوم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نصف طرق للتحقيق في موقع التيلوميرات والبروتينات المرتبطة الكروموسوم في السطح النووي ينتشر من الحيوانات المنوية معزولة عن الخصيتين حمار وحشي. نتوقع أن تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتحليل الحيوانات المنوية في الأنواع الأخرى teleost مع التكيف مع حجم الخصية.

في حين تم رفع عدد قليل فقط من الأجسام المضادة إلى البروتينات ميوتيك حمار وحشي، لقد كان النجاح باستخدام الأجسام المضادة التالية التي أثيرت إلى الإنسان (ح) أو الماوس (م) البروتينات. وقد أثار مختبرنا الأجسام المضادة لحمار وحشي Sycp1 البروتين (zfSycp1) في الدجاج الذي كان بمثابة علامة موثوق بها لمجمع synaptonemal (SC)، ومع ذلك، هذا البروتين موجود فقط من الزيجوتين في وقت مبكر إلى pachytene في وقت متأخر، عندما الكروموسومات هي مشابك تماما. كان الأجسام المضادة المضادة لـ hSYCP3 من الأرانب موثوقة للغاية للكشف عن محاور الكروموسومات المتوسطة من اللبتوتين حتى حل SC في الباتشيتين في وقت متأخر(الشكل 1B, C). والجدير بالذكر أننا لم نلاحظ مرحلة الديبلوتين الكلاسيكية مع محاور كاملة الطول التي حددها Sycp3 وغياب Sycp1 ، مما يشير إلى أنه ، على عكس الماوس ، قد تتدهور المحاور بعد الخروج من pachytene3. الأجسام المضادة الأخرى المتاحة تجاريا لm، ح أو zf البروتينات ميوتيك التي أعطت نتائج إيجابية تشمل أيضا إعادة تركيب الحمض النووي / النسخ المتماثل أرنب المضادة hRAD51 وأرنب المضادة hRPA. يتم سرد مصدر كل جسم مضاد والتخفيف المستخدم في جدول المواد. تلك التي حاولنا دون نجاح باستخدام ما لا يقل عن ثلاثة تخفيفات مختلفة تشمل الماعز المضادة hDMC1، الماوس المضادة hMlh1، الماوس المضادة لهامستر Sycp3، الماوس المضادة hRPA.

هناك ثلاث مراحل حرجة من إجراء انتشار الكروموسوم. الأول هو جمع الكمية الصحيحة من المواد. وينبغي أن تكون خمس عشرة الخصية سليمة كافية لبروتوكول نشر للذكور ~ 6 mpf، ويمكن تعديل هذا العدد صعودا أو هبوطا اعتمادا على حجم الحيوانات. نضع في اعتبارنا أن بعض المسوخ meiotic سيكون أصغر testes، لذلك ينبغي استخدام 2 الحيوانات إضافية. الخطوة الثانية الهامة هي تفكك الخلايا. أثناء هضم التربسين ، إذا لم تنفصل الخصيتين إلى كتل صغيرة ، فمن المحتمل أن يتم استرداد عدد قليل جدًا من الخلايا من إجراء الانتشار. الخطوة الرئيسية الثالثة هي وجود بيليه مرئية بعد العلاجات DNase I. إذا بيليه غير مرئية، فمن المرجح أن الإجراء نشر سوف تسفر عن القليل من أي نواة. قد ينشأ فقدان بيليه إذا تم استخدام عدد قليل جدا من الحيوانات أو إذا تم تنفيذ الكثير من DNase أنا النظافة. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي عدد قليل جدًا من علاجات DNase I إلى تعليق خلايا السكروز اللزج ، مما سيمنع الخلايا من الانتشار على الشريحة(الشكل 4). من المهم الاستمرار في إجراء علاجات DNase I (بحد أقصى 4 علاجات) حتى لا تعد الكتل موجودة عند إضافة DMEM.

تنتج تقنية الانتشار الكروموسومية المقدمة مئات النوى المنتشرة بشكل جيد لكل شريحة. باستخدام هذا الإجراء ، تمكنا من تقديم تحليل مفصل للأحداث الرئيسية أثناء تكوين الحيوانات المنوية حمار وحشي باستخدام المجهر فائق الدقة3. في أيدينا ، وقد ولدت هذا البروتوكول الكروموسومات انتشار أفضل ، مع أقل الحطام على الشريحة ، وأقل تلطيخ الخلفية مقارنة مع أساليب أسرع باستخدام الحيوانات المفردة التي وصفها موينس14 وSansam وPezza11 (الشكل 5). ومن المرجح أن تكون هذه الاختلافات بسبب استخدام الكولاجين، التريبسين، وعلاجات دناز في بروتوكولنا. اثنين من القيود التي لدينا تقنية هي شرط استخدام 10-20 الذكور حمار وحشي الكبار والعلاجات انزيم أكثر مشقة وخطوات الغسيل. إذا لم يكن الكشف عن الدقة الفائقة ضروريًا ، أو إذا كانت مادة الحمار الوحشي محدودة ، أو تم اختبار أكثر من شرطين بالتوازي ، فقد تكون الطرق الأسرع بدائل أكثر ملاءمة14،15،16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر ترينت نيومان وماسودا شريفي على تعليقاتهما على المخطوطة و"نغوين" للمساعدة في تحسين طرق نشر وتلطيخ الكروموسومات من مقلدات الحمار الوحشي. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM079115 الممنوحة لS.M.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).

Tags

علم الوراثة، العدد 157، meiosis، حمار وحشي، testis، ينتشر الكروموسوم، مجمع synaptonemal، التيلوميرات، تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية، التهجين، المجهر المناعي، المجهر فائقة الدقة، تلطيخ الأجسام المضادة، الفلورفينس في التهجين الموقعي، FISH
إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, … More

Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter