Summary
核表面の拡散は、間見下がれの間に染色体の事象を研究するために不可欠なツールです。ゼブラフィッシュの精子から前相Iの間にマイオサイト染色体を調製し、可視化する方法を実証する。
Abstract
Meiosisは、性的生殖のためのハプロイドの解球を作成するために必要な重要な細胞プロセスです。モデル生物は、ペアリング、シナプス、適切な染色体分離を保証する組み換えイベントなど、マイオティックの前相中に起こる染色体事象を理解するのに役立っています。マウスは、これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解するための重要なモデルであったが、このシステム内のすべてのマイオティック事象は人間のマイオーシスに類似しているわけではない。我々は最近、ヒト精子形成のモデルとしてゼブラフィッシュのエキサイティングな可能性を実証した。ここでは、染色体広がり製剤におけるマイオサイト染色体および関連タンパク質を可視化する方法について詳しく説明します。これらの製剤は、染色体構造の高解像度分析を可能にするという利点を有する。まず、成体ゼブラフィッシュから精巣を解剖し、続いて細胞解離、分解、染色体の広がりについて説明する。次に、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)による生声染色体タンパク質の局在を検出する方法について、免疫蛍光検出、および核酸配列を挙げる。これらの技術はゼブラフィッシュ系におけるマイオティッククロマチンアーキテクチャの細胞学的分析に有用なツールセットを含む。ゼブラフィッシュコミュニティの研究者は、これらの技術を迅速に習得し、生殖機能の標準的な分析に組み込むことができるはずです。
Introduction
性的生殖は、2つのハプロイド・アプタの組み合わせを通して進行し、それぞれが体細胞の染色体補体の半分を運ぶ。Meiosisは、DNA複製の1ラウンドと染色体分離の2つの連続したラウンドを通じてハプロイドのアホテを生成する特殊な細胞分裂である。前相Iでは、相同染色体(ホモログ)は、対合、組換え、およびシナプス化を受けなければならないが、後者は、横断フィラメントによって架橋された2つの相同軸を含むシナプトン複合体の形成によって特徴付けられる、Sycp1(図1A、B)。これらのプロセスを適切に実行しないと、人間の流産の主な原因である異常の多い球体の生産につながる可能性があります1.組み合わせ、組換え、シナプスの間の協調に関する我々の知識は、酵母、C.エレガンス、マウス、ショウジョウバエなどの幅広い生物の研究によって促進されてきた2。相同染色体の組み合わせの一般的なプロセスは、分離が続くが十分に保存されているが、組換えとシナプス化への依存性とこれらのイベントの順序は異なります。
相同の組換えを開始するマイオティック二重鎖破断(DSB)形成は、レプトテンおよびシナプスの間に花束に集まったテロメアの近くで発生し、シナプスは3、4の直後に続く。DSB形成およびシナプス開始のこの構成はまた、ヒトにおける男性のマイオシスの特徴であるが、マウス5、6、7、8では、 ゼブラフィッシュがヒト精子形成のモデルとして役立つことを示唆している。ゼブラフィッシュのマイオーザ症を研究するいくつかの実用的な利点もあります。男性と女性の両方が成人期を通じてゲーム形成を受け、生殖腺は簡単にアクセスでき、何百もの子孫が単一の十字架から生成されます。さらに、胚は透明であり、外部的に発達し、これは、異常体素3、9による胚発生における収差の早期発見を容易にする。ゼブラフィッシュを使用することの欠点は、性的成熟度(約60日)に達するのが遅く、核表面に必要な物質の量は、その大きさに応じて〜10〜20匹の成虫動物から収集されなければならないということです。
マイオティック染色体広がり製剤は、マイオティック染色体ダイナミクスの主要なシグネチャを調べることができるので、すべてのモデル生物間で染色体ダイナミクスを研究するための重要なツールです。ゼブラフィッシュでは、マイオティックプログラムと核組織の進行の重要な側面は、魚3、4、9、10、12によるタンパク質および/または核酸の免疫蛍光検出のための抗体を用いて、ここで染色体拡散と呼ばれる核表面広がりを探査することによって解剖されてきた。実際、花束中のクラスター化テロメアの偏光局在化は、スプレッド製剤中に保存することができる(図1C)。最近では、ゼブラフィッシュの精子染色体を蛍光検出法や超解像顕微鏡法とともに用い、ゼブラフィッシュテロメアダイナミクス、相同染色体の組み合わせ、二重鎖破壊局在化、および主要なマイオティック遷移におけるシナプスの詳細な進行を解明した。ここではゼブラフィッシュ精巣の精子から発色広がりの染色体を調製し、続いて蛍光ペプチド核酸(PNA)プローブで染色し、染色体関連タンパク質の繰り返しテロメア配列と免疫蛍光検出を行う方法を紹介します。
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Protocol
ゼブラフィッシュを含むすべての方法は、UCデイビスの機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された倫理基準を使用して行われました。
1. 染色体の拡散手順
注: 次のプロトコルは、スライドごとに数百個のマイオティック核が広がる 4 ~ 6 枚のスライドを作成するように設計されています。使用される精巣の数は、魚の大きさによって異なります。受精後60日(dpf)で20匹、受精後6ヶ月(mpf)で15匹を使用することを期待してください。大きなゼブラフィッシュ(例えば、12mpf)の場合は10匹の動物で十分であるべきである。いくつかのマイオティック変異体(例えば、spo11-/-)の精巣は、やや小さい3になります。このプロトコルでは、1 つのテスト プールが 1 つのサンプルと見なされます。並列で4個以下のサンプルを用意することをお勧めします。
- 展開手順を開始する前に、次のソリューションを作成します。
注: 将来の拡散実験で使用するために指定された量で次のソリューションを準備すると便利です。- 蒸留水100mLに3.42gのスクロースを溶解して0.1Mスクロース溶液を調製する。スクロース溶液をpH 8に持ち込み、pH 8でもある1 M Tris-HClを使用します。次いで、スクロース溶液をフィルター滅菌する。常温で保管してください。
- 1.37 M NaCl、27 mM KCl、73 mM Na2HPO 4、27.6 mMKH2 PO4の最終濃度の 1.8 L の蒸留水に 10 倍のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ストック溶液を作ります。溶けるまでかき混ぜ、NaOHとオートクレーブを使用してpHを7.3に調整します。常温で保管してください。
- 滅菌蒸留水で400 μg/mL DNase I溶液を作ります。-20 °Cで保管してください。この溶液の5 mLを準備し、100 μLのアリコートとして保存することをお勧めします。
- プロトコルの拡散日に以下の解決策を作る
注:時間効率のために、すべての精巣を解剖した直後にコラゲラーゼ溶液を作り、サンプルがコラゲラーゼで処理されている間にトリプシンとトリプシン阻害剤溶液を作ることをお勧めします。- サンプルあたり200μLのDulbeccoの変性イーグル培地(DMEM)に4mgのコラゲラーゼを溶解します(2%w/vコラゲラーゼ最終濃度)。必要になるまで氷の上に置いてください。コラゲナーゼは精巣を解き出します。
- 1サンプルあたり200μLのDMEM(0.7%w/vトリプシン最終濃度)に1.4mgのトリプシンを溶解します。必要になるまで氷の上に置いてください。トリプシンは、細胞の解の関連付けを解除するのに役立ちます.
- トリプシン阻害剤の10mgをサンプルあたり500μLのDMEMに溶解する(2%w/vトリプシン阻害剤最終濃度)。必要になるまで氷の上に置いてください。トリプシン阻害剤は、トリプシンが細胞を分解するのを防ぎます。
- 1%ホルムアルデヒド溶液(16%の予め作り溶液から)を0.15%トリトンX-100で滅菌蒸留水で調製する。必要になるまで氷の上に置いてください。1%ホルムアルデヒドは、精巣がトリプシンおよびDNase Iで処理されている間に調製することができる(すなわち、広がり手順のステップ1.4.7の間)。
注意:ホルムアルデヒドは危険です。
- 成雄ゼブラフィッシュからの精巣の解剖
- オスのゼブラフィッシュ(>60dpf)を氷水に沈めることによって安楽死させる。魚は解剖する準備ができるまで氷水に入れておくことができますが、できるだけ早く解剖する必要があります。
注: この手順では野生型ひずみ AB が使用されますが、他の野生型株もまた、適している必要があります。解剖前に氷水に魚を保管している最長の時間は、プロトコルに顕著な影響を与えることなく3時間です。 - 小さなはさみで一度に1匹の魚を切断し、マイクロハサミを使用して腹側の正線に沿って切断し、体腔を露出させます。
- 顕微鏡で1.65倍の倍率で鉗子(材料の表を参照)を使用して精巣を解剖する。1x PBSの浅いプールで覆われたシリコーンコーティングされたペトリ皿で分節を行います。
注:精巣は水泳膀胱と腸の間にあり、筋肉組織よりも軽く見えます(図2A)。ゼブラフィッシュから除去すると、精巣には2つのローブが必要です(図2B)。 - 精巣からできるだけ多くの脂肪および周囲の組織を除去する。次に、解剖された各精巣を2mLのDMEMを備えた5 mLチューブに直接加え、氷の上に置く。
注: 実験を行う前に、ステップ 1.3.3 および 1.3.4 をマスターする必要があります。
- オスのゼブラフィッシュ(>60dpf)を氷水に沈めることによって安楽死させる。魚は解剖する準備ができるまで氷水に入れておくことができますが、できるだけ早く解剖する必要があります。
- 精巣細胞の解離
- 0.1Mスクロース溶液を37°Cに予温100mL。
- 5 mLチューブに200μLのコラゲアーゼ溶液を添加します。溶液を数回反転させることで混合します。
- DMEMが曇り、精巣が小さな塊になるまで、32°Cで100rpmで精巣を50分から1時間水平にゆるめます。解離を容易にするために、10分ごとにチューブを急速に反転します。
- コラゲナーゼを洗い流すために、最終的な5mLの容積にDMEMを加え、チューブを数回反転します。精巣を室温で3分間~200 x gでペレットする。上清の3 mLを取り除き、2 mLだけ残るようにします。
注:DMEMの添加、除去、および移動は、染色体拡散手順の全体のためのプラスチック移動ピペットで行われます。 - 合計 3 回の DMEM の処理について、手順 1.4.4 を 2 回繰り返します。DMEM の間でペレットを再サスペンドしないでください。最後のDMEM洗浄の後、1 mLだけ残るように上清の4 mLを取り除きます。
- 総容量2 mLのDMEMを1 mL加え、200 μLのトリプシン溶液と20 μLのDNase I溶液を加えます。溶液を混合するためにチューブを数回反転します。
- DMEM溶液が数個の束を含むまで、100rpmで32°Cでチューブを5〜15分間水平に振ります。解離を容易にするために、チューブを5分ごとに急速に反転します。
注:束は、揺れた後はかなり小さくする必要があります。 - トリプシン阻害液500μL、DNase I溶液50μLを添加します。チューブを数回反転して混合し、室温で3分間〜200 x gで短時間スピンダウンし、チューブキャップまたはチューブの側面に付着する可能性のある液体または塊を除去します。
- チューブを氷の上に置き、残りの塊の解離を容易にするために、プラスチックトランスファーピペットで上下に2分間繰り返しピペットを回して細胞懸濁液を再懸濁します。細胞懸濁液を転写ピペットの球根に入れないようにしてください。2分後、懸濁液を5mLチューブに戻します。
- 100 μmの細胞ストレーナーをDMEMで予め濡らし、50mLのチューブの上に置きます。
- プラスチックトランスファーピペットを使用して、ストレーナーを通して細胞懸濁液を一滴ずつ移します。セル懸濁液が転写ピペットの球根に入らないようにします。
- プラスチックトランスファーピペットを使用してフィレットを新しい5 mLチューブに移し、DMEMを最終体積5 mLに追加します。きれいなプラスチックトランスファーピペットでフィルターの下側に取り付けられたプールされたセルを収集してください。細胞を室温で5分間~200 x gでペレットする。
- ペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を取り除く。
- 5 μLのDNase I溶液をペレットに直接加えます。次に、空の1.5 mLマイクロ遠心管ラックに沿ってチューブの外側底を4〜5回静かに削り取り、ペレットをDNase I溶液と混合します。あまりにも過酷な削り取りは、回収されたスプレッドの減少につながる可能性があります。
- 5 mLの最終体積にDMEMを追加し、数回チューブを反転させることによって溶液を混合します。最初のDNase I治療の後も塊がまだ存在するのが一般的です。
- 細胞懸濁液を室温で2分間~200xgでペレット化する。
- DMEM の追加時に再懸濁されたペレットが凝集しなくなるまで、手順 1.4.13-1.4.16 を 1 ~3 回追加します。最後のスピンの後、ペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を取り除く。
注:すべてのDNase I処理でペレットサイズの縮小を期待してください。4を超えるDNase私は、細胞の著しい損失をもたらす可能性があります。DNase I 処理手順の後にペレットが見えない場合は、手順を進めないでください。未使用の DNase I を破棄します。 - 1 mL の 1 mL の PBS を追加し、空の 1.5 mL チューブ ラックに沿ってチューブの外側の底を軽く削り取ってペレットを再サスペンドします。
- 細胞懸濁液を~200 x gで5分間ペレットし、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を除去する。
- 200μLピペットチップの端から~3mm切り、切りピペットチップを上下にピペットでピペットし、0.1Mスクロース溶液の80μL近くでペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を室温で3分間座らせます。
- ガラススライド上に染色体を広げる
- 100 μLの100μLのホルムアルデヒドを0.15%トリトンX-100でピペットチップの側面にコーティングします。次に、スクロースセル懸濁液を長辺に垂直に直線でスライドの中心に18μL加えます。すべてのコーナーにセルサスペンションの広がりに容易にするために、スライドを前後(〜60°)に傾けます。
- スライドを少しひび割れた開いた湿室(図3)に平らにして、ホルムアルデヒド溶液が乾燥するのを防ぎます。湿度室を暗い引き出しに一晩置きます。
- 湿度室から蓋を取り外し、スライドを完全に乾燥させます。
- スライドをCoplinジャーに入れ、Coplinジャーに蒸留水を入れ、室温で穏やかに振るう5分間インキュベートします。
注:スライドは、コプリン瓶当たりのスライド数を最大化するためにジグザグパターンでCoplin瓶に入れることができます。すべてのスライド間に液体が入るスペースがあることを確認します。 - 水を注ぎ、瓶に1:250の濡れ剤を入れます(材料の表を参照)。室温で穏やかに振とうして、それぞれ5分間2回洗います。
- スライドが完全に乾燥し、それらが染色されるまで-20°Cで保存します。
注:染色体の顕著な劣化なしにスライドを保存した最長は〜2ヶ月です。
2. テロメアPNAプローブ染色
注:テロメア反復は、主要な鎖テロメア反復(CCCTAA)にハイブリダイズするフルオロフォア共役テロメアPNAプローブを使用して染色することができます。PNAプローブは中性のバックボーンを有し、陰電性DNAに対するハイブリダイゼーション親和性を高め、ほとんどまたは全くバックグラウンドを生じない。テロメア探査ステップはオプションです。抗体染色に進むために、ステップ2.2.2.で示された1x PBS中のスライドを再水和し、「一次抗体染色」に直接進む。
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テロメア染色を開始する前にPNAプローブ試薬を作る
注: 将来の実験で使用するために指定された量で次のソリューションを準備すると便利です。保管条件は以下に記されている。- 20Xの生理塩水ナトリウム(SSC)溶液の2Lを、最終濃度3M NaClおよび0.3Mクエン酸ナトリウムで調製する。オートクレーブと室温で保存します。
- 50%のホルマミド、50%のSSC、50 μg/mLヘパリン、500 μg/mLトランスファーRNA、0.1%Tween 20、460 μLの460 μLを加えてpH〜6に溶液を持って来る50%のホルマミド、50 μg/mLヘパリンの最終濃度にRNAを含む前ハイブリダイゼーション溶液を50mL作ります。-20 °Cで保管してください。
注意:ホルムアミドは危険です。ヒュームフードで溶液を準備します。 - トランスファーRNAを添加せずに、ステップ2.1.2と同じ方法で50 mLのハイブリダイゼーション前溶液を調製します。-20 °Cで保管してください。
- PNAテロメアプローブTelC-Cy3とTelC-Alexa647は、メーカーの指示に従って、フォルマミドの50 μMの株式として調製されます。PNAプローブを8μLアリコットとして-80°Cに保存します。
- 無菌蒸留水中のウシ血清アルブミン(BSA)の100mg/mLストック溶液の少なくとも1 mLを作ります。-20 °Cで保管してください。ストックBSAの1mL以上を調製する場合は、溶液を1mLアリコートとして保存します。
- 2 mLチューブを使用して、27 mg/mL BSAの27 μLと50 μM PNAプローブの8 μLをトランスファーRNAを含む1.965 mLの前ハイブリダイゼーション溶液に添加して、2 mLのハイブリダイゼーション溶液を調製します。-20°Cの暗闇の中に保管してください。
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PNAテロメアプローブ染色
- ハイブリダイゼーションオーブンを82°Cに予熱します。
- 室温で湿度チャンバーで5分間、スライドあたり500 μLの1x PBSでスライドを再水和します。ペーパータオルのスライドの側面をタップして、PBSを取り外します。
- スライドとハイブリダイゼーション溶液を含む2 mLチューブを金属表面に直接加熱したハイブリダイゼーションオーブンで2分間加熱します。
- スライドを金属表面に置きながら、スライドごとにハイブリダイゼーション溶液を100μL追加し、オートクレーブバッグから切り取ったプラスチック製のカバースリップ(約25mm x 75mm)でスライドを覆います。スライドを82°Cで10〜12分間座らせます。
- 16-24時間37°Cの暗闇の中で湿気室にスライドを置きます。この時点から、一次抗体および二次抗体染色のために、スライドは蛍光シグナルの光無色化を避けるために暗闇の中に保たれなければならない。インキュベーション期間後、抗体染色用試薬は、ステップ2.2.9の間に調製することができる。
- ピペットの先端でカバースリップを取り外します。
注:カバースリップの除去を容易にするために、転写RNAのないハイブリダイゼーション溶液の~50~100μLを、カバースリップが解除される間、スライドとカバースリップの間に静かに分配することができます。 - ピペット500 μLのプレハイブリダイゼーション溶液と各スライドにRNAを転写しない、室温で15分間湿度室にスライドを置きます。ペーパータオルのスライドの側面をタップして、溶液を取り外します。
注:転写RNAのないプリハイブリダイゼーション溶液は、各スライドに添加される前に事前加熱されません。 - ピペット500μLの50%プレハイブリダイゼーション溶液、1x PBSのトランスファーRNAを各スライドにトランスファーし、室温で15分間湿度チャンバーにスライドを置きます。ペーパータオルのスライドの側面をタップして、溶液を取り外します。
- スライドをCoplinジャーに移し、室温で1回15分間穏やかに揺れながらPBS1xで3回洗います。
- コップリンジャーからスライドを取り出し、ペーパータオルのスライドの側面をタップして余分なPBSを取り除きます。次にステップ3.2「一次抗体染色」に進みます。
3. 抗体染色
注:既知のマイオティックタンパク質に対して育てられた抗体は、広がる染色体調製物における免疫蛍光検出に使用することができます。異なるフルオロフォアに結合した二次抗体は、一次抗体が異なる動物で飼育された場合に、複数のタンパク質を同時に染色することを可能にする。
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一次抗体および二次抗体染色の日に以下の解決策を作る
- 1x PBSでPBTの1 Lを作り、0.1%トリトンX-100を蒸留水で希釈します。常温で保管してください。これは、将来の拡散実験のために、事前に、大量に準備することができます。
- PBTで2mg/mLの最終濃度である2 mg/mLの最終濃度まで、スライド当たり500μLの抗体ブロックを調製します。
- スライドごとに100 μLの一次抗体または二次抗体ミックスを作成するには、適切な抗体を正しい濃度で追加し(材料表を参照)抗体ブロックに入れます。
注:抗体濃度は、経験的に決定する必要があります。議論では、我々は成功して試みた抗体のリストを含む(希釈/濃度で)、我々は成功せずに試みたもの。
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一次抗体染色
注:ウサギの抗ヒトSCP3および鶏抗ゼブラフィッシュSycp1は、通常、一次抗体染色に使用されます。- スライドから余分なPBSを除去した後、スライドあたり500μLの抗体ブロックを加え、最低20分間室温の湿度室にスライドを置きます。
- ペーパータオルのスライドの側面をタップして、抗体ブロックを取り外します。
- スライドごとに100 μLの一次抗体ミックスを抗体ブロックに追加し、オートクレーブバッグから作られたプラスチック製のカバースリップでスライドを覆います。4 °Cの湿度チャンバーにスライドを一晩置きます。
- ピペットチップでカバースリップを取り出し、室温で穏やかに揺れるCoplin瓶に1x PBSでそれぞれ最低5分間スライドを2回洗います。
- ペーパータオルのスライドの側面をタップして、PBSを取り外します。
-
二次抗体染色
注:結合ヤギ抗ウサギと抗鶏抗体を異なる蛍光体に対して、1:1000濃度で染色するために使用されます。- スライドあたり500μLの抗体ブロックを追加し、最低5分間室温で湿度室にスライドを置きます。
- ペーパータオルのスライドの側面をタップして、抗体ブロックを取り外します。
- スライドごとに抗体ブロックに100μLの二次抗体ミックスを加え、オートクレーブバッグから作られたプラスチック製のカバースリップでスライドを覆います。37 °Cで1時間湿度チャンバーにスライドを置きます。
- ピペットチップでカバースリップを取り外し、室温で穏やかに揺れるCoplin瓶に1x PBSでそれぞれ最低5分間スライドを3回洗います。
- 室温で穏やかに揺れるコプリン瓶に蒸留水で最低2分間スライドを1回洗い流します。
- 空気乾燥スライドを傾け、乾燥を容易にする。
- DAPI の有無にかかわらず 20 μL のアンチフェードマウント(材料の表を参照)を、ガラスのカバースリップ(24 mm x 60 mm)に 3 つの均等な間隔のドットとして配置します。
- スライドをガラスのカバースリップの上に下向きに置き、スライドの曇った端に重なるエッジにマニキュアでカバースリップをシールします。
- 準備したスライドをイメージングの準備ができるまで4°Cに保管します。
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Representative Results
ゼブラフィッシュの精子拡散製剤を準備・可視化する方法を概説した。正しく実行すると、我々の手順は、よく広がり、重複しない核をもたらす。このような核を回収するには、適切な量の出発物質(すなわち、精巣)を有し、トリプシンおよび十分な数のDNase I処理において十分な時間の精巣を治療することが重要である。これらのスプレッドは、テロメアおよびマイオティックタンパク質に染色して、プロフェーズIの間にマイオティック進行を研究することができる。
図1:PNAおよび抗体プローブで染色された染色体拡散製剤の代表的な超解像画像。(A)シナプトン複合体の概略図。(B)Aの相乗軸タンパク質Sycp3(緑色)を示す相乗状の対のホモログ、横フィラメントタンパク質Sycp1(赤色)、および構造照明顕微鏡法(SIM)で画像化されたDNA(青色)を100x目的とした。スケールバー = 1 μm (C) 左側のパネルは、マイオティックプロフェーズの 3 つの段階を示しています: レプトテン (上)、早期ジゴテン (中央) パキテン (下)。スケールバーは5μm。右:各ステージのテロメア(マゼンタ)を含む代表的な画像。スケールバー = 1 μm. 数字は Blokhina ら 3.から適応されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゼブラフィッシュ精巣の例(受精後〜7ヶ月)。(A) 画像はゼブラフィッシュ内の精巣の相対的な位置を示す。精巣は水泳膀胱と腸の間に位置する。(B) テストの長さ。若いゼブラフィッシュは精巣が小さくなります。染色体が広がった場合は、精巣からできるだけ多くの脂肪および周囲の組織を除去する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:スライド用湿度チャンバー。私達の湿気の部屋は電気ポレーションキュヴェットを出荷するように設計されているポリスチレンの泡箱(21 cm x 19 cm x 6 cm)を使用してなされる。私たちは、他のすべての溝にウェット薄いティッシュワイプ(材料の表を参照)を挿入しました。スライドは、濡れたワイプに触れることなく、尾根の上に平らに配置されています。市販の湿度室もご用意しています(資料表を参照)。我々は、任意のポリスチレンフォームボックスが隆起と溝を取り付け(例えば、ガラスピペット13を使用して)使用することができることを想定しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DNase I処理不足による低品質のスプレッドの例Sycp3に染色されたマイオティック染色体を、20倍の目的を用いてSIMで画像化した。DNase I処理が不十分な場合、粘性スクロース細胞懸濁液が原因で核が重なり合い、スライド上で細胞が適切に広がるのを防ぎます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:代替方法11を用いて染色体が広がった例。Sycp3(緑色)およびSycp1(赤)に染色されたマイオティック染色体。染色体スプレッドは、サンサムおよびペッツァ11によって記述されるように調製した。この方法は、我々のプロトコルに必要ないくつかのゼブラフィッシュではなく、個々のゼブラフィッシュを使用して行うことができる。私たちの手の中では、よく広がっていない染色体を見ることは一般的です。染色体の広がり中にスライドに残された破片から生じる背景染色の顕著な増加もあります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、ゼブラフィッシュ精巣から分離された精子から広がる核表面におけるテロメアおよび染色体関連タンパク質の位置を探査する方法について説明する。我々は、これらの方法が精巣の大きさに調整して他のテレオスト種の精子細胞の分析に適用可能であることを期待する。
ゼブラフィッシュのマイオティックタンパク質に対して抗体が少ないのに対し、ヒト(h)またはマウス(m)タンパク質に上げられた以下の抗体を用いて成功を収めています。我々の研究室では、シナプトン複合体(SC)の信頼できるマーカーとして機能した鶏のゼブラフィッシュSycp1タンパク質(zfSycp1)に対する抗体を上げましたが、このタンパク質は染色体が完全にシナプス化されている初期のジゴテンから後期パチテンにのみ存在します。ウサギ抗hSYCP3抗体は、レプトテンから後期パチテンにおけるSCの溶解までマイオティック染色体軸を検出するのに非常に信頼できるものでした(図1B,C)。特に、Sycp3によって定義された全長軸を有する古典的なジプロテン段階とSycp1の不在を観察していない、マウスとは異なり、軸がパキテン3からの出口後に劣化する可能性があることを示唆している。m、hまたはzfマイオティックタンパク質に対して他の市販の抗体は陽性結果を与えたが、また、DNA再結合/複製ウサギ抗hRAD51およびウサギ抗hRPAが挙げられる。使用される各抗体の供給源と希釈は、材料表に記載されています。我々は、少なくとも3つの異なる希釈を使用して成功せずに試みたものは、ヤギ抗hDMC1、マウス抗hMlh1、マウスアンチハムスターSycp3、マウス抗hRPAを含む。
染色体拡散手順には3つの重要な段階がある。1つ目は、正しい量の材料を集めることです。15個の無傷の精巣は、〜6 mpfの雄の広がりプロトコルに十分であるべきであり、この数は動物の大きさに応じて上下に調整することができる。いくつかのマイオティック変異体は、より小さな精巣を有するので、2追加の動物を使用する必要があることを覚えておいてください。第二の重要なステップは、細胞の解離です。トリプシン消化中、精巣が小さな塊に解離しない場合、広がり手順から回収される細胞が少なすぎると考えられます。第3の重要なステップは、DNase I処理後の可視ペレットの存在です。ペレットが見えない場合、拡散手順はほとんど核を生み出さない可能性があります。あまりにも少ない動物が使用されている場合や、私が打つDNaseが多すぎると、ペレットの損失が発生する可能性があります。一方、DNase I処理が少なすぎると、粘性スクロース細胞懸濁液が生じるため、スライド上に細胞が広がるのを防ぐことができます(図4)。DMEMの追加時に塊が存在しなくなるまで、DNase I治療(最大4つの治療)を継続することが重要です。
提示された染色体拡散技術は、スライドごとに何百ものよく広がった核を生み出す。この手順を用いて、超解像顕微鏡3を用いてゼブラフィッシュ精子形成の際の主要事象の詳細な分析を行うことができる。私たちの手では、このプロトコルは、スライド上の破片が少なく、より良い広がり染色体を生成し、Moens14とサンサムとペッツァ11(図5)によって記述された単一の動物を使用するより速い方法と比較して、バックグラウンド染色が少なくなっています。これらの違いは、コラゲナーゼ、トリプシン、およびDNaseの使用がプロトコルで原因である可能性が高い。私たちの技術の2つの制限は、10-20大人のゼブラフィッシュの男性と、より手間のかかる酵素処理と洗浄手順を使用する必要があります。超分解能検出が必要でない場合、ゼブラフィッシュ材料が制限されている場合、または2つ以上の条件が並列に試験される場合、より速い方法は、より好適な代替手段14、15、16であり得る。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、原稿とアン・グエンに関するコメントに対するトレント・ニューマンとマスダ・シャリフィに感謝します。この作品は、S.M.Bに授与されたNIH R01 GM079115によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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