Summary
ここでは、サンガーシーケンシング、RT-PCR、ウェスタンブロッティングを用いたジストロフィン38発現の分子特性を臨床試験で紹介する。
Abstract
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、筋肉量の進行性喪失を引き起こす変性筋疾患であり、早期死亡につながる。突然変異はしばしば歪んだ読書フレームおよび早期停止コドンを引き起こし、その結果、ジストロフィンタンパク質のほぼ完全な欠如をもたらす。リーディングフレームは、エキソンスキップを誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AnONs)を使用して補正することができる。モルフォリノAONビラルセン(コード名:NS-065/NCNP-01)は、エキソン52欠失患者の読み取りフレームを復元し、エキソン53スキップを誘発することが示されている。我々は最近、探索的研究者開始、NS-065/NCNP-01の最初のヒト試験でDMD患者にNS-065/NCNP-01を静脈内投与した。本方法の記事では、サンガーシーケンシング、RT-PCR、ウェスタンブロッティングを用いたジストロフィン発現の分子特性を臨床試験で紹介する。ジストロフィン発現の特徴付けは、機能性結果試験が行われなかったので有効性を示す研究において基本的なものであった。
Introduction
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、筋肉量の進行性喪失、呼吸不全、心筋症を引き起こす変性筋疾患であり、早期死亡につながる1。この疾患は、大きな構造筋タンパク質ジストロフィン2の不足によって引き起こされる。X染色体上のDMD遺伝子の変異は劣性であり、この疾患は3500-5000人の新生男性33、4、54,5の1に影響を及ぼす。突然変異は、しばしば、歪んだ読み取りフレームと早期停止コドンにつながるエキソン44と55の間のホットスポット領域で大きな欠失であり、ナンセンス媒介性崩壊およびジストロフィンタンパク質66、7、87,8のほぼ全量欠乏を引き起こす。この読み取り枠は、エキソンスキップを誘導し、リーディングフレームを復元するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AnONs)を用いて補正することができ、ジストロフィン発現を部分的に復元し、疾患進行を遅延させる9、10、11。10,11最近連邦医薬品庁(FDA)によって承認されたモルフォリノAONエテプリルセンは、エキソン51のスキップを誘発し、エキソン52欠失12、13,13を有する患者における読み取りフレームを復元することができる。しかしながら、exon 53スキップは、エクソン52欠失を有する患者に対する読み取りフレームを復元し、DMD患者14の約10%を治療できる可能性がある。モルフォリノAON薬NS-065/NCNP-01は、ヒト細胞におけるエキソン53スキップを誘導することが示されている、 そして最近、第1相オープンラベル用量エスカレーション臨床試験(以下「研究」と呼ばれる)でDMD患者にNS-065/NCNP-01を投与した(以下、"研究"と呼ばれる)(UMIN:000010964とClinicalTrials.govとして登録:NCT02081625)14。14この研究は、ウェスタンブロッティングに基づくRT-PCRおよびジストロフィンタンパク質レベルに基づくエキソン53スキップの用量依存的増加を示し、重篤な有害薬物事象または中退は14であった。
すべての臨床試験において、結果の分析は最も重要です。DMD臨床試験では、治療上の利点を示す最良の方法に関する議論がまだ進行中です。6分間の歩行テストなどの臨床検査には一定の欠点があります。ジストロフィン発現の分子特性は、RT-PCR、qPCR、デジタルPCR、ウェスタンブロッティング、免疫検査などのいくつかの方法を用いて行うことができる。しかしながら、臨床的利益を与えるために必要なタンパク質発現回復の程度は不明のままである。本方法の記事では、エキソンスキップおよびタンパク質レベルをそれぞれ決定するために用いられるRT-PCRおよびウェスタンブロッティング法について、AONスキップ薬NS-065/NCNP-0114の第1相試験で詳細に説明する。
Protocol
調査官が開始した試験の運用手順は、NCNP倫理委員会(承認ID:A2013-019)によって承認されました。
1. 筋肉サンプルの調製
注:上腕二頭筋や四頭筋はしばしば生検部位として選択されます。しかし、チバアリス前房は臨床試験で使用された。
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患者からの筋肉生検
- 皮膚の準備前に切開部位をマークします。
- 生検標本のために生理的に湿らせたガーゼを準備しなさい。ガーゼをよく絞ります。
- 皮膚および皮下組織に局所麻酔を注入するが、筋肉には注入しない。皮痛の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
注:全身麻酔は、一般的に15歳未満の小児科患者に使用されます。 - 皮膚から皮下組織への切開を行います。切開部を開き、皮下脂肪を分離するために小さなレトラクターを使用してください。
注:このステップでは、皮膚の一部を線維芽細胞培養のために切断することができます。 - 鼻隠しにもう一つの小さな切開を行い、さらに鼻隠しをカットします。筋肉を露出させるために蚊の鉗子を使用してエッジをクランプします。
- 縫合糸を使用して、筋肉の選択した部分を引き上げろ。アイリスはさみを使って小さなトンネルを作り、蚊の鉗子をトンネルに挿入します。
- 鉗子を使用して筋束を分離し、ターゲット部分の両端を切断します。
注:筋肉生検標本は、成人患者のための鉛筆のサイズの周りでなければなりません(長さ1.0-1.5 cm、直径0.8-1.0 cm)。検体は小児科患者では約1cm、直径5mm程度であるべきである。 - 試料を生理食い物に覆ったガーゼで包み、新鮮な筋肉を室温(RT)で直ちに、試料を更なる分析のために準備できる施設に運ぶ。
注:輸送期間が1時間を超える場合は、試料を4°Cで輸送する必要があります。
2. 筋肉サンプルの準備
- ガムが柔らかく粘着性になるまで、トラガカンスガムと水の等しい量を混ぜます。混合物を25 mLの注射器に入れます。注射器は冷蔵庫に保管できます。
- コルクディスクに約0.5〜1cmのトラガカンスガムを置きます。反対側のディスクにラベルを付けます。
- 液体の一部が凍結するまで液体窒素中にイセペンタンの容器を入れます。
- トラガカンスガムに標本を入れる。各筋肉の縦軸はコルクに対して垂直であるべきである。適切な配置を助けるために、各筋肉の底の周りにガムを配置します。
- ピンセットを使用して、筋肉/コルク標本をステップ2.3で調製した冷たいイポペンタンに入れて凍結します。試料を1分間、または完全に凍結するまで絶えず動かし、一時的にドライアイスの上に置きます。
- ガラスバイアルに試料を入れ、-80°Cに保管してください。
3. 筋肉の切り離し
- -25 °Cの動作温度で切り離し用のクライオスタットを設定します。
- コルク/筋肉ブロックをマウントし、平らなセクションが達成されるまでトリム.
- RT-PCRおよびウェスタンブロッティングには、10 μmの断面厚さを使用してください。免疫検査、ヘマトキシリン、エオシン染色には、それぞれ6~8μm、10~12μmの厚さを使用してください。2.0 mLチューブにスライスしたセクションを入れ、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングのために-80 °Cで保管してください。
4. RNA抽出および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
- 凍結した筋肉から、約10枚の厚さをクライオスタットで抽出します。メーカーの指示に従って、全RNAの精製キットを使用して精製された全RNAを回収します。
- 分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
- 表 1に従って、RT-PCR 反応に必要な試薬を PCR チューブに組み合わせます。プライマーシーケンスについては、表 2を参照してください。
注:前方プライマーは患者NS-03のための44Fおよび患者NS-07のための46Fであった。リバースプライマーは、デフォルトとして54/55Rでした。非特異的な製品が明らかな場合、54Rが代替として使用されました。 - 混合物を含むPCRチューブをサーモサイクラーに入れます。 表 3に従ってサーモサイクラーを実行します。
- PCR製品は、短期保存用に4°C、長期保存用に-20 °Cに保存してください。
5. マイクロチップ電気泳動とエキソンスキップ計算
メモ:多くの場合、マイクロチップ電気泳動(MCE)システムは、エキサクのスキップ効率を分析するために選択されます。本プロトコルでは、メーカーAとメーカーB(以下、システムAおよびB)によるMCEシステムを用いて、エキソンスキップ効率を分析するために必要なステップを説明する。臨床試験の間、エキソンスキップ効率をシステムAで分析した。しかし、システムAはもはや売り物ではなく、エキサクスキップ効率を分析するシステムBを推奨します。両方のシステムのプロトコルが含まれています(システムAの場合は5.1、システムBの場合は5.2を参照)。システム A および B に関する情報については、 資料表 を参照してください。さらに、この工程は、通常のアガロースゲル電気泳動で行うこともできますが、感度は著しく低下します。
- システムAを用いたマイクロチップ電気泳動
注: システム A には 2 種類のチップがあります。ここでは、DNAチップの手順について説明します。- キット試薬(染色バッファ、ローディングバッファ、ラダー、ゲルバッファ)をRT、ボルテックス、スピンダウンに平衡化します。
- ゲル染色バッファー (GS) を調製するには、12.5 μL の汚れバッファーを 250 μL のゲルバッファーと渦を 10 秒に加えます。溶液をスピンフィルターチューブに、遠心分離機を2,400 x g で15分間動かします。フィルタを破棄します。
注:フィルターしたGSは1ヶ月間4°Cで保存することができます。 - サンプルが高濃度の場合は、TEバッファーまたはDNaseフリー水で約50 ng/μLに希釈します。
注:サンプルが塩濃度200 mM KCl(またはNaCl)および/または15 mM MgCl2である場合は、バッファーを交換します。 - DNAチップのゲルプライミングウェル(強調表示され、ラベル付けされたGS)にGS溶液12 μLを加え、チップをプライミングステーションに配置します。
注:気泡を避けるために、ピペットチップを塗布時に垂直に、ウェルの底に挿入します。ピペットの最初の停留所までゆっくりと分配し、ピペットステップの終わりに空気を排出しないでください。 - C3モードを選択し、 スタート ボタンを押します。プライミングが完了したら、チップを取り外します。
- マイクロチャネルに閉じ込められた気泡や不完全なプライミングがないかを視覚的に検査します。
- 以下のように、準備したサンプルとラダーをチップに積み込みます。
- ピペット9 μLのGS溶液を他の3 GSウェルに取り込みます。
- Lウェルおよび各サンプルに負荷バッファーのピペット5 μL(1-11)。
- ピペット1 μLのラダーをLウェルに入る。
- 11個のサンプルウェルのそれぞれに1μLのDNAサンプルをピペットします。
- TEまたはDNaseフリーの水のピペット1 μLは、未使用の井戸に入ります。キットのクイックガイドはチップレイアウトの図を示しています。
注:チップを軽く着色した背景の上に保持して、すべてのウェルに気泡がないか調べます。きれいなピペットチップで、または溶液を取り外して再ロードすることによって、井戸の底に閉じ込められた気泡を取り外します。
- 渦ステーションにチップを置き、ミックスを押 します。渦のステーションは1分後に自動的に停止します。
- 負荷から5分以内に電気泳動ステーションでチップを実行します。
- ソフトウェアツールバーで[新規実行]を選択します。[新規実行]画面で、アッセイプルダウンリストからDNAとDNA1Kを選択します。
- [プロジェクト]プルダウン リストから実行するプロジェクト フォルダを選択するか、[ プロジェクト ]フィールドに名前を入力して新しい プロジェクト フォルダを作成します。
- [ 実行プレフィックス ] フィールドに実行の名前を入力し、[ 実行開始] をクリックします。
- 解析が完了すると音源がビープ音を鳴り、実行の終了を示すウィンドウが開きます。 [OK] を 選択し、チップ プラットフォームからチップを取り外します。
- ファイルの選択 |データをエクスポートしてデータをエクスポートします。エクスポートダイアログで必要なオプションを選択します。
- 電極を洗浄するには、800 μLの脱イオン水でクリーニングチップを充填し、チッププラットフォーム上に置き、蓋を閉めて1分間閉じたままにします。1分後、蓋を開け、クリーニングチップを取り外し、電極を1分間乾燥させます。
- システムBを用いたマイクロチップ電気泳動
- オペレーティング・ソフトウェアを開き、サンプル情報を入力します。情報を入力すると、ソフトウェアは分離バッファとマーカーソリューションの量を自動的に計算します。
- ソフトウェアによって計算された分離バッファの必要量を準備します。まず、適量のTEバッファーで10,000x溶液を希釈して100x核酸ゲル染色液を調製する。100x溶液は-20°Cで保存することができます。
- 会社が提供する特定のチューブに100x核酸ゲル染色剤を適量混合し、1x溶液を調製する特定のチューブ内で分離緩衝液を配合する。溶液を渦。
- チューブ内のマーカー溶液の必要量を準備します。
- プローブ洗浄プログラムを開始します。
- 完了したら、マイクロチップの洗浄プログラムを開始します。
- 同時に、サンプルをPCRマルチプレート(96ウェル、クリア)にピペットし、脱イオン水で4回希釈します。機械が扱える最小容積は6 μLで、最大は30 μLです。総体積は10μL(2.5μLサンプル、水/TEバッファ7.5μL)を推奨します。
- 粘着PCRシールホイルシートでプレートを覆い、サンプルをスピンダウンします。
- 機械で示される配置に従って、プレート、マーカー溶液、および1x分離バッファを機械にセットします。 [スタート ]ボタンを押します。
- 実行が完了したら、ソフトウェアから結果データを .csv ファイルとしてエクスポートし、次のようにモル濃度を使用してエキサクスキップ効率を計算します。
エキサシスキップ効率(%)=(スキップバンド/(スキップバンド+非スキップバンド) X 100
6. 相補DNA (cDNA) シーケンシング
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アガロースゲル製剤
- アガロース粉末1.5gを測定し、マイクロウェーブ可能なフラスコ(1.5%アガロースゲルをもたらす)に1x TAEバッファーの100 mLと粉末を混合します。
- アガロースが完全に溶解するまで1〜3分間の電子レンジ。
注:バッファーの一部が蒸発し、ゲルの最終的なアガロースパーセントを変更するので、溶液をオーバーボイルしないでください。 - アガロース溶液を約50°Cに冷却させる。
- アガロース溶液に10μL 10,000x蛍光核酸染料を加えます。
- アガロースをウェルコームを所定の位置に置いてゲルトレイに注ぎます。完全に固まるまでRTで20〜30分間放置します。
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シーケンス
- RT-PCR製品の5 μL(ステップ4.4から)と6xローディングバッファの1 μLを混合します。1.5%アガロースゲルの井戸にロードします。
- ゲルを135 Vで5分間、120 Vで20分間動かします。
- メーカーのプロトコルに従ってトランスイルミエータを使用してバンドを視覚化します。
- ゲルから目的の物品切れバンドを使用し、ゲルと PCR のクリーンアップ キットを使用して RT-PCR 製品を取得します。
- 分光光度計を用いて濃度を測定します。
注: 精製バンドは、Sanger シーケンシング装置が社内で使用できない場合、会社またはシーケンシング施設でシーケンシングのために送信できます。 - サイクルシーケンシングキットとピペットに必要な試薬を、 表4に従ってマルチプレートPCRプレートに準備する。プライマーシーケンスについては 、表 2 を参照してください。
- 透明な粘着フィルムでプレートを密封します。
- プレートを2~3sに渦する。遠心分離機は、1,000 x gでウェルの底(5~10 s)に落ち着くように、振るバケツ遠心分離機で短時間。
注:気泡は井戸に存在する可能性がありますが、反応に悪影響を及ぼすものではありません。 - 混合物をサーモサイクラーに入れ、 表5に従って実行します。
- メーカーの指示に従ってプレートでシーケンシング反応を浄化します。
- DNA分析装置を使用して、製造業者のプロトコルに従って配列を決定します。
- 得られた配列を患者の期待される順序と比較する。
7. ウェスタンブロッティング
- サンプル準備
- SDSサンプルバッファー(4%SDS、4 M尿素、10%2-メルカプトエタノール、10%グリセロール、70 mM Tris-HCl pH 6.4、0.001%ブロモフェノールブルー、プロテアーゼ阻害剤)を調製します。
- 150 μL の SDS バッファーに、クライオセクショニングから採取した 10 μm の筋肉セクションの約 100 スライスを配置します。
- 便利なマイクロホモジナイザーを使用して、氷上のタンパク質サンプルを30s分の一に均質化します。
- 16,500 x g で15分間遠心分離機を、上清を新鮮なチューブに移します。-80°Cで分析または保存を進めます。
- タンパク質濃度測定用のSDS-ページ
注:蛍光ゲル染色剤を使用してタンパク質濃度を決定しました。- メーカーの指示に従って、BCAタンパク質アッセイキットを使用して、正常な健康な対照サンプルの重量と濃度を決定します。
- ゲル電気泳動用サンプルを準備します。ピペット10μgの全タンパク質の健常対照および5μLの患者サンプル、5μLの4倍サンプルバッファー、10xサンプル還元剤の2μL。これらを混合したら、各サンプルの最終容積20μLに脱イオン水を加えます。
- 70°Cで10分間加熱します。
- 40x SDS実行バッファの50 mLを使用して、1x SDSランニングバッファの2,000 mLを準備します。1,950mLの脱イオン水で希釈します。
注: この時点で、1,000 mL の実行バッファで十分です。残りの 1,000 mL バッファはステップ 7.3.1 で使用されます。 - 十分に混合し、ゲルボックスの下部(外側)バッファチャンバーで使用するために、1x SDSランニングバッファの800 mLを確保します。
- 電気泳動の直前に、ゲルボックスの上部(内側)バッファチャンバーで使用する1x SDSランニングバッファの200 mLに抗酸化バッファーの500 μLを追加します。
- メーカーのプロトコルに従って3-8%トリ酢酸ゲルを設定してゲル電気泳動に備えます。各サンプルの20 μLをゲルに積み込みます。
- 150Vで75分間電気泳動を行います。
- 電気泳動後、50 mLの蛍光ゲル染色液を含むクリーントレイにゲルを直接入れ、
- トレイを覆い、シェーカーの上に置き、液体をはねたったり、ゲルを90分間損傷したりせずに攪拌します。
- エチジウム臭化エミズエミッションフィルターを使用して、蛍光システムで蛍光システムでイメージングする前にゲルを水に移し、蛍光を検出します。
- 既知の濃度で通常の制御法を用いて構築された分析曲線に基づいて患者のサンプルの濃度を測定する。
- ウェスタンブロッティング用 SDS ページ
- ステップ7.2.4-7.2.6に従ってゲルボックスを準備します。
- ステップ7.2.11で得られた濃度測定に基づいて、健康な対照lysateのレーンあたり100 μgおよび患者サンプルのレーン当たり300 μgをロードする。ステップ 7.2.7 と同じ設定を使用してエレクトロフォレス。
- タンパク質の転写
- 転送バッファを準備します。PVDF膜を20sのメタノールに浸します。使用するまでブロッティングバッファBに移動します。
- 余分厚いブロッティングペーパーをブロッティングバッファー A、B、C に浸して、バッファーあたり少なくとも 30 分間浸します。
- 電気泳動後、ゲルをブロッティングバッファーBに5分間浸します。
- 図1の図面に従って、ブロッティングペーパー、PVDF膜、およびゲルを半乾燥転写機に配置する。ゲルと膜の間の気泡をローラーでロールアウトします。
- RTで1時間2mA/cm2膜で移動する。2
注:転写後、大きな分子量タンパク質の転写に成功したことを確認するために、ポンソー染色と同様の全タンパク質染色を行うことを推奨します。
- ブロッキングと抗体染色
- 膜をPBST(1x PBS 0.1%Tween 20)で2回リンスします。
- 膜を1%ブロッキング剤に入れ、RTで1時間静かに揺れ、ブロックします。
- ブロッキング溶液(1:125)および抗スペクトリン抗体(1:25,000)で、RTで1時間または4°Cで一晩、抗ジストロフィン抗体で膜をインキュベートします。
- 膜をRTでPBSTでそれぞれ10分間3回洗浄します。
- PBST(1:100)で西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート二次抗マウス/ウサギ抗体をRTで40分間インキュベートします。
- 膜をRTでPBSTで10分間再び3回洗浄します。
- 検出
- 1:1の比で検出溶液AとBを混合する。必要な検出試薬の最終容積は、0.1 mL/cm2 膜です。
- 洗浄された膜から余分なPBSTを取り除き、ラップまたは他の適切なきれいな表面のシート上にタンパク質側とそれを置きます。混合検出試薬を膜に加え、RTで5分間インキュベートします。
- 膜を鉗子にそっと保持し、組織に対してエッジに触れることで、過剰検出試薬を除去します。
- ブロットプロテイン側をサンプルトレイの上に置きます。ユーザーマニュアルに従って蛍光システムを操作します。マシンを次のように設定します。露出タイプ:増分、間隔時間:10秒、感度/解像度:高。
注: 測定された領域は、青い長方形で箱詰めされました (図 4a-b):BG: 背景;D:ジストロフィン427 kDa、SL:スペクトリンベータ長いアイソフォーム(274 kDa);SS:短いアイソフォーム(253 kDa)。ジストロフィン/スペクトリンシグナル比は(D-BG)/[SL-BG]+(SS-BG)として計算した。通常制御の比率を100%とした。
Representative Results
RT-PCR を使用してエキソンスキップを検出するには、スキップされるエキソンの両側のプライマーが設計され、特定のバンドのみが得られるように評価されました (エキサのスキップとプライマー位置の概略図については図 2を参照)。プライマーは、MCEシステム上のサイズまたは通常のアガロースゲル電気泳動で容易に識別できる製品を生成する必要があります。図3は、用量エスカレーションフェーズ1試験におけるNS-065/NCNP-01による治療前後の患者NS-03およびNS-07からのスキップされたバンドのRT-PCR反応およびスキップされたバンドのシーケンシング結果のMCE系Aゲル画像を示す。NS-03およびNS-07の港の削除は、それぞれ45-52および48-52に及ぶ。NS-03は5mg /kgとNS-07 20 mg/kgを毎週12週間受け取りました。治療前に予想されるように、両方の患者はスキップを示さなかったし、唯一のスキップされていないバンドを視覚化することができた。12週間の治療の後、明確にスキップされた下のバンドをNS-07のために視覚化した。しかし、患者NS-03のスキップされた製品を検出することは依然として困難でした。シーケンシングの結果は、NS-07のエキソン47と54、NS-03のエキソン44と54の連結を示した。配列によると、これらは理論的には機能的であるが短縮されたジストロフィンアイソフォームを生成することができる。図 3bに示すスキップ率を計算するために、スキップされたバンドのモル濃度をスキップバンドとスキップ解除されたバンドで割った値です。患者NS-07の場合、治療後の割合は72%、NS-03では3.4%であった。患者NS-03、NS-07、および健康なコントロールからのウェスタンブロットデータ(三重化)を図4に示します。予想通り、治療前にジストロフィンバンドは検出されなかった。治療後、患者NS-07からのバンドは、健康なコントロールと比較して低分子量で検出された(野生型ジストロフィンは427kDaの分子量を有し、NS-07ジストロフィンは389kDaの分子量を有する)。エキサ欠失とスキップのため、患者NS-07からのジストロフィンアイソフォームにはエキソンがいくつか欠け、分子量が低いと予想された。患者NS-03は治療後にジストロフィンの検出可能なレベルを示さなかった。図4bbでは、患者NS-07に対する健常制御と比較したジストロフィンの量が示されている。ジストロフィン復元の計算のために信号強度を測定した場所は、青い四角形で示されています。ジストロフィンスペクトリン比を用いて、健常コントロールのそれと比較してジストロフィンの量を計算した。この点を、ジストロフィンから背景を引いた信号を、2つのスペクトルアイソフォーム(長い、短い)から背景を引いたものの和で割った(ステップ8.6.5を参照)。健康コントロールの比率は100%に設定した。治療後の患者NS-07における健康なコントロールと比較したジストロフィンの量は9.1%であった。しかし、両患者の前治療サンプルで得られたものと同様の弱いジストロフィンバンドのために患者NS-03の割合を計算することができなかった。
図1:ウェスタンブロット解析用の転送スタックの概略図 下にブロッティングバッファーAに浸したブロッティング紙を用いたウェスタンブロット転写スタックの組み立て、続いてブロッティングバッファB、PVDF膜に浸したブロッティング紙、3-8%トリス酢酸ゲル及び上の2のブロッティングペーパーをブロッティングバッファCに浸した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:DMD 遺伝子におけるエキソン45-52欠失を有する患者におけるエキソン53のエキソンスキップの模式図。 例えば、用量エスカレーション臨床試験における患者NS-03は、この欠失を持っていた。エキソン53が保持されている場合、エキソン44と53の間のエキソン-エキソン接合が読み取りフレームを破壊し、エキソン53でコドンを停止させるので、mRNAはフレームから外れる。この読み取り枠は、エキソン53がスキップされると復元され、ジストロフィンの短いアイソフォームが生成される。RT-PCRによるエキソン53スキップを検出するために、スキップされたmRNAとスキップされていないmRNAの間のPCR産物を容易に検出できるように、エキソン44および54のプライマーが使用される。FWD: フォワードプライマー, REV: リバースプライマー, PMO: ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脛表筋前筋生検サンプルからの患者NS-03およびNS-07の効率をスキップする。a)患者NS-03およびNS-07からの未治療および治療されたサンプルのRT-PCRサンプルの電気泳動システムAによって生成されたゲル画像。上部パネルには、NS-03と下部パネルNS-07が三重に表示されます。NS-03 の場合、スキップされないバンドは 422 bp、スキップされたバンドは 212 bp です。NS-07の場合、バンドはそれぞれ836 bpと624 bpです。配列解析では、NS-03に対するエキソン44とエキソン54と、NS-07のエキソン47とエキソン44の連結を示した。b)治療前後のスキップ効率が患者NS-03およびNS-07に対して示され、スキップされたバンド/(スキップされたバンド+スキップされていないバンド)x 100としてシステムAが提供する2つのバンドのモル濃度から計算される。NS-03のスキップ効率は、治療後に非常に低く、非常に低かった。NS-07では、スキップ効率は70%を超えました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:エキソンスキップ療法の前後のジストロフィンアイソフォームのタンパク質定量化a) エキソンスキップ療法の前後のジストロフィンアイソフォームのタンパク質定量化治療前後の患者NS-03およびNS-07の脛表症前部からの筋肉生検のウェスタンブロットおよび三重における健康なコントロールからの。ジストロフィンは、健康なコントロールのために427 kDaで、治療後のNS-07のために389 kDaで見ることができます。治療前のいずれの患者にもジストロフィンは検出できなかったか、患者NS-03の治療後も検出できなかった。黒いボックスの領域を図 4bに示します。各ブロットの左にマーカーが表示されます。b)患者NS-07の治療後に回復したジストロフィンの量。ジストロフィン復元は、ジストロフィンのバンドの強度、背景、およびスペクトリンの長くて短いアイソフォームの強度に基づいて計算された: (ジストロフィン - 背景)/(スペクトリンL -バックグラウンド)+(スペクトルS - バックグラウンド)健康コントロールの比率が100%に設定されています。各バンドの強度は、図に示す青色のボックス内で測定した。NS-07のジストロフィン修復は、治療後9.1%であった。ジストロフィンシグナルは、未処理のサンプルで測定するには弱すぎました。マーカーのサイズはキロダルトンで示されています。Dys:ジストロフィン、BG:背景、SL:スペクトリン長いアイソフォーム、SS:スペクターリン短いアイソフォーム、私:ミオシンタイプ1。マーカーのサイズはキロダルトンで示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション | ボリューム/リアクション(μl) | 最終濃度 |
| RNaseフリーウォーター(提供) | 変数 | - |
| 5x QIAGEN ワンステップ RT-PCR バッファー | 5.0 | 1x |
| dNTP ミックス (各 dNTP の 10 mM を含む) | 1.0 | 各 dNTP の 400 μM |
| フォワードプライマー(10 μM) | 1.5 | 0.6 μM |
| リバースプライマー(10 μM) | 1.5 | 0.6 μM |
| QIAGEN ワンステップ RT-PCR 酵素ミックス | 1.0 | - |
| RNase阻害剤(オプション) | 変数 | 5~10単位/反応 |
| テンプレート RNA | 50 ng | |
| 合計 | 25 |
表1:RT-PCR試薬。 RT-PCRの1つの反応に必要な化合物。
| プライマー | シーケンス |
| 44F | 5'-CCTGAGAATTGGGAATGC-3' |
| 46F | 5'-アアッケガーアガガガッカガア-3' |
| 48F | 5'-CCAAAGAAGGACCATTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-TCTCGCTCTCACTCACCCTTTT-3' |
| 54R | 5'-GTGGACTTTCTGGATCAT-3' |
表2: プライマーリスト 本研究で使用されるプライマーのシーケンス。F: 前方、R: 逆。
| 1サイクル | 逆転写 | 30分 | 50°C |
| 1サイクル | 初期 PCR 活性化ステップ | 15分 | 95°C |
| 35サイクル | 変性 | 1分 | 94°C |
| 焼鈍 | 1分 | 60°C | |
| 拡張子 | 1分 | 72°C | |
| 1サイクル | 最終拡張 | 7分 | 72°C |
| 保持 | ∞ | 4°C |
表3:PCRを用いた条件を用いた。 RT-PCR反応の PCR 条件を表示します。
| ソリューション | ボリューム/リアクション(μl) |
| RNaseフリーウォーター | 変数 |
| BigDyeターミネーター3.1レディリアクションミックス | 3.5 |
| フォワードプライマー/リバースプライマー(3.2 μM) | 2.0 |
| テンプレート RNA | 20 ng |
| 合計 | 20 |
表4:シーケンシング反応に必要な試薬。 セットアップでは、両方を同時に使用せず、前方またはリバースプライマーを使用します。
| 1サイクル | 1分 | 96°C |
| 25サイクル | 10 s | 96°C |
| 5 s | 50°C | |
| 4分 | 60°C | |
| 保持 | ∞ | 4°C |
表5:サンガーシーケンシングのPCR条件。
Discussion
DMDの臨床試験は、ここ数年で成功と失敗の両方を生み出しました。RT-PCRおよびウェスタンブロッティングは、患者に投与されたエキソンスキップ化合物によって生成されるスキップ効率を評価するための一般的な技術である。しかし、RT-PCRは、デジタルPCR15と比較してスキップ効率を過大評価することが報告されている。これはいくつかの理由によるものですが、主にPCRサイクル中にスキップされる小さな断片のより効率的な増幅によって引き起こされます。この臨床試験で使用されたRT-PCRはまた、ウェスタンブロッティングによって推定されるタンパク質発現と比較して、より高いスキップ効率を生み出したようです。FDAによると、これはジストロフィンの修復12を定量化するためのより信頼性の高い方法です。したがって、RT-PCR スキップ結果を解釈する際には注意が必要です。ただし、サンプルは引き続き比較できます。RT-PCR 結果に基づいてより高いスキップ効率を示すサンプルは、一般的にウェスタンブロット分析でより高いタンパク質発現レベルを高くします。
DMD臨床試験のすべての患者は同じ欠失パターンを有していないので、すべてのサンプルに対してデジタルまたはqPCRを行うために適切に特異的なプライマーおよびプローブを設計することは困難である可能性がある。したがって、RT-PCR は、スキップ効率の最初の評価にはまだ良い代替手段です。NS-065/NCNP-01の臨床試験が開始される前は、筋肉または皮膚生検のいずれかが患者固有の筋芽細胞を生成することが必須であったため、インビトロの各患者のスキップ効率を評価するのは面倒でした。しかし、最近では、患者特異的なMYOD1変換された尿由来細胞(UDC)を新規DMD筋細胞モデル16として生成する新しい技術を発表した。したがって、患者から採取された尿のみが筋芽細胞を生成するために必要であり、侵襲的処置は必要ない。この方法は、患者固有の細胞内の異なるAnANをスクリーニングするために使用できると考えています。さらに、患者が臨床試験を開始する前に、異なるプライマーおよびプローブをテストすることができます。これにより、将来のDMD臨床試験でのエキソンスキップ測定にqPCRまたはデジタルPCRの使用を容易にすることができます。
この臨床試験でウェスタンブロット分析を行う場合、ジストロフィンに対する抗体を1つ使用し、健常な対照を1つだけ基準試料として使用した。したがって、抗体の特異性は適切に検証されなかった。これは、抗体がジストロフィンのC末端ドメインのみを認識するという事実と共に、プロトコルの限界である。ジストロフィン分子の異なるドメインに対して向けられたより健康的なコントロールおよび抗体は、将来的に推奨される。
ここでは、NS-065/NCNP-01の最近の探索的調査員開始、初めてのヒト試験で使用されたプロトコルを要約した。NS-065/NCNP-01は、DMD患者の10.1%に適用される可能性があります。
Disclosures
なし。
Acknowledgments
先生、永田哲也博士、増田聡氏、武下隆博士の科学的な議論に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
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