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Genetics

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

doi: 10.3791/60671 Published: March 3, 2020

Summary

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Abstract

A meiose é o processo celular-chave necessário para criar gametes haploides para reprodução sexual. Os organismos modelo têm sido fundamentais para entender os eventos cromossomos que ocorrem durante a profase do meioético, incluindo a combinação, a sinapse e eventos de recombinação que garantem a segregação adequada do cromossomo. Embora o mouse tenha sido um modelo importante para entender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos, nem todos os eventos meioticéticos neste sistema são análogos à meiose humana. Recentemente demonstramos o potencial excitante do zebrafish como um modelo de espermatogênese humana. Aqui descrevemos, em detalhes, nossos métodos para visualizar cromossomos meioóticos e proteínas associadas em preparações de propagação de cromossomos. Esses preparativos têm a vantagem de permitir a análise de alta resolução das estruturas cromossais. Primeiro, descrevemos o procedimento de dissecação de testículos de zebrafish adultos, seguido de dissociação celular, lise e disseminação dos cromossomos. Em seguida, descrevemos o procedimento para detectar a localização de proteínas cromossomos mestióticas, por detecção de imunofluorescência, e sequências de ácido nucleico, por fluorescência na hibridização situ (FISH). Essas técnicas compreendem um conjunto útil de ferramentas para a análise citológica da arquitetura de cromatina meiotic no sistema de zebrafish. Pesquisadores da comunidade de zebrafish devem ser capazes de dominar rapidamente essas técnicas e incorporá-las em suas análises padrão da função reprodutiva.

Introduction

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A reprodução sexual prossegue através da combinação de dois gametes haploides, cada um carregando metade do complemento cromossomo de uma célula somática. Meiosis é uma divisão de células especializadas que produz gametas haploides através de uma rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação de cromossomos. Na profase I, os cromossomos homônimos (homologs) devem passar por pareamento, recombinação e sinapse, sendo este último caracterizado pela formação do complexo sinaponômico que compreende dois eixos homolog a ponteados pelo filaverso transversal, Sycp1(Figura 1A,B). A não execução desses processos pode levar à produção de gametes aneuploides, que são uma das principais causas de abortos em humanos1. Nosso conhecimento da coordenação entre emparelhamento, recombinação e sinapse tem sido facilitado por estudos em uma ampla gama de organismos, como levedura, C. elegans,rato e Drosophila,entre outros2. Embora o processo geral de emparelhamento cromossomo homônimo seguido de segregação seja bem conservado, sua dependência da recombinação e sinopse e da ordem desses eventos varia.

A formação de quebra de fio duplo meiotic (DSB), que inicia a recombinação homóloga, ocorre perto de telômeros agrupados no buquê durante leptotene e a sinopse segue logo após3,4. Essa configuração de formação dsb e iniciação de sinapse também é uma característica da meiose masculina em humanos, mas não no rato5,6,7,8,sugerindo que os zebrafish podem servir de modelo para a spermatogênese humana. Há também várias vantagens práticas de estudar a meio-peixe-zebra. Machos e fêmeas passam por gametogênese durante toda a idade adulta, suas gônadas são facilmente acessíveis, e centenas de descendentes são gerados a partir de uma única cruz. Além disso, os embriões são transparentes e se desenvolvem externamente, o que facilita a detecção precoce de aberrações em desenvolvimento embrionário devido aos gametes aneuploides3,9. As desvantagens do uso de zebrafish são de que eles são lentos para atingir a maturidade sexual (~60 dias) e a quantidade de material necessário para propagações de superfície nuclear deve ser coletada de ~10-20 animais adultos, dependendo de seu tamanho.

Os preparativos de disseminação do cromossomo meioético são uma ferramenta vital para estudar dinâmicas cromossãs em todos os organismos modelo, uma vez que as principais assinaturas da dinâmica do cromossomo meioético podem ser sondadas. Em zebrafish, aspectos-chave da progressão do programa de meiotética e organização nuclear foram dissecados através da sondagem de superfícienuclear espalhadas, referidas aqui como spreads cromossomos, com anticorpos para detecção de proteínas e/ou ácidos nucleicos pelo PEIXE3,4,9,10,11. De fato, a localização polarizada de telômeros agrupados no buquê pode ser preservada na preparação de spread(Figura 1C). Recentemente, usamos cromossomo de espermatoósico de zebrafish, se espalha junto com métodos de detecção de fluorescência e microscopia de superresolução para elucidar a progressão detalhada da dinâmica do telômero de zebrafish, emparelhamento de cromossomo homólogo, localização de quebra de fio duplo e sinopse nas principais transições meioticas3. Aqui apresentamos métodos para preparar spreads cromossomos de espermatocitocitos dos testículos de zebrafish e, posteriormente, manchá-los com sondas de ácido nuclecítico de peptídeo fluorescente (PNA) a repetidas sequências de telômero e detecção de imunofluorescência de proteínas associadas ao cromossomo.

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Protocol

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Todos os métodos envolvendo zebrafish foram realizados utilizando padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis.

1. Procedimento de propagação de cromossomo

NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para criar slides 4-6, com centenas de núcleos meioéticos espalhados por slide. O número de testículos utilizados dependerá do tamanho do peixe. Espera-se utilizar 20 animais em ~60 dias após a fertilização (DPF) e 15 animais em ~6 meses após a fertilização (mpf). Para grandes zebrafish (por exemplo, 12 mpf) 10 animais devem ser suficientes. Saiba que os testículos de alguns mutantes meiotic (por exemplo, spo11-/-) serão um pouco menores3. Neste protocolo, um grupo de testículos é considerado como uma única amostra. Recomenda-se que não mais do que 4 amostras sejam preparadas em paralelo.

  1. Faça as seguintes soluções antes de iniciar o procedimento de disseminação
    NOTA: É conveniente preparar as seguintes soluções nas quantidades especificadas para uso em experimentos futuros de disseminação.
    1. Prepare uma solução de sacarose de 0,1 M dissolvendo 3,42 g de sacarose em 100 mL de água destilada. Traga a solução de sacarose para pH 8 usando 1 M Tris-HCl que também está no pH 8. Em seguida, filtrar esterilizar a solução de sacarose. Guarde à temperatura ambiente.
    2. Faça uma solução de estoque tampão de fosfato de 10x (PBS) para uma concentração final de 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 e 27,6 mM KH2PO4 em 1,8 L de água destilada. Mexa até dissolver, depois ajuste o pH para 7,3 usando NaOH e autoclave. Guarde à temperatura ambiente.
    3. Faça uma solução dnase de Dnase I de 400 μg/mL em água destilada estéril. Loja a -20 °C. Recomenda-se preparar 5 mL desta solução e, em seguida, armazenar como 100 μL alíquotas.
  2. Faça as seguintes soluções no dia do protocolo de disseminação
    NOTA: Para a eficiência do tempo, é melhor fazer a solução colagenase imediatamente após a dissecação de todos os testículos e, em seguida, fazer as soluções inibidoras de trippsina e trypsin durante o tempo em que as amostras estão sendo tratadas na colagenase.
    1. Dissolva 4 mg de colagenase em 200 μL do meio eagle modificado de Dulbecco (DMEM) por amostra (concentração final de 2% w/v colagenase). Mantenha no gelo até que seja necessário. A colagenase vai dissociar os testículos.
    2. Dissolva 1,4 mg de trippsina em 200 μL de DMEM por amostra (0,7% w/v trypsin concentração final). Mantenha no gelo até que seja necessário. A trippsina ajudará a dissociar as células.
    3. Dissolva 10 mg de inibidor de trypsina em 500 μL de DMEM por amostra (2% w/v trypsin inibidor concentração final). Mantenha no gelo até que seja necessário. O inibidor da metepsina impede que a tentação dedegradar as células.
    4. Prepare uma solução de formaldeído de 1% (a partir de uma solução pré-fabricada de 16%) com 0,15% Triton X-100 em água destilada estéril. Mantenha no gelo até que seja necessário. O formaldeído de 1% pode ser preparado enquanto os testículos estão sendo tratados com trippsina e DNase I (ou seja, durante a etapa 1.4.7 do procedimento de disseminação).
      CUIDADO: O formaldeído é perigoso.
  3. Dissecção de testículos de zebrafish macho adulto
    1. Eutanize zebrafish macho (> 60 dpf) submergindo-os em água gelada. Os peixes podem ser mantidos em água gelada até que estejam prontos para dissecar, porém devem ser dissecados o mais rápido possível.
      NOTA: A cepa selvagem AB é usada para este procedimento, mas outras cepas do tipo selvagem também devem ser favoráveis. O maior tempo que mantivemos peixes na água gelada antes da dissecação é de 3h sem qualquer efeito perceptível no protocolo.
    2. Decapitar um peixe de cada vez com uma tesoura pequena e, em seguida, usar micro tesouras para cortar ao longo da linha média ventral para expor a cavidade corporal.
    3. Dissecar os testículos é usando fórceps (ver Tabela de Materiais) na ampliação de 1,65x um microscópio. Realize as dissecções em uma placa de Petri revestida de silicone com coberta por uma piscina rasa de 1x PBS.
      NOTA: O testículo está localizado entre a bexiga de natação e o intestino e aparecerá mais leve que o tecido muscular (Figura 2A). Os testículos devem ter 2 lóbulos quando removidos do zebrafish (Figura 2B).
    4. Remova o máximo de gordura e tecido circundante possível. Em seguida, adicione cada teste dissecado é diretamente em um tubo de 5 mL com 2 mL de DMEM e mantenha no gelo.
      NOTA: Os passos 1.3.3 e 1.3.4 devem ser dominados antes de fazer qualquer experimento.
  4. Dissociação de células de testículos
    1. Solução de sacarose pré-quente de 100 mL de 0,1 M a 37 °C.
    2. Adicione 200 μL de solução colagenase ao tubo de 5 mL com os testículos. Misture a solução invertendo-a várias vezes.
    3. Agite suavemente os testículos em um agitador de incubadora horizontalmente a 100 rpm a 32 °C por 50 min a uma hora até que o DMEM esteja nublado e os testículos estejam em pequenos pedaços. Inverta rapidamente o tubo a cada 10 min para facilitar a dissociação.
    4. Para lavar a colagenase, adicione o DMEM a um volume final de 5 mL e inverta o tubo algumas vezes. Pelotas os testículos em ~200 x g por 3 min à temperatura ambiente. Remova 3 mL do supernatant para que apenas 2 mL permaneça.
      NOTA: A adição, remoção e transferência de DMEM é feita com pipetas de transferência plástica para a totalidade do procedimento de propagação do cromossomo.
    5. Repita o passo 1.4.4 duas vezes mais para um total de 3 lava-louças DMEM. Não suspenda novamente a pelota entre as lavas DMEM. Após a última lavagem DMEM, remova 4 mL do supernatant para que apenas 1 mL permaneça.
    6. Adicione 1 mL de DMEM para um volume total de 2 mL e adicione 200 μL da solução de trypsin e 20 μL de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar a solução.
    7. Horizontalmente agite o tubo a 32 °C por 5-15 min a 100 rpm até que a solução DMEM contenha apenas alguns aglomerados. Inverta rapidamente o tubo a cada 5 min para facilitar a dissociação.
      NOTA: Os aglomerados devem ser consideravelmente menores depois de tremer.
    8. Adicione 500 μL da solução inibidora de trypsin a e 50 μL de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar, em seguida, gire brevemente para baixo em ~200 x g por 3 min à temperatura ambiente para remover líquido ou aglomerados que podem aderir à tampa do tubo ou ao lado do tubo.
    9. Coloque o tubo no gelo e resuspenda a suspensão celular, canalizando repetidamente para cima e para baixo com uma pipeta de transferência de plástico por 2 minutos para facilitar a dissociação de quaisquer aglomerados restantes. Não deixe a suspensão da célula entrar na lâmpada da pipeta de transferência. Após os 2 min, a tubulação da suspensão volta ao tubo de 5 mL.
    10. Pré-muscar um filtro de célula de 100 μm com DMEM e colocá-lo em cima de um tubo de 50 mL no gelo.
    11. Transfira a suspensão da célula através do filtro uma gota de cada vez usando uma pipeta de transferência de plástico. Certifique-se de que a suspensão celular não vá para a lâmpada da pipeta de transferência.
    12. Transfira o filtrante usando uma pipeta de transferência de plástico para um novo tubo de 5 mL e adicione O DMEM a um volume final de 5 mL. Certifique-se de coletar as células agrupadas presas à parte inferior do filtro com uma pipeta de transferência de plástico limpo. Pelotas as células em ~200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
    13. Remova o máximo de supernatant possível sem perturbar a pelota.
    14. Adicione 5 μL de solução DNase I diretamente na pelota. Em seguida, misture a pelota com a solução DNase I raspando suavemente o fundo externo do tubo 4-5 vezes ao longo de um rack vazio de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Raspar muito duramente pode resultar em uma redução de spreads recuperados.
    15. Adicione o DMEM a um volume final de 5 mL e misture a solução invertendo o tubo várias vezes. É comum que aglomerados ainda estejam presentes após o primeiro tratamento de DNase I.
    16. Pelota a suspensão celular em ~200 x g por 2 min à temperatura ambiente.
    17. Repita as etapas 1.4.13-1.4.16 adicionais 1-3 vezes até que a pelota resuspensa não se agrupe sobre a adição do DMEM. Após a última rodada, remova o máximo de supernatant possível sem perturbar a pelota.
      NOTA: Espere uma redução no tamanho da pelota a cada tratamento de DNase I; exceder 4 lava-mnase total eu pode resultar em perda significativa de células. Se nenhuma pelota for visível após o DNase I tratar etapas, não prossiga com o procedimento. Descarte qualquer DNase não utilizado.
    18. Adicione 1 mL de 1x PBS e resuspenda a pelota raspando suavemente o fundo externo do tubo ao longo de um rack de tubo vazio de 1,5 mL.
    19. Contada a suspensão celular em ~200 x g por 5 min e, em seguida, remova o máximo de supernatant possível sem perturbar a pelota.
    20. Corte ~3 mm da extremidade de uma ponta de tubulata de 200 μL para ampliar a abertura e resuspender a pelota em ~80 μL de solução de sacarose de 0,1 M, canalizando para cima e para baixo com a ponta de tubulação cortada. Deixe a suspensão celular sentar-se à temperatura ambiente por 3 min.
  5. Espalhando cromossomos em slides de vidro
    1. Cubra um slide com 100 μL de 1% formaldeído com 0,15% Triton X-100 com o lado de uma ponta de pipeta. Em seguida, adicione 18 μL da suspensão da célula de sacarose no centro do slide em uma linha reta perpendicular à borda longa. Incline o slide para frente e para trás (~60°) para facilitar a propagação da suspensão celular para todos os cantos.
    2. Coloque os slides abaixados em uma câmara de umidade aberta ligeiramente rachada (Figura 3) para evitar que a solução de formaldeído seque. Coloque a câmara de umidade em uma gaveta escura durante a noite.
    3. Retire a tampa da câmara de umidade e deixe que os slides sequem completamente.
    4. Coloque os slides em um pote coplin, em seguida, encha o frasco Coplin com água destilada e incuba por 5 min com suave agitação à temperatura ambiente.
      NOTA: Os slides podem ser colocados no frasco coplin em um padrão de ziguezague para maximizar o número de slides por jarra Coplin. Certifique-se de que há espaço para o líquido passar entre todos os slides.
    5. Despeje a água e encha o frasco com 1:250 agente molhado (ver Tabela de Materiais). Lave 2 vezes por 5 min cada um com suave agitação à temperatura ambiente.
    6. Deixe os slides secarem totalmente e armazenem a -20 °C até ficarem manchados.
      NOTA: O maior tempo que armazenamos slides sem qualquer degradação perceptível dos cromossomos é de ~2 meses.

2. Telômero PNA manchade sonda

NOTA: As repetições de telômero podem ser manchadas usando sondas PNA de telômero conjugadas com fluorofóforo que hibridizam para as principais repetições de telômero de fio (CCCTAA). As sondas PNA têm uma espinha dorsal neutra, o que aumenta a afinidade de hibridização ao DNA carregado negativamente, resultando em pouco ou nenhum fundo. O passo de sondagem de telômero é opcional. Para proceder à coloração de anticorpos, reidrate slides em 1x PBS, conforme indicado na etapa 2.2.2., depois procede diretamente à "coloração primária de anticorpos".

  1. Faça a sonda PNA reagentes antes de iniciar a coloração de telômero
    NOTA: É conveniente preparar as seguintes soluções nas quantidades especificadas para uso em experimentos futuros. As condições de armazenamento são anotadas abaixo.
    1. Prepare 2 L da solução de citrato salino-sódio (SSC) de 20x com uma concentração final de 3 M NaCl e citrato de sódio de 0,3 M. Autoclave e loja à temperatura ambiente.
    2. Faça 50 mL de solução de pré-hibridização contendo RNA de transferência para uma concentração final de 50% de formamide, 5x SSC, 50 μg/mL heparin, 500 μg/mL transfer RNA, 0,1% Tween 20 e adicionar 460 μL de 1 M ácido citrico para trazer a solução para pH ~6. Loja a -20 °C.
      ATENÇÃO: A formamida é perigosa. Prepare a solução em um capô de fumaça.
    3. Faça 50 mL de solução de pré-hibridização preparada da mesma forma que na etapa 2.1.2 sem adicionar RNA de transferência. Loja a -20 °C.
    4. As sondas de telômero PNA TelC-Cy3 e TelC-Alexa647 são preparadas como estoques de 50 μM em formaide de acordo com as instruções do fabricante. Armazene as sondas PNA como alíquotas de 8 μL a -80 °C.
    5. Faça pelo menos 1 mL de 100 mg/mL solução de estoque de soro bovino (BSA) em água destilada estéril. Loja a -20 °C. Se preparar mais de 1 mL de estoque BSA, armazene a solução como 1 mL aliquots.
    6. Usando um tubo de 2 mL, prepare 2 mL de solução de hibridização adicionando 27 μL de 100 mg/mL BSA e 8 μL de 50 μM PNA para 1.965 mL de solução de pré-hibridização contendo RNA de transferência. Guarde no escuro a -20 °C.
  2. Coloração da sonda de telômero PNA
    1. Pré-aqueça o forno hibridização a 82 °C.
    2. Reahidrato desliza com 500 μL de 1x PBS por deslizamento por 5 min em uma câmara de umidade à temperatura ambiente. Remova o PBS tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
    3. Aqueça os slides e o tubo de 2 mL contendo a solução de hibridização diretamente em uma superfície metálica no forno de hibridização aquecido por 2 min.
    4. Mantendo os slides na superfície metálica, adicione 100 μL da solução de hibridização por slide e, em seguida, cubra os slides com tampas plásticas (~25 mm x 75 mm) cortadas para moldar um saco autoclave. Deixe os slides sentarem-se a 82 °C para 10-12 min.
    5. Coloque os slides em uma câmara de umidade no escuro a 37 °C por 16-24 h. A partir deste ponto e para a coloração primária e secundária de anticorpos, os slides devem ser mantidos no escuro para evitar fotobranqueamento do sinal de fluorescência. Após o período de incubação, os reagentes para coloração de anticorpos podem ser preparados durante a etapa 2.2.9.
    6. Remova os deslizamentos de cobertura com uma ponta de pipette.
      NOTA: Para facilitar a remoção do deslizamento de cobertura, ~50-100 μL da solução de hibridização sem RNA de transferência pode ser gentilmente dispensado entre o slide e o deslizamento de cobertura à medida que o deslizamento de cobertura está sendo levantado.
    7. Pipette 500 μL de solução pré-hibridização sem RNA de transferência para cada slide e coloque os slides na câmara de umidade por 15 min à temperatura ambiente. Remova a solução tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
      NOTA: A solução de pré-hibridização sem RNA de transferência não é pré-aquecida antes de ser adicionada em cada slide.
    8. Pipette 500 μL de 50% de solução de pré-hibridização sem RNA de transferência em 1x PBS para cada slide e coloque os slides na câmara de umidade por 15 min à temperatura ambiente. Remova a solução tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
    9. Transfira os slides para um frasco coplin e lave 3 vezes em 1x PBS com suave agitação por 15 min por lavagem à temperatura ambiente.
    10. Remova os slides do frasco coplin e remova o excesso de PBS tocando na lateral do slide em uma toalha de papel. Em seguida, prossiga para a etapa 3.2 "Coloração primária de anticorpos".

3. Coloração de anticorpos

NOTA: Anticorpos elevados a proteínas mestióticas conhecidas podem ser usados para detecção de imunofluorescência em preparações de cromossomo de propagação. Anticorpos secundários conjugados a diferentes fluoroforos permitem que múltiplas proteínas sejam manchadas simultaneamente, se os anticorpos primários foram criados em diferentes animais.

  1. Faça as seguintes soluções no dia da coloração primária e secundária de anticorpos
    1. Faça 1 L de PBT com 1x PBS e 0,1% Triton X-100 diluído em água destilada. Guarde à temperatura ambiente. Isso pode ser preparado com antecedência e em grandes quantidades para futuros experimentos de disseminação.
    2. Prepare 500 μL de bloco de anticorpos por deslizamento para uma concentração final de 2 mg/mL de BSA e 2% de soro de cabra em PBT.
    3. Para fazer 100 μL de mistura primária ou secundária de anticorpos por slide, adicione os anticorpos apropriados na concentração correta (ver Tabela de Materiais) no bloco de anticorpos.
      NOTA: A concentração de anticorpos pode precisar ser determinada empiricamente. Na discussão, incluímos uma lista de anticorpos que tentamos com sucesso (com diluição/concentrações) e aqueles que tentamos sem sucesso.
  2. Coloração primária de anticorpos
    NOTA: Rabbit anti-humano SCP3 e frango anti-zebrafish Sycp1 são tipicamente usados para coloração primária de anticorpos.
    1. Depois de remover o excesso de PBS dos slides, adicione 500 μL de bloco anticorpo por escorregador e coloque os slides em uma câmara de umidade a temperatura ambiente por um mínimo de 20 min.
    2. Remova o bloco de anticorpos tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
    3. Adicione 100 μL de mistura primária de anticorpos em bloco de anticorpos por slide e cubra os slides com um deslizamento de plástico feito de um saco autoclave. Coloque os slides em uma câmara de umidade durante a noite a 4 °C.
    4. Retire os deslizamentos de cobertura com uma ponta de pipeta e lave os slides 2 vezes por um mínimo de 5 minutos cada com 1x PBS em um frasco coplin com suave agitação à temperatura ambiente.
    5. Remova o PBS tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
  3. Coloração secundária de anticorpos
    NOTA: Anti-coelho de cabra conjugado e anticorpos anti-frango para diferentes fluoroforóres são usados para colorir a uma concentração de 1:1000.
    1. Adicione 500 μL de bloco anticorpo por escorregador e coloque os slides na câmara de umidade à temperatura ambiente por um mínimo de 5 min.
    2. Remova o bloco de anticorpos tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
    3. Adicione 100 μL de mistura de anticorpos secundários em bloco de anticorpos por slide e cubra os slides com um protetor plástico feito de um saco autoclave. Coloque os slides em uma câmara de umidade por 1h a 37 °C.
    4. Retire os deslizamentos de cobertura com uma ponta de pipeta e lave os slides 3 vezes por um mínimo de 5 min cada com 1x PBS em um frasco coplin com suave agitação à temperatura ambiente.
    5. Enxágüe os slides uma vez por um mínimo de 2 min com água destilada em um frasco coplin com suave agitação à temperatura ambiente.
    6. O ar seque os slides inclinados, para facilitar a secagem.
    7. Coloque 20 μL de montador anti-fade com ou sem DAPI (ver Tabela de Materiais) como 3 pontos espaçados uniformemente em tampas de vidro (24 mm x 60 mm).
    8. Coloque os slides de frente para baixo nos deslizamentos de vidro e sele os coverslips com esmalte na borda sobrepondo a extremidade fossa do slide.
    9. Armazene os slides preparados a 4°C até ficar pronto para a imagem.

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Representative Results

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Traçamos um método para preparar a disseminação de espermatocitos de zebrafish. Quando realizado corretamente, nosso procedimento rende núcleos bem espalhados, não sobrepostos. Para recuperar tais núcleos, é importante ter a quantidade adequada de material inicial (ou seja, testículos), tratar testículos por tempo suficiente na trippsina e um número adequado de tratamentos de DNase I. Esses spreads podem então ser manchados para telômeros e proteínas mestióticas para estudar a progressão do meiotético durante a profase I. A Figura 1 retrata exemplos de preparações de disseminação manchadas para características cromossômicas em diferentes estágios da profase I. A Figura 4 ilustra um exemplo de núcleos mal espalhados.

Figure 1
Figura 1: Imagens representativas de superresolução de preparações de disseminação de cromossomos manchadas com pna e sondas de anticorpos. (A)Esquema do complexo sinaponômico. (B)Um par de homologs sinapsados mostrando a proteína do eixo cromossomo Sycp3 (verde), a proteína de filamento transverso Sycp1 (vermelho) e DNA (Azul) imaged por microscopia de iluminação estrutural (SIM) usando um objetivo de 100x. A barra de escala = 1 μm.(C) Os painéis à esquerda mostram três estágios de profase meiotic: leptotene (superior), zigote precoce (meio) e pachytene (inferior). A barra de escala = 5 μm. Direito: imagens representativas contendo telômeros (magenta) para cada etapa. A barra de escala = 1 μm. As figuras são adaptadas de Blokhina et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Exemplo de testículos de zebrafish (~7 meses após a fertilização). (A) A imagem mostra a localização relativa dos testículos dentro do zebrafish. Os testículos ficam entre a bexiga de natação e o intestino. (B)O comprimento de um testículo. Zebrafish mais jovem terá testículos menores. Para se espalhar pelo cromossomo, remova o máximo de gordura e tecido circundante possível dos testículos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Câmara de umidade para slides. Nossa câmara de umidade é feita usando uma caixa de espuma de poliestireno (21 cm x 19 cm x 6 cm) projetada para enviar cuvetas de eletroporação. Inserimos lenços finos molhados (ver Tabela de Materiais)em todas as outras ranhuras. Os slides são colocados planas em cima dos cumes sem tocar nos lenços umedecidos. Uma câmara de umidade comercial também está disponível (ver Tabela de Materiais). Imaginamos que qualquer caixa de espuma de poliestireno equipada com cumes e ranhuras (por exemplo, usando pipetas de vidro13) pode ser usada. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Exemplos de spreads de má qualidade devido a tratamentos insuficientes de DNase I. Cromossomos meioéticos manchados para Sycp3 imagens por SIM usando um objetivo de 20x. Tratamentos insuficientes do DNase I levam a núcleos sobrepostos devido a uma suspensão viscosa das células de sacarose que impede que as células se espalhem adequadamente no escorregador. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 5
Figura 5: Exemplos de cromossomo se espalha usando um método alternativo11. Cromossomos meioéticos manchados para Sycp3 (verde) e Sycp1 (vermelho). Os spreads cromossomos foram preparados como descrito por Sansam e Pezza11. Este método pode ser realizado usando zebrafish individuais em vez dos vários zebrafish necessários para o nosso protocolo. Em nossas mãos, é comum ver cromossomos que não estão bem espalhados. Há também um aumento perceptível na coloração de fundo que resulta de detritos que são deixados nos slides durante o procedimento de propagação do cromossomo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

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Aqui descrevemos métodos para sondar a localização de telômeros e proteínas associadas ao cromossomo na superfície nuclear se espalha de espermatocitoses isolados de testículos de zebrafish. Esperamos que esses métodos sejam aplicáveis para análise de espermatocitocitos em outras espécies teleast com ajuste ao tamanho dos testículos.

Embora apenas alguns anticorpos tenham sido elevados para proteínas meioticas de zebrafish, tivemos sucesso usando os seguintes anticorpos levantados para proteínas humanas (h) ou camundongos (m). Nosso laboratório levantou anticorpos para a proteína sycp1 de zebrafish (zfSycp1) em frango que serviu como um marcador confiável para o complexo sinaponômico (SC), no entanto, esta proteína está presente apenas do ziggote precoce ao pachytene tardio, quando os cromossomos são totalmente sinapos. O anticorpo anti-hSYCP3 tem sido muito confiável para detectar eixos cromossomos meioóticos de leptoteno até a dissolução do SC no final do pachytene(Figura 1B,C). Notavelmente, não observamos um estágio de diplotene clássico com eixos de comprimento completo definidos pelo Sycp3 e a ausência de Sycp1, sugerindo que, ao contrário do mouse, os eixos podem ser degradados após a saída do pachytene3. Outros anticorpos disponíveis comercialmente para proteínas meiotic a m, h ou zf que deram resultados positivos também incluem recombinação/replicação de DNA coelho anti-hRAD51 e anti-hRPA coelho. A fonte de cada anticorpo e a diluição utilizada está listada na Tabela de Materiais. Aqueles que tentamos sem sucesso usando pelo menos três diluições diferentes incluem cabra anti-hDMC1, mouse anti-hMlh1, mouse anti-hamster Sycp3, mouse anti-hRPA.

Há três estágios críticos do procedimento de propagação do cromossomo. O primeiro é coletar a quantidade correta de material. Quinze testículos intactos devem ser suficientes para o protocolo de disseminação de ~6 machos do MPF, e esse número pode ser ajustado para cima ou para baixo, dependendo do tamanho dos animais. Tenha em mente que alguns mutantes meiotic terão testículos menores, por isso 2 animais adicionais devem ser usados. O segundo passo importante é a dissociação das células. Durante a digestão da trippsina, se os testículos não se dissociarem em pequenos aglomerados, é provável que poucas células sejam recuperadas do procedimento de propagação. Um terceiro passo fundamental é a presença de uma pelota visível após os tratamentos do DNase I. Se uma pelota não for visível, é provável que o procedimento de propagação renderá pouco a nenhum núcleo. A perda de uma pelota pode surgir se poucos animais forem usados ou se muitos DNase eu lava. Por outro lado, poucos tratamentos de DNase I podem resultar em uma suspensão de células de sacarose viscid, o que impedirá que as células se espalhem no slide(Figura 4). É importante continuar realizando tratamentos de DNase I (para um máximo de 4 tratamentos) até que os aglomerados não estejam mais presentes mediante aadição do DMEM.

A técnica de disseminação do cromossomo apresentado produz centenas de núcleos bem espalhados por slide. Usando este procedimento, conseguimos fornecer uma análise detalhada dos eventos-chave durante a espermatogênese de zebrafish usando microscopia super-resolução3. Em nossas mãos, este protocolo gerou melhor propagação de cromossomos, com menos detritos no escorregador, e menos manchas de fundo em comparação com métodos mais rápidos usando animais únicos descritos por Moens14 e Sansam e Pezza11 (Figura 5). Essas diferenças são provavelmente devido ao uso de tratamentos de colagenase, trippsina e DNase em nosso protocolo. Duas limitações de nossa técnica são a exigência de usar machos zebrafish adultos de 10 a 20 anos e os tratamentos enzienzymes mais trabalhosos e etapas de lavagem. Se a detecção de superresolução não for necessária, se o material do zebrafish for limitado, ou mais de duas condições forem testadas em paralelo, os métodos mais rápidos podem ser alternativas mais adequadas14,15,16.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Trent Newman e Masuda Sharifi por comentários sobre o manuscrito e An Nguyen por ajudarem a otimizar métodos para espalhar e manchar cromossomos de meiocitos de zebrafish. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM079115 concedido à S.M.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

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References

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Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish
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Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).More

Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

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