Summary
Las propagaciones de superficies nucleares son una herramienta indispensable para estudiar los eventos cromosómicos durante la meiosis. Aquí demostramos un método para preparar y visualizar cromosomas meióticos durante la profase I a partir de espermacitos de peces brabra.
Abstract
La meiosis es el proceso celular clave necesario para crear gametos haploides para la reproducción sexual. Los organismos modelo han sido fundamentales para comprender los eventos cromosómicos que tienen lugar durante la profase meiótica, incluidos los eventos de emparejamiento, sinapsis y recombinación que aseguran la segregación cromosómica adecuada. Mientras que el ratón ha sido un modelo importante para entender los mecanismos moleculares subyacentes a estos procesos, no todos los eventos meióticos en este sistema son análogos a la meiosis humana. Recientemente demostramos el emocionante potencial del pez cebra como modelo de espermatogénesis humana. Aquí describimos, en detalle, nuestros métodos para visualizar cromosomas meióticos y proteínas asociadas en preparaciones de propagación cromosómica. Estas preparaciones tienen la ventaja de permitir el análisis de alta resolución de las estructuras cromosómicas. En primer lugar, describimos el procedimiento para disección de testículos de peces cebra adultos, seguido de disociación celular, lisis y propagación de los cromosomas. A continuación, describimos el procedimiento para detectar la localización de proteínas cromosómicas meióticas, mediante la detección de inmunofluorescencia, y secuencias de ácido nucleico, mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Estas técnicas comprenden un conjunto útil de herramientas para el análisis citológico de la arquitectura de la cromatina meiótica en el sistema de peces cebra. Los investigadores de la comunidad de peces cebra deben ser capaces de dominar rápidamente estas técnicas e incorporarlas a sus análisis estándar de la función reproductiva.
Introduction
La reproducción sexual procede a través de la combinación de dos gametos haploides, cada uno llevando la mitad del complemento cromosómico de una célula somática. La meiosis es una división celular especializada que produce gametos haploides a través de una ronda de replicación del ADN y dos rondas sucesivas de segregación cromosómica. En la profase I, los cromosomas homólogos (homólogos) deben someterse a emparejamiento, recombinación y sinapsis, el último de los cuales se caracteriza por la formación del complejo sinntántmal que comprende dos ejes homólogos puenteados por el filamento transversal, Sycp1(Figura 1A,B). La falta de ejecución adecuada de estos procesos puede conducir a la producción de gametos aneuploides, que son una causa principal de abortos espontáneos en los seres humanos1. Nuestro conocimiento de la coordinación entre emparejamiento, recombinación y sinapsis ha sido facilitado por estudios en una amplia gama de organismos, como levadura, C. elegans,ratón, y Drosophila,entre otros2. Si bien el proceso general de emparejamiento cromosómico homólogo seguido de segregación está bien conservado, su dependencia de la recombinación y la sinapsis y el orden de estos eventos varía.
La formación meiotica de rotura de doble cadena (DSB), que inicia una recombinación homóloga, se produce cerca de telómeros agrupados en el ramo durante el leptoteno y la sinapsis se produce poco después de3,4. Esta configuración de la formación DSB y la iniciación de la sinapsis es también una característica de la meiosis masculina en los seres humanos pero no en el ratón5,6,7,8, lo que sugiere que el pez cebra puede servir como modelo para la espermatogénesis humana. También hay varias ventajas prácticas de estudiar la meiosis de pez cebra. Tanto los machos como las hembras se someten a gametogénesis a lo largo de la edad adulta, sus gónadas son fácilmente accesibles, y cientos de crías se generan a partir de una sola cruz. Además, los embriones son transparentes y se desarrollan externamente, lo que facilita la detección precoz de aberraciones en el desarrollo embrionario debido a los gametos aneuploides3,9. Las desventajas de utilizar peces cebra son que son lentos para alcanzar la madurez sexual (60 días) y la cantidad de material necesario para las propagaciones de superficie nuclear debe recogerse de 10-20 animales adultos, dependiendo de su tamaño.
Las preparaciones de propagación cromosómica meiótica son una herramienta vital para estudiar la dinámica cromosómica en todos los organismos modelo, ya que se pueden sondear las firmas clave de la dinámica cromosómica meiótica. En el pez cebra, se han diseccionado aspectos clave de la progresión del programa meiótico y de la organización nuclear mediante sondeos de propagaciones superficiales nucleares, denominadas aquí diseminas cromosómicas, con anticuerpos para la detección de inmunofluorescencia de proteínas y/o ácidos nucleicos por FISH3,4,9,10,11,12. De hecho, la localización polarizada de telómeros agrupados en el ramo se puede conservar en la preparación de propagación(Figura 1C). Recientemente, hemos utilizado propagaciones cromosómicas de espermacitos de peces cebra junto con métodos de detección de fluorescencia y microscopía de superresolución para dilucidar la progresión detallada de la dinámica de los telómeros de pez cebra, el emparejamiento de cromosomas homólogos, la localización de roturas de doble cadena y la sinapsis en transiciones meióticas clave3. Aquí presentamos métodos para preparar las propagaciones cromosómicas de los espermismocitos de los testículos de peces cebra y posteriormente mancharlos con sondas de ácido nucleico péptido fluorescente (AnP) a secuencias repetidas de telómeros y detección de inmunofluorescencia de proteínas asociadas al cromosoma.
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Protocol
Todos los métodos relacionados con el pez cebra se llevaron a cabo utilizando normas éticas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Davis.
1. Procedimiento de propagación del cromosoma
NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para crear 4-6 diapositivas, con cientos de núcleos meióticos extendidos por diapositiva. El número de testículos utilizados dependerá del tamaño del pez. Prepárese para utilizar 20 animales a los 60 días posteriores a la fertilización (dpf) y 15 animales a los 6 meses posteriores a la fertilización (mpf). Para peces cebra grandes (por ejemplo, 12 mpf) 10 animales deben ser suficientes. Tenga en cuenta que los testículos de algunos mutantes meióticos (por ejemplo, spo11-/-) serán algo más pequeños3. En este protocolo, un grupo de testículos se considera como una sola muestra. Se recomienda que no se preparen más de 4 muestras en paralelo.
- Realice las siguientes soluciones antes de iniciar el procedimiento de propagación
NOTA: Es conveniente preparar las siguientes soluciones en las cantidades especificadas para su uso en futuros experimentos de propagación.- Preparar una solución de sacarosa de 0,1 M disolviendo 3,42 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada. Lleve la solución de sacarosa al pH 8 utilizando 1 M Tris-HCl que también está en pH 8. A continuación, filtre la solución de sacarosa. Conservar a temperatura ambiente.
- Hacer una solución salina 10x con fosfato (PBS) a una concentración final de 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 y 27,6 mM KH2PO4 en 1,8 L de agua destilada. Revuelva hasta que se disuelva, luego ajuste el pH a 7.3 usando NaOH y autoclave. Conservar a temperatura ambiente.
- Hacer una solución DNase I de 400 g/ml en agua destilada estéril. Conservar a -20oC. Se recomienda preparar 5 ml de esta solución y luego almacenar como alícuotas de 100 l.
- Haga las siguientes soluciones el día del protocolo de difusión
NOTA: Para la eficiencia del tiempo, lo mejor es hacer la solución de colagenasa inmediatamente después de disuado todos los testículos y luego hacer las soluciones inhibidoras de tripina y trippsina durante el tiempo que las muestras están siendo tratadas en colagenasa.- Disolver 4 mg de colagenasa en 200 ml del medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco por muestra (concentración final de colagenasa del 2% p/v). Manténgase en hielo hasta que sea necesario. La colagenasa disociará a los testículos.
- Disolver 1,4 mg de tripsina en 200 ml de DMEM por muestra (0,7% p/v de concentración final de trippsina). Manténgase en hielo hasta que sea necesario. La trippsina ayudará a disociar las células.
- Disolver 10 mg de inhibidor de la tripsina en 500 ml de DMEM por muestra (concentración final del inhibidor de la trippsina del 2% p/v). Manténgase en hielo hasta que sea necesario. El inhibidor de la trippsina evita que la trippsina degrade las células.
- Prepare una solución de formaldehído al 1% (a partir de una solución prefabricada del 16%) con 0,15% de Triton X-100 en agua destilada estéril. Manténgase en hielo hasta que sea necesario. El 1% de formaldehído se puede preparar mientras los testículos están siendo tratados con trippsina y DNase I (es decir, durante el paso 1.4.7 del procedimiento de propagación).
ADVERTENCIA: El formaldehído es peligroso.
- Disección de testículos de peces cebra macho adultos
- Eutanasia el pez cebra macho (> 60 dpf) sumergiéndolos en agua helada. Los peces pueden mantenerse en agua helada hasta que estén listos para diseccionar, sin embargo, deben ser diseccionados tan pronto como sea posible.
NOTA: La cepa de tipo salvaje AB se utiliza para este procedimiento, pero otras cepas de tipo salvaje también deben ser susceptibles. El tiempo más largo que hemos mantenido los peces en agua helada antes de la diselación es 3 h sin ningún efecto notable en el protocolo. - Decapitar un pez a la vez con tijeras pequeñas y luego usar micro tijeras para cortar a lo largo de la línea media ventral para exponer la cavidad del cuerpo.
- Diseccionar los testículos usando fórceps (ver Tabla de Materiales)a 1,65x aumento bajo un microscopio. Lleve a cabo las disecciones en un plato Petri recubierto de silicona con cubierto por una piscina poco profunda de 1x PBS.
NOTA: El testículo se encuentra entre la vejiga de baño y el intestino y aparecerá más ligero que el tejido muscular(Figura 2A). Los testículos deben tener 2 lóbulos cuando se retiran del pez cebra(Figura 2B). - Retire la mayor cantidad posible de grasa y tejido circundante de los testículos. A continuación, agregue cada testículo diseccionado directamente en un tubo de 5 ml con 2 ml de DMEM y manténgalo en hielo.
NOTA: Los pasos 1.3.3 y 1.3.4 deben dominarse antes de realizar cualquier experimento.
- Eutanasia el pez cebra macho (> 60 dpf) sumergiéndolos en agua helada. Los peces pueden mantenerse en agua helada hasta que estén listos para diseccionar, sin embargo, deben ser diseccionados tan pronto como sea posible.
- Disociación de células de testículos
- Precalentamiento 100 mL de solución de sacarosa de 0,1 M a 37oC.
- Añadir 200 ml de solución de colagenasa al tubo de 5 ml con los testículos. Mezcle la solución invirtvirtándola varias veces.
- Agitar suavemente los testículos en una coctelera de incubadora horizontalmente a 100 rpm a 32 oC durante 50 minutos a una hora hasta que el DMEM esté turbio y los testículos estén en pequeños trozos. Invierta rápidamente el tubo cada 10 minutos para facilitar la disociación.
- Para lavar la colagenasa, añadir DMEM a un volumen final de 5 ml e invertir el tubo unas cuantas veces. Pellet los testículos a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retire 3 ml del sobrenadante de modo que sólo queden 2 ml.
NOTA: La adición, eliminación y transferencia de DMEM se realiza con pipetas de transferencia de plástico para la totalidad del procedimiento de propagación cromosómica. - Repita el paso 1.4.4 dos veces más para un total de 3 lavados DMEM. No resuspenda el pellet entre lavados DMEM. Después del último lavado DMEM, retire 4 ml del sobrenadante de modo que sólo quede 1 ml.
- Añadir 1 ml de DMEM para un volumen total de 2 ml y añadir 200 ml de la solución de trippsina y 20 ml de solución DNase I. Invierta el tubo varias veces para mezclar la solución.
- Agitar horizontalmente el tubo a 32 oC durante 5-15 minutos a 100 rpm hasta que la solución DMEM contenga sólo unos pocos grumos. Invierta rápidamente el tubo cada 5 minutos para facilitar la disociación.
NOTA: Los grumos deben ser considerablemente más pequeños después de agitar. - Añadir 500 l de la solución inhibidora de la trippsina y 50 ml de solución de DNase I. Invierta el tubo unas cuantas veces para mezclar, luego gire brevemente hacia abajo a 200 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente para eliminar el líquido o los grumos que puedan adherirse a la tapa del tubo o al lado del tubo.
- Coloque el tubo sobre hielo y vuelva a suspender la suspensión celular pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de transferencia de plástico durante 2 minutos para facilitar la disociación de los grumos restantes. No deje que la suspensión celular entre en la bombilla de la pipeta de transferencia. Después de los 2 minutos, pipetear la suspensión de nuevo en el tubo de 5 ml.
- Humedezca previamente un colador de células de 100 m con DMEM y colóquelo encima de un tubo de 50 ml sobre hielo.
- Transfiera la suspensión celular a través del colador una gota a la vez utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Asegúrese de que la suspensión celular no entre en la bombilla de la pipeta de transferencia.
- Transfiera el filtrado utilizando una pipeta de transferencia de plástico a un nuevo tubo de 5 ml y añada DMEM a un volumen final de 5 ml. Asegúrese de recoger las células agrupadas unidas a la parte inferior del filtro con una pipeta de transferencia de plástico limpia. Peletlas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet.
- Añadir 5 l de solución de DNase I directamente en el pellet. A continuación, mezcle el pellet con la solución DNase I raspando suavemente la parte inferior exterior del tubo 4-5 veces a lo largo de un bastidor de tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 ml. Raspar con demasiada dureza puede resultar en una reducción de los diferenciales recuperados.
- Añadir DMEM a un volumen final de 5 ml y mezclar la solución invirtiendo el tubo varias veces. Es común que los grumos sigan presentes después del primer tratamiento con DNase I.
- Reperque la suspensión de la célula a 200 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
- Repita los pasos 1.4.13-1.4.16 1-3 veces adicionales hasta que el pellet resuspendido no se agrupe al adición de DMEM. Después del último giro, retire tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet.
NOTA: Espere una reducción en el tamaño del pellet con cada tratamiento DNase I; exceder 4 lavados Totales de DNase I puede resultar en una pérdida significativa de células. Si no hay pellets visibles después de los pasos de los tratamientos DNase I, no proceda con el procedimiento. Deseche cualquier DNase I no utilizado. - Añadir 1 ml de 1x PBS y resuspender el pellet raspando suavemente la parte inferior exterior del tubo a lo largo de un bastidor de tubo vacío de 1,5 ml.
- Pellet la suspensión de la célula a 200 x g durante 5 min y luego retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet.
- Corte a 3 mm desde el final de una punta de pipeta de 200 ml para ensanchar la abertura y resuspender el pellet en una solución de sacarosa de 0,1 M pipeteando hacia arriba y hacia abajo con la punta de la pipeta cortada. Deje que la suspensión celular se sifique a temperatura ambiente durante 3 min.
- Difusión de cromosomas en diapositivas de vidrio
- Recubrir un portaobjetos con 100 s de 1% de formaldehído con 0.15% Triton X-100 con el lado de una punta de pipeta. A continuación, agregue 18 l de la suspensión de la célula de sacarosa en el centro de la diapositiva en una línea recta perpendicular al borde largo. Incline la corredera hacia adelante y hacia atrás (60o) para facilitar la propagación de la suspensión celular a todas las esquinas.
- Coloque las diapositivas planas en una cámara de humedad abierta ligeramente agrietada(Figura 3) para evitar que la solución de formaldehído se seque. Coloque la cámara de humedad en un cajón oscuro durante la noche.
- Retire la tapa de la cámara de humedad y deje que los portaobjetos se sequen por completo.
- Coloque los portaobjetos en un frasco de Coplin y luego llene el frasco de Coplin con agua destilada e incuba durante 5 minutos con un suave temblor a temperatura ambiente.
NOTA: Las diapositivas se pueden colocar en el frasco de Coplin en un patrón en zigzag para maximizar el número de diapositivas por tarro de Coplin. Asegúrese de que haya espacio para que el líquido pase entre todas las diapositivas. - Vierta el agua y llene el frasco con 1:250 agente humectante (ver Tabla de Materiales). Lavar 2 veces durante 5 minutos cada uno con un suave temblor a temperatura ambiente.
- Deje que las diapositivas se sequen por completo y guárdelas a -20 oC hasta que estén manchadas.
NOTA: El más largo que hemos almacenado diapositivas sin ninguna degradación notable de los cromosomas es de 2 meses.
2. Tinción de la sonda Telómero PNA
NOTA: Las repeticiones de telómeros se pueden teñir utilizando sondas de Telómero PNA conjugadas con fluoróforos que hibridan a las repeticiones de telómeros de hebra sprincipales (CCCTAA). Las sondas PNA tienen una columna vertebral neutra, lo que aumenta la afinidad de hibridación con el ADN cargado negativamente, lo que resulta en poco o ningún fondo. El paso de sondeo de telómeros es opcional. Para proceder a la tinción de anticuerpos, rehidrate los portaobjetos en 1x PBS como se indica en el paso 2.2.2., luego proceda directamente a "Tinción primaria de anticuerpos".
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Haga los reactivos de la sonda PNA antes de iniciar la tinción de telómeros
NOTA: Es conveniente preparar las siguientes soluciones en las cantidades especificadas para su uso en experimentos futuros. Las condiciones de almacenamiento se indican a continuación.- Preparar 2 L de 20x solución de citrato de solución salina-sodio (SSC) con una concentración final de 3 M NaCl y 0,3 M de citrato de sodio. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
- Hacer 50 ml de solución de pre-hibridación que contenga ARN de transferencia a una concentración final de 50% de formamida, 5x SSC, 50 g/ml de heparina, 500 g/ml de ARN de transferencia, 0.1% Tween 20 y añadir 460 ml de ácido cítrico de 1 M para llevar la solución al pH 6. Conservar a -20oC.
ADVERTENCIA: Formamida es peligrosa. Prepare la solución en una campana de humos. - Haga 50 ml de solución de pre-hibridación preparada de la misma manera que en el paso 2.1.2 sin añadir ARN de transferencia. Conservar a -20oC.
- Las sondas de telómero de PNA TelC-Cy3 y TelC-Alexa647 se preparan como stocks de 50 m en formamida según las instrucciones del fabricante. Almacene las sondas PNA como alícuotas de 8 l a -80 oC.
- Hacer al menos 1 ml de 100 mg/ml de solución de albúmina sérica bovina (BSA) en agua destilada estéril. Conservar a -20oC. Si prepara más de 1 ml de BSA de stock, almacene la solución como alícuotas de 1 ml.
- Con un tubo de 2 ml, prepare 2 ml de solución de hibridación añadiendo 27 ml de 100 mg/ml de BSA y 8 ml de sonda PNA de 50 m a 1,965 ml de solución de prehibridación que contenga ARN de transferencia. Conservar en la oscuridad a -20oC.
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Tna de telómeros de PNA tinción de la sonda
- Precalentar el horno de hibridación a 82oC.
- Rehidratar los portaobjetos con 500 ml de 1 pbS por diapositiva durante 5 minutos en una cámara de humedad a temperatura ambiente. Retire el PBS tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
- Caliente los portaobjetos y el tubo de 2 ml que contiene la solución de hibridación directamente sobre una superficie metálica en el horno de hibridación calentado durante 2 min.
- Mientras mantiene las diapositivas en la superficie metálica, agregue 100 s de la solución de hibridación por diapositiva y luego cubra las diapositivas con tapas de plástico (25 mm x 75 mm) cortadas para dar forma a una bolsa de autoclave. Deje que las diapositivas se senten a 82 oC durante 10-12 min.
- Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad en la oscuridad a 37 oC durante 16-24 h. A partir de este punto y para la tinción de anticuerpos primarios y secundarios, las diapositivas deben mantenerse en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de la señal de fluorescencia. Después del período de incubación, los reactivos para la tinción de anticuerpos se pueden preparar durante el paso 2.2.9.
- Retire los cubreobjetos con una punta de pipeta.
NOTA: Para facilitar la extracción de la cubierta, se puede dispensar suavemente entre la corredera y la cubierta a medida que se levanta la cubierta. - Pipetear 500 l de solución de pre-hibridación sin ARN de transferencia en cada diapositiva y colocar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
NOTA: La solución de pre-hibridación sin ARN de transferencia no se precalienta antes de agregarse a cada diapositiva. - Pipetear 500 l de solución de pre-hibridación del 50% sin ARN de transferencia en 1x PBS a cada diapositiva y colocar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
- Transfiera las diapositivas a un frasco de Coplin y lave 3 veces en 1PBS con agitación suave durante 15 minutos por lavado a temperatura ambiente.
- Retire las diapositivas del frasco de Coplin y retire el exceso de PBS tocando el lado de la diapositiva en una toalla de papel. A continuación, proceda al paso 3.2 "Tinción primaria de anticuerpos".
3. Tinción de anticuerpos
NOTA: Los anticuerpos elevados a proteínas meióticas conocidas se pueden utilizar para la detección de inmunofluorescencia en preparaciones cromosómicas de propagación. Los anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos permiten teñir múltiples proteínas simultáneamente, si los anticuerpos primarios se criaron en diferentes animales.
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Realice las siguientes soluciones el día de la tinción de anticuerpos primarios y secundarios
- Hacer 1 L de PBT con 1x PBS y 0.1% Triton X-100 diluido en agua destilada. Conservar a temperatura ambiente. Esto se puede preparar con anticipación y en grandes cantidades para futuros experimentos de propagación.
- Preparar 500 l de bloque de anticuerpos por diapositiva a una concentración final de 2 mg/ml de BSA y 2% de suero de cabra en PBT.
- Para hacer 100 ml de mezcla de anticuerpos primarios o secundarios por diapositiva, añada los anticuerpos adecuados a la concentración correcta (ver Tabla de materiales)en el bloque de anticuerpos.
NOTA: Es posible que sea necesario determinar empíricamente la concentración de anticuerpos. En la discusión, incluimos una lista de anticuerpos que hemos probado con éxito (con dilución/concentraciones) y los que hemos probado sin éxito.
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Tinción primaria de anticuerpos
NOTA: El conejo antihumano SCP3 y el pollo anti-zebrafish Sycp1 se utilizan típicamente para la tinción primaria de anticuerpos.- Después de eliminar el exceso de PBS de las diapositivas, agregue 500 ml de bloque de anticuerpos por diapositiva y coloque los portaobjetos en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos.
- Retire el bloque de anticuerpos tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
- Añadir 100 l de mezcla de anticuerpos primarios en bloque de anticuerpos por diapositiva y cubrir las diapositivas con una cubierta de plástico hecha de una bolsa de autoclave. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad durante la noche a 4 oC.
- Retire los cubreobjetos con una punta de pipeta y lave los portaobjetos 2 veces durante un mínimo de 5 minutos cada uno con 1 PBS en un frasco de Coplin con un suave temblor a temperatura ambiente.
- Retire el PBS tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
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Tinción secundaria de anticuerpos
NOTA: Los anticuerpos anticonejo y antipollo de cabra conjugados a diferentes fluoróforos se utilizan para la tinción a una concentración de 1:1000.- Añadir 500 l de bloque de anticuerpos por diapositiva y colocar los portaobjetos en la cámara de humedad a temperatura ambiente durante un mínimo de 5 min.
- Retire el bloque de anticuerpos tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
- Añadir 100 l de mezcla secundaria de anticuerpos en bloque de anticuerpos por diapositiva y cubrir las diapositivas con una cubierta de plástico hecha de una bolsa de autoclave. Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad durante 1 h a 37 oC.
- Retire los cubreobjetos con una punta de pipeta y lave los portaobjetos 3 veces durante un mínimo de 5 minutos cada uno con 1 PBS en un frasco de Coplin con un suave temblor a temperatura ambiente.
- Enjuague los portaobjetos una vez durante un mínimo de 2 minutos con agua destilada en un frasco de Coplin con un suave temblor a temperatura ambiente.
- Seque al aire los portaobjetos inclinados, para facilitar el secado.
- Coloque 20 ml de soporte anti-fade con o sin DAPI (ver Tabla de Materiales)como 3 puntos espaciados uniformemente en los cubredes de vidrio (24 mm x 60 mm).
- Coloque las diapositivas boca abajo en las cubiertas de vidriolabios y luego sellar los labios de las cubiertas con esmalte de uñas en el borde superpuesto el extremo esmerilado de la diapositiva.
- Almacene las diapositivas preparadas a 4 oC hasta que estén listas para la toma de imágenes.
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Representative Results
Hemos descrito un método para preparar y visualizar las preparaciones de propagación de espermatocitos de peces cebra. Cuando se realiza correctamente, nuestro procedimiento produce núcleos bien diseminados y no superpuestos. Para recuperar estos núcleos, es importante tener la cantidad adecuada de material de partida (es decir, testículos), tratar los testículos durante un período de tiempo suficiente en trippsina y un número adecuado de tratamientos DNase I. Estos diseminados se pueden teñir para que los telómeros y las proteínas meióticas estudien la progresión meiótica durante la profase I. La Figura 1 muestra ejemplos de preparaciones de propagación teñidas para características cromosómicas en diferentes etapas de la profase I. La Figura 4 ilustra un ejemplo de núcleos mal diseminados.
Figura 1: Imágenes representativas de superresolución de preparaciones de propagación cromosómica manchadas con nAS y sondas de anticuerpos. (A) Esquema del complejo sintanomal. (B) Un par de homólogos sinapsed que muestran la proteína del eje cromosómico Sycp3 (verde), la proteína de filamento transversal Sycp1 (rojo) y el ADN (azul) que se muestra mediante microscopía de iluminación estructural (SIM) utilizando un objetivo de 100x. Los paneles de la izquierdamuestran tres etapas de la profase meiótica: leptoteno (arriba), cigoteno temprano (medio) y paquiteno (abajo). La barra de la báscula es de 5 m. Derecha: imágenes representativas que contienen telómeros (magenta) para cada etapa. Las figuras se adaptan a las figuras de Blokhina et al.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de testículos de pez cebra (7 meses después de la fertilización). (A) La imagen muestra la ubicación relativa de los testículos dentro del pez cebra. El testículo se encuentra entre la vejiga de natación y el intestino. (B) La longitud de un testículo. El pez cebra más joven tendrá testículos más pequeños. Para las diseciones cromosómicas, extraiga la mayor cantidad de grasa y tejido circundante posible de los testículos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cámara de humedad para diapositivas. Nuestra cámara de humedad está hecha con una caja de espuma de poliestireno (21 cm x 19 cm x 6 cm) diseñada para enviar cubetas de electroporación. Insertamos toallitas húmedas de tejido delgado (ver Tabla de Materiales)en cada otra ranura. Los portaobjetos se colocan planos en la parte superior de las crestas sin tocar las toallitas húmedas. También hay disponible una cámara de humedad comercial (ver Tabla de Materiales). Prevemos que se pueda utilizar cualquier caja de espuma de poliestireno equipada con crestas y ranuras (por ejemplo, utilizando pipetas de vidrio13). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de propagaciones de mala calidad debido a la insuficiencia de tratamientos DNase I. Cromosomas meióticos manchados para Sycp3 con la imagen de SIM utilizando un objetivo de 20x. Los tratamientos insuficientes para DNase I conducen a núcleos superpuestos debido a una suspensión viscosa de la célula sacarosa que evita que las células se propaguen correctamente en la corredera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de propagaciones cromosómicas utilizando un método alternativo11. Cromosomas meióticos manchados para Sycp3 (verde) y Sycp1 (rojo). Se prepararon diseciones cromosómicas según lo descrito por Sansam y Pezza11. Este método se puede realizar utilizando peces cebra individuales en lugar de los varios peces cebra necesarios para nuestro protocolo. En nuestras manos, es común ver cromosomas que no están bien diseminados. También hay un aumento notable en la tinción de fondo que resulta de los desechos que se dejan en las diapositivas durante el procedimiento de propagación cromosómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos métodos para sondear la ubicación de los telómeros y las proteínas asociadas al cromosoma en las propagaciones de superficies nucleares de espermatocitos aislados de los testículos de peces cebra. Esperamos que estos métodos sean aplicables para el análisis de espermacitos en otras especies de teleost con ajuste al tamaño de los testículos.
Mientras que sólo unos pocos anticuerpos han sido elevados a las proteínas meióticas de pez cebra, hemos tenido éxito utilizando los siguientes anticuerpos elevados a proteínas humanas (h) o ratón (m). Nuestro laboratorio ha elevado anticuerpos a la proteína Sycp1 del pez cebra (zfSycp1) en pollo que ha servido como un marcador confiable para el complejo sinnanomal (SC), sin embargo, esta proteína está presente sólo desde el cigoteno temprano hasta el paquiteno tardío, cuando los cromosomas están completamente sinapsed. El anticuerpo conejo anti-hSYCP3 ha sido muy fiable para detectar ejes cromosómicos meióticos desde el leptoteno hasta la disolución del SC en el paquiteno tardío(Figura 1B,C). En particular, no hemos observado una etapa de diploteno clásico con ejes de longitud completa definidos por Sycp3 y la ausencia de Sycp1, lo que sugiere que, a diferencia del ratón, los ejes pueden degradarse después de la salida del paquiteno3. Otros anticuerpos disponibles comercialmente a proteínas m, h o zf meióticas que han dado resultados positivos también incluyen la recombinación/replicación del ADN conejo anti-hRAD51 y el conejo anti-hRPA. La fuente de cada anticuerpo y la dilución utilizada se enumeran en la Tabla de Materiales. Aquellos que hemos probado sin éxito utilizando al menos tres diluciones diferentes incluyen cabra anti-hDMC1, ratón anti-hMlh1, ratón anti-hámster Sycp3, ratón anti-hRPA.
Hay tres etapas críticas del procedimiento de propagación cromosómica. El primero es recoger la cantidad correcta de material. Quince testículos intactos deben ser suficientes para el protocolo de propagación para los machos de 6 mpf, y este número se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo dependiendo del tamaño de los animales. Ten en cuenta que algunos mutantes meióticos tendrán testículos más pequeños, por lo que se deben usar 2 animales adicionales. El segundo paso importante es la disociación de las células. Durante la digestión de la trippsina, si los testículos no se disocian en pequeños grumos, es probable que muy pocas células se recuperen del procedimiento de propagación. Un tercer paso clave es la presencia de un pellet visible después de los tratamientos DNase I. Si un pellet no es visible, es probable que el procedimiento de propagación produzca poco o ningún núcleo. La pérdida de un pellet puede surgir si se utilizan muy pocos animales o si se llevan a cabo demasiados lavados DNase I. Por otro lado, muy pocos tratamientos DNase I pueden resultar en una suspensión de células de sacarosa viscida, que evitará que las células se propaguen en la diapositiva(Figura 4). Es importante continuar realizando tratamientos con DNase I (para un máximo de 4 tratamientos) hasta que los grumos ya no estén presentes tras la adición de DMEM.
La técnica de propagación cromosómica presentada produce cientos de núcleos bien difundidos por diapositiva. Usando este procedimiento, hemos sido capaces de proporcionar un análisis detallado de los eventos clave durante la espermatogénesis del pez cebra utilizando la microscopía de superresolución3. En nuestras manos, este protocolo ha generado mejores cromosomas de propagación, con menos escombros en la diapositiva, y menos tinción de fondo en comparación con métodos más rápidos utilizando animales individuales descritos por Moens14 y Sansam y Pezza11 (Figura 5). Estas diferencias son probablemente debido al uso de tratamientos de colagenasa, trippsina y DNase en nuestro protocolo. Dos limitaciones de nuestra técnica son el requisito de utilizar 10-20 machos adultos de pez cebra y los tratamientos enzimáticos más laboriosos y pasos de lavado. Si la detección de superresolución no es necesaria, si el material del pez cebra es limitado, o más de dos condiciones se prueban en paralelo, los métodos más rápidos pueden ser alternativas más adecuadas14,15,16.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Trent Newman y Masuda Sharifi por sus comentarios sobre el manuscrito y An Nguyen por ayudar a optimizar los métodos para difundir y manchar cromosomas de meiocitos de peces cebra. Este trabajo fue apoyado por NIH R01 GM079115 otorgado a S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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