Summary
Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.
Abstract
Meiose is het belangrijkste cellulaire proces dat nodig is om haploïde gameten te maken voor seksuele voortplanting. Modelorganismen hebben een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van de chromosoomgebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de meiotische profase, waaronder de koppeling, synapsis en recombinatiegebeurtenissen die zorgen voor een goede chromosoomsegregatie. Hoewel de muis een belangrijk model is geweest voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die aan deze processen ten grondslag liggen, zijn niet alle meiotische gebeurtenissen in dit systeem analoog aan menselijke meiose. We hebben onlangs het opwindende potentieel van de zebravissen aangetoond als een model van menselijke spermatogenese. Hier beschrijven we, in detail, onze methoden om meiotische chromosomen en bijbehorende eiwitten te visualiseren in chromosoomspreadpreparaten. Deze preparaten hebben het voordeel dat de analyse van chromosoomstructuren met hoge resolutie kan worden geanalyseerd. Ten eerste beschrijven we de procedure voor het ontleden van teelballen van volwassen zebravis, gevolgd door celdissociatie, lyse en verspreiding van de chromosomen. Vervolgens beschrijven we de procedure voor het detecteren van de lokalisatie van meiotische chromosoomeiwitten, door immunofluorescentiedetectie en nucleïnezuursequenties, door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Deze technieken omvatten een nuttige set van instrumenten voor de cytologische analyse van meiotic chromatine architectuur in het zebravissysteem. Onderzoekers in de zebravisgemeenschap moeten deze technieken snel onder de knie kunnen krijgen en opnemen in hun standaardanalyses van de voortplantingsfunctie.
Introduction
Seksuele voortplanting verloopt door de combinatie van twee haploïde gameten, die elk de helft van de chromosoomcomplement van een somatische cel dragen. Meiosis is een gespecialiseerde celdeling die haploïde gameten produceert door middel van een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende rondes van chromosoom segregatie. In profase I moeten homologe chromosomen (homologs) koppeling, recombinatie en synapsis ondergaan, waarvan de laatste wordt gekenmerkt door de vorming van het synaptonemale complex dat bestaat uit twee homologassen die overbrugd zijn door de transversale gloeidraad, Sycp1 (figuur 1A, B). Het niet goed uitvoeren van deze processen kan leiden tot de productie van aneuploïde gameten, die een belangrijke oorzaak zijn van miskramen bij mensen1. Onze kennis van de coördinatie tussen koppeling, recombinatie en synapsis is gefaciliteerd door studies in een breed scala van organismen, zoals gist, C. elegans,muis, en Drosophila, onder andere2. Terwijl het algemene proces van homologe chromosoomkoppeling, gevolgd door segregatie, goed wordt bewaard, varieert de afhankelijkheid van recombinatie en synapsis en de volgorde van deze gebeurtenissen.
Meiotic double-strand break (DSB) formatie, die homologe recombinatie initieert, treedt op in de buurt van telomeren geclusterd in het boeket tijdens leptotene en synapsis ontstaat kort na3,4. Deze configuratie van DSB-vorming en synapsisinitiatie is ook een kenmerk van mannelijke meiose bij demens,maar niet bij muis5,6,7,8, wat suggereert dat zebravissen als model voor menselijke spermatogenese kunnen dienen. Er zijn ook verschillende praktische voordelen van het bestuderen van zebravissen meiose. Zowel mannetjes als vrouwtjes ondergaan gametogenese gedurende de volwassenheid, hun geslachtsklieren zijn gemakkelijk toegankelijk, en honderden nakomelingen worden gegenereerd uit een enkel kruis. Bovendien zijn de embryo's transparant en ontwikkelen ze zich extern, wat de vroegtijdige opsporing van afwijkingen in de embryonale ontwikkeling als gevolg van aneuploïde gameten3,9vergemakkelijkt. Nadelen van het gebruik van zebravis zijn dat ze traag zijn om seksuele rijpheid te bereiken (~ 60 dagen) en de hoeveelheid materiaal die nodig is voor nucleaire oppervlakte spreads moet worden verzameld van ~ 10-20 volwassen dieren, afhankelijk van hun grootte.
Meiotic chromosoom spread preparaten zijn een essentieel hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoom dynamiek in alle modelorganismen, omdat de belangrijkste handtekeningen van meiotische chromosoom dynamiek kunnen worden onderzocht. Bij zebravis zijn belangrijke aspecten van de progressie van het meiotische programma en de nucleaire organisatie ontleed door indringende nucleaire oppervlaktespreads, hier aangeduid als chromosoomspreads, met antilichamen voor immunofluorescentiedetectie van eiwitten en/of nucleïnezuren door FISH3,4,9,10,11,12. Inderdaad, de gepolariseerde lokalisatie van geclusterde telomeren in het boeket kan worden bewaard in de spread preparaat (Figuur 1C). Onlangs hebben we zebravissen spermatocyten chromosoom spreads samen met fluorescentie detectie methoden en super-resolutie microscopie gebruikt om de gedetailleerde progressie van zebravissen telomeer dynamiek, homologe chromosoom koppeling, dubbele-streng breuk lokalisatie, en synapsis op key meiotic overgangen3verduidelijken. Hier presenteren we methoden om chromosoomspreads van spermatocyten van de zebravisteös voor te bereiden en ze vervolgens te bevlekken met fluorescerend peptide nucleïnezuur (PNA) sondes tot herhaalde telomeersequenties en immunofluorescentiedetectie van chromosoomgeassocieerde eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden waarbij zebravis betrokken waren, werden uitgevoerd volgens ethische normen die waren goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van uc Davis.
1. Chromosoomverspreidingsprocedure
OPMERKING: Het volgende protocol is ontworpen om 4-6 dia's te maken, met honderden verspreide meiotische kernen per dia. Het aantal gebruikte teelballen is afhankelijk van de grootte van de vis. Verwacht 20 dieren te gebruiken op ~ 60 dagen na bevruchting (dpf) en 15 dieren op ~ 6 maanden na bevruchting (mpf). Voor grote zebravis (bijvoorbeeld 12 mpf) moeten 10 dieren voldoende zijn. Houd er rekening mee dat de teelballen van sommige meiotische mutanten (bijvoorbeeld spo11-/-) iets kleiner zullen zijn3. In dit protocol wordt één groep teelballen beschouwd als één monster. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 4 monsters parallel te bereiden.
- De volgende oplossingen maken voordat u met de verspreidingsprocedure begint
OPMERKING: Het is handig om de volgende oplossingen voor te bereiden in de hoeveelheden die zijn opgegeven voor gebruik in toekomstige verspreidingsexperimenten.- Bereid een 0,1 M sacharoseoplossing door 3,42 g sacharose op te lossen in 100 mL gedestilleerd water. Breng de sacharoseoplossing naar de PH 8 met 1 M Tris-HCl die ook op pH 8 ligt. Filter vervolgens steriliseren van de sacharose oplossing. Bewaar op kamertemperatuur.
- Maak een 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een eindconcentratie van 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 en 27,6 mM KH2PO4 in 1,8 L gedestilleerd water. Roer tot het is opgelost en pas de pH aan op 7,3 met NaOH en autoclave. Bewaar op kamertemperatuur.
- Maak een 400 μg/mL DNase I oplossing in steriel gedestilleerd water. Bewaar bij -20 °C. Het wordt aanbevolen om 5 mL van deze oplossing voor te bereiden en vervolgens op te slaan als 100 μL aliquots.
- Maak de volgende oplossingen op de dag van het verspreidingsprotocol
OPMERKING: Voor tijdefficiëntie is het het beste om de collageenoplossing onmiddellijk na het ontleden van alle teelballen te maken en vervolgens de trypsine en trypsine remmer oplossingen te maken gedurende de tijd dat de monsters in collagenase worden behandeld.- Los 4 mg collagenase op in 200 μL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) per monster (2% w/v collagenase eindconcentratie). Blijf op ijs tot dat nodig is. De collageen zal de teelballen scheiden.
- Los 1,4 mg trypsine op in 200 μL DMEM per monster (0,7% w/v trypsine eindconcentratie). Blijf op ijs tot dat nodig is. De trypsine zal helpen de cellen te scheiden.
- Los 10 mg trypsineremmer op in 500 μL DMEM per monster (2% w/v trypsineremmer eindconcentratie). Blijf op ijs tot dat nodig is. Trypsine remmer voorkomt trypsine van vernederende de cellen.
- Bereid een 1% formaldehyde oplossing (van een 16% vooraf gemaakte oplossing) met 0,15% Triton X-100 in steriel gedestilleerd water. Blijf op ijs tot dat nodig is. De 1% formaldehyde kan worden bereid terwijl de teelballen worden behandeld met trypsine en DNase I (d.w.z. tijdens stap 1.4.7 van de verspreidingsprocedure).
LET OP: Formaldehyde is gevaarlijk.
- Dissectie van teelballen van volwassen mannelijke zebravis
- Euthanaseren mannelijke zebravissen (> 60 dpf) door ze onder te dompelen in ijswater. De vissen kunnen worden bewaard in ijswater tot klaar om te ontleden, maar ze moeten zo snel mogelijk worden ontleed.
OPMERKING: De wilde stam AB wordt gebruikt voor deze procedure, maar andere wilde stammen moeten ook vatbaar zijn. De langste tijd hebben we vis gehouden in ijswater voorafgaand aan ontleden is 3 uur zonder merkbaar effect op het protocol. - Onthoofd een vis tegelijk met een kleine schaar en gebruik vervolgens een microschaar om langs de ventrale middellijn te snijden om de lichaamsholte bloot te leggen.
- Ontleed de testis met behulp van tangen (zie Tabel met materialen)op 1,65x vergroting onder een microscoop. Voer de dissecties uit in een petrischaal met siliconen laag met een ondiepe plas 1x PBS.
OPMERKING: De testis bevindt zich tussen de zwemblaas en de darm en lijkt lichter dan spierweefsel(figuur 2A). De testmoet 2 lobben hebben wanneer ze van de zebravis worden verwijderd (figuur 2B). - Verwijder zoveel mogelijk vet en omliggende weefsel uit de testis. Voeg vervolgens elke ontleed testis direct toe aan een 5 mL buis met 2 mL DMEM en blijf op ijs.
OPMERKING: De stappen 1.3.3 en 1.3.4 moeten onder de knie worden voordat er experimenten worden uitgevoerd.
- Euthanaseren mannelijke zebravissen (> 60 dpf) door ze onder te dompelen in ijswater. De vissen kunnen worden bewaard in ijswater tot klaar om te ontleden, maar ze moeten zo snel mogelijk worden ontleed.
- Dissociatie van teelballencellen
- Verwarm 100 mL 0,1 M sacharoseoplossing voor op 37 °C.
- Voeg 200 μL collageenase oplossing toe aan de 5 mL buis met de teelballen. Meng de oplossing door het meerdere keren om te keren.
- Schud de teelballen in een couveuseshaker horizontaal bij 100 tpm bij 32 °C gedurende 50 min tot een uur totdat de DMEM troebel is en de teelballen in kleine stukjes zijn. Keer de buis om de 10 min snel om de dissociatie te vergemakkelijken.
- Om de collageen uit te wassen, voeg DMEM toe aan een laatste 5 mL volume en omkeer de buis een paar keer. Pellet de teelballen op ~ 200 x g voor 3 min bij kamertemperatuur. Verwijder 3 mL van de supernatant, zodat er slechts 2 mL overblijft.
OPMERKING: De toevoeging, verwijdering en overdracht van DMEM gebeurt met plastic overdracht pipetten voor het geheel van de chromosoom spread procedure. - Herhaal stap 1.4.4 twee maal meer voor een totaal van 3 DMEM wasbeurten. Niet opnieuw opschorten van de pellet tussen DMEM wast. Verwijder na de laatste DMEM-wasbeurt 4 mL van de supernatant zodat er slechts 1 mL overblijft.
- Voeg 1 mL DMEM toe voor een totaal volume van 2 mL en voeg 200 μL van de trypsineoplossing en 20 μL DNase I-oplossing toe. Keer de buis een paar keer om de oplossing te mengen.
- Horizontaal schud de buis bij 32 °C voor 5-15 min bij 100 rpm tot de DMEM-oplossing slechts een paar klonten bevat. Keer de buis om de 5 min snel om de dissociatie te vergemakkelijken.
LET OP: De klonten moeten aanzienlijk kleiner zijn na het schudden. - Voeg 500 μL van de trypsineremmeroplossing en 50 μL DNase I-oplossing toe. Keer de buis een paar keer om te mengen, dan kort draaien op ~ 200 x g voor 3 min bij kamertemperatuur om vloeistof of klonten die zich kunnen hechten aan de buis dop of de zijkant van de buis te verwijderen.
- Plaats de buis op ijs en bretel de celvering opnieuw door herhaaldelijk op en neer te stampen met een plastic overdrachtpipet gedurende 2 minuten om de ontkoppeling van eventuele resterende klonten te vergemakkelijken. Laat de celvering niet in de bol van de overdrachtspipet gaan. Na de 2 min, pipetde de vering terug in de 5 mL buis.
- Maak een 100 μm celzeef met DMEM voor en leg deze op een buis van 50 mL op ijs.
- Breng de celvering door de zeef een druppel per keer met behulp van een plastic overdracht pipet. Zorg ervoor dat de celvering niet in de bol van de overdrachtspipet gaat.
- Breng het filtraat met behulp van een plastic overdrachtpipet over op een nieuwe 5 mL-buis en voeg DMEM toe aan een eindvolume van 5 mL. Zorg ervoor dat u de samengevoegde cellen aan de onderkant van het filter verzamelt met een schone plastic overdrachtspipet. Pellet de cellen op ~ 200 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder zoveel mogelijk supernatant zonder de pellet te storen.
- Voeg 5 μL DNase I-oplossing direct toe aan de pellet. Meng vervolgens de pellet met de DNase I oplossing door de buitenkant van de buis 4-5 keer zachtjes te schrapen langs een leeg 1,5 mL microcentrifuge buizenrek. Schrapen te hard kan resulteren in een vermindering van herstelde spreads.
- Voeg DMEM toe aan een eindvolume van 5 mL en meng de oplossing door de buis meerdere keren om te keren. Het is gebruikelijk dat klontjes nog steeds aanwezig zijn na de eerste DNase I behandeling.
- Pellet de cel vering op ~ 200 x g voor 2 min bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 1.4.13-1.4.16 een extra 1-3 keer totdat de opnieuw opschorten pellet niet klontert bij toevoeging van DMEM. Na de laatste spin, verwijder zo veel supernatant mogelijk zonder verstoring van de pellet.
LET OP: Verwacht een vermindering van de korrelgrootte bij elke DNase I-behandeling; meer dan 4 totaal DNase I wast kan leiden tot aanzienlijk verlies van cellen. Als er geen pellet zichtbaar is na de DNase I behandelingen stappen, ga dan niet verder met de procedure. Gooi ongebruikte DNase I weg. - Voeg 1 mL 1x PBS toe en breg de pellet opnieuw op door de buitenkant van de buis voorzichtig te schrapen langs een leeg 1,5 mL buizenrek.
- Pellet de cel vering op ~ 200 x g voor 5 min verwijder dan zo veel supernatant mogelijk zonder verstoring van de pellet.
- Snijd ~ 3 mm van het einde van een 200 μL pipet tip om het diafragma te verbreden en de pellet opnieuw op te schorten in ~ 80 μL van 0,1 M sacharose oplossing door op en neer te paien met de cut pipet tip. Laat de celvering 3 min op kamertemperatuur zitten.
- Het uitspreiden van chromosomen op glasdia's
- Bestrijk één dia met 100 μL formaldehyde met 0,15% Triton X-100 met de zijkant van een pipettip. Voeg vervolgens 18 μL van de sucrose celvering toe aan het midden van de dia in een rechte lijn loodrecht op de lange rand. Kantel de schuif heen en weer (~ 60°) om de verspreiding van de celvering naar alle hoeken te vergemakkelijken.
- Plaats de glijbanen plat in een licht gebarsten open vochtigheidskamer(figuur 3)om te voorkomen dat de formaldehydeoplossing droogt. Plaats de vochtigheidskamer 's nachts in een donkere lade.
- Haal het deksel uit de vochtigheidskamer en laat de glijbanen volledig drogen.
- Plaats de glijbanen in een Coplin-pot en vul de Coplin-pot met gedestilleerd water en broed 5 min uit met zacht schudden bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De dia's kunnen in de Coplin-pot in een zigzagpatroon worden geplaatst om het aantal dia's per Coplin-pot te maximaliseren. Zorg ervoor dat er ruimte is voor vloeistof om tussen alle glijbanen door te geven. - Giet het water uit en vul de pot met 1:250 bevochtigingsmiddel (zie Materiaaltabel). Was 2 keer voor 5 min elk met zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Laat de glijbanen volledig drogen en op te slaan op -20 °C totdat ze zijn gekleurd.
LET OP: De langste hebben we opgeslagen dia's zonder enige merkbare afbraak van de chromosomen is ~ 2 maanden.
2. Telomere PNA-sondekleuring
OPMERKING: Telomere herhalingen kunnen worden gekleurd met behulp van gefluoreerde telomeer PNA-sondes die hybridiseren naar toonaangevende streng telomeerherhalingen (CCCTAA). PNA-sondes hebben een neutrale ruggengraat, wat de hybridisatieaffiniteit met negatief geladen DNA vergroot, wat resulteert in weinig tot geen achtergrond. De telomere indringende stap is optioneel. Om over te gaan tot antilichaam vlekken, hydrateren dia's in 1x PBS zoals aangegeven in stap 2.2.2., ga dan direct naar "Primaire antilichaam vlekken".
-
Maak de PNA-sonde reagentia voordat u begint met de telomeervlekken
OPMERKING: Het is handig om de volgende oplossingen voor te bereiden in de hoeveelheden die zijn opgegeven voor gebruik in toekomstige experimenten. De opslagvoorwaarden worden hieronder vermeld.- Bereid 2 L van 20x zout-natriumcitraat (SSC) oplossing voor met een eindconcentratie van 3 M NaCl en 0,3 M natriumcitraat. Autoclave en op te slaan bij kamertemperatuur.
- Maak 50 mL pre-hybridisatieoplossing met overdrachtRNA tot een eindconcentratie van 50% formamide, 5x SSC, 50 μg/mL heparine, 500 μg/mL transfer RNA, 0,1% Tween 20 en voeg 460 μL citroenzuur toe om de oplossing naar pH ~6 te brengen. Bewaar bij -20 °C.
LET OP: Formamide is gevaarlijk. Bereid de oplossing voor in een rookkap. - Maak 50 mL pre-hybridisatie oplossing voorbereid op dezelfde manier als in stap 2.1.2 zonder toevoeging van overdracht RNA. Bewaar bij -20 °C.
- PNA telomere sondes TelC-Cy3 en TelC-Alexa647 worden volgens de instructies van de fabrikant voorbereid als 50 μM-voorraden in formamide. Bewaar de PNA-sondes als 8 μL aliquots bij -80 °C.
- Maak ten minste 1 mL van 100 mg/mL voorraadoplossing van runderserumalbumine (BSA) in steriel gedestilleerd water. Bewaar bij -20 °C. Als het voorbereiden van meer dan 1 mL voorraad BSA, bewaar de oplossing als 1 mL aliquots.
- Bereid met behulp van een 2 mL-buis 2 mL hybridisatieoplossing voor door 27 μL van 100 mg/mL BSA en 8 μL van 50 μM PNA-sonde toe te voegen aan 1,965 mL pre-hybridisatieoplossing die overdrachtsRNA bevat. Bewaar in het donker bij -20 °C.
-
PNA telomere sonde kleuring
- Verwarm de hybridisatieoven voor op 82 °C.
- Hydraterende glijbanen met 500 μL 1x PBS per dia gedurende 5 min in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur. Verwijder de PBS door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken.
- Verwarm de glijbanen en de 2 mL buis met de hybridisatieoplossing direct op een metalen oppervlak in de verwarmde hybridisatieoven gedurende 2 min.
- Terwijl u de glijbanen op het metalen oppervlak houdt, voegt u 100 μL van de hybridisatieoplossing per dia toe en bedek vervolgens de dia's met plastic afdekkingen (~ 25 mm x 75 mm) die uit een autoclavezak zijn gesneden. Laat dia's 10-12 min bij 82 °C zitten.
- Plaats de glijbanen in een vochtigheidskamer in het donker bij 37 °C gedurende 16-24 uur. Vanaf dit punt naar voren en voor de primaire en secundaire antilichaamkleuring moeten de dia's in het donker worden bewaard om fotobleken van het fluorescentiesignaal te voorkomen. Na de incubatietijd kunnen de reagentia voor vlekken van antilichamen worden voorbereid tijdens stap 2.2.9.
- Verwijder de afdekkingen met een pipettip.
OPMERKING: Om het verwijderen van de coverslip te vergemakkelijken, kan ~50-100 μL van de hybridisatieoplossing zonder overdrachtRNA voorzichtig tussen de dia en de coverslip worden afgegeven wanneer de coverslip wordt opgeheven. - Pipetteer 500 μL pre-hybridisatieoplossing zonder overdrachtsRNA op elke dia en plaats de dia's in de vochtigheidskamer gedurende 15 min op kamertemperatuur. Verwijder de oplossing door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken.
OPMERKING: De pre-hybridisatieoplossing zonder overdrachtsRNA wordt niet voorverwarmd voordat deze aan elke dia wordt toegevoegd. - Pipetteer 500 μL van 50% pre-hybridisatie oplossing zonder overdracht RNA in 1x PBS aan elke dia en plaats de dia's in de vochtigheidskamer gedurende 15 min op kamertemperatuur. Verwijder de oplossing door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken.
- Breng de glijbanen over op een Coplin-pot en was 3 keer in 1x PBS met een zachte trilbeurt van 15 min per wasbeurt bij kamertemperatuur.
- Haal de glijbanen uit de Coplin-pot en verwijder overtolligpbs door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken. Ga dan verder naar stap 3.2 "Primaire antilichaamkleuring".
3. Vlekken van antilichamen
OPMERKING: Antilichamen die zijn verhoogd tot bekende meiotische eiwitten kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentiedetectie in verspreidingschromosoompreparaten. Secundaire antilichamen die aan verschillende fluorophoren worden geconjugeerd, maken het mogelijk om meerdere eiwitten tegelijkertijd te bereiken, als de primaire antilichamen bij verschillende dieren werden gekweekt.
-
Maak de volgende oplossingen op de dag van de primaire en secundaire antilichaamkleuring
- Maak 1 L PBT met 1x PBS en 0,1% Triton X-100 verdund in gedestilleerd water. Bewaar op kamertemperatuur. Dit kan van tevoren en in grote hoeveelheden worden voorbereid voor toekomstige verspreidingsexperimenten.
- Bereid 500 μL antilichaamblok per dia voor op een eindconcentratie van 2 mg/mL BSA en 2% geitenserum in PBT.
- Als u 100 μL primaire of secundaire antilichaammix per dia wilt maken, voegt u de juiste antilichamen bij de juiste concentratie (zie Materiaaltabel)toe aan het antilichaamblok.
OPMERKING: De concentratie van antilichamen moet mogelijk empirisch worden bepaald. In de discussie nemen we een lijst op van antilichamen die we met succes hebben geprobeerd (met verdunning/concentraties) en de antistoffen die we zonder succes hebben geprobeerd.
-
Primaire vlekken van antilichamen
OPMERKING: Konijn anti-menselijke SCP3 en kip anti-zebravis Sycp1 worden meestal gebruikt voor primaire antilichaam vlekken.- Voeg na het verwijderen van overtollig PBS van de glijbanen 500 μL antilichaamblok per dia toe en plaats de glijbanen minimaal 20 min in een vochtigheidskamer op kamertemperatuur.
- Verwijder het antilichaamblok door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken.
- Voeg 100 μL primaire antilichaammix toe in antilichaamblok per dia en bedek de glijbanen met een plastic coverslip gemaakt van een autoclavezak. Plaats de glijbanen 's nachts in een vochtigheidskamer op 4 °C.
- Verwijder de afdekkingen met een pipettip en was de glijbanen 2 keer gedurende minimaal 5 minuten met 1x PBS in een Coplin-pot met zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Verwijder de PBS door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken.
-
Secundaire antilichaamkleuring
OPMERKING: Geconjugeerde geitenanti-konijn en anti-kip antilichamen tegen verschillende fluorophoren worden gebruikt voor vlekken bij een 1:1000 concentratie.- Voeg 500 μL antilichaamblok per dia toe en plaats de glijbanen in de vochtigheidskamer minimaal 5 min op kamertemperatuur.
- Verwijder het antilichaamblok door op de zijkant van de glijbaan op een papieren handdoek te tikken.
- Voeg 100 μL secundaire antilichaammix toe in antilichaamblok per dia en bedek de glijbanen met een plastic coverslip gemaakt van een autoclavebag. Plaats de glijbanen in een vochtigheidskamer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Verwijder de afdekkingen met een pipettip en was de glijbanen 3 keer voor minimaal 5 min elk met 1x PBS in een Coplin-pot met zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Spoel de glijbanen een keer voor een minimum van 2 min met gedestilleerd water in een Coplin pot met zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Lucht droog toveren de glijbanen gekanteld, om het drogen te vergemakkelijken.
- Plaats 20 μL anti-fade mountant met of zonder DAPI (zie Tabel met materialen)als 3 gelijkmatig gespreide stippen op glazen afdekkingen (24 mm x 60 mm).
- Plaats de dia's naar beneden op de glazen coverslippen en sluit de coverslippen af met nagellak op de rand die het berijpte uiteinde van de glijbaan overlapt.
- Bewaar de voorbereide glijbanen op 4 °C tot ze klaar zijn voor beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben een methode geschetst om zebravis spermatocyten verspreidingspreparaten voor te bereiden en te visualiseren. Wanneer correct uitgevoerd, onze procedure levert goed verspreid, niet-overlappende kernen. Om dergelijke kernen te herstellen, is het belangrijk om de juiste hoeveelheid uitgangsmateriaal te hebben (d.w.z. teelballen), teelballen te behandelen voor een voldoende lange tijd in trypsine en een voldoende aantal DNase I-behandelingen. Deze spreads kunnen vervolgens worden gekleurd voor telomeren en meiotic proteïnen om meiotische progressie te bestuderen tijdens profase I. Figuur 1 toont voorbeelden van spreadpreparaten gekleurd voor chromosomale kenmerken in verschillende stadia van profase I. Figuur 4 illustreert een voorbeeld van slecht verspreide kernen.
Figuur 1: Representatieve superresolutiebeelden van chromosoomverspreidingspreparaten die zijn gekleurd met PNA en antilichaamsondes. (A) Schematisch van het synaptonemal complex. (B) Een gesynapseerd paar homologs met het chromosoomaseiwit Sycp3 (groen), het transversale filamenteiwit Sycp1 (rood) en DNA (Blauw) dat wordt weergegeven door structurele verlichtingsmicroscopie (SIM) met behulp van een 100x-doelstelling. De schaalbalk = 1 μm. (C) De panelen aan de linkerkant tonen drie fasen van meiotische profase: leptotene (boven), early-zygotene (midden) en pachytene (onder). De schaalbalk = 5 μm. Rechts: representatieve afbeeldingen met telomeren (magenta) voor elke fase. De schaalbalk = 1 μm. De cijfers zijn aangepast van Blokhina et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van zebravistetesten (~ 7 maanden na bevruchting). (A) Afbeelding toont de relatieve locatie van de testis binnen de zebravissen. De test is zit tussen de zwemblaas en de darm. b) De lengte van een testis. Jongere zebravis zal kleinere teelballen hebben. Voor chromosoomspreads, verwijder zoveel mogelijk vet en omliggende weefsel uit de testis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vochtigheidskamer voor dia's. Onze vochtigheidskamer is gemaakt met behulp van een polystyreen schuimdoos (21 cm x 19 cm x 6 cm) ontworpen om elektroporatiecuvettes te verschepen. We plaatsten natte dunne weefseldoekjes (zie Tabel met materialen)in elke andere groef. De glijbanen worden plat op de nok geplaatst zonder de natte doekjes aan te raken. Er is ook een commerciële vochtigheidskamer beschikbaar (zie Materiaaltabel). Wij stellen ons voor dat elke polystyreen schuimdoos die is uitgerust met ribbels en groeven (bijvoorbeeld met behulp van glaspipetten13)kan worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van spreads van slechte kwaliteit als gevolg van onvoldoende DNase I behandelingen. Meiotic chromosomen gekleurd voor Sycp3 afgebeeld door SIM met behulp van een 20x doelstelling. Onvoldoende DNase I behandelingen leidt tot overlappende kernen als gevolg van een viskeuze sucrose cel suspensie die voorkomt dat cellen goed verspreiden op de dia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van chromosoomspreads met behulp van een alternatieve methode11. Meiotic chromosomen gekleurd voor Sycp3 (groen) en Sycp1 (rood). Chromosoom spreads werden voorbereid zoals beschreven door Sansam en Pezza11. Deze methode kan worden uitgevoerd met behulp van individuele zebravissen in plaats van de verschillende zebravissen die nodig zijn voor ons protocol. In onze handen is het gebruikelijk om chromosomen te zien die niet goed verspreid zijn. Er is ook een merkbare toename van de achtergrond kleuring die het gevolg is van puin dat wordt achtergelaten op de dia's tijdens de chromosoom verspreiding procedure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we methoden om de locatie van telomeren en chromosoom-geassocieerde eiwitten in nucleaire oppervlakte spreads van spermatocyten geïsoleerd van zebravis tetesten sonde. We verwachten dat deze methoden van toepassing zullen zijn voor de analyse van spermatocyten in andere teleostsoorten met aanpassing aan de grootte van de testis.
Hoewel slechts een paar antilichamen zijn verhoogd tot zebravis meiotic eiwitten, hebben we succes gehad met behulp van de volgende antilichamen verhoogd tot menselijke (h) of muis (m) eiwitten. Ons lab heeft antilichamen aan zebravissen Sycp1 eiwit (zfSycp1) in kip opgeheven die als betrouwbare teller voor synaptonemal complex (SC) heeft gediend, echter, is dit eiwit aanwezig slechts van vroeg zygotene aan recente pachytene, wanneer de chromosomen volledig synapsen zijn. Het konijn anti-hSYCP3 antilichaam is zeer betrouwbaar geweest om meiotische chromosoomassen van leptotene op te sporen tot de ontbinding van de SC in het late pachytene (figuur 1B,C). Met name hebben we geen klassieke diploteenfase waargenomen met door Sycp3 gedefinieerde bijlen over de volledige lengte en de afwezigheid van Sycp1, wat erop wijst dat, in tegenstelling tot bij de muis, de assen kunnen worden afgebroken na het verlaten van pachytene3. Andere commercieel beschikbare antilichamen tegen m, h of zf meiotic eiwitten die positieve resultaten hebben gegeven ook DNA recombinatie / replicatie konijn anti-hRAD51 en konijn anti-hRPA. De bron van elk antilichaam en de gebruikte verdunning is opgenomen in de Materiaaltabel. Degenen die we hebben geprobeerd zonder succes met behulp van ten minste drie verschillende verdunningen omvatten geit anti-hDMC1, muis anti-hMlh1, muis anti-hamster Sycp3, muis anti-hRPA.
Er zijn drie kritieke stadia van de chromosoomverspreidingsprocedure. De eerste is het verzamelen van de juiste hoeveelheid materiaal. Vijftien intacte teelballen moeten voldoende zijn voor het verspreidingsprotocol voor ~ 6 mpf mannetjes, en dit aantal kan omhoog of omlaag worden aangepast, afhankelijk van de grootte van de dieren. Houd er rekening mee dat sommige meiotische mutanten kleinere teelballen zullen hebben, dus er moeten 2 extra dieren worden gebruikt. De tweede belangrijke stap is de dissociatie van cellen. Tijdens trypsine spijsvertering, als de teelballen niet scheiden in kleine klonten, is het waarschijnlijk dat te weinig cellen zullen worden hersteld van de verspreidingsprocedure. Een derde belangrijke stap is de aanwezigheid van een zichtbare pellet na de DNase I behandelingen. Als een pellet niet zichtbaar is, is het waarschijnlijk dat de verspreidingsprocedure weinig tot geen kernen zal opleveren. Verlies van een pellet kan ontstaan als er te weinig dieren worden gebruikt of als er te veel DNase I wasbeurten worden uitgevoerd. Aan de andere kant kunnen te weinig DNase I-behandelingen resulteren in een viscid sucrosecelsuspensie, waardoor cellen zich niet op de dia verspreiden (figuur 4). Het is belangrijk om DNase I-behandelingen (voor maximaal 4 behandelingen) te blijven uitvoeren totdat er geen klonten meer aanwezig zijn bij toevoeging van DMEM.
De gepresenteerde chromosoomverspreidingstechniek levert honderden goed verspreide kernen per dia op. Met behulp van deze procedure hebben we een gedetailleerde analyse kunnen geven van belangrijke gebeurtenissen tijdens zebravissen spermatogenese met behulp van super-resolutie microscopie3. In onze handen, dit protocol heeft gegenereerd beter verspreid chromosomen, met minder puin op de dia, en minder achtergrond kleuring in vergelijking met snellere methoden met behulp van enkele dieren beschreven door Moens14 en Sansam en Pezza11 (Figuur 5). Deze verschillen zijn waarschijnlijk te wijten aan het gebruik van collageenase, trypsine, en DNase behandelingen in ons protocol. Twee beperkingen van onze techniek zijn de eis van het gebruik van 10-20 volwassen zebravissen mannetjes en de meer moeizame enzym behandelingen en wassen stappen. Als detectie van superresolutie niet nodig is, als het zebravismateriaal beperkt is of als meer dan twee omstandigheden parallel worden getest, kunnen de snellere methoden geschiktere alternatieven zijn14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Trent Newman en Masuda Sharifi voor opmerkingen over het manuscript en An Nguyen voor het helpen optimaliseren van methoden voor het verspreiden en bevlekken van chromosomen van zebravissen meiocyten. Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM079115 toegekend aan S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
