Summary
Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.
Abstract
Meyozis, eşeyli üreme için haploid gametler oluşturmak için gerekli olan anahtar hücresel süreçtir. Model organizmalar, meyotik profaz sırasında meydana gelen kromozom olaylarının anlaşılmasında, eşleştirme, sinaps ve uygun kromozom ayrımını sağlayan rekombinasyon olayları da dahil olmak üzere etkili olmuştur. Fare bu süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir model olmakla birlikte, bu sistemdeki tüm meyotik olaylar insan mayoz bölünmesine benzemektedir. Yakın zamanda insan spermatogenezinin bir modeli olarak zebra balığının heyecan verici potansiyelini gösterdik. Burada, kromozom yayılımı preparatlarında meyotik kromozomları ve ilişkili proteinleri görselleştirme yöntemlerimizi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu preparatlar kromozom yapılarının yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. İlk olarak, testislerin yetişkin zebra balığından diseksiyon prosedürünü, ardından hücre ayrışması, lysis ve kromozomların yayılmasını tanımladık. Daha sonra, meyotik kromozom proteinlerinin lokalizasyonunu, immünororesans tespiti ve nükleik asit dizileri ile situ hibridizasyonda (FISH) floresan ile saptandırma prosedürünü tanımladık. Bu teknikler zebra balığı sisteminde ki meyotik kromatin mimarisinin sitolojik analizi için yararlı bir araç kümesi oluşturmaktadır. Zebra balığı topluluğundaki araştırmacılar bu tekniklerde hızlı bir şekilde ustalaşmalı ve bunları üreme fonksiyonlarının standart analizlerine dahil edebilmelidir.
Introduction
Eşeyli üreme, her biri somatik bir hücrenin kromozomunun yarısını taşıyan iki haploid gametin birleşimi ile devam eder. Meyozis DNA replikasyonu bir tur ve kromozom segregasyonu iki ardışık tur ile haploid gamet üreten özel bir hücre bölünmesidir. Profaz I'de homolog kromozomlar (homologlar) eşleştirme, rekombinasyon ve sinapstan geçmelidir, ikincisi enine filament, Sycp1(Şekil 1A,B)ile köprülenmiş iki homolog eksenden oluşan sinaptonal kompleksin oluşumu ile karakterizedir. Bu süreçlerin düzgün bir şekilde yürütülmemesi, insanlarda düşüklerin önde gelen nedenlerinden biri olan aneuploid gametlerin üretimine yol açabilir1. Eşleştirme arasındaki koordinasyon bilgimiz, rekombinasyon ve sinaps, maya, C. elegans,fare ve Drosophilagibi organizmaların geniş bir yelpazede çalışmalar la kolaylaştırılmıştır , diğerleri arasında2. Homolog kromozom eşleştirmesinin ve segregasyonun genel süreci iyi korunmuş olmakla birlikte, rekombinasyon ve sinapsa olan bağımlılığı ve bu olayların sırası farklılık gösterir.
Homolog rekombinasyon başlatan meyotik çift iplikçikli kopma (DSB) oluşumu, leptoten sırasında buket içinde kümelenmiş telomerlerin yakınında oluşur ve sinaps 3,4'tenkısa bir süresonraortaya çıkar. DSB oluşumu ve sinaps inisiyasyonu bu yapılandırma da insanlarda erkek mayoz bir özelliğidir ama fare5değil,6,7,8, zebra balığı insan spermatogenez için bir model olarak hizmet edebilir düşündüren. Zebra balığı meyozisi çalışmanın çeşitli pratik avantajları da vardır. Hem erkek hem de dişiler yetişkinlik boyunca gametogenez geçirirler, gonadlarına kolayca erişilebilir ler ve yüzlerce yavru tek bir haçtan üretilir. Ayrıca, embriyolar şeffaf ve dıştan geliştirmek, hangi aneuploid gametler nedeniyle embriyonik gelişim sapmalarının erken teşhisikolaylaştırır3,9. Zebra balığı kullanmanın dezavantajları, cinsel olgunluğa ulaşmada yavaş olmalarıdır (~60 gün) ve nükleer yüzey spreadleri için gerekli malzeme miktarı boyutlarına bağlı olarak ~10-20 yetişkin hayvanlardan toplanmalıdır.
Meyotik kromozom yayma preparatları, meyotik kromozom dinamiğinin temel imzaları incelenebildiği için, tüm model organizmalarda kromozom dinamiklerinin incelenmesi için hayati bir araçtır. Zebra balığında, meyotik program ve nükleer organizasyonun ilerlemesinin önemli yönleri, burada kromozom yayılımı olarak adlandırılan nükleer yüzey yayınımlarını delme yoluyla incelenmiştir, proteinlerin immünoresans tespiti için antikorlar ve/veya NÜkleik asitler FISHtarafından3,4,9,10,11,12. Nitekim, buket kümelenmiş telomerlerin polarize lokalizasyonu yayılma hazırlığında korunabilir (Şekil 1C). Son zamanlarda, zebrabalığı spermatosit kromozomu, floresan algılama yöntemleri ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birlikte zebrabalığı telomer dinamiği, homolog kromozom eşleştirme, çift iplikli break lokalizasyonu ve sinaps ilerlü anahtar meyatik geçişlerde ayrıntılı ilerlemesini açıklamak için kullandık3. Burada zebra balığı testislerinin spermatositlerinden kromozom spreadlerini hazırlamak ve daha sonra bunları floresan peptit nükleik asit (PNA) probları ile tekrarlanan telomer dizilerine ve kromozom ilişkili proteinlerin immünfloresans tespitine boyamak için yöntemler sarıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balıkları içeren tüm yöntemler UC Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlar kullanılarak yapılmıştır.
1. Kromozom yayma prosedürü
NOT: Aşağıdaki protokol, slayt başına yüzlerce yayılan meyotik çekirdekiçeren 4-6 slayt oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Kullanılan testislerin sayısı balığın büyüklüğüne bağlıdır. ~60 gün sonrası döllenme (dpf) ve ~ 6 ay sonrası döllenme (mpf) 15 hayvan 20 hayvan kullanmayı bekleyin. Büyük zebra balıkları için (örn. 12 mpf) 10 hayvan yeterli olmalıdır. Bazı meiyotik mutantların testislerinin (örn. spo11-/-) biraz daha küçük olacağını unutmayın3. Bu protokolde, bir testis havuzu tek bir örnek olarak kabul edilir. En fazla 4 numunenin paralel olarak hazırlanması tavsiye edilir.
- Yayılma prosedürüne başlamadan önce aşağıdaki çözümleri yapın
NOT: Aşağıdaki çözümleri gelecekteki yayılma deneylerinde kullanılmak üzere belirtilen miktarlarda hazırlamak uygundur.- 100 mL distile suda 3,42 g sakaroz eriterek 0,1 M sakaroz çözeltisi hazırlayın. Sakaroz çözeltisini pH 8'de de olan 1 M Tris-HCl kullanarak pH 8'e getirin. Sonra sakaroz çözeltisini sterilize süzün. Oda sıcaklığında saklayın.
- 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 ve 27.6 mM KH2PO4 1.8 L distile su nihai konsantrasyona 10x fosfat tamponlu salin (PBS) stok çözeltisi yapın. Eriyene kadar karıştırın, sonra NaOH ve otoklav kullanarak 7.3 pH ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- Steril distile suda 400 μg/mL DNase I çözeltisi yapın. -20 °C'de saklayın. Bu çözeltinin 5 mL'inin hazırlanması ve ardından 100 μL aliquots olarak saklanması önerilir.
- Yayma protokolünün olduğu gün aşağıdaki çözümleri yapın
NOT: Zaman verimliliği için, tüm testisleri inceledikten hemen sonra kollajenaz çözeltisi yapmak ve örneklerkolajenaz tedavi edilirken sonra tripsin ve tripsin inhibitörü çözeltileri yapmak en iyisidir.- Her numune de Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamının (DMEM) 200 μL'sinde 4 mg kollajenaz çözünür (%2 w/v kollajenaz son konsantrasyon). İhtiyaç duyulana kadar buzda tutun. Kollajenaz testisleri ayıracak.
- Numune başına 200 μL DMEM'de 1.4 mg tripsin çözün (%0.7 w/v tripsin son konsantrasyonu). İhtiyaç duyulana kadar buzda tutun. Tripsin hücrelerin ayrıştırılmaya yardımcı olur.
- Numune başına 500 μL DMEM'de 10 mg tripsin inhibitörü çözün (%2 w/v tripsin inhibitörü son konsantrasyon). İhtiyaç duyulana kadar buzda tutun. Tripsin inhibitörü tripsinin hücreleri alçaltmasını önler.
- Steril distile suda %0,15 Triton X-100 ile %1 formaldehit çözeltisi (%16 önceden yapılmış çözeltiden) hazırlayın. İhtiyaç duyulana kadar buzda tutun. Testisler tripsin ve DNase I (yani, yayma işleminin 1.4.7. adımlarında) ile tedavi edilirken %1 formaldehit hazırlanabilir.
DİkKAT: Formaldehit tehlikelidir.
- Yetişkin erkek zebra balığından testislerin diseksiyonu
- Erkek zebra balıklarını (> 60 dpf) buzlu suya batırarak ötenazi yapar. Balıklar parçalanmaya hazır olana kadar buzlu suda tutulabilir, ancak en kısa sürede kesilmelidir.
NOT: Yabani tip suşu AB bu yordam için kullanılır, ancak diğer yabani tip suşları da münasip olmalıdır. Biz kesme den önce buzlu suda balık tutmuş uzun süre protokolü üzerinde herhangi bir fark etkisi olmadan 3 saat. - Küçük makas ile bir seferde bir balık decapitate ve sonra vücut boşluğu ortaya çıkarmak için ventral orta hat boyunca kesmek için mikro makas kullanın.
- Mikroskop altında 1.65x büyütmede forceps kullanarak testisleri inceleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). 1x PBS sığ bir havuz ile kaplı silikon kaplı Petri çanak diseksiyon yürütmek.
NOT: Testis, yüzme mesanesi ile bağırsak arasında yer alır ve kas dokusundan daha hafif görünür (Şekil 2A). Testisler zebra balığından çıkarıldığında 2 lobal olmalıdır (Şekil 2B). - Testislerden mümkün olduğunca çok yağ ve çevre dokuyu çıkarın. Daha sonra her bir diseksiyon testini doğrudan 2 mL DMEM ile 5 mL'lik bir tüpe ekleyin ve buzüzerinde tutun.
NOT: Herhangi bir deneme yapmadan önce 1.3.3 ve 1.3.4 adımlarına hakim olunmalıdır.
- Erkek zebra balıklarını (> 60 dpf) buzlu suya batırarak ötenazi yapar. Balıklar parçalanmaya hazır olana kadar buzlu suda tutulabilir, ancak en kısa sürede kesilmelidir.
- Testis hücrelerinin dissosiyasyonu
- 37 °C'ye 0,1 M sakaroz çözeltisi önceden 100 mL.
- Testislerle birlikte 5 mL tüpe 200 μL kollajenaz çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
- DMEM bulutlu ve testisler küçük parçalar halinde olana kadar 32 °C'de 100 rpm'de 50 dakika ile bir saat arasında bir kuvöz çalkalayıcıda testisleri hafifçe sallayın. Hızla ayrışma kolaylaştırmak için her 10 dakikada tüp ters.
- Kollajenazı temizlemek için, Son 5 mL hacmine DMEM ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Pellet oda sıcaklığında 3 dk için ~ 200 x g testisleri. Sadece 2 mL kalması için süpernatantın 3 mL'sini çıkarın.
NOT: DMEM'in eklenmesi, çıkarılması ve transferi, kromozom yayma işleminin tamamı için plastik transfer pipetleri ile yapılır. - Toplam 3 DMEM yıkama için adımı 1.4.4'ü iki kez daha tekrarlayın. DMEM yıkayımı arasındaki peleti yeniden askıya almayın. Son DMEM yıkamadan sonra, sadece 1 mL kalması için 4 mL supernatant çıkarın.
- Toplam 2 mL hacim için 1 mL DMEM ekleyin ve 200 μL tripsin çözeltisi ve 20 μL DNase I çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
- DMEM çözeltisi sadece birkaç küme içerene kadar tüpü 100 rpm'de 5-15 dk'da 32 °C'de yatay olarak sallayın. Hızla ayrışma kolaylaştırmak için her 5 dakikada tüp ters.
NOT: Kümeler salladıktan sonra çok daha küçük olmalıdır. - Tripsin inhibitörü çözeltisinin 500 μL'sini ve 50 μL DNase I çözeltisini ekleyin. Tüpü karıştırmak için birkaç kez ters çevirin, sonra kısaca tüp kapağı veya tüp tarafına yapışabilir sıvı veya kümeleri kaldırmak için oda sıcaklığında 3 dakika ~ 200 x g aşağı spin.
- Tüpü buzüzerine yerleştirin ve kalan kümelerin ayrıştırılmasını kolaylaştırmak için 2 dakika boyunca plastik bir transfer pipetiyle tekrar tekrar yukarı ve aşağı boru lar atarak hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonu transfer pipetinin ampulüne girmesine izin vermeyin. 2 dk sonra, pipet süspansiyon geri 5 mL tüp içine.
- DMEM ile 100 μm hücreli bir süzgeç önceden ıslayın ve buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin.
- Plastik transfer pipeti kullanarak bir seferde bir damla süzgeç yoluyla hücre süspansiyon aktarın. Hücre süspansiyonunun transfer pipetinin ampulüne girmediğinden emin olun.
- Plastik transfer pipetini kullanarak filtratı yeni bir 5 mL boruya aktarın ve DMEM'i son 5 mL hacmine ekleyin. Temiz bir plastik transfer pipet ile filtrenin altına bağlı havuzlu hücreleri toplamak için emin olun. Hücre yi 5 dk oda sıcaklığında ~200 x g'de peletleyin.
- Pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın.
- Doğrudan pelet içine 5 μL DNase I çözeltisi ekleyin. Daha sonra boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüp raf boyunca tüpün dış alt 4-5 kez kazıyarak yavaşça DNase I çözeltisi ile pelet karıştırın. Çok sert kazıma kurtarılan yayılır bir azalmaya neden olabilir.
- DMEM'i son 5 mL hacmine ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. İlk DNase I tedavisinden sonra kümelerin hala mevcut olması yaygındır.
- Hücre süspansiyonu 2 dk oda sıcaklığında 2 dk.
- DMEM ilavesi üzerine yeniden askıya alınan pelet kümelenmeden 1.4.13-1.4.16 adımlarını 1-3 kez daha tekrarlayın. Son spinsonra, pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın.
NOT: Her DNase I tedavisinde pelet boyutunda bir azalma bekleyin; 4 toplam DNase I yıkar önemli hücre kaybına neden olabilir. DNase I tedavi adımlarından sonra pelet görünmüyorsa, prosedüre devam etmeyin. Kullanılmayan DNase I'i atın. - 1 mL 1x PBS ekleyin ve boş bir 1,5 mL tüp raf boyunca tüpün dış altını hafifçe kazıyarak peleti yeniden askıya alın.
- 5 dk için ~200 x g'de hücre süspansiyonuna pelet daha sonra peleti rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın.
- Diyafram açıklığını genişletmek ve kesme pipet ucu ile yukarı ve aşağı boru ile pipetleme 0,1 M sakaroz çözeltisi ~ 80 μL pelet resuspend 200 μL pipet ucu ucundan ~ 3 mm kesin. Hücre süspansiyonu 3 dakika oda sıcaklığında oturalım.
- Kromozomların cam kaydıraklarda yayılması
- Bir pipet ucu yan ile% 0.15 Triton X-100 ile% 1 formaldehit% 100 μL ile Coat bir slayt. Daha sonra sakaroz hücre süspansiyonunun 18 μL'sini uzun kenarına dik düz bir çizgi içinde kaydırak ın ortasına ekleyin. Hücre süspansiyonunun tüm köşelere yayılmasını kolaylaştırmak için kaydırağı ileri geri (~60°) yatırın.
- Formaldehit çözeltisinin kurumasını önlemek için slaytları hafifçe çatlamış açık nem odasına(Şekil 3)yerleştirin. Nem odasını bir gecede karanlık bir çekmeceye yerleştirin.
- Kapağı nem odasından çıkarın ve kaydıraların tamamen kurumasını bekleyin.
- Bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin sonra distile su ile Coplin kavanoz doldurun ve oda sıcaklığında hafif sallayarak 5 dakika kuluçka.
NOT: Slaytlar Coplin kavanoz başına slayt sayısını maksimize etmek için bir zikzak desen Coplin kavanoza yerleştirilebilir. Tüm slaytlar arasında sıvı geçmek için boşluk olduğundan emin olun. - Suyu dökün ve kavanozu 1:250 ıslatma maddesi ile doldurun (Bkz. Malzeme Tablosu). Oda sıcaklığında hafifçe sallayarak 5 dakika her biri için 2 kez yıkayın.
- Slaytların tamamen kurumasını bekleyin ve -20 °C'de boyanana kadar saklayın.
NOT: Kromozomlarda gözle görülür bir bozulma olmadan slaytları depoladığımız en uzun süre ~2 aydır.
2. Telomer PNA sonda boyama
NOT: Telomer tekrarları, önde gelen telomer tekrarları (CCCTAA) ile hibridize florofor konjuge telomer PNA probları kullanılarak boyanabilir. PNA probları nötr bir omurgaya sahiptir, bu da negatif yüklü DNA'ya melezleşme afiyetini arttırır ve bu da çok az ve hiç arka plan la sonuçlanır. Telomer sondalama adımı isteğe bağlıdır. Antikor boyama devam etmek için, adım 2.2.2 belirtildiği gibi 1x PBS slaytlar rehydrate,sonra doğrudan devam "Primer antikor boyama".
-
Telomer boyama başlamadan önce PNA probu reaktifleri olun
NOT: Aşağıdaki çözümleri gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere belirtilen miktarlarda hazırlamak uygundur. Depolama koşulları aşağıda belirtilmiştir.- 3 M NaCl ve 0,3 M sodyum sitrat son konsantrasyonu ile 2 L 20x tuzlu sodyum sitrat (SSC) çözeltisi hazırlayın. Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
- 50 mL ön hibridizasyon solüsyonu içeren transfer RNA'yı %50 formamid, 5x SSC, 50 μg/mL heparin, 500 μg/mL transfer RNA, %0,1 Tween 20 yapın ve çözeltiyi pH ~6'ya getirmek için 460 μL 1 M sitrik asit ekleyin. -20 °C'de saklayın.
DİkKAT: Formamide tehlikelidir. Bir duman başlık içinde çözüm hazırlayın. - Transfer RNA eklemeden adım 2.1.2'deki gibi aynı şekilde hazırlanan 50 mL ön hibridizasyon çözeltisini yapın. -20 °C'de saklayın.
- PNA telomer probları TelC-Cy3 ve TelC-Alexa647 üreticinin talimatlarına göre formamid içinde 50 μM stok olarak hazırlanır. PNA problarını -80 °C'de 8 μL aliquot olarak saklayın.
- Steril distile suda sığır serum albumininin (BSA) en az 1 mL 100 mg/mL stok çözeltisi yapın. -20 °C'de saklayın. 1 mL'den fazla stok BSA hazırlıyorsanız, çözümü 1 mL aliquots olarak saklayın.
- 2 mL'lik bir tüp kullanarak, transfer RNA içeren 1,965 mL ön hibridizasyon çözeltisine 27 μL 100 mg/mL BSA ve 8 μL 50 mM PNA probu ekleyerek 2 mL hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. Karanlıkta -20 °C'de saklayın.
-
PNA telomer sonda boyama
- Melezleme fırınını 82 °C'ye ısıtın.
- Oda sıcaklığında nem haznesinde 5 dakika boyunca slayt başına 500 μL 1x PBS ile yeniden nemlendirin. Kağıdın yan tarafına kağıt havlu yla dokunarak PBS'yi çıkarın.
- Isı slaytlar ve hibridizasyon çözeltisi içeren 2 mL tüp doğrudan 2 dakika için ısıtmalı hibridizasyon fırınmetal bir yüzey üzerinde.
- Slaytları metal yüzeyde tutarken, slayt başına 100 μL hibritleştirme çözeltisi ekleyin ve ardından otoklav torbasından şekil almak için slaytları plastik kapaklı (~25 mm x 75 mm) kesilerek kapatın. Slaytlar 82 °C'de 10-12 dk oturun.
- Slaytları 37 °C'de karanlıkta bir nem haznesinde 16-24 saat süreyle yerleştirin. Bu noktadan itibaren ve primer ve sekonder antikor boyama için, floresan sinyalinin fotobeyazrlamasını önlemek için slaytlar karanlıkta tutulmalıdır. Kuluçka döneminden sonra, antikor boyama reaktifleri adım 2.2.9 sırasında hazırlanabilir.
- Kapakları pipet ucuyla çıkarın.
NOT: Kapak kaymasının kaldırılmasını kolaylaştırmak için, transfer RNA'sı olmayan hibridizasyon çözeltisinin ~50-100 μL'si, kapak kayması kaldırılırken slayt ve kapak lı arasında yavaşça dağıtılabilir. - Pipet 500 μL ön hibridizasyon çözeltisi her slayt üzerine hiçbir transfer RNA ile ve oda sıcaklığında 15 dakika nem odasında slaytlar yerleştirin. Kağıdın üzerine kaydırağının kenarına dokunarak çözümü çıkarın.
NOT: Aktarım RNA'sı olmayan ön hibridizasyon çözümü, her slayta eklenmeden önce önceden ısıtılmaz. - Pipet 500 μL % 50 ön hibridizasyon çözeltisi ile 1x PBS'de transfer RNA olmadan her slayta ve slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nem haznesine yerleştirin. Kağıdın üzerine kaydırağının kenarına dokunarak çözümü çıkarın.
- Slaytları Coplin kavanozuna aktarın ve oda sıcaklığında yıkama başına 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak 1x PBS'de 3 kez yıkayın.
- Coplin kavanozundaki slaytları çıkarın ve kağıdın yan tarafına kağıt havlu yla dokunarak fazla PBS'yi çıkarın. Sonra adım 3.2 "Birincil antikor boyama" devam edin.
3. Antikor boyama
NOT: Bilinen meyotik proteinlere yükseltilen antikorlar, yayılmış kromozom preparatlarında immünfloresans tespiti için kullanılabilir. Farklı floroforlara konjuge sekonder antikorlar, primer antikorlar farklı hayvanlarda yükseltilmişse, aynı anda birden fazla proteinin boyanmasını sağlar.
-
Primer ve sekonder antikor boyama gününde aşağıdaki çözeltileri yapın
- 1 X PBS ile 1 L PBT ve distile suda seyreltilmiş % 0.1 Triton X-100 yapın. Oda sıcaklığında saklayın. Bu önceden ve gelecekteki yayılan deneyler için büyük miktarlarda hazırlanabilir.
- Slayt başına 500 μL antikor bloğu hazırlayın ve PBT'de 2 mg/mL BSA ve %2 keçi serumu son konsantrasyonuna kadar.
- Slayt başına 100 μL primer veya sekonder antikor karışımı yapmak için, doğru konsantrasyonda uygun antikorları ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)antikor bloğuna.
NOT: Antikor konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir. Tartışmada, başarı ile denediğimiz antikorların bir listesini (seyreltme/konsantrasyonlarla) ve başarılı olamadan denedik.
-
Primer antikor boyama
NOT: Tavşan anti-insan SCP3 ve tavuk anti-zebrabalığı Sycp1 genellikle birincil antikor boyama için kullanılır.- Fazla PBS'yi slaytlardan çıkardıktan sonra, slayt başına 500 μL antikor bloğu ekleyin ve slaytları en az 20 dakika oda sıcaklığında bir nem odasına yerleştirin.
- Bir kağıt havlu üzerinde slayt tarafında dokunarak antikor bloğu çıkarın.
- Slayt başına antikor bloğuna 100 μL primer antikor karışımı ekleyin ve slaytları otoklav torbasından yapılmış plastik bir kapak lı kapakla kapatın. Slaytları bir gecede 4 °C'de bir nem odasına yerleştirin.
- Bir pipet ucu ile kapakları çıkarın ve oda sıcaklığında hafif sallayarak bir Coplin kavanozda 1x PBS ile her 5 dakika en az 2 kez slaytlar yıkayın.
- Kağıdın yan tarafına kağıt havlu yla dokunarak PBS'yi çıkarın.
-
Sekonder antikor boyama
NOT: 1:1000 konsantrasyonunda boyama için farklı floroforlara konjuge keçi anti-tavşan ve anti-tavuk antikorları kullanılır.- Slayt başına 500 μL antikor bloğu ekleyin ve slaytları en az 5 dakika oda sıcaklığında nem odasına yerleştirin.
- Bir kağıt havlu üzerinde slayt tarafında dokunarak antikor bloğu çıkarın.
- Slayt başına antikor bloğuna 100 μL ikincil antikor karışımı ekleyin ve slaytları otoklav torbasından yapılmış plastik bir kapak lı kapakla kapatın. Slaytları 37 °C'de 1 saat nem odasına yerleştirin.
- Bir pipet ucu ile kapakları çıkarın ve oda sıcaklığında hafif sallayarak bir Coplin kavanozda 1x PBS ile her biri en az 5 dakika boyunca slaytlar 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında hafif sallayarak bir Coplin kavanozda distile su ile 2 dakika en az bir kez slaytlar durulayın.
- Kurumasını kolaylaştırmak için kaydıraklar eğik hava kurutun.
- 20 μL'lik dapi li veya DAPI'siz anti-fade montaj antını (Bkz. Malzeme Tablosu)cam kapaklara (24 mm x 60 mm) 3 eşit aralıklı nokta olarak yerleştirin.
- Slaytları cam kapaklara yüzüstü yerleştirin ve kapakları kenarına oje yle mühürleyin ve kaydırağın buzlu ucuyla örtüşün.
- Hazırlanan slaytları görüntülemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zebrabalığı spermatosit yayma preparatlarını hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem belirledik. Doğru yapıldığında, prosedürümüz iyi yayılmış, üst üste binmeyen çekirdekleri verir. Bu tür çekirdekleri kurtarmak için, uygun miktarda başlangıç materyaline (yani testislere), testisleri yeterli süre için tripsin'de tedavi etmek ve yeterli sayıda DNase I tedavisine sahip olmak önemlidir. Bu spreadler daha sonra telomerler ve meyotik proteinler için profaz I. Şekil 1 profaz I. Şekil 4 farklı aşamalarında kromozomal özellikleri için boyanmış yayılmış preparatörnekleri göstermek için meiotik ilerleme çalışma için lekeli olabilir Şekil 4 kötü yayılmış çekirdekleri bir örnek göstermektedir.
Şekil 1: Kromozom yayma preparatlarının PNA ve antikor probları ile boyanmış temsili süper çözünürlüklü görüntüleri. (A) Sinaptonemal kompleksin şeması. (B) Kromozom ekseni proteini Sycp3 (yeşil), enine filament proteini Sycp1 (kırmızı) ve DNA (Mavi) 100x hedefi kullanılarak yapısal aydınlatma mikroskobu (SIM) ile görüntülenen sinapslı homolog çifti. Ölçek çubuğu = 1 μm. (C) Soldaki paneller meiyotik profazın üç aşamasını gösterir: leptoten (üst), erken zigot (orta) ve pachytene (alt). Ölçek çubuğu = 5 μm. Sağ: her aşama için telomerler (macenta) içeren temsili görüntüler. Ölçek çubuğu = 1 μm. Şekiller Blokhina ve ark.3'tenuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Zebra balığı testisleri örneği (~7 ay sonrası döllenme). (A) Görüntü, testisin zebra balığı içindeki göreli konumunu gösterir. Testis yüzme mesane ve bağırsak arasında oturur. (B) Bir testisin uzunluğu. Genç zebra balıkları daha küçük testislere sahip olacak. Kromozom yayılır için, testis mümkün olduğunca çok yağ ve çevre doku kaldırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Slaytlar için nem odası. Nem haznemiz elektroporasyon kütüğü nezreleri sevk etmek için tasarlanmış polistiren köpük kutusu (21 cm x 19 cm x 6 cm) kullanılarak yapılır. Islak ince doku mendilleri (bkz. Malzemeler Tablosu)diğer her oluğa yerleştirdik. Slaytlar ıslak mendillere dokunmadan sırtların üzerine düz olarak yerleştirilir. Ticari bir nem odası da mevcuttur (bkz. Sırtlar ve oluklarla donatılmış herhangi bir polistiren köpük kutusunun (örneğin, campipetler 13kullanılarak) kullanılabileceğini öngörüyoruz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yetersiz DNase I tedavileri nedeniyle düşük kaliteli yayılır örnekleri. Sycp3 için boyanmış meyotik kromozomlar SIM tarafından 20x nesnel kullanılarak görüntülenebiyi. Yetersiz DNase I tedavileri, hücrelerin slaytta düzgün bir şekilde yayılmasını engelleyen viskoz bir sakaroz hücre süspansiyonu nedeniyle üst üste gelen çekirdeklere yol açar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Alternatif bir yöntem kullanarak kromozom yayılma örnekleri11. Sycp3 (yeşil) ve Sycp1 (kırmızı) için meiotik kromozomlar boyanmıştır. Kromozom spreadleri Sansam ve Pezza11tarafından açıklandığı gibi hazırlanmıştır. Bu yöntem, protokolümüz için gerekli olan birkaç zebra balığı yerine tek tek zebra balığı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Elimizde, iyi yayılmayan kromozomlar görmek yaygındır. Ayrıca kromozom yayma işlemi sırasında slaytlar üzerinde kalan enkaz sonucu arka plan boyama belirgin bir artış vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, zebra balığı testislerinden izole edilen spermatositlerden yayılan nükleer yüzey deki telomerlerin ve kromozomla ilişkili proteinlerin yerini araştırma yöntemlerini açıklıyoruz. Bu yöntemlerin diğer teleost türlerindeki spermatositlerin analizinde testislerin büyüklüğüne göre ayarlanabilecek şekilde uygulanacağını düşünüyoruz.
Zebrabalığı meiotik proteinlere sadece birkaç antikor yükseltilmiş olsa da, insan (h) veya fare (m) proteinlerine yükseltilmiş aşağıdaki antikorları kullanarak başarılı olduk. Laboratuvarımız, sinaptonal kompleks (SC) için güvenilir bir belirteç görevi gören tavukta zebrabalığı Sycp1 proteinine (zfSycp1) antikor yetiştirmiştir, ancak bu protein sadece erken zigoten geç pachytene'ye kadar mevcuttur, kromozomlar tamamen sinapslandığında. Tavşan anti-hSYCP3 antikor geç pakimeten SC çözünme kadar leptoten gelen meyotik kromozom eksenleri tespit etmek için çok güvenilir olmuştur(Şekil 1B,C). Özellikle, biz Sycp3 ve Sycp1 yokluğu tarafından tanımlanan tam uzunlukta eksenleri ile klasik bir diplotene sahne gözlenmemiş, fare aksine, eksenler pachytene3 çıkışından sonra bozulmuş olabileceğini düşündürmektedir . M, h veya zf meyotik proteinlere karşı ticari olarak mevcut olan ve olumlu sonuçlar veren diğer antikorlar arasında DNA rekombinasyon/replikasyon tavşan anti-hRAD51 ve tavşan anti-hRPA sayılabilir. Her antikor ve kullanılan seyreltme kaynağı Malzemeler Tablosundalistelenmiştir. Biz en az üç farklı seyreltme kullanarak başarı olmadan denedim keçi anti-hDMC1, fare anti-hMlh1, fare anti-hamster Sycp3, fare anti-hRPA içerir.
Kromozom yayma işleminin üç kritik aşaması vardır. İlk malzemenin doğru miktarda toplanıyor. 15 bozulmamış testis ~ 6 mpf erkekler için yayma protokolü için yeterli olmalıdır ve bu sayı hayvanların büyüklüğüne bağlı olarak yukarı veya aşağı ayarlanabilir. Bazı meiyotik mutantlar küçük testisler olacağını unutmayın, bu yüzden 2 ek hayvanlar kullanılmalıdır. İkinci önemli adım hücrelerin dissociation olduğunu. Tripsin sindirimi sırasında, testisler küçük kümeler halinde ayrıştırmak yoksa, çok az hücre yayma prosedürü kurtarıldı olması muhtemeldir. Üçüncü bir anahtar adım DNase I tedavilerinden sonra görünür bir pelet varlığıdır. Bir pelet görünmüyorsa, yayma prosedürünün çekirdekleri çok az verim muhtemeldir. Çok az hayvan kullanılırsa veya çok fazla DNase I yıkar ise bir pelet kaybı ortaya çıkabilir. Öte yandan, çok az DNase I tedavileri, hücrelerin slaytta yayılmasını önleyecek viscid sakaroz hücre süspansiyonuna neden olabilir (Şekil 4). DMEM'in eklenmesiyle kümeler artık mevcut olmayana kadar DNase I tedavilerini (maksimum 4 tedavi için) yapmaya devam etmek önemlidir.
Sunulan kromozom yayma tekniği slayt başına yüzlerce iyi yayılmış çekirdek verir. Bu prosedürü kullanarak, süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak zebrabalığı spermatogenezi sırasında ki önemli olayların detaylı bir analizini sağlayabildik3. Elimizde, bu protokol daha iyi yayılmış kromozomlar üretti, slayt üzerinde daha az enkaz ile, ve daha az arka plan boyama Moens tarafından açıklanan tek hayvanlar kullanarak daha hızlı yöntemlerle karşılaştırıldığında14 ve Sansam ve Pezza11 (Şekil 5). Bu farklılıklar muhtemelen protokolümüzde kollajenaz, tripsin ve DNase tedavilerinin kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Tekniğimizin iki sınırlaması 10-20 yetişkin zebra balığı erkek ve daha zahmetli enzim tedavileri ve yıkama adımları kullanarak gereksinimi vardır. Süper çözünürlük algılama gerekli değilse, zebrabalığı malzeme sınırlı ise, ya da ikiden fazla koşullar paralel olarak test edilirse, daha hızlı yöntemler daha uygun alternatifler14,15,16olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz zebrabalığı meiocytes kromozomlar yaymak ve boyama için yöntemleri optimize etmek için yardımcı olmak için el yazması ve An Nguyen hakkında yorum için Trent Newman ve Masuda Sharifi teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 GM079115 tarafından Desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
