Summary
评估圈养动物福利的一个基本方面是询问这些动物是否拥有它们想要的东西。在这里，我们提出一个协议，以确定在斑马鱼（达尼奥雷里奥）的住房偏好，在存在/缺乏环境丰富和获得流动的水。
Abstract
动物福利评估技术试图考虑相关动物的具体需要和需求。提供丰富（在住房环境中添加物理物体或附物）通常是让圈养动物有机会选择与谁或什么互动以及如何花费时间的方式。然而，在圈养中经常被忽视的水生环境的一个基本组成部分是动物选择进行体育锻炼的能力。对于许多动物，包括鱼类，运动是它们生命历史的一个重要方面，众所周知，它有许多健康益处，包括大脑和行为的积极变化。在这里，我们提出了一个方法，以评估圈养动物的栖息地偏好。该协议可以很容易地调整，以研究不同水生物种的各种环境因素（例如，砾石与沙为基质、塑料植物与活植物、低流量与高水流）的不同水生物种，或与陆地物种一起使用。偏好统计评估使用 Jacob 的偏好指数进行，该指数将栖息地从 -1（避免）排列到 +1（最优先）。有了这些信息，就可以从福利的角度确定动物想要什么，包括它们的首选位置。
Introduction
关于实验室动物如何安置在圈养中的条例是明确的，而且定义明确。实验室动物护理评估与认证协会（AAALAC）监督和管理所有与研究动物打交道的组织和机构，并针对适合物种的饲养和住房制定具体准则。例如，美国AAALAC的《斑马鱼的住房和照料指南》，Danio Rerio1"强烈鼓励"在圈养斑马鱼时使用浓缩物（在住房环境中添加实物或附物）。指南接着说，"提供模仿斑马鱼栖息地的人工植物或结构，使动物在其环境中有选择。
有证据表明，富足可以刺激大脑中参与处理空间信息2的区域的新神经元（神经发生）的生长，并且认为这些神经变化与增强学习能力有关3。丰富对神经发生和学习的影响已被广泛研究在各种分类，包括鱼4，5，鸟类6，爬行动物7和哺乳动物8。虽然这些类型的研究对于理解富足对大脑和行为的影响很重要，但它们没有考虑到动物对特定环境的特定选择或偏好。
在评估圈养动物的福利时，一个基本问题是这些动物是否拥有他们想要的。调查这个问题，提供具体证据的一种方法是提供动物的选择，使我们能够了解他们的主观偏好。例如，两项研究调查了斑马鱼是喜欢进入富集环境还是平原环境，这两项研究都表明，斑马鱼更喜欢含有富集10、11的区域。然而，也有人提出斑马鱼似乎对环境富集无动于衷，因此对这个问题的回答显然并不明确。与动物福利相关的偏好测试的另一个应用延伸到试图了解丰富环境的不同方面在个体动物的选择中如何发挥作用。单单在鱼类中，不同类型的富集对大脑和行为有差异效应，而这种关系由于个性特征的个体差异而变得更加复杂。此外，优惠测试有助于环境富集的比较研究。即使在不同的鱼种中，富足也已被证明对许多不同类型的行为有影响，包括攻击14、大胆15、运动16和冒险行为17。
雅各布的偏好指数是一个统计测试，经常用于量化住房偏好18。Jacob 的偏好指数根据不同时间点每个栖息地类型中的动物数量为每个不同的栖息地分配一个值，其中首选项范围为 -1（避免）到 +1（最优先）。在这里，我们描述了一种使用Jacob的偏好指数来调查鱼类中住房偏好的方法，并举例说明了水生环境的两个重要特征：1） 存在或缺乏富集性;和2）水流19。然而，该议定书可以很容易地加以调整，以研究不同物种和景观（如水生和陆地）的各种环境因素（例如，砾石与沙为基质、塑料植物与活植物、低与高水流）。
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Protocol
目前的研究已经批准，并符合宾夕法尼亚州立大学动物护理和使用协议的所有要求;IACUC号46466号。
1. 设置首选项装置
- 在开始实验之前，获得该研究所动物护理委员会（或同等组织）批准所有涉及活体动物的实验和饲养程序。
- 使用由不透明白色塑料制成的实验罐。区域之间的墙壁由灰色丙烯酸制成，用硅密封剂固定到位。
注：实验舱的大小取决于感兴趣的物种的大小和使用的个人数量（例如，对于8条成年斑马鱼，建议使用76厘米长x76厘米的鱼缸x30厘米H）。 - 将实验舱分成四个区域，根据要测试的特定栖息地参数而变化。要调查的不同类型的富集示例包括沙质与岩石基质、人工植物与掩体、或水流与人工植物的存在（图1）。
- 如果使用水流作为感兴趣的参数，请使用小型泵来供应喷水（参见材料表）。将泵设置为选择的速度，以便它们提供恒定且定向的水流。根据感兴趣的物种的生态和生命史（例如，斑马鱼的14厘米/s）选择所需的速度。
- 在实验罐的中间，有一个中央竞技场，在那里运送食物（图1）。从每个区域进入中央竞技场是通过分隔墙的一个小开口。开口足够大，感兴趣的物种可以不受阻碍地在区域之间移动，但足够小，以减少鱼可能从其他区域体验到的任何视觉线索。
- 在水箱的每个角落放置生物过滤器和加热器，但在实验区外放置，以免干扰水流，并确保所有区域的水温恒定。
- 根据空间要求设置额外的实验罐。旋转每个实验罐中的不同区域，以限制任何顺序偏差。确保所有复制罐具有均匀的条件（相同的光照水平、水温等）
- 将相机（见材料表）放在每个实验罐正上方的三脚架上，以便所有区域都可见。避免使用广角镜头，并确保存储卡有足够的空间进行录制。
- 将房间照明设置为渐进（例如 1/2 小时） 12 L： 12 D 周期，以模拟日出和日落。水温保持在25~1°C。
2. 捕获、适应和程序
- 当鱼没有经过测试时，将鱼放在家用水箱中。从他们家的水箱中网出所有测试鱼，并放置在实验罐的中心竞技场（第1天）。最小化捕获时间以减少应力（例如，小于 30 s）。
注：将鱼从家庭水箱转移到实验水箱的另一个程序是将鱼输送到水箱水烧杯中。 - 保持每个实验水箱中鱼的数量和性别恒定，并根据鱼种大小和生态进行选择。
- 在第1⁄4天，鱼花时间适应和探索不同的区域。不要收集这些天的数据。
注：根据特定的实验协议，延长或减少适应天数。然而，适应期应足以尽量减少处理的影响，以及使鱼习惯于在仪器中喂养。 - 在适应期间，通过定期进行水质测试（如pH、硝酸盐或亚硝酸盐水平）密切监测水质，如果发现任何问题，则更换水（见材料表）。
- 在中央竞技场用浮食环（见材料表）喂鱼片食物（见材料表），附在水面上中央竞技场的墙壁上。食物环确保食物颗粒留在中央竞技场内，不会因食物漂移而对区域产生偏差。
- 给鱼.5小时喂，然后取出实验罐的剩菜，用浸网。早上喂鱼一次，下午喂一次。
- 评估第 5-7 天的行为。在每个预定的上午和下午喂食后，打开摄像头并记录鱼的行为 2 小时。第8天，用浸网将实验舱中取出所有鱼，并放回母舱。
- 根据可用的水池水量，在实验水箱中至少用新鲜的水池水替换至少 1/3 的水，以减少压力荷尔蒙对鱼的任何影响。
- 按照该周的区域轮换时间表设置实验罐。旋转区域可减少由于放置任何相对区域而发生任何行为偏差的机会。然后用一批新的鱼重新开始测试过程。
3. 测量和数据分析
- 在每个录制日结束时将视频下载到计算机。这可确保每次使用前存储卡上都有空间。
- 使用视频软件（参见材料表）来量化区域偏好。在每个 2 小时记录周期中，以 5 分钟间隔手动计算每个区域中的鱼数（包括这些计数中的中央竞技场）。如果从视频片段中可以区分雄性与雌性，在分析过程中定义鱼的性别。
- 要分析栖息地偏好，请计算每个复制鱼缸的每个区域平均鱼数（即，平均3天内的所有数据）。为了获得结构使用的偏好分数，将 Jacobs 的偏好指数15计算为
J = （rx = p）/*（rx + p） = 2 =r=p|
其中x是感兴趣区域，rx是区域 x中的鱼与所有区域中的鱼总数的比率，p是实验罐中所有区域的可用比例。索引范围为 ±1 表示最大首选项，而 "1"则介于最大避免范围。 - 要确定在观察期间，鱼在区域之间切换的速度是否有任何变化，请计算每个观察期的第一个和最后5分钟的切换速率，其中rsr是鱼从中央竞技场进入每个区域的次数，除以鱼的总数。
- 当鱼的整个身体穿过分隔区域的开口时，假设鱼已经进入一个区域。计算每个复制罐的起动和精加工平均开关速率。由同一实验者执行所有行为观察，以减少任何实验者观察偏差。
- 使用统计软件（见材料表），进行相关的统计分析。建议的分析包括单向方差分析，以偏好指数为因变量，区域为预测变量，以及每个储罐的起始和精加工平均开关速率上的成对 t 检验。
- 应用 Tukey 的多个比较后临时测试以进一步调查区域比较，其中每个区域相互比较。更复杂的统计分析包括评估时间效应、竞技场效应、性别影响甚至行为个体差异的混合模型。
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Representative Results
我们使用偏好测试来调查斑马鱼的住房偏好，在不同富集物（包括1）塑料植物和沙基板之间做出选择;2） 水流。这些区域分为四个区域：（一） 仅丰富;（二） 仅丰富;（三） 仅丰富;（三） 仅丰富;（四） 仅丰富;（四） 仅丰富（二） 仅流动;（三） 丰富和流动;（四） 平原;和中央竞技场，食物被交付19。斑马鱼对丰富和流动区域表现出最高的偏好，这与所有其他区域（仅丰富、仅流、平原和中央竞技场）明显不同;p < 0.01）。鱼避开了"仅流"和"平原"区域，在中央竞技场19号（图2A）花费更多时间。此外，斑马鱼在观测期开始时在不同生境区之间移动的频率高于在结束时（图2B）。
图1：测试栖息地偏好的不同实验设计示例。（A） 设置实验罐，以测试沙基与岩石基板的偏好。（B） 设置实验罐，以测试浓缩（塑料植物）与避难所的偏好。（C） 设置实验水箱，以测试富集（塑料植物）相对于水流的偏好。在所有图形面板中，鱼无法接触到四个角落隔间，仅包含加热器和过滤器。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：显示斑马鱼栖息地偏好测试结果的代表性数据。（A） 雅各布斯对每个区域的偏好指数： （i） 仅丰富;（ii） 丰富和流动;（iii） 仅流动;（iv） 平原;和中立的中央竞技场正值和负值分别表示偏好和回避。这些框指示 25 ± 75 百分位数范围，并包含中线;柱表示第 10 和第 90 个百分位值;打开点表示这些值之外的点。a = 与所有区域存在显著差异（p < 0.05）;b = 与丰富和流动、仅丰富和中央竞技场（p < 0.05）显著不同;和 （B） 框图显示观察周期开始和结束的开关速率（框表示 25 ± 75 百分位数范围并包含中线;柱表示第 10 和 90 百分位数值）。图2A已由DePasquale等人第19条修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们提出了一个实验设计，使我们能够研究鱼类对不同类型的栖息地的偏好。在偏好测试中非常重要的一些关键步骤包括：1） 确保在不同复制（例如，外部噪音或运动、实验者、水化学、光照水平）之间保持统一条件;（2） 确保在不同复制体之间保持均匀的条件;2） 确保区域在复制之间旋转，并在测试之间用新鲜的水池水替换大量水，以减少偏差;（3） 确保使用适当的样本量来检测显著结果，包括每组个体数量和复制罐数;4） 如果记录试验，优化和确保正确的视频录制和文件传输。
对现行协议的修改包括将鱼类暴露在各种其他生境类型中，例如不同的浓缩物、不同的基材，甚至不同的流速。此外，可以使用动物跟踪软件进一步了解鱼类如何使用每个区域的空间（例如，鱼花时间在流动区中游过水流，或者它们是否完全避开了栖息地的这一部分）。但是，实验罐的墙壁可能需要修改以适应这种类型的跟踪软件。最后，这里描述的偏好测试可以适应任何鱼类物种，或实验者想要研究的任何水生生物。
当前协议的一个限制是，首选项测试受呈现给动物的资源的限制。因此，动物可能不会选择首选，但最不令人不快的那些提出20。然而，首先选择可能比只给予有限的选择（即只获得最首选的生境）更能为福利服务。此外，有人建议斑马鱼找到光背景逆23，因此替代的坦克颜色（如黑色）可能更合适。此外，偏好测试往往仅限于在一小段时间内进行的观察，其中有关动物可能根据即时线索采取行动，而不是未来需要21，22。此外，性别、群体规模和社会环境是影响群体动态的因素，因此影响鱼类潜在的栖息地偏好，因此，在复制中尽量保持这些因素一致非常重要。
通过我们的代表性结果显示，斑马鱼优先选择富集区和流区和纯流区，避免只流区和平原区。总之，丰富区和流区优先于所有其他区域。对丰富环境，特别是丰富和流动区的优先选择，可能是对感官刺激（探索）需求增加的结果，或者可能是需要找到隐藏的地方（减少来自同一具体环境的竞争）。有趣的是，中央竞技场比"仅流"和"平原区"略胜一筹，这表明提供食物的潜力比游泳更具有激励作用。就区域之间的移动而言，在观测期开始时区域之间的切换比在终点的切换更多。观察期开始时运动的增加可能与喂食的时间相对应（鱼在记录开始前半小时喂食），因此它们可能更有动力移动和寻找额外的食物。总之，本研究中描述的协议是研究鱼类生境偏好的有效工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了宾夕法尼亚州立大学研究合作研究奖学金和哈克研究所以及美国农业部AES 4558的支持。该研究符合宾夕法尼亚州立大学动物护理和使用协议的所有要求;IACUC号46466号。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
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