Summary
Här presenterar vi den molekylära karakterisering av dystrofin 38 uttryck med sanger sekvensering, RT-PCR och västra blotting i den kliniska prövningen.
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en degenerativ muskelsjukdom som orsakar progressiv förlust av muskelmassa, vilket leder till för tidig död. Mutationerna orsakar ofta en förvrängd läsram och för tidigt stopp kodon, vilket resulterar i en nästan total brist på dystrofinprotein. Läsramen kan korrigeras med hjälp av antisense oligonukleotider (AONs) som inducerar exonhopping. Morfolino AON viltolarsen (kodnamn: NS-065/NCNP-01) har visats för att inducera exon 53 hoppa, återställa läsramen för patienter med exon 52 borttagningar. Vi administrerade nyligen NS-065/NCNP-01 intravenöst till DMD patienter i en undersökande utredare-inletts, första-i-människa-studie av NS-065/NCNP-01. I denna metoder artikeln presenterar vi den molekylära karakterisering av dystrofin uttryck med sanger sekvensering, RT-PCR och västra blotting i den kliniska prövningen. Karakterisering av dystrofin uttryck var grundläggande i studien för att visa effekten eftersom inga funktionella resultatet tester utfördes.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en degenerativ muskelsjukdom som orsakar progressiv förlust av muskelmassa, andningssvikt, och kardiomyopati, och det leder till för tidig död1. Sjukdomen orsakas av en brist på den stora strukturella muskelprotein dystrophin2. Mutationer i DMD-genen på X-kromosomen är recessiva, och sjukdomen drabbar 1 i 3500-5000 nyfödda hanar3,4,5. Mutationerna är ofta stora strykningar i en hotspot region mellan exons 44 och 55 som leder till en förvrängd läsning ram och för tidigt stopp kodon, orsakar nonsens-medierad förfall och en nästan total brist på dystrofinprotein6,7,8. Läsramen kan korrigeras med hjälp av antisense oligonukleotider (AONs) som inducerar exon hoppa över och återställa läsramen, delvis återställa dystrofin uttryck och fördröja sjukdomsprogression9,10,11. Den morpholino AON eteplirsen, som nyligen godkändes av Federal Drug Agency (FDA), inducerar hoppa över exon 51 och kan återställa läsramen hos patienter med exon 52 borttagningar12,13. Emellertid återställer exon 53 hoppa över läsramen för patienter med exon 52 borttagningar, och det kan potentiellt behandla cirka 10% av DMD patienter14. Morpholino AON-läkemedlet NS-065/NCNP-01 har visat sig framkalla att exon 53 hoppar över i mänskliga celler, och vi nyligen administreras NS-065/NCNP-01 till DMD patienter i en fas 1 öppen dos-eskalering klinisk prövning (hädanefter, kallad "studien") (registrerad som UMIN: 000010964 och ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Studien visade en dosberoende ökning av exon 53 hoppa baserat på RT-PCR och dystrofin proteinnivåer baserat på västra blotting, och inga allvarliga negativa läkemedelshändelser eller avhopp observerades14.
I alla kliniska prövningar är analysen av resultaten av största vikt. För DMD kliniska prövningar pågår fortfarande en debatt om den bästa metoden för att visa en behandlingsfördel. Kliniska tester som 6-minuters promenadtestet har vissa nackdelar. Molekylär karakterisering av dystrophin uttrycket kan utföras med hjälp av flera metoder, såsom RT-PCR, qPCR, digital-PCR, västra blotting och immunohistokemi. Omfattningen av protein uttryck restaurering som krävs för att förmedla en klinisk nytta är dock oklart. I denna metoder artikel beskriver vi i detalj de RT-PCR och västra blotting metoder som används för att bestämma exon hoppa över och proteinnivåer, respektive, i fas 1-studien av AON hoppa över drogen NS-065/NCNP-0114.
Protocol
Det operativa förfarandet för den prövarinitierade rättegången har godkänts av NCNP:s etiska kommitté (godkännande-ID: A2013-019).
1. Beredning av muskelprover
OBS: Biceps brachii eller quadriceps muskler väljs ofta som biopsi platser. Emellertid, tibialis främre användes i den kliniska prövningen.
-
Muskelbiopsi från patienter
- Märk snittet plats innan huden förberedelse.
- Förbered saltlösning-dämpad gasväv för biopsi exemplaret. Kläm gasbindning väl.
- Injicera lokalbedövning i huden och subkutan vävnad, men inte i muskeln. Se till att anestesins djup genom frånvaro av testning smärta.
OBS: Allmänbedövning används i allmänhet till pediatriska patienter under 15 år. - Gör ett snitt från huden till den subkutana vävnaden. Använd små upprullningsdon för att öppna snittet och separera det subkutana fettet.
OBS: Vid detta steg kan en del av huden skäras för fibroblastkultur. - Gör en annan liten snitt i fascian och skär fascia ytterligare. Kläm fast kanterna med hjälp av myggtens tämpningar för att exponera muskeln.
- Använd en sutur för att dra upp den valda delen av muskeln. Gör en liten tunnel med iris sax och sätt in myggtens tulkar i tunneln.
- Separera muskelbunten med hjälp av tärningar och skär båda ändarna av måldelen.
OBS: Muskelbiopsi exemplar bör vara runt storleken på en penna för vuxna patienter (längd 1,0-1,5 cm, diameter 0,8-1,0 cm). Provet ska vara omkring 1 cm i längd och 5 mm i diameter hos pediatriska patienter. - Linda in preparatet i saltsaltdämpad gasbindning och transportera den färska muskeln vid rumstemperatur (RT) omedelbart till en anläggning där preparatet kan beredas för vidare analys.
OBS: Exemplaren bör transporteras vid 4 °C om transporttiden överstiger 1 timme.
2. Framställning av muskelprov
- Blanda lika stora volymer av tragacanth tuggummi och vatten tills tandköttet blir mjukt och klibbigt. Fyll på blandningen i 25 mL-sprutor. Sprutorna kan förvaras i kylskåp.
- Placera ungefär 0,5 till 1 cm tragacanth tuggummi på korkskivor. Märk skivorna på motsatt sida.
- Placera en behållare med isopentan i flytande kväve tills en del av vätskan fryser.
- Placera preparatet i tragacanthgummit. Den längsgående axeln av varje muskel bör vara vinkelrätt mot korken. Placera tuggummi runt botten av varje muskel för att hjälpa korrekt placering.
- Med hjälp av pincett, placera muskeln / kork exemplaret i kall isopentane beredd i steg 2,3 för att frysa. Flytta preparatet konstant i 1 min eller tills helt fryst, och placera på torris tillfälligt.
- Placera preparatet i glasflaskor och förvara vid -80 °C.
3. Muskelsnittning
- Ställ in kryostaten för snittning med en arbetstemperatur på -25 °C.
- Montera korken/muskelblocket och trimma tills plana sektioner uppnås.
- Använd en sektionstjocklek på 10 μm för RT-PCR och western blotting. Använd en tjocklek på 6-8 μm och 10-12 μm för immunohistokemi eller haematoxylin respektive eosinfärgning. Lägg skivade sektioner i 2,0 mL-rör och förvara vid -80 °C för RT-PCR och western blotting.
4. RNA-extraktion och omvänd transkriptionspolymeras kedjereaktion (RT-PCR)
- Extrahera cirka 10 skivor med 10 μm tjocklek från frysta muskler av en kryostat. Samla upp det renade totala RNA med hjälp av reningssatsen av totalt RNA enligt tillverkarens anvisningar.
- Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
- Kombinera de reagenser som krävs för en RT-PCR-reaktion i PCR-rör enligt tabell 1. Se tabell 2 för primersekvenser.
OBS: Den framåt primer var 44F för patienten NS-03 och 46F för patienten NS-07. Den omvända primern var 54/55R som standard. Om icke-specifika produkter var uppenbara användes 54R som ett alternativ. - Placera DE PCR-rör som innehåller blandningen i en termo-cycler. Kör termo-cyclern enligt tabell 3.
- Förvara PCR-produkt vid 4 °C för korttidsförvaring eller -20 °C för långtidsförvaring.
5. Microchip elektrofores och exon hoppa beräkning
OBS: Ett MCE-system (microchip electrophoresis) är ofta valt för att analysera exon hoppa effektivitet. I detta protokoll beskriver vi de åtgärder som krävs för att analysera exon hoppa effektivitet med hjälp av ett MCE-system av tillverkare A samt från tillverkare B, hädanefter kallas system A och B. Under den kliniska prövningen analyserades exonens övershoppningseffektivitet på system A. System A är dock inte längre till salu, och vi rekommenderar system B för att analysera exon hoppa över effektivitet. Vi har inkluderat protokoll för båda systemen (se avsnitt 5.1 för system A och 5.2 för system B). Se Tabell över material för information angående system A och B. Vidare kan detta steg också utföras med normal agarosgelelektrofores, men känsligheten minskar markant.
- Microchipelektrofores med hjälp av System A
OBS: System A har två typer av marker. Här beskriver vi stegen för DNA-chipet.- Reagenser för jämviktssatser (fläckbuffert, lastbuffert, stege och gelbuffert) till RT, virvel och spinn ner.
- För att förbereda gel-stain buffert (GS), tillsätt 12,5 μL fläckbuffert till 250 μL gelbuffert och vortex för 10 s. Flytta lösningen till ett spinnfilterrör och centrifug vid 2 400 x g i 15 min. Kassera filtret.
OBS: Det filtrerade GS:t kan förvaras vid 4 °C i 1 månad. - Om proverna är mycket koncentrerade, späd till ca 50 ng/μL med TE-buffert eller DNase-fritt vatten.
OBS: Om prover är i en saltkoncentration ≥ 200 mM KCl (eller NaCl) och/eller 15 mM MgCl2, byt ut bufferten. - Tillsätt 12 μL GS-lösning till gelpriming-brunnen (markerad och märkt GS) av DNA-chipet och placera chipet i primingstationen.
OBS: För att undvika luftbubblor, sätt i pipettspetsen vertikalt och till brunnens botten vid dispensering. Dispensera långsamt till första anslaget på pipetten, och utvisa inte luft i slutet av pipetteringssteget. - Välj C3-läge och tryck på Start-knappen. Efter priming är avslutad, ta bort chip.
- Inspektera mikrokanalerna visuellt för fångade luftbubblor eller ofullständig grundning.
- Ladda de förberedda proverna och stegen på chipet enligt nedan.
- Pipett 9 μL av GS-lösning i de övriga 3 GS-brunnarna.
- Pipett 5 μL av lastningsbuffert i L-brunnen och varje provväl (1-11).
- Pipett 1 μL stege in i L-brunnen.
- Pipett 1 μL DNA-prov i var och en av de 11 prov brunnarna.
- Pipett 1 μL TE eller DNasefritt vatten i eventuella oanvända brunnar. Snabbguiden i satsen visar en figur av spånlayouten.
OBS: Inspektera alla brunnar för luftbubblor genom att hålla chipet ovanför en lätt färgad bakgrund. Rubba eventuella fångade luftbubblor i botten av en brunn med ren pipettspets eller genom att ta bort och ladda om lösningen.
- Placera chipet i vortexstationen och tryck på Mix. Vortexstationen stannar automatiskt efter 1 min.
- Kör chipet i elektroforesstationen inom 5 min från lastning.
- Välj Ny körning i programverktygsfältet. På skärmen Ny körning väljer du DNA och DNA 1K från analyslistan.
- Antingen väljer du en projektmapp för körningen i project-pull-down-listan eller så skapar du en ny projektmapp genom att ange ett namn i fältet Projekt. Project
- Ange ett namn för körningen i fältet Kör prefix och klicka på Starta körning.
- Instrumentet piper när analysen är klar, och ett fönster öppnas som anger slutet av körningen. Välj OK och ta bort chipet från spånplattformen.
- Välj Arkiv | Exportera Data om du vill exportera data. Välj önskade alternativ i dialogen Exportera.
- För att rengöra elektroderna, fyll ett rengöringschip med 800 μL avjoniserat vatten och placera det på spånplattformen, stäng locket och låt det vara stängt i 1 min. Efter 1 min, öppna locket, ta bort rengöringschip, och låt elektroderna torka i 1 min.
- Mikrochipelektrofores med hjälp av system B
- Öppna driftprogramvaran och ange provinformationen. Efter att ha angett informationen beräknar programvaran mängden avsepareringsbuffert och markörlösningar automatiskt.
- Förbered den nödvändiga mängden av avskiljningsbuffert som beräknas av programvaran. Först, förbereda 100x nukleinsyra gel fläcklösning genom att späda 10,000x lösning med lämplig mängd TE buffert. 100x-lösningen kan förvaras vid -20 °C.
- Blanda en lämplig mängd 100x nukleinsyra gel fläck medseparation buffert i den specifika röret som tillhandahålls av företaget för att förbereda en 1x lösning. Vortex lösningen.
- Bered den erforderliga mängden markörlösning i röret.
- Starta sondtvättprogrammet.
- Starta mikrochiptvättprogrammet när du är klar.
- Samtidigt pipettera proverna till ett PCR multiplate (96-brunn, klart) och späd 4 gånger med avjoniserat vatten. Den minsta volym maskinen kan hantera är 6 μL, och den maximala är 30 μL. Vi föreslår en total volym på 10 μL (2,5 μL prov och 7,5 μL vatten/TE-buffert).
- Täck plattorna med självhäftande PCR-tätningsfolielakan och spin-down proven.
- Ställ in plattan, markörlösningen, och 1x-separeringsbufferten i maskinen enligt den placering som maskinen visar. Tryck på Start-knappen.
- När körningen är klar exporterar du resultatdata som en .csv-fil från programvaran och beräknar exonhopping-effektiviteten med hjälp av molarkoncentration enligt följande:
Exon hoppar över effektivitet (%) = (Skipped band / (Skipped band + Non-skipped band) X 100
6. Komplementär DNA (cDNA) sekvensering
-
Agarose gel förberedelse
- Mät 1,5 g agarospulver och blanda pulvret med 100 mL 1x TAE-buffert i en mikrowavabel kolv (vilket ger en 1,5 % agarosgel).
- Mikrovågsugn i 1-3 min tills agaros är helt upplöst.
OBS: Inte överkoka lösningen, eftersom en del av bufferten kommer att avdunsta och ändra den slutliga agaros procent av gelen. - Låt agaroslösningen svalna till ca 50 °C.
- Tillsätt 10 μL 10,000x fluorescerande nukleinsyrafärgämne till agaroslösningen.
- Häll agarosen i en gelbricka med brunnskammen på plats. Låt lämna vid RT i 20-30 min tills den har stelnat helt.
-
Sekvensering
- Blanda 5 μL av RT-PCR-produkt (från steg 4.4) och 1 μL av 6x lastningsbuffert. Ladda dem i brunnarna på 1,5% agarosgel.
- Kör gelen vid 135 V i 5 min och 120 V i 20 min.
- Visualisera banden med hjälp av en transilluminator enligt tillverkarens protokoll.
- Punktskatteband av intresse från gelen och använd en gel och PCR cleanup kit för att hämta RT-PCR-produkter.
- Mät koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: Det renade bandet kan skickas för sekvensering på ett företag eller sekvenseringsanläggning om ingen Sangersekvenseringsutrustning finns i huset. - Förbered de reagenser som krävs för ett cykelsekvenseringskit och pipettering till en MULTIPLATE PCR-platta enligt tabell 4. Se tabell 2 för primersekvenser.
- Täta plattan med klar självhäftande film.
- Vortexa plattan för 2 till 3 s. Centrifugera kort i en svängig hink centrifug så att innehållet lägger sig till botten av brunnarna (5 till 10 s) vid 1.000 x g.
OBS: Luftbubblor kan finnas i brunnarna, men de påverkar inte reaktionen negativt. - Placera blandningen i en termocykler och kör enligt tabell 5.
- Rena sekvenseringsreaktionerna med plattor enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd en DNA-analysator för att bestämma sekvenserna enligt tillverkarens protokoll.
- Jämför den sekvens som erhålls med patientens förväntade sekvens.
7. Västra blotting
- Provberedning
- Förbered SDS-provbuffert (4% SDS, 4 M urea, 10% 2-merkaptoetanol, 10% glycerol, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0.001% bromophenolblå, och proteashämmare).
- Placera omkring 100 skivor av de 10 μm muskelsektioner som samlats in från kryosektionering i 150 μL SDS-buffert.
- Kort homogenisera proteinproverna på is i 30 s med hjälp av en praktisk mikro homogenisator.
- Centrifugera vid 16 500 x g i 15 min, och överför supernatanten till ett nytt rör. Fortsätt med analys eller förvara vid -80 °C.
- SDS-PAGE för proteinkoncentrationsmätning
OBS: En fluorescerande gel fläck användes för att bestämma proteinkoncentrationen.- Bestäm den normala friska kontrollprovsvikten och koncentrationen med hjälp av BCA-proteinanalyssatsen enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered proverna för gelelektrofores. Pipett 10 μg av totalt protein av den friska kontrollen och 5 μL av patientproverna, 5 μL av 4x provbuffert, 2 μL av 10x provreducerande medel. När dessa har blandats, tillsätt avjoniserat vatten till en slutlig volym på 20 μL i varje prov.
- Värmeprover vid 70 °C i 10 min.
- Förbered 2 000 mL 1x SDS-rinnande buffert med hjälp av 50 mL 40x SDS-körbuffert. Späd med 1 950 mL avjoniserat vatten.
OBS: Vid denna punkt räcker det med 1 000 mL löpbuffert. Resterande 1 000 mL buffert används vid steg 7.3.1. - Blanda noggrant och ställ åt sidan 800 mL av 1x SDS-rinnande buffert för användning i gelboxens nedre (yttre) buffertkammare.
- Omedelbart före elektrofores, tillsätt 500 μL antioxidant buffert till 200 mL 1x SDS körbuffert att använda i den övre (inre) buffertkammaren av gelen rutan.
- Förbered för gelelektrofores genom att sätta upp en 3-8% Tris-acetat gel enligt tillverkarens protokoll. Lasta 20 μL av varje prov på gelen.
- Utför elektrofores vid 150 V i 75 min.
- Efter elektrofores, placera gelen direkt i en ren bricka som innehåller 50 mL fluorescerande gel fläcklösning.
- Täck facket, placera på en shaker, och agitera utan att stänk vätska eller skada gelen i 90 min.
- Överför gelen till vatten före avbildning i ett fluorescenssystem vid 312 nm belysning med ethidiumbromidemissionsfilter för att upptäcka fluorescens.
- Mät patientprovens koncentrationer utifrån en analytisk kurva som konstruerats med hjälp av normalkontroll lysate med känd koncentration.
- SDS-SIDA för västra blotting
- Förbered gelboxen enligt steg 7.2.4-7.2.6.
- Baserat på den koncentrationsmätning som erhålls i steg 7.2.11, laddas 100 μg per körfält av frisk kontroll lysate och 300 μg per körfält av patientprovet. Elektroforser som använder samma inställningar som steg 7.2.7.
- Protein överföring
- Förbered överföringsbufferten. Blötlägg ett PVDF-membran för 20 s i metanol. Flytta den till blottingbufferten B tills användning.
- Blötlägg ett extra tjockt blottingpapper i blottingbuffert A, B och C i minst 30 min per buffert.
- Efter elektrofores, blötlägg gelen i blotting buffert B i 5 min.
- Placera blottingpapper, PVDF-membran, och gel på halvtorköverföringsmaskinen enligt ritningen i figur 1. Rulla ut luftbubblor mellan gelen och membranet med en rulle.
- Överför vid 2 mA/cm2 membran i 1 h vid RT.
OBS: Efter överföring rekommenderas att utföra en total proteinfläck som liknar Ponceau-färgning för att bekräfta framgångsrik överföring av de stora molekylviktsproteinerna.
- Blockering och antikroppsfärgning
- Skölj membranet två gånger med PBST (1x PBS med 0,1% Tween 20).
- Placera membranet i 1% blockerande agent, och rock försiktigt för 1 h vid RT att blockera.
- Inkubera membranet med antidystrofin antikropp i blockerande lösning (1:125) och anti-spectrinantikropp (1:25,000) i 1 h vid RT eller över natten vid 4 °C.
- Tvätta membranet tre gånger i 10 min vardera med PBST vid RT.
- Inkubera membranet med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär anti-mus/kaninantikropp i PBST (1:100) i 40 min vid RT.
- Tvätta membranet igen tre gånger i 10 min med PBST vid RT.
- Upptäckt
- Blanda detektionslösningarna A och B i förhållandet 1:1. Den slutliga volymen av detektionsreagens som krävs är 0,1 mL/cm2 membran.
- Ta bort överskottet PBST från det tvättade membranet och placera den med proteinsidan uppåt på ett ark av plastfolie eller andra lämpliga rena ytor. Tillsätt den blandade detektionsreagensen på membranet och inkubera i 5 minuter vid RT.
- Ta bort överskottet detektionsreagens genom att hålla membranet försiktigt i tens och röra vid kanten mot en vävnad.
- Placera blot proteinsidan uppåt på ett provfack. Manövrera lysrörssystemet enligt användardokumentationen. Ställ in maskin enligt följande. Exponeringstyp: Steg, Intervalltid: 10 s, Känslighet/Upplösning: hög.
OBS: Uppmätta områden var förpackade med en blå rektangel (Bild 4a-b): BG: bakgrund; D: dystrophin 427 kDa, SL: spectrin beta lång isoform (274 kDa); SS: kort isoform (253 kDa). Dystrofin/spectrin signalförhållande beräknades som (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. Förhållandet mellan normal kontroll sattes som 100%.
Representative Results
För att använda RT-PCR för att upptäcka exon hoppa, primers på vardera sidan av exon som kommer att hoppas över utformades och utvärderas för att ge endast specifika band (se figur 2 för ett schemadiagram av exon hoppa och primer position). Primers bör generera produkter som lätt kan särskiljas genom storlek på ett MCE-system eller normal agarosgelelektrofores om MCE inte är tillgänglig. Bild 3a visar MCE-system A gelbilder av RT-PCR-reaktioner och sekvenseringsresultaten av det överhoppade bandet från patienterna NS-03 och NS-07 före och efter behandling med NS-065/NCNP-01 i dos-eskaleringsfas 1-prövningen. NS-03 och NS-07 hamn borttagningar som spänner exons 45-52 och 48-52, respektive. NS-03 fick 5 mg/kg och NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 veckovis i 12 veckor. Som väntat före behandling, båda patienter visade ingen hoppa, och endast en icke-hoppade band kunde visualiseras. Efter 12 veckors behandling visualiserades ett tydligt överhoppat lägre band för NS-07. Det var dock fortfarande svårt att upptäcka någon överhoppad produkt för patienten NS-03. Sekvenseringsresultaten visade en sammanföring av exons 47 och 54 för NS-07, samt exons 44 och 54 för NS-03. Enligt sekvensen skulle dessa teoretiskt kunna producera en funktionell men förkortad dystrofin isoform. För att beräkna hoppande procent som visas i figur 3b, molar koncentrationen för det överhoppade bandet delades med den överhoppade och un-skipped band. För patienten NS-07 var procenttalet efter behandlingen 72%, och det var 3,4% för NS-03. Western blot data (i tre exemplar) från patienter NS-03, NS-07, och en hälsosam kontroll visas i figur 4a. Väntade, upptäcktes inga dystrofin band före behandling. Efter behandling ett band från patienten NS-07 upptäcktes med en lägre molekylvikt jämfört med friska kontroll (vild typ dystrofin har en molekylvikt på 427 kDa, och NS-07 dystrofin har en molekylvikt på 389 kDa). På grund av exon borttagning och hoppa över, den dystrofin isoform från patienten NS-07 saknade flera exons, och det förväntades ha en lägre molekylvikt. Patienten NS-03 visade inga påvisbara nivåer av dystrofin efter behandling. I figur 4bvisas mängden dystrofin jämfört med en hälsosam kontroll för patienten NS-07. Platsen där signalintensiteter mättes för beräkningen av dystrofin restaurering anges med blå rutor. Dystrofin spectrin förhållandet användes för att beräkna mängden dystrofin jämfört med den friska kontrollen. För detta ändamål var signalen från dystrofin minus bakgrunden dividerat med summan av de två spectrin isoforms (lång och kort) minus bakgrund (se steg 8.6.5). Förhållandet för hälsosam kontroll sattes till 100%. Mängden dystrofin jämfört med den friska kontrollen hos patienten NS-07 efter behandlingen var 9, 1%. Andelen kunde dock inte beräknas för patienten NS-03 på grund av ett svagt dystrofinband, som liknar dem som erhållits för tidigare behandlingsprover för båda patienterna.
Bild 1: Schematiskt diagram över överföringsstacken för western blot-analys. Montering av den västra blotöverföringsstacken med blottingpapper indränkt i blottingbuffert A i botten följt av blottingpapper indränkt i blotting buffert B, PVDF-membran, 3-8% Tris-Acetate Gel och på de översta 2 blottingpapperen indränkt i blotting buffert C visas. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk ritning av exon hoppa över av exon 53 i en patient med exon 45-52 borttagning i DMD genen. Till exempel hade patienten NS-03 i dos-eskalering kliniska prövningen denna borttagning. Om exon 53 behålls kommer mRNA att vara ur ramen eftersom korsningen exon-exon mellan exon 44 och 53 stör läsramen, vilket orsakar ett stopp-kodon i exon 53. Läsramen återställs när exon 53 hoppas över, och en kortare isoform av dystrofin produceras. För att upptäcka exon 53-hoppa över av RT-PCR används primers i exon 44 och 54 så att PCR-produkten mellan överhoppade och ohoppade mRNA lätt kan upptäckas. FWD: framåt primer, REV: omvänd primer, PMO: fosfordiamidat morpholino oligomer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Hoppa över effektivitet för patienter NS-03 och NS-07 från tibialis främre muskelbiopsi prover. a) Gelbild som alstras av elektroforessystem A av RT-PCR-prover av obehandlade och behandlade prover från patienterna NS-03 och NS-07. Övre panelen visar NS-03 och nedre panelen NS-07 i tre exemplar. För NS-03 är det ohoppade bandet 422 bp, och det överhoppade bandet är 212 bp. För NS-07 är banden 836 bp respektive 624 bp. Sequence analys visade en sammanföring av exon 44 och exon 54 för NS-03 och exon 47 till exon 54 för NS-07. b) Överhoppning av effektivitet före och efter behandling visas för patienter NS-03 och NS-07, beräknas från molar koncentrationen av de två banden som tillhandahålls av system A som hoppade band / (skipped band + un-skipped band) x 100. Den hoppande effektivitet för NS-03 var mycket låg efter behandling; för NS-07 var den hoppande effektiviteten över 70 %. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Proteinkvantifiering av Dystrophin isoformer före och efter exon hoppa terapi. a) Proteinkvantifiering av dystrofinisoformer före och efter exon överhoppningsterapi. Western blot av muskel biopsi från tibialis främre från patienter NS-03 och NS-07 före och efter behandling och från friska kontroll i tre exemplar. Dystrophin kan ses på 427 kDa för den friska kontrollen och vid 389 kDa för NS-07 efter behandling. Ingen dystrophin kunde upptäckas för antingen patienten före behandling, eller varken kunde upptäckas efter behandling för patienten NS-03. Området i den svarta lådan visas i bild 4b. Till vänster i varje blot visas markören. b) Mängden dystrofin som återställs efter behandling för patienten NS-07. Dystrophin restaurering beräknades baserat på bandens intensiteter för dystrophin, bakgrund, och den långa och korta isoformen av spectrin enligt formeln: (dystrophin - bakgrund)/(spectrin L -background) + (spectrin S - bakgrund) där förhållandet för hälsosam kontroll är inställt på 100%. Intensiteten i varje band mättes inuti de blå rutorna som visas i figuren. Den dystrophin restaurering för NS-07 var 9,1% efter behandling. Dystrophin signalen var för svag för att mäta i de obehandlade proverna. Markörstorlekar visas i kilodalton. Dys: Dystrophin, BG: bakgrund, SL: Spectrin lång isoform, SS: Spectrin kort isoform, Min: Myosin typ 1. Markörstorlekar visas i kilodalton. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Lösning | Volym/Reaktion (μl) | Slutlig koncentration |
| RNasefritt vatten (tillhandahålls) | Variabel | - |
| 5x QIAGEN OneStep RT-PCR-buffert | 5.0 | 1x |
| dNTP Mix (innehållande 10 mM av varje dNTP) | 1.0 | 400 μM av varje dNTP |
| Framåt Primer (10 μM) | 1.5 | 0,6 μM |
| Omvänd Primer (10 μM) | 1.5 | 0,6 μM |
| QIAGEN OneStep RT-PCR enzym Mix | 1.0 | - |
| RNashämmare (tillval) | Variabel | 5–10 enheter/reaktion |
| Mall-RNA | 50 ng | |
| Totala | 25 |
Tabell 1: RT-PCR-reagenser. De nödvändiga föreningarna för en reaktion av RT-PCR.
| Primer | Sekvens |
| 44F | 5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3' |
| 46F | 5'-AACCTGGAAAGAGCAGCAA-3" |
| 48F | 5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3' |
| 54R | 5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3' |
Tabell 2: Primer-lista. Sekvenser för de grund- och primrar som används i denna studie. F: Framåt, R: Omvänd.
| 1 cykel | Omvänd transkription | 30 min | 50 °C |
| 1 cykel | Inledande PCR-aktiveringssteg | 15 min | 95 °C |
| 35 cykler | Denaturering | 1 min | 94 °C |
| Glödgning | 1 min | 60 °C | |
| Förlängning | 1 min | 72 °C | |
| 1 cykel | Slutlig förlängning | 7 min | 72 °C |
| Hålla | ∞ | 4 °C |
Tabell 3: PCR-betingad använd. Visa PCR-villkor för RT-PCR-reaktionen.
| Lösning | Volym/Reaktion (μl) |
| RNasefritt vatten | Variabel |
| BigDye Terminator 3,1 Färdig reaktion Mix | 3.5 |
| Framåt Primer/Omvänd primer (3,2 μM) | 2.0 |
| Mall-RNA | 20 ng |
| Totala | 20 |
Tabell 4: Reagenser som är nödvändiga för sekvenseringsreaktionen. Använd antingen Forward eller Reverse primer i inställningen, inte båda samtidigt.
| 1 cykel | 1 min | 96 °C |
| 25 cykler | 10 s | 96 °C |
| 5 s | 50 °C | |
| 4 min | 60 °C | |
| Hålla | ∞ | 4 °C |
Tabell 5: PCR-villkor för Sangersekvenseringen.
Discussion
Kliniska prövningar av DMD har producerat både framgångar och misslyckanden under de senaste åren. Både RT-PCR och västra blotting är vanliga tekniker för att bedöma hoppa effektivitet som genereras av exon-hoppa föreningar administreras till patienterna. RT-PCR har dock rapporterats över-uppskatta hoppa effektivitet jämfört med digitala PCR15. Även om detta beror på ett antal skäl, är det främst orsakas av effektivare förstärkning av de mindre hoppade fragment under PCR cykler. Det verkar som RT-PCR används i denna kliniska prövning också genererat högre hoppa effektivitetsvinster jämfört med protein uttryck uppskattas av västra blotting. Enligt FDA, Detta är ett mer tillförlitligt sätt att kvantifiera dystrofin restaurering12. Därav, försiktighet bör iakttas vid tolkning av RT-PCR hoppa resultat; emellertid kan tar prov stilla jämföras. Prover som visar högre hoppa över effektivitetsvinster baserat på RT-PCR-resultat exhbit ofta högre proteinuttryck nivåer i västra blot analyser.
Eftersom alla patienter i DMD kliniska prövningar inte har samma raderingsmönster kan det vara svårt att utforma grundfärger och sonder som är tillräckligt specifika för att utföra digital eller qPCR på alla prover. Därför är RT-PCR fortfarande ett bra alternativ för en första bedömning av hoppa effektivitet. Innan den kliniska prövningen av NS-065/NCNP-01 påbörjades var det tråkigt att bedöma hoppa över effektivitet för varje patient in vitro eftersom antingen en muskel- eller hudbiopsi var obligatorisk för att generera patientspecifika myoblaster. Vi har dock nyligen publicerat en ny teknik för att generera patientspecifika MYOD1-konverterade, urin-härledda celler (UDI:er) som en ny DMD muskelcell modell16. Således krävs endast urin som samlats in från patienten för att generera myoblasterna, och inget invasivt förfarande är nödvändigt. Vi anser att denna metod kan användas för att skärmen olika AONs i patient-specifika celler. Vidare kan olika grund- och prober testas innan patienten påbörjar någon klinisk prövning. Detta kan underlätta användningen av qPCR eller digital PCR för exon hoppa mätning i DMD kliniska prövningar i framtiden.
För att utföra western blot analys i denna kliniska prövning, en enda antikropp mot dystrofin användes, och endast en hälsosam kontroll användes som ett referensprov. Därav validerades inte antikroppens specificitet på lämpligt sätt. Detta, tillsammans med det faktum att antikroppen bara erkänner C-terminal domänen av dystrofin, är en begränsning av protokollet. Mer hälsosamma kontroller och antikroppar riktade mot olika domäner av dystrofinmolekylen är tillrådligt i framtiden.
Här sammanfattade vi de protokoll som användes i den senaste förberedande undersökande undersökande-initierade, första-i-människa-prövning av NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 är potentiellt tillämpligt på 10,1% av patienterna med DMD.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Dr Takashi Saito, Dr Tetsuya Nagata, Herr Satoshi Masuda, och Dr Eri Takeshita för vetenskaplig diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
- Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
- Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
- Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
- Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
- Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
- Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
- Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
- Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).
