Summary
Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.
Abstract
La meiosi è il processo cellulare chiave necessario per creare gameti aploidi per la riproduzione sessuale. Gli organismi modello sono stati determinanti nella comprensione degli eventi cromosomici che si verificano durante la profase meiotica, tra cui l'accoppiamento, la sinapsi e gli eventi di ricombinazione che garantiscono una corretta segregazione cromosomica. Mentre il topo è stato un modello importante per comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi, non tutti gli eventi meiotici in questo sistema sono analoghi alla meiosi umana. Recentemente abbiamo dimostrato l'entusiasmante potenziale del pesce zebra come modello di spermatogenesi umana. Qui descriviamo, in dettaglio, i nostri metodi per visualizzare i cromosomi meiotici e le proteine associate nei preparati di diffusione cromosomica. Questi preparati hanno il vantaggio di consentire l'analisi ad alta risoluzione delle strutture cromosomiche. In primo luogo, descriviamo la procedura per la sezionamento dei testicoli da pesci zebra adulti, seguita da dissociazione cellulare, lisi e diffusione dei cromosomi. Successivamente, descriviamo la procedura per rilevare la localizzazione delle proteine cromosomiche meiotiche, mediante rilevamento dell'immunofluorescenza e sequenze di acidi nucleici, mediante fluorescenza nell'ibridazione in situ (FISH). Queste tecniche comprendono un utile insieme di strumenti per l'analisi citologica dell'architettura della cromatina meiotica nel sistema del pesce zebra. I ricercatori della comunità dei pesci zebra dovrebbero essere in grado di padroneggiare rapidamente queste tecniche e incorporarle nelle loro analisi standard della funzione riproduttiva.
Introduction
La riproduzione sessuale procede attraverso la combinazione di due gameti aploidi, ognuno dei quali trasporta metà del complemento cromosomico di una cellula somatica. La meiosi è una divisione cellulare specializzata che produce gameti aploidi attraverso un ciclo di replicazione del DNA e due cicli successivi di segregazione cromosomica. Nella profase I, i cromosomi omologhi (omologi) devono subire l'abbinamento, la ricombinazione e la sinapsi, quest'ultima caratterizzata dalla formazione del complesso sinatonemale che comprende due assi omologi colmati dal subverso, Sycp1 (Figura 1A,B). La mancata esecuzione corretta di questi processi può portare alla produzione di gameti aneuploidi, che sono una delle principali cause di aborti spontanei in esseri umani1. La nostra conoscenza del coordinamento tra abbinamento, ricombinazione e sinapsi è stata facilitata da studi in una vasta gamma di organismi, come lievito, C. elegans, topo e Drosophila, tra gli altri2. Mentre il processo generale di accoppiamento cromosomico omologato seguito dalla segregazione è ben conservato, la sua dipendenza dalla ricombinazione e dalla sinapsi e l'ordine di questi eventi varia.
La formazione meiotica di rottura a doppio filamento (DSB), che avvia una ricombinazione omologa, si verifica vicino ai telomeri raggruppati nel bouquet durante il leptotene e la sinapsi segue poco dopo3,4. Questa configurazione della formazione e dell'avvio della sinapsi di DSB è anche una caratteristica della meiosi maschile negli esseri umani ma non nel topo5,6,7,8, suggerendo che il pesce zebra può servire come modello per la spermatogenesi umana. Ci sono anche diversi vantaggi pratici dello studio della meiosi del pesce zebra. Sia i maschi che le femmine subiscono gametogenesi durante l'età adulta, le loro gonadi sono facilmente accessibili e centinaia di prole sono generate da una singola croce. Inoltre, gli embrioni sono trasparenti e si sviluppano esternamente, il che facilita la diagnosi precoce di aberrazioni nello sviluppo embrionale a causa di gameti aneuploidi3,9. Svantaggi dell'uso di pesci zebra sono che sono lenti a raggiungere la maturità sessuale (60 giorni) e la quantità di materiale necessaria per gli spread di superficie nucleare deve essere raccolta da 10-20 dollari animali adulti, a seconda delle loro dimensioni.
I preparati meiotici sono uno strumento vitale per studiare la dinamica cromosomica in tutti gli organismi modello, poiché è possibile sondare le firme chiave della dinamica cromosomica meiotica. Nel pesce zebra, gli aspetti chiave della progressione del programma meiotico e dell'organizzazione nucleare sono stati sezionati attraverso la sonda di diffusione della superficie nucleare, indicati qui come si diffonde cromosomica, con anticorpi per il rilevamento immunofluorescenza di proteine e/o acidi nucleici da FISH3,4,9,10,11,12. Infatti, la localizzazione polarizzata dei telomeri raggruppati nel bouquet può essere preservata nella preparazione della diffusione (Figura 1C). Recentemente, abbiamo usato i cromosomi di spermatociti zebrati insieme a metodi di rilevamento della fluorescenza e microscopia a super-risoluzione per chiarire la progressione dettagliata della dinamica dei telomeri di pesce zebra, l'abbinamento cromologo omologoso, la localizzazione delle rotture a doppio filamento e la sinapsi alle transizioni meiotiche chiave3. Qui presentiamo metodi per preparare le crescite cromosomiche dagli spermatociti dei testicoli del pesce zebra e successivamente le macchiamo con sonde fluorescenti di acido nucleico peptide (PNA) a sequenze di telomeri ripetute e rilevamento di immunofluorescenza delle proteine associate al cromosoma.
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Protocol
Tutti i metodi che coinvolgono il pesce zebra sono stati effettuati utilizzando standard etici approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'UC Davis.
1. Procedura di diffusione dei cromosomi
NOTA: Il seguente protocollo è progettato per creare 4-6 vetrini, con centinaia di nuclei meiotici diffusi per diapositiva. Il numero di testicoli utilizzati dipenderà dalle dimensioni del pesce. Aspettatevi di utilizzare 20 animali a 60 giorni dopo la fecondazione (dpf) e 15 animali a 6 mesi dopo la fecondazione (mpf). Per i pesci zebra di grandi dimensioni (ad esempio, 12 mpf) dovrebbero essere sufficienti 10 animali. Essere consapevoli del fatto che i testicoli di alcuni mutanti meiotici (ad esempio, spo11-/-) saranno un po 'più piccoli3. In questo protocollo, un pool di teste viene considerato come un singolo campione. Si raccomanda di preparare in parallelo non più di 4 campioni.
- Effettuare le seguenti soluzioni prima di iniziare la procedura di diffusione
NOTA: È conveniente preparare le seguenti soluzioni nelle quantità specificate per l'uso in esperimenti di diffusione futuri.- Preparare una soluzione di saccarosio di 0,1 m sciogliendo 3,42 g di saccarosio in 100 mL di acqua distillata. Portare la soluzione di saccarosio al pH 8 utilizzando 1 M Tris-HCl che è anche a pH 8. Quindi filtrare sterilizzare la soluzione di saccarosio. Conservare a temperatura ambiente.
- Rendere una soluzione di stock salina (PBS) con buffer di fosfato per una concentrazione finale di 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 e 27,6 mM KH2PO4 in 1,8 L di acqua distillata. Mescolare fino a dissoluzione, quindi regolare pH a 7.3 utilizzando NaOH e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
- Fare una soluzione di 400 g/mL DNase I in acqua distillata sterile. Conservare a -20 gradi centigradi. Si consiglia di preparare 5 mL di questa soluzione e quindi conservare come 100 aliquote.
- Effettuare le seguenti soluzioni il giorno del protocollo di diffusione
NOTA: Per l'efficienza del tempo, è meglio fare la soluzione di collagenasi immediatamente dopo aver sezionato tutti i testicoli e quindi fare le soluzioni inibitori della trypsin e della tripsina durante il tempo in cui i campioni vengono trattati in collagenase.- Sciogliere 4 mg di collagenasi in 200 gradi l del mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) per campione (2% w/v di collagenana Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. La collagenase dissocierà i testicoli.
- Sciogliere 1,4 mg di metapsina in 200 : L di DMEM per campione (0,7% w/v tryps in concentrazione finale). Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. La trypsin aiuterà a dissociare le cellule.
- Sciogliere 10 mg di inibitore della tripsina in 500 :L di DMEM per campione (2% w/v trypsin inibitore concentrato finale). Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. L'inibitore della orpsina impedisce alla trypsin di degradare le cellule.
- Preparare una soluzione di formaldeide dell'1% (da una soluzione pre-made del 16%) con 0,15% Triton X-100 in acqua distillata sterile. Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. L'1% di formaldeide può essere preparata mentre i testicoli sono trattati con trypsin e DNase I (cioè durante la fase 1.4.7 della procedura di diffusione).
AVVISO: La formaldeide è pericolosa.
- Dissezione dei testicoli da pesci zebra maschi adulti
- Eutanasia il pesce zebra maschile (> 60 dpf) immergendoli nell'acqua ghiacciata. I pesci possono essere tenuti in acqua ghiacciata fino a quando non sono pronti a sezionare, tuttavia dovrebbero essere sezionati il prima possibile.
NOTA: Il ceppo di tipo selvaggio AB viene utilizzato per questa procedura, ma anche altri ceppi di tipo selvatico dovrebbero essere suscettibili. Il tempo più lungo che abbiamo mantenuto il pesce in acqua ghiacciata prima della dissezione è 3 h senza alcun effetto evidente sul protocollo. - Decapitare un pesce alla volta con piccole forbici e quindi utilizzare micro forbici per tagliare lungo la linea mediana ventrale per esporre la cavità del corpo.
- Dissezionare il testis utilizzando pinze (vedi Tabella dei materiali)con ingrandimento 1,65x al microscopio. Eseguire le dissezioni in una piastra Petri rivestita in silicone con coperto da una piscina poco profonda di 1x PBS.
NOTA: Il testico si trova tra la vescica da bagno e l'intestino e apparirà più leggero del tessuto muscolare (Figura 2A). Il testico deve avere 2 lobi quando viene rimosso dal pesce zebra (Figura 2B). - Rimuovere il maggior contenuto di grasso e tessuto circostante dal testire è possibile. Quindi aggiungere ogni testicolo sezionato direttamente in un tubo da 5 mL con 2 mL di DMEM e tenere sul ghiaccio.
NOTA: i passaggi 1.3.3 e 1.3.4 devono essere masterizzati prima di eseguire qualsiasi esperimento.
- Eutanasia il pesce zebra maschile (> 60 dpf) immergendoli nell'acqua ghiacciata. I pesci possono essere tenuti in acqua ghiacciata fino a quando non sono pronti a sezionare, tuttavia dovrebbero essere sezionati il prima possibile.
- Dissociazione delle cellule dei testicoli
- Pre-caldo 100 mL di 0,1 M soluzione di saccarosio a 37 gradi centigradi.
- Aggiungere 200 l di soluzione di collagenasi al tubo da 5 mL con i testicoli. Mescolare la soluzione invertendola più volte.
- Agitare delicatamente i testicoli in uno shaker incubatore orizzontalmente a 300 giri a 32 gradi centigradi per 50 min a un'ora fino a quando il DMEM è nuvoloso e i testicoli sono a pezzetti. Invertire rapidamente il tubo ogni 10 min per facilitare la dissociazione.
- Per lavare il collagenasi, aggiungere DMEM ad un volume finale di 5 mL e invertire il tubo un paio di volte. Pellet i testicoli a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente. Rimuovere 3 mL del supernatante in modo che rimangano solo 2 mL.
NOTA: L'aggiunta, la rimozione e il trasferimento di DMEM viene effettuato con pipette di trasferimento in plastica per l'intera procedura di diffusione del cromosoma. - Ripetere il passaggio 1.4.4 altre due volte per un totale di 3 ormeggi DMEM. Non risospendere il pellet tra i ventilatori DMEM. Dopo l'ultimo lavaggio DMEM, rimuovere 4 mL del supernatante in modo che rimanga solo 1 mL.
- Aggiungere 1 mL di DMEM per un volume totale di 2 mL e aggiungere 200 l della soluzione trypsin e 20 l of DNase I. Invertire il tubo un paio di volte per mescolare la soluzione.
- Agitare in modo orizzontale il tubo a 32 gradi centigradi per 5-15 min a 100 giri/m fino a quando la soluzione DMEM non contiene solo pochi grumi. Invertire rapidamente il tubo ogni 5 min per facilitare la dissociazione.
NOTA: I grumi devono essere notevolmente più piccoli dopo lo scuotimento. - Aggiungete 500 l della soluzione inibitore della trypsin e 50-L di soluzione DNase I. Invertire il tubo un paio di volte per mescolare, poi girare brevemente verso il basso a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente per rimuovere liquidi o grumi che possono aderire al tappo del tubo o il lato del tubo.
- Posizionare il tubo sul ghiaccio e risospendere la sospensione cellulare ripetutamente pipetting su e giù con una pipetta di trasferimento di plastica per 2 min per facilitare la dissociazione di eventuali grumi rimanenti. Non lasciare che la sospensione cellulare vada nella lampadina della pipetta di trasferimento. Dopo i 2 min, pipette la sospensione di nuovo nel tubo 5 mL.
- Pre-bagnato di un colino da 100 m con DMEM e posizionarlo sopra un tubo da 50 mL sul ghiaccio.
- Trasferire la sospensione cellulare attraverso il colino una goccia alla volta utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica. Assicurarsi che la sospensione cellulare non entri nella lampadina della pipetta di trasferimento.
- Trasferire il filtrato utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica in un nuovo tubo da 5 mL e aggiungere DMEM ad un volume finale di 5 mL. Assicurarsi di raccogliere le celle raggruppate attaccate alla parte inferiore del filtro con una pipetta di trasferimento di plastica pulita. Pellet le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il maggior numero possibile di supernatali senza disturbare il pellet.
- Aggiungete 5 -L di Soluzione DNase I direttamente nel pellet. Quindi mescolare il pellet con la soluzione DNase I raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo 4-5 volte lungo un rack tubo di microcentrifuga vuoto da 1,5 mL. La raschiatura troppo dura può comportare una riduzione degli spread recuperati.
- Aggiungere DMEM ad un volume finale di 5 mL e mescolare la soluzione invertendo il tubo più volte. È comune che i grumi siano ancora presenti dopo il primo trattamento DNase I.
- Pellet la sospensione cellulare a 200 x g per 2 min a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi 1.4.13-1.4.16 un'ulteriore 1-3 volte fino a quando il pellet risospeso non si agglomera al momento dell'aggiunta di DMEM. Dopo l'ultimo giro, rimuovere il maggior numero possibile di supernatali senza disturbare il pellet.
NOTA: Aspettatevi una riduzione delle dimensioni del pellet ad ogni trattamento DNase I; superando 4 lavamenti DNase I possono provocare una significativa perdita di cellule. Se dopo i passaggi dei trattamenti DNase I non è visibile alcun pellet, non procedere con la procedura. Eliminare qualsiasi DNase I inutilizzato. - Aggiungere 1 mL di 1x PBS e risospendere il pellet raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo lungo un rack tubo vuoto da 1,5 mL.
- Pellet la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min poi rimuovere il maggior numero di supernatante possibile senza disturbare il pellet.
- Tagliare 3 mm dall'estremità di una punta di pipetta da 200 , per allargare l'apertura e sospendere il pellet in soluzione di saccarosio di 0,1 M, pipeting su e giù con la punta pipetta tagliata. Lasciare che le sospensioni cellulari si siedano a temperatura ambiente per 3 min.
- Diffusione cromosomi su vetrini di vetro
- Coprire uno scivolo con 100 l una slitta dell'1% con 0,15% Triton X-100 con il lato di una punta di pipetta. Quindi aggiungere 18 - L della sospensione della cella di saccarosio al centro della diapositiva in una linea retta perpendicolare al bordo lungo. Inclinare lo scivolo avanti e indietro di (60 gradi) per facilitare la diffusione della sospensione della cella a tutti gli angoli.
- Posizionare i vetrini in una camera di umidità aperta leggermente incrinata (Figura 3) per evitare che la soluzione di formaldeide si secchi. Collocare la camera di umidità in un cassetto scuro durante la notte.
- Togliere il coperchio dalla camera di umidità e lasciare che i vetrini si asciughino completamente.
- Mettere i vetrini in un barattolo Coplin quindi riempire il vaso Coplin con acqua distillata e incubare per 5 min con agitazione delicata a temperatura ambiente.
NOTA: Le diapositive possono essere posizionate nel barattolo Coplin in un motivo a zig-zag per massimizzare il numero di diapositive per vaso Coplin. Assicurarsi che ci sia spazio per il liquido di passare tra tutte le diapositive. - Versare l'acqua e riempire il barattolo con 1:250 agente bagnanti (vedere Tabella dei materiali). Lavare 2 volte per 5 min ciascuno con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Lasciare asciugare completamente i vetrini e conservarli a -20 gradi centigradi fino a quando non sono macchiati.
NOTA: Il più lungo abbiamo memorizzato diapositive senza alcuna degradazione evidente dei cromosomi è di 2 mesi.
2. Colorazione sonda Telomere PNA
NOTA: le ripetizioni di telomeri possono essere macchiate utilizzando sonde PNA di telomeri coniugate con fluoroforo che si ibridano alle ripetute dei telomeri del filamento (CCCTAA). Le sonde PNA hanno una spina dorsale neutra, che aumenta l'affinità di ibridazione al DNA caricato negativamente, risultando in poco o nessun background. La fase di sonda dei telomeri è facoltativa. Per procedere alla colorazione degli anticorpi, reidratare i vetrini in 1x PBS come indicato al punto 2.2.2., quindi procedere direttamente alla "colorazione primaria degli anticorpi".
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Rendere i reagenti della sonda PNA prima di iniziare la colorazione dei telomeri
NOTA: è conveniente preparare le seguenti soluzioni nelle quantità specificate per l'uso in esperimenti futuri. Le condizioni di conservazione sono indicate di seguito.- Preparare 2 L di 20x citrato saline-sodio (SSC) con una concentrazione finale di 3 M NaCl e 0,3 M di citrato di sodio. Autoclave e conservare a temperatura ambiente.
- Creare 50 mL di soluzione di pre-ibridazione contenente l'RNA di trasferimento a una concentrazione finale del 50% di formamide, 5x SSC, 50 g/mL di eparina, 500 RNA di trasferimento g/mL, 0,1% Tween 20 e aggiungere 460 - L di 1 M di acido citrico per portare la soluzione a pH 6. Conservare a -20 gradi centigradi.
AVVISO: Formamide è pericoloso. Preparare la soluzione in una cappa di fumi. - Preparare 50 mL di soluzione di pre-ibridazione allo stesso modo del passaggio 2.1.2 senza aggiungere RNA di trasferimento. Conservare a -20 gradi centigradi.
- Le sonde in telomeri PNA TelC-Cy3 e TelC-Alexa647 sono preparate come 50 stock di m in formamide come da istruzioni del produttore. Conservare le sonde PNA come 8 - L aliquote a -80 gradi centigradi.
- Fare almeno 1 mL di 100 mg/mL soluzione stock di albumina siero bovina (BSA) in acqua distillata sterile. Conservare a -20 gradi centigradi. Se si preparano più di 1 mL di magazzino BSA, memorizzare la soluzione come 1 aliquote mL.
- Utilizzando un tubo da 2 mL, preparare 2 mL di soluzione di ibridazione aggiungendo 27 -L di 100 mg/mL BSA e 8 -L di 50 sonda PNA a 1,965 mL di soluzione di pre-ibridazione contenente RNA di trasferimento. Conservare al buio a -20 gradi centigradi.
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Colorazione sonda telomeri PNA
- Preriscaldare il forno di ibridazione a 82 gradi centigradi.
- Reidratare i vetrini con 500 l-L di 1x PBS per scivolo per 5 min in una camera di umidità a temperatura ambiente. Rimuovere il PBS toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
- Riscaldare i vetrini e il tubo da 2 mL contenente la soluzione di ibridazione direttamente su una superficie metallica nel forno di ibridazione riscaldato per 2 min.
- Mantenendo i vetrini sulla superficie metallica, aggiungere 100 l della soluzione di ibridazione per diapositiva e quindi coprire i vetrini con copricapi in plastica (25 mm x 75 mm) tagliati fuori da un sacchetto di autoclave. Lasciare sciacquare gli scivoli a 82 gradi centigradi per 10-12 min.
- Collocare i vetrini in una camera di umidità al buio a 37 gradi centigradi per 16-24 h. Da questo punto in avanti e per la colorazione dell'anticorpo primario e secondario, i vetrini devono essere tenuti al buio per evitare il fotosbiancamento del segnale di fluorescenza. Dopo il periodo di incubazione, i reagenti per la colorazione degli anticorpi possono essere preparati durante la fase 2.2.9.
- Rimuovere i copricopertine con una punta di pipetta.
NOTA: Per facilitare la rimozione del coperchio, è possibile erogare delicatamente l'uso della soluzione di ibridazione senza RNA di trasferimento tra il vetrino e il coperchio quando il coperchio viene sollevato. - Pipette 500 - L di pre-ibridazione senza RNA di trasferimento su ogni vetrino e posizionare i vetrini nella camera di umidità per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
NOTA: La soluzione di pre-ibridazione senza RNA di trasferimento non viene preriscaldata prima di essere aggiunta a ogni diapositiva. - Pipetta 500 - L del 50% di pre-ibridazione senza RNA di trasferimento in 1x PBS su ogni vetrine e posizionare i vetrini nella camera di umidità per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
- Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin e lavare 3 volte in 1x PBS con agitazione delicata per 15 min per lavaggio a temperatura ambiente.
- Rimuovere i vetrini dal barattolo Coplin e rimuovere il PBS in eccesso toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta. Quindi procedere al passaggio 3.2 "Colorazione anticorpale primaria".
3. Colorazione anticorpale
NOTA: gli anticorpi allevati a proteine meiotiche note possono essere utilizzati per il rilevamento dell'immunofluorescenza nei preparati ai cromosomi diffusi. Gli anticorpi secondari coniugati a diversi fluorofori consente di colorare contemporaneamente più proteine, se gli anticorpi primari sono stati allevati in animali diversi.
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Effettuare le seguenti soluzioni il giorno della colorazione degli anticorpi primari e secondari
- Fare 1 L di PBT con 1x PBS e 0.1% Triton X-100 diluito in acqua distillata. Conservare a temperatura ambiente. Questo può essere preparato in anticipo e in grandi quantità per futuri esperimenti di diffusione.
- Preparare 500 l di blocco dell'anticorpo per diapositivtivo ad una concentrazione finale di 2 mg/mL di BSA e 2% siero di capra in PBT.
- Per fare 100 l di miscela di anticorpi primari o secondari per diapositiva, aggiungere gli anticorpi appropriati alla corretta concentrazione (vedi Tabella dei materiali) nel blocco anticorpale.
NOTA: Potrebbe essere necessario determinare empiricamente la concentrazione di anticorpi. Nella discussione, includiamo un elenco di anticorpi che abbiamo provato con successo (con diluizione/concentrazioni) e quelli che abbiamo provato senza successo.
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Colorazione anticorpale primaria
NOTA: Coniglio anti-umano SCP3 e pollo anti-zebrafish Sycp1 sono tipicamente utilizzati per la colorazione anticorpale primaria.- Dopo aver rimosso il PBS in eccesso dai vetrini, aggiungere 500 l di blocco anticorpo per diapositiva e posizionare i vetrini in una camera di umidità a temperatura ambiente per un minimo di 20 min.
- Rimuovere il blocco anticorpo toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
- Aggiungere 100 l di miscela di anticorpi primari nel blocco anticorpo per vetrina e coprire i vetrini con un coperchio di plastica realizzato da un sacchetto di autoclave. Collocare i vetrini in una camera di umidità durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere i coperchi con una punta di pipetta e lavare i vetrini 2 volte per un minimo di 5 minuti ciascuno con 1x PBS in un barattolo Coplin con leggera agitazione a temperatura ambiente.
- Rimuovere il PBS toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
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Colorazione anticorpale secondaria
NOTA: Gli anticorpi contro il coniglio e l'anti-pollo coniugati a diversi fluorofori vengono utilizzati per la colorazione ad una concentrazione di 1:1000.- Aggiungere 500 l di blocco anticorpale per diapositiva e posizionare i vetrini nella camera di umidità a temperatura ambiente per un minimo di 5 min.
- Rimuovere il blocco anticorpo toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
- Aggiungere 100 l di miscela di anticorpi secondari nel blocco anticorpo per vetrine e coprire i vetrini con un coperchio di plastica fatto da un sacchetto autoclave. Collocare i vetrini in una camera di umidità per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Rimuovere i copricopertine con una punta di pipetta e lavare i vetrini 3 volte per un minimo di 5 minuti ciascuno con 1x PBS in un barattolo Coplin con leggera agitazione a temperatura ambiente.
- Sciacquare gli scivoli una volta per un minimo di 2 min con acqua distillata in un barattolo Coplin con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Asciugare all'aria i vetrini inclinati, per facilitare l'essiccazione.
- Posizionare 20 l di supporto anti-dissolvenza con o senza DAPI (vedere Tabella dei materiali) come 3 punti equidistanti sui riccielli di vetro (24 mm x 60 mm).
- Posizionare i vetrini a faccia in giù sul coperchio del vetro, quindi sigillare i copricapi con smalto sul bordo sovrapponendo l'estremità smerigliata della diapositiva.
- Conservare i vetrini preparati a 4 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per l'imaging.
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Representative Results
Abbiamo delineato un metodo per preparare e visualizzare i preparativi per la diffusione dello spermatocito del pesce zebra. Se eseguita correttamente, la nostra procedura produce nuclei ben diffusi e non sovrapposti. Per recuperare tali nuclei, è importante avere la quantità appropriata di materiale di partenza (cioè testicoli), trattare i testicoli per un periodo di tempo sufficiente nella trypsina e un numero adeguato di trattamenti DNase I. Questi spread possono quindi essere macchiati per i telomeri e le proteine meiotiche per studiare la progressione meiotica durante la profase I. La figura 1 illustra esempi di preparati diffusi macchiati per le caratteristiche cromosomiche in diverse fasi della profase I. Figura 4 illustra un esempio di nuclei scarsamente diffusi.
Figura 1: Immagini rappresentative a super-risoluzione dei preparati di diffusione cromosomica macchiate con PNA e sonde anticorpali. (A)Schematico del complesso sinaptonemale. (B) Una coppia di omologhi sinapsi che mostra la proteina dell'asse cromosomico Sycp3 (verde), la proteina di filamento trasversale Sycp1 (rosso) e il DNA (blu) immagine della microscopia dell'illuminazione strutturale (SIM) utilizzando un obiettivo 100x. La barra della scala(C) I pannelli a sinistra mostrano tre fasi di profase meiotica: leptotene (in alto), zigotene iniziali (al centro) e pazie (in basso). La barra della scala è di 5 m. A destra: immagini rappresentative contenenti telomeri (magenta) per ogni fase. La barra della scala è adattata da Blokhina et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di testicoli di pesce zebra (7 mesi dopo la fecondazione). (A) L'immagine mostra la posizione relativa del testicolo all'interno del pesce zebra. Il testire si trova tra la vescica da bagno e l'intestino. (B) La lunghezza di un testicolo. I pesci zebra più giovani avranno testicoli più piccoli. Per le creme cromosomiche, rimuovere il più grasso e tessuto circostante possibile dal testire. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Camera di umidità per le diapositive. La nostra camera di umidità è realizzata utilizzando una scatola di schiuma di polistirolo (21 cm x 19 cm x 6 cm) progettata per spedire cuvette di elettroporazione. Abbiamo inserito le salviette di tessuto sottile bagnate (vedi Tabella dei materiali)in ogni altra scanalatura. I vetrini sono posizionati in piano sulla parte superiore delle creste senza toccare le salviette umidificate. È disponibile anche una camera di umidità commerciale (vedi Tabella dei Materiali). Immaginiamo che qualsiasi scatola di schiuma di polistirolo dotata di creste e scanalature (ad esempio, utilizzando pipette di vetro13) può essere utilizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempi di spread di scarsa qualità a causa di trattamenti DNase I insufficienti. Cromosomi meiotici macchiati per Sycp3 immagini da SIM utilizzando un obiettivo 20x. Trattamenti insufficiente DNase I porta a nuclei sovrapposti a causa di una sospensione visco delle cellule di saccarosio che impedisce alle cellule di diffondersi correttamente sul vetrino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempi di diffusione cromosomica con un metodo alternativo11. Cromosomi meiotici macchiati per Sycp3 (verde) e Sycp1 (rosso). Gli spread cromosomici sono stati preparati come descritto da Sansam e Pezza11. Questo metodo può essere eseguito utilizzando il pesce zebra individuale piuttosto che i diversi pesci zebra necessari per il nostro protocollo. Nelle nostre mani, è comune vedere cromosomi che non sono ben diffusi. C'è anche un notevole aumento della colorazione di fondo che deriva dai detriti che vengono lasciati sui vetrini durante la procedura di diffusione del cromosomica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo i metodi per sondare la posizione dei telomeri e delle proteine associate ai cromosomi nella superficie nucleare si diffonde dagli spermatociti isolati dai testicoli dei pesci zebra. Prevediamo che questi metodi saranno applicabili per l'analisi di spermatociti in altre specie teleost con regolazione delle dimensioni dei testicoli.
Mentre solo pochi anticorpi sono stati sollevati per le proteine meiotiche dei pesci zebra, abbiamo avuto successo usando i seguenti anticorpi sollevati alle proteine umane (h) o topo (m). Il nostro laboratorio ha sollevato anticorpi contro la proteina Sycp1 zebra (zfSycp1) nel pollo che è servito come un marcatore affidabile per il complesso sinaptonemal (SC), tuttavia, questa proteina è presente solo dallo zigotene precoce al tardo pachytene, quando i cromosomi sono completamente sinapsi. L'anticorpo anti-hSYCP3 del coniglio è stato molto affidabile per rilevare gli assi cromosomici meiotici dal leptotene fino alla dissoluzione della SC in tardo pachytene (Figura 1B,C). In particolare, non abbiamo osservato uno stadio diplotne classico con assi a figura intera definito da Sycp3 e l'assenza di Sycp1, suggerendo che, a differenza del mouse, gli assi possono essere degradati dopo l'uscita dal pachytene3. Altri anticorpi disponibili in commercio contro le proteine m, h o zf meiotice che hanno dato risultati positivi includono anche la ricombinazione/replicazione del DNA coniglio anti-hRAD51 e il coniglio anti-hRPA. La fonte di ogni anticorpo e la diluizione utilizzata sono elencate nella Tabella dei Materiali. Quelli che abbiamo provato senza successo utilizzando almeno tre diversi diluizioni includono capra anti-hDMC1, topo anti-hMlh1, topo anti-criceto Sycp3, topo anti-hRPA.
Ci sono tre fasi critiche della procedura di diffusione cromosomica. Il primo è la raccolta della quantità corretta di materiale. Quindici testicoli intatti dovrebbero essere sufficienti per il protocollo di diffusione per i maschi di 6 mpf, e questo numero può essere regolato verso l'alto o verso il basso a seconda delle dimensioni degli animali. Tenete a mente che alcuni mutanti meiotici avranno testicoli più piccoli, quindi 2 animali aggiuntivi dovrebbero essere utilizzati. Il secondo passo importante è la dissociazione delle cellule. Durante la digestione della trypsina, se i testicoli non si dissociano in piccoli grumi, è probabile che troppo poche cellule saranno recuperate dalla procedura di diffusione. Un terzo passo chiave è la presenza di un pellet visibile dopo i trattamenti DNase I. Se un pellet non è visibile, è probabile che la procedura di diffusione produca poco o nessun nuclei. La perdita di un pellet potrebbe insorgere se vengono utilizzati troppi animali o se vengono effettuati troppi lavamenti DNase I. D'altra parte, troppo pochi trattamenti DNase I possono provocare una sospensione cellulare di saccarosio viscid, che impedirà alle cellule di diffondersi sul vetrino (Figura 4). È importante continuare a eseguire trattamenti DNase I (per un massimo di 4 trattamenti) fino a quando i grumi non sono più presenti dopo l'aggiunta di DMEM.
La tecnica di diffusione cromosomica presentata produce centinaia di nuclei ben diffusi per diapositiva. Utilizzando questa procedura, siamo stati in grado di fornire un'analisi dettagliata degli eventi chiave durante la spermatogenesi del pesce zebra utilizzando la microscopia a super-risoluzione3. Nelle nostre mani, questo protocollo ha generato cromosomi diffusi meglio, con meno detriti sulla diapositiva, e meno colorazione di fondo rispetto a metodi più veloci utilizzando singoli animali descritti da Moens14 e Sansam e Pezza11 (Figura 5). Queste differenze sono probabilmente dovute all'uso di trattamenti di collagenasi, trypsin e DNase nel nostro protocollo. Due limitazioni della nostra tecnica sono il requisito di utilizzare 10-20 maschi maschi di pesce zebra adulti e i trattamenti enzimatici più laboriosi e passaggi di lavaggio. Se il rilevamento della super-risoluzione non è necessario, se il materiale del pesce zebra è limitato, o più di due condizioni sono testate in parallelo, i metodi più veloci possono essere alternative più adatte14,15,16.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Trent Newman e Masuda Sharifi per i commenti sul manoscritto e An Nguyen per aver contribuito a ottimizzare i metodi per diffondere e macchiare i cromosomi dai meiociti del pesce zebra. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM079115 assegnato a S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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