Summary
Kjernefysiske overflatespreader er et uunnværlig verktøy for å studere kromosomhendelser under meiosis. Her demonstrerer vi en metode for å forberede og visualisere meiotiske kromosomer under profase I fra sebrafiskspermatocytter.
Abstract
Meiosis er den viktigste cellulære prosessen som kreves for å lage haploid gametes for seksuell reproduksjon. Modellorganismer har vært medvirkende til å forstå kromosomhendelsene som finner sted under meiotisk profase, inkludert paring, synapsis og rekombinasjonshendelser som sikrer riktig kromosomsegregering. Mens musen har vært en viktig modell for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse prosessene, er ikke alle meiotiske hendelser i dette systemet analoge med menneskelig meiose. Vi har nylig demonstrert det spennende potensialet til sebrafisken som en modell av human spermatogenese. Her beskriver vi i detalj våre metoder for å visualisere meiotiske kromosomer og tilhørende proteiner i kromosomspredningspreparater. Disse preparatene har fordelen av å tillate høyoppløselig analyse av kromosomstrukturer. For det første beskriver vi prosedyren for å dissekere testiklene fra voksen sebrafisk, etterfulgt av celledissosiasjon, lyse og spredning av kromosomene. Deretter beskriver vi prosedyren for å oppdage lokalisering av meiotiske kromosomproteiner, ved immunofluorescensdeteksjon og nukleinsyresekvenser, ved fluorescens i situ hybridisering (FISH). Disse teknikkene utgjør et nyttig sett med verktøy for cytologisk analyse av meiotisk kromatinarkitektur i sebrafisksystemet. Forskere i sebrafisk samfunnet bør være i stand til raskt å mestre disse teknikkene og innlemme dem i sine standard analyser av reproduktiv funksjon.
Introduction
Seksuell reproduksjon fortsetter gjennom kombinasjonen av to haploid gametes, hver bærer halvparten av kromosomkomplement av en somatisk celle. Meiosis er en spesialisert celledivisjon som produserer haploid gametes gjennom en runde DNA-replikasjon og to påfølgende runder med kromosomsegregering. I profase I må homologe kromosomer (homologer) gjennomgå paring, rekombinasjon og synapsis, hvorav sistnevnte er preget av dannelsen av synaptonemal-komplekset som består av to homologakser brolagt av den tverrgående filamentet, Sycp1 (Figur 1A,B). Unnlatelse av å utføre disse prosessene kan føre til produksjon av aneuploid gametes, som er en ledende årsak til spontanaborter hos mennesker1. Vår kunnskap om koordinering mellom paring, rekombinasjon og synapsis har blitt tilrettelagt av studier i et bredt spekter av organismer, som gjær, C. elegans,mus og Drosophila, blant andre2. Mens den generelle prosessen med homologk kromosom paring etterfulgt av segregering er godt bevart, er avhengigheten av rekombinasjon og synapsis og rekkefølgen på disse hendelsene varierer.
Meiotisk dobbel-strand pause (DSB) formasjon, som initierer homolog rekombinasjon, oppstår nær telomeres klynget i buketten under leptoten og synapsis følger kort tid etter3,4. Denne konfigurasjonen av DSB dannelse og synapsis initiering er også et karakteristisk for mannlig meiosis hos mennesker, men ikke i mus5,6,7,8, noe som tyder på at sebrafisk kan tjene som en modell for menneskelig spermatogenese. Det er også flere praktiske fordeler ved å studere sebrafisk meiosis. Både menn og kvinner gjennomgår gametogenesis gjennom voksen alder, deres gonader er lett tilgjengelig, og hundrevis av avkom genereres fra et enkelt kors. I tillegg er embryoene gjennomsiktige og utvikler seg eksternt, noe som letter tidlig påvisning av avvik i embryonisk utvikling på grunn av aneuploid gametes3,9. Ulemper ved å bruke sebrafisk er at de er trege til å nå seksuell modenhet (~ 60 dager) og mengden materiale som trengs for kjernefysiske overflatespreader må samles inn fra ~ 10-20 voksne dyr, avhengig av deres størrelse.
Meiotiske kromosomspredningspreparater er et viktig verktøy for å studere kromosomdynamikk på tvers av alle modellorganismer, siden viktige signaturer av meiotisk kromosomdynamikk kan undersøkes. I sebrafisk har viktige aspekter ved utviklingen av meiotisk program og kjernefysisk organisasjon blitt dissekert gjennom sondering kjernefysiske overflatespreader, referert til her som kromosomspreader, med antistoffer for immunofluorescensdeteksjon av proteiner og/ eller nukleinsyrer av FISH3,4,9,10,11,12. Faktisk kan polarisert lokalisering av grupperte telomerer i buketten bevares i spredningspreparatet (Figur 1C). Nylig har vi brukt sebrafisk spermatocyte kromosom sprer seg sammen med fluorescens deteksjonsmetoder og superoppløsning mikroskopi for å belyse den detaljerte progresjonen av sebrafisk telomere dynamikk, homologkkromosom paring, dobbel-strand pause lokalisering, og synapsis på viktige meiotiske overganger3. Her presenterer vi metoder for å forberede kromosomsprer fra spermatocytter av sebrafisktestiklene og deretter flekker dem med fluorescerende peptid kjernesyre (PNA) sonder til gjentatte telomersekvenser og immunofluorescensdeteksjon av kromosom assosierte proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som involverte sebrafisk ble utført ved hjelp av etiske standarder godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved UC Davis.
1. Kromosom spredning prosedyre
MERK: Følgende protokoll er utformet for å lage 4-6 lysbilder, med hundrevis av spredte meiotiske kjerner per lysbilde. Antall testiklene som brukes vil avhenge av størrelsen på fisken. Forvent å bruke 20 dyr på ~ 60 dager etter befruktning (dpf) og 15 dyr på ~ 6 måneder etter befruktning (mpf). For store sebrafisk (f.eks. 12 mpf) bør 10 dyr være tilstrekkelige. Vær oppmerksom på at testiklene av noen meiotiske mutanter (f.eks. spo11-/-) vil være noe mindre3. I denne protokollen anses ett utvalg av testikler som et enkelt eksempel. Det anbefales at ikke mer enn 4 prøver er utarbeidet parallelt.
- Lag følgende løsninger før du starter spredningsprosedyren
MERK: Det er praktisk å klargjøre følgende løsninger i mengdene som er angitt for bruk i fremtidige spredningseksperimenter.- Forbered en 0,1 M sukroseløsning ved å oppløse 3,42 g sukrose i 100 ml destillert vann. Ta med sukroseoppløsningen til pH 8 ved hjelp av 1 M Tris-HCl som også er på pH 8. Filtrer deretter steriliser sukroseoppløsningen. Oppbevares ved romtemperatur.
- Lag en 10x fosfatbufret saltvannsløsning (PBS) til en endelig konsentrasjon på 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 og 27,6 mM KH2PO4 i 1,8 L destillert vann. Rør til oppløst, og juster deretter pH til 7,3 med NaOH og autoklav. Oppbevares ved romtemperatur.
- Lag en 400 μg/ml DNase I-oppløsning i sterilt destillert vann. Oppbevares ved -20 °C. Det anbefales å forberede 5 ml av denne løsningen og deretter lagre som 100 μL aliquots.
- Lag følgende løsninger på dagen for spredningsprotokollen
MERK: For tidseffektivitet er det best å lage kollagensliket løsning umiddelbart etter dissekering av alle testiklene og deretter gjøre trypsin og trypsin inhibitor løsninger i løpet av den tiden som prøvene blir behandlet i kollagen.- Oppløs 4 mg kollagenase i 200 μL av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) per prøve (2% w/v kollagenetter endelig konsentrasjon). Hold på is til det er nødvendig. Kollagenene vil dissosiere testiklene.
- Oppløs 1,4 mg trypsin i 200 μL DMEM per prøve (0,7 % w/v trypsin sluttkonsentrasjon). Hold på is til det er nødvendig. Trypsin vil bidra til å dissosiere cellene.
- Oppløs 10 mg trypsinhemmer i 500 μL DMEM per prøve (2 % w/v trypsinhemmer endelig konsentrasjon). Hold på is til det er nødvendig. Trypsinhemmer hindrer trypsin fra å degradere cellene.
- Forbered en 1% formaldehydløsning (fra en 16% ferdigløsning) med 0,15% Triton X-100 i sterilt destillert vann. Hold på is til det er nødvendig. Den 1% formaldehyd kan tilberedes mens testiklene blir behandlet med trypsin og DNase I (dvs. i trinn 1.4.7 av spredningsprosedyren).
FORSIKTIG: Formaldehyd er farlig.
- Disseksjon av testiklene fra voksen hannsefisk
- Euthanize mannlige sebrafisk (> 60 dpf) ved å senke dem i isvann. Fisken kan holdes i isvann til de er klare til å dissekere, men de skal dissekeres så snart som mulig.
MERK: Den ville typen belastning AB brukes til denne prosedyren, men andre villtype stammer bør også være mottagelig. Den lengste tiden vi har holdt fisk i isvann før dissekering er 3 timer uten merkbar effekt på protokollen. - Decapitate en fisk om gangen med liten saks og bruk deretter mikrosaks til å kutte langs ventralmidtlinjen for å eksponere kroppshulen.
- Dissekertestis ved hjelp av tang (se Tabell av materialer) på 1,65x forstørrelse under et mikroskop. Utfør desseksjonene i en silikonbelagt Petri-tallerken med dekket av et grunt basseng på 1x PBS.
MERK: Testis ligger mellom svømmeblæren og tarmen og vil vises lettere enn muskelvev (Figur 2A). Testis bør ha 2 fliker når den fjernes fra sebrafisken (Figur 2B). - Fjern så mye fett og omkringliggende vev fra testis som mulig. Legg deretter til hver dissekert testis direkte i et 5 ml rør med 2 ml DMEM og hold på is.
MERK: Trinn 1.3.3 og 1.3.4 bør mestres før du gjør noen eksperimenter.
- Euthanize mannlige sebrafisk (> 60 dpf) ved å senke dem i isvann. Fisken kan holdes i isvann til de er klare til å dissekere, men de skal dissekeres så snart som mulig.
- Dissosiasjon av testiklene celler
- Før varm 100 ml 0,1 M sukroseoppløsning til 37 °C.
- Tilsett 200 μL kollagennaseoppløsning til 5 ml-røret med testiklene. Bland løsningen ved å invertere den flere ganger.
- Rist testiklene forsiktig i en inkubatorshaker horisontalt ved 100 o/min ved 32 °C i 50 minutter til en time til DMEM er overskyet og testiklene er i små biter. Vend røret raskt hver 10 min for å lette dissosiasjonen.
- For å vaske ut kollagen, legg DMEM til et endelig 5 ml volum og inverter røret noen ganger. Pellet testiklene på ~ 200 x g for 3 min ved romtemperatur. Fjern 3 ml av supernatanten slik at bare 2 ml gjenstår.
MERK: Tillegg, fjerning og overføring av DMEM gjøres med plastoverføringspipetter for hele kromosomforordet. - Gjenta trinn 1.4.4 to ganger til for totalt 3 DMEM-vasker. Ikke resuspender pelleten mellom DMEM vasker. Etter den siste DMEM-vasken, fjern 4 ml supernatant slik at bare 1 ml gjenstår.
- Tilsett 1 ml DMEM for et totalt volum på 2 ml og tilsett 200 μL av trypsinoppløsningen og 20 μL DNase I-løsning. Snu røret et par ganger for å blande løsningen.
- Vannrett rist røret ved 32 °C i 5-15 min ved 100 o/min til DMEM-oppløsningen bare inneholder noen få klumper. Vend røret raskt hver 5 min for å lette dissosiasjonen.
MERK: Klumpene skal være betydelig mindre etter risting. - Tilsett 500 μL av trypsinhemmeroppløsningen og 50 μL DNase I-oppløsning. Snu røret et par ganger for å blande, og deretter kort spinne ned på ~ 200 x g i 3 min ved romtemperatur for å fjerne væske eller klumper som kan holde seg til rørhetten eller siden av røret.
- Plasser røret på isen og resuspender cellesuspensjonen ved å gjentatte ganger pipettere opp og ned med en plastoverføringspipette i 2 min for å lette dissosiasjon av eventuelle gjenværende klumper. Ikke la cellesuspensjonen gå inn i pæren på overføringspipetten. Etter 2 min, pipette suspensjonen tilbake i 5 ml rør.
- Pre-våt en 100 μm celle sil med DMEM og plassere den på toppen av en 50 ml rør på is.
- Overfør cellesuspensjonen gjennom silen en dråpe om gangen ved hjelp av en plastoverføringspipett. Kontroller at cellesuspensjonen ikke går inn i pæren på overføringspipetten.
- Overfør filtrateved hjelp av en plastoverføringspipette til et nytt 5 ml rør og tilsett DMEM til et endelig volum på 5 ml. Pass på å samle de sammenslåtte cellene som er festet til undersiden av filteret med en ren plastoverføringspipett. Pellet cellene på ~ 200 x g for 5 min ved romtemperatur.
- Fjern så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pelleten.
- Tilsett 5 μL DNase I-løsning direkte inn i pelleten. Bland deretter pelleten med DNase I-løsningen ved å skrape forsiktig utsiden av røret 4-5 ganger langs et tomt 1,5 ml mikrocentrifugerørstativ. Skraping for hardt kan resultere i en reduksjon av gjenvunnet spreads.
- Tilsett DMEM til et endelig volum på 5 ml og bland løsningen ved å invertere røret flere ganger. Det er vanlig at klumper fortsatt er til stede etter den første DNase I-behandlingen.
- Pellet cellesuspensjonen på ~ 200 x g i 2 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 1.4.13-1.4.16 ytterligere 1-3 ganger til den resuspenderte pelleten ikke klumper seg ved tillegg av DMEM. Etter siste spinn, fjern så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pellet.
MERK: Forvent en reduksjon i pelletstørrelse med hver DNase I-behandling; over 4 totale DNase jeg vasker kan resultere i betydelig tap av celler. Hvis ingen pellet er synlig etter DNase I behandlinger trinn, ikke fortsett med prosedyren. Kast eventuelle ubrukte DNase I. - Tilsett 1 ml 1x PBS og resuspender pelleten ved å forsiktig skrape utsiden av røret langs et tomt 1,5 ml rørstativ.
- Pellet cellen suspensjon på ~ 200 x g for 5 min deretter fjerne så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pellet.
- Klipp ~ 3 mm fra enden av en 200 μL pipettespiss for å utvide blenderåpningen og resuspendere pelleten i ~ 80 μL på 0,1 M sukroseoppløsning ved å pipettere opp og ned med kuttpipettespissen. La cellesuspensjonen sitte ved romtemperatur i 3 min.
- Spre kromosomer på glasssklier
- Coat ett lysbilde med 100 μL av 1% formaldehyd med 0,15% Triton X-100 med siden av en pipettespiss. Tilsett deretter 18 μL av sukrosecellesuspensjonen på midten av lysbildet i en rett linje vinkelrett på langkanten. Vipp lysbildet frem og tilbake (~ 60°) for å lette spredningen av cellesuspensjonen til alle hjørner.
- Plasser lysbildene flatt ned i et litt sprukket åpent fuktighetskammer (figur 3) for å hindre at formaldehydoppløsningen tørker. Plasser fuktighetskammeret i en mørk skuff over natten.
- Fjern lokket fra fuktighetskammeret og la lysbildene tørke helt.
- Legg skliene i en Coplin-krukke og fyll Coplin-krukken med destillert vann og inkuber i 5 min med mild risting ved romtemperatur.
MERK: Lysbildene kan plasseres i Coplin-krukken i et sikksakkmønster for å maksimere antall lysbilder per Coplin-krukke. Kontroller at det er plass til væske som skal passere mellom alle lysbildene. - Hell ut vannet og fyll krukken med 1:250 fuktingsmiddel (se Materialtabell). Vask 2 ganger i 5 min hver med mild risting ved romtemperatur.
- La lysbildene tørke helt og oppbevares ved -20 °C til de er farget.
MERK: Den lengste vi har lagret lysbilder uten merkbar nedbrytning av kromosomene er ~ 2 måneder.
2. Telomere PNA sonde farging
MERK: Telomere repetisjoner kan være farget ved hjelp av fluorophore-konjugerte telomere PNA-sonder som hybridiserer til ledende strandtelomere repetisjoner (CCCTAA). PNA-prober har en nøytral ryggrad, noe som øker hybridiseringsaffiniteten til negativt ladet DNA, noe som resulterer i liten eller ingen bakgrunn. Telomere-prøvetrinnet er valgfritt. For å fortsette til antistofffarging, rehydrere lysbilder i 1x PBS som angitt i trinn 2.2.2., fortsett deretter direkte til "Primær antistofffarging".
-
Lag PNA-probereagensene før du starter telomerefar
MERK: Det er praktisk å klargjøre følgende løsninger i antallene som er angitt for bruk i fremtidige eksperimenter. Lagringsforholdene er notert nedenfor.- Forbered 2 L saltvannsnatriumsitrat (SSC) oppløsning med en endelig konsentrasjon på 3 M NaCl og 0,3 M natriumsitrat. Autoklav og oppbevar esus ved romtemperatur.
- Lag 50 ml pre-hybridiseringsløsning som inneholder overføring RNA til en endelig konsentrasjon på 50% formamid, 5x SSC, 50 μg/ml heparin, 500 μg/ml overføring RNA, 0,1% Tween 20 og tilsett 460 μL av 1 m sitronsyre for å bringe løsningen til pH ~ 6. Oppbevares ved -20 °C.
FORSIKTIG: Formamid er farlig. Forbered løsningen i en røykhette. - Lag 50 ml pre-hybridiseringløsning utarbeidet på samme måte som i trinn 2.1.2 uten å legge til overføring RNA. Oppbevares ved -20 °C.
- PNA telomere probes TelC-Cy3 og TelC-Alexa647 er utarbeidet som 50 μM aksjer i formamid i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar PNA-sondene som 8 μL aliquots ved -80 °C.
- Lag minst 1 ml 100 mg/ml lageroppløsning av storfeserumalbumin (BSA) i sterilt destillert vann. Oppbevares ved -20 °C. Hvis du forbereder mer enn 1 ml lager BSA, lagre ren løsningen som 1 ml aliquots.
- Bruk et 2 ml rør til bereder 2 ml hybridiseringsoppløsning ved å tilsette 27 μL på 100 mg/ml BSA og 8 μL på 50 μM PNA-sonde til 1,965 ml prehybridiseringsoppløsning som inneholder overføring RNA. Oppbevares i mørket ved -20 °C.
-
PNA telomere sonde farging
- Forvarm hybridiseringsovnen til 82 °C.
- Re-hydrat eslides med 500 μL av 1x PBS per sklie i 5 min i et fuktighetskammer ved romtemperatur. Fjern PBS ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle.
- Varm opp lysbildene og 2 ml-røret som inneholder hybridiseringsløsningen direkte på en metalloverflate i den oppvarmede hybridiseringsovnen i 2 min.
- Mens du holder lysbildene på metalloverflaten, legg til 100 μL hybridiseringsoppløsning en sklie og dekk deretter lysbildene med plastdekk (~ 25 mm x 75 mm) kuttet for å forme ut av en autoklavpose. La lysbildene sitte ved 82 °C i 10-12 min.
- Plasser lysbildene i et fuktighetskammer i mørket ved 37 °C i 16-24 timer. Fra dette punktet fremover og for den primære og sekundære antistofffarging, må lysbildene holdes i mørket for å unngå fotobleking av fluorescenssignalet. Etter inkubasjonsperioden kan reagensene for antistofffarging tilberedes i trinn 2.2.9.
- Fjern dekksslipsene med en pipettespiss.
MERK: For å lette fjerningen av dekksslip, ~ 50-100 μL av hybridiseringsløsningen uten overføring RNA kan forsiktig dispenseres mellom lysbildet og dekkslip som dekkslip blir løftet. - Pipette 500 μL pre-hybridiseringløsning uten overføring RNA på hvert lysbilde og plasser lysbildene i fuktighetskammeret i 15 min ved romtemperatur. Fjern oppløsningen ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle.
MERK: Pre-hybridiseringsløsningen uten overføring RNA er ikke forvarmet før den legges til på hvert lysbilde. - Pipette 500 μL av 50% pre-hybridiseringløsning uten overføring RNA i 1x PBS til hvert lysbilde og plasser lysbildene i fuktighetskammeret i 15 min ved romtemperatur. Fjern oppløsningen ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle.
- Overfør lysbildene til en Coplin-krukke og vask 3 ganger i 1x PBS med mild risting i 15 min per vask ved romtemperatur.
- Fjern lysbildene fra Coplin-krukken og fjern overflødig PBS ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle. Fortsett deretter til trinn 3.2 "Primær antistofffarging".
3. Antistofffarging
MERK: Antistoffer som er oppvokst til kjente meiotiske proteiner, kan brukes til immunofluorescensdeteksjon i spread kromosompreparater. Sekundære antistoffer konjugert til forskjellige fluoropforer gjør det mulig for flere proteiner å bli farget samtidig, hvis de primære antistoffene ble reist i forskjellige dyr.
-
Lag følgende løsninger på dagen for den primære og sekundære antistofffarging
- Lag 1 l PBT med 1x PBS og 0,1% Triton X-100 fortynnet i destillert vann. Oppbevares ved romtemperatur. Dette kan utarbeides på forhånd og i store mengder for fremtidige spredningseksperimenter.
- Forbered 500 μL antistoffblokk per sklie til en endelig konsentrasjon på 2 mg/ml BSA og 2 % geitserum i PBT.
- For å lage 100 μL primær eller sekundær antistoffblanding per lysbilde, legg til de riktige antistoffene ved riktig konsentrasjon (se Materialtabell)i antistoffblokken.
MERK: Antistoffkonsentrasjon må kanskje bestemmes empirisk. I diskusjonen inkluderer vi en liste over antistoffer vi har prøvd med suksess (med fortynning / konsentrasjoner) og de vi har prøvd uten å lykkes.
-
Primær antistofffarging
MERK: Kaninantihumant SCP3 og kyllingantisebrafisk Sycp1 brukes vanligvis til primær antistofffarging.- Etter å ha fjernet overflødig PBS fra lysbildene, legg til 500 μL antistoffblokk per lysbilde og plasser lysbildene i et fuktighetskammer ved romtemperatur i minst 20 min.
- Fjern antistoffblokken ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle.
- Tilsett 100 μL primær antistoffblanding i antistoffblokk per lysbilde og dekk lysbildene med en plastdekselslip laget av en autoklavpose. Plasser lysbildene i et fuktighetskammer over natten ved 4 °C.
- Fjern dekkslipsene med en pipettespiss og vask lysbildene 2 ganger i minst 5 minutter hver med 1x PBS i en Coplin-krukke med forsiktig risting ved romtemperatur.
- Fjern PBS ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle.
-
Sekundær antistofffarging
MERK: Konjugert geit antikanin og antikyllingantistoffer mot forskjellige fluoropforer brukes til flekker ved en konsentrasjon på 1:1000.- Tilsett 500 μL antistoffblokk per sklie og plasser lysbildene i fuktighetskammeret ved romtemperatur i minst 5 min.
- Fjern antistoffblokken ved å trykke på siden av lysbildet på et papirhåndkle.
- Tilsett 100 μL sekundær antistoffblanding i antistoffblokk per lysbilde og dekk lysbildene med en plastdeksel slip laget av en autoklavpose. Plasser lysbildene i et fuktighetskammer i 1 time ved 37 °C.
- Fjern dekkslipsene med en pipettespiss og vask lysbildene 3 ganger i minst 5 min hver med 1x PBS i en Coplin-krukke med forsiktig risting ved romtemperatur.
- Skyll skliene en gang i minst 2 min med destillert vann i en Coplin-krukke med mild risting ved romtemperatur.
- Lufttørk lysbildene vippet, for å lette tørkingen.
- Plasser 20 μL anti-fade mountant med eller uten DAPI (se Materialtabell) som 3 jevnt fordelte prikker på glassdekk (24 mm x 60 mm).
- Plasser lysbildene med forsiden ned på glassdekselet, og forsegle trekklappene med neglelakk på kanten som overlapper den frostede enden av lysbildet.
- Oppbevar de preparerte lysbildene ved 4 °C til de er klare for bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har skissert en metode for å forberede og visualisere sebrafisk spermatocyte spredning preparater. Når den utføres riktig, gir vår prosedyre godt spredning, ikke-overlappende kjerner. For å gjenopprette slike kjerner er det viktig å ha riktig mengde startmateriale (dvs. testiklene), behandle testiklene i tilstrekkelig tid i trypsin og et tilstrekkelig antall DNase I-behandlinger. Disse spreadene kan deretter være farget for telomerer og meiotiske proteiner for å studere meiotisk progresjon under profase I. Figur 1 viser eksempler på spredningspreparater farget for kromosomale trekk på ulike stadier av profase I. Figur 4 illustrerer et eksempel på dårlig spredningskjerner.
Figur 1: Representative superoppløsningsbilder av kromosomspredningspreparater farget med PNA og antistoffsonder. (A) Skjematisk av syndetmal komplekset. (B) Et synapsed par homologer som viser kromosomakseproteinet Sycp3 (grønn), det tverrgående filamentproteinet Sycp1 (rød) og DNA (Blå) avbildet av strukturell belysningmikroskopi (SIM) ved hjelp av et 100x-mål. Skalabar = 1 μm. (C) Panelene til venstre viser tre stadier av meiotisk profase: leptoten (topp), tidlig zygoten (midten) og pachytene (nederst). Skalerbar = 5 μm. Høyre: representative bilder som inneholder telomerer (magenta) for hvert trinn. Skalabar = 1 μm. Tallene er tilpasset fra Blokhina et al.3. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel på sebrafisktestikler (~7 måneder etter befruktning). (A) Bildet viser den relative plasseringen av testis i sebrafisken. Testen sitter mellom svømmeblæren og tarmen. (B) Lengden på en testis. Yngre sebrafisk vil ha mindre testiklene. For kromosomsprer, fjern så mye fett og omkringliggende vev som mulig fra testis. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fuktighetskammer for lysbilder. Fuktighetskammeret vårt er laget ved hjelp av en polystyrenskumboks (21 cm x 19 cm x 6 cm) designet for å sende elektroporasjonskuv. Vi satte inn våte tynne vevsservietter (se Materialtabell)i alle andre spor. Lysbildene er plassert flatt på toppen av ryggene uten å berøre våtserviettene. Et kommersielt fuktighetskammer er også tilgjengelig (se Materialtabell). Vi ser for oss at enhver polystyren skum boks utstyrt med rygger og spor (f.eks. ved hjelp av glasspipetter13)kan brukes. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempler på spredning av dårlig kvalitet på grunn av utilstrekkelige DNase I-behandlinger. Meiotiske kromosomer farget for Sycp3 avbildet av SIM ved hjelp av et 20x mål. Utilstrekkelig DNase I behandlinger fører til overlappende kjerner på grunn av en viskøs sukrose celle suspensjon som hindrer celler fra å spre seg på riktig måte. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempler på kromosomspreader ved hjelp av en alternativ metode11. Meiotiske kromosomer farget for Sycp3 (grønn) og Sycp1 (rød). Kromosomspreader ble utarbeidet som beskrevet av Sansam og Pezza11. Denne metoden kan utføres ved hjelp av individuell sebrafisk i stedet for flere sebrafisk som kreves for vår protokoll. I våre hender er det vanlig å se kromosomer som ikke er godt spredt. Det er også en merkbar økning i bakgrunnsfarging som skyldes rusk som er igjen på lysbildene under kromosomspredningsprosedyren. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi metoder for å undersøke plasseringen av telomerer og kromosom-tilknyttede proteiner i kjernefysisk overflate sprer seg fra spermatocytter isolert fra sebrafisk testikler. Vi forventer at disse metodene vil være anvendelig for analyse av spermatocytter i andre teleostarter med justering av størrelsen på testis.
Mens bare noen få antistoffer har blitt hevet til sebrafisk meiotiske proteiner, har vi hatt suksess ved hjelp av følgende antistoffer hevet til menneskelige (h) eller mus (m) proteiner. Vårt laboratorium har hevet antistoffer mot sebrafisk Sycp1 protein (zfSycp1) i kylling som har fungert som en pålitelig markør for synaptonemal kompleks (SC), men dette proteinet er til stede bare fra tidlig zygotene til sent pachytene, når kromosomer er fullt synapsed. Kaninanti-hSYCP3 antistoff har vært svært pålitelig for å oppdage meiotiske kromosomakser fra leptoten til oppløsningen av SC i sen pachytene (Figur 1B,C). Spesielt har vi ikke observert en klassisk diploten scene med full lengde akser definert av Sycp3 og fraværet av Sycp1, noe som tyder på at, i motsetning til i mus, aksene kan bli degradert etter exit fra pachytene3. Andre kommersielt tilgjengelige antistoffer mot m, h eller zf meiotiske proteiner som har gitt positive resultater inkluderer også DNA-rekombinasjon/replikering kanin anti-hRAD51 og kanin anti-hRPA. Kilden til hvert antistoff og fortynning som brukes er oppført i materialbordet. De vi har prøvd uten å lykkes ved hjelp av minst tre forskjellige fortynninger inkluderer geit anti-hDMC1, mus anti-hMlh1, mus anti-hamster Sycp3, mus anti-hRPA.
Det er tre kritiske stadier av kromosomspredningsprosedyren. Den første er å samle riktig mengde materiale. Femten intakte testiklene bør være tilstrekkelig for spredningsprotokollen for ~ 6 mpf menn, og dette tallet kan justeres opp eller ned avhengig av størrelsen på dyrene. Husk at noen meiotiske mutanter vil ha mindre testiklene, så 2 ekstra dyr bør brukes. Det andre viktige trinnet er dissosiasjon av celler. Under trypsin fordøyelse, hvis testiklene ikke dissosierer i små klumper, er det sannsynlig at for få celler vil bli gjenopprettet fra spredningsprosedyren. Et tredje nøkkeltrinn er tilstedeværelsen av en synlig pellet etter DNase I-behandlingene. Hvis en pellet ikke er synlig, er det sannsynlig at spredningsprosedyren vil gi liten eller ingen kjerner. Tap av pellet kan oppstå hvis for få dyr brukes eller hvis for mange DNase jeg vasker utføres. På den annen side kan for få DNase I-behandlinger resultere i en viscid sukrosecellesuspensjon, noe som vil hindre celler i å spre seg på lysbildet (Figur 4). Det er viktig å fortsette å utføre DNase I behandlinger (for maksimalt 4 behandlinger) inntil klumper ikke lenger er til stede ved tillegg av DMEM.
Den presenterte kromosomspredningsteknikken gir hundrevis av godt sprekjerner per lysbilde. Ved hjelp av denne prosedyren har vi vært i stand til å gi en detaljert analyse av viktige hendelser under sebrafisk spermatogenese ved hjelp av superoppløsning mikroskopi3. I våre hender har denne protokollen generert bedre spredningkromosomer, med mindre rusk på lysbildet, og mindre bakgrunnsfarging sammenlignet med raskere metoder ved hjelp av enkeltdyr beskrevet av Moens14 og Sansam og Pezza11 (Figur 5). Disse forskjellene skyldes sannsynligvis bruk av kollagenase, trypsin og DNase-behandlinger i vår protokoll. To begrensninger i vår teknikk er kravet om å bruke 10-20 voksne sebrafisk menn og mer arbeidskrevende enzym behandlinger og vaske trinn. Hvis superoppløsningsdeteksjon ikke er nødvendig, hvis sebrafiskmaterialet er begrenset, eller mer enn to forhold testes parallelt, kan de raskere metodene være mer egnede alternativer14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Trent Newman og Masuda Sharifi for kommentarer til manuskriptet og An Nguyen for å bidra til å optimalisere metoder for spredning og flekker kromosomer fra sebrafisk meiocytes. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM079115 tildelt S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
